CN110951895B - 检测和区分奇异变形杆菌、普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的系统和方法 - Google Patents
检测和区分奇异变形杆菌、普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的系统和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明适用于细菌检测技术领域，首次提供了一种可以同时区分奇异变形杆菌(P.mirabilis),普通变形杆菌(P.vulgaris)和潘氏变形杆菌(P.penneri)的三重TaqMan Real‑Time PCR检测方法与试剂盒，通过计算机软件预测变形杆菌的引物和核苷酸序列，公开了3对(6条)可以用于同时检测3种变形杆菌的引物和3条探针的核苷酸序列。该方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特性。该方法在检测变形杆菌的同时还可以将变形杆菌鉴定到具体的种，填补了当前变形杆菌检测中仅能对奇异变形杆菌进行区分的不足，大大简化了变形杆菌检测的流程，减少操作人员的工作量，缩短检测周期，可为医疗、卫检等行业中检测变形杆菌提供有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，是一种用于检测变形杆菌属及同时区分奇异变形杆菌、普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的三重TaqMan Real-Time PCR的系统
背景技术
变形杆菌是一种属于肠杆菌科的革兰氏阴性菌，在自然界中广泛存在，是人和动物肠道中的条件致病菌。变形杆菌属包含奇异变形杆菌(P.mirabilis)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、潘氏变形杆菌(P.penneri)和豪氏变形杆菌(P.hauseri)4个种。其中P.mirabilis，P.vulgaris，P.penneri被认为有致病性，并且以各种组合在健康的人和动物的肠道中长期存在，但是丰度非常低(<0.05％)；豪氏变形杆菌在常存在于水域中，被认为没有致病。当外界环境发生剧烈变化或者机体平衡状态被破坏时P.mirabilis、P.vulgaris和P.penneri可引起多种疾病，如食物中毒、尿路感染、创伤及烧伤感染、急性胃肠炎型和败血症等。当前变形杆菌在泌尿系统中的发病情况最令人关注，奇异变形杆菌是临床上引起尿路感染的第2大病原菌。近年来，变形杆菌在食物中毒中表现出逐年上升趋势，不断的有变形杆菌引起的食物中毒事件发生。因此，对变形杆菌的快速诊断和区分应引起足够重视。
目前，国内外报道了多种变形杆菌的诊断方法，主要有：生化鉴定、普通PCR和荧光定量PCR。但是还没有一种既能快速的检测变形杆菌感染，又能准确的对变形杆菌属内的3种变形杆菌进行区分的方法。在现有的方法中，生化鉴定法存在操作繁琐，耗时较长，特异性差的缺点；而当前已经建立的普通PCR和荧光定量PCR方法仅能从变形杆菌属中区分奇异变形杆菌，不能对普通变形杆菌(P.vulgaris)和潘氏变形杆菌(P.penneri)进行区分和定量。由此可见，现有变形杆菌检测技术存在较大的缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于检测变形杆菌属及同时区分奇异变形杆菌和/或普通变形杆菌和/或潘氏变形杆菌的三重TaqMan Real-Time PCR的系统，其特征在于，所述系统包括：
预测模块，安装有分析所述变形杆菌的引物和核苷酸序列的数据库的计算机；
引物合成模块，用于合成所述预测模块预测的引物序列的设备，检测所述变形杆菌的PCR引物，所述引物序列的核苷酸互补序列组成引物组，探针序列的核苷酸互补序列组成探针组；
PCR扩增模块，用于扩增PCR的PCR仪，将所述引物组、探针组、qPCR Mix和ddH2O按照预定的配制方法配制PCR预反应体系，将待测DNA模板加入预反应体系混合离心后，使用3通道荧光定量PCR仪按照规定扩增程序进行检测，同时可以并根据荧光强度对变形杆菌进行定量；
判断模块，安装有分析数据结果进行判定的提示装置，测定通道FAM、HEX和Red610，根据通道的CT值来判定变形杆菌。解决现有技术不能对变形杆菌在种水平上进行区分和定量的缺陷。
进一步的，检测模块的PCR引物组，引物序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6，NO:7-NO:9共同组成该检测方法的引物组，所述引物的核苷酸序列如表1所示：
表1引物核苷酸序列表
注意：引物序列也可以为表中引物序列的核苷酸互补序列。
进一步的，检测模块的PCR探针组，探针序列为SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:9，NO:7-NO:9共同组成该检测方法的探针组，所述探针的核苷酸序列、荧光基团和淬灭基团如表2所示：
表2探针核苷酸序列表
注意：探针序列也可以为表中探针序列的核苷酸互补序列；
进一步的，其判断模块，测定通道FAM、HEX和Red610，FAM通道用于检测奇异变形杆菌，HEX通道用于检测普通变形杆菌，Red610通道用于检测潘氏变形杆菌：
阳性结果的判定：当FAM通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为奇异变形杆菌阳性；当HEX通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为普通变形杆菌阳性；当Red610通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为潘氏变形杆菌阳性；
疑结果的判定：测定FAM、HEX和Red610通道，35≤CT值≤40，则结果判定为可疑，需要重复检测一次，如果重测结果仍然为可疑则判定为阳性；如果重测结果无CT值则判断为阴性；
阴性结果的判定：测定FAM、HEX和Red610通道，当无CT值或无典型的S型扩增曲线，则结果判定为阴性。
本发明的目的之二在于提供一种检测变形杆菌属及同时区分奇异变形杆菌和/或普通变形杆菌和/或潘氏变形杆菌的三重TaqMan Real-Time PCR的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)检测变形杆菌的PCR引物，所述引物序列的核苷酸互补序列组成引物组，探针序列的核苷酸互补序列组成探针组；
(2)将所述引物组、探针组、qPCR Mix和ddH2O按照预定的配制方法配制PCR预反应体系，将待测DNA模板加入预反应体系混合离心后，使用3通道荧光定量PCR仪按照规定扩增程序进行检测，同时可以并根据荧光强度对变形杆菌进行定量。
进一步的，检测PCR引物探针的方法，在引物设计时分析了GeneBank上公布的所有奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌和豪氏变形杆菌的序列，并与同属于肠杆菌科下的普罗非登斯菌属和摩根氏菌属等的核苷酸序列进行比对，采用构建系统进化树的方法筛选检测的检测目标基因，最后发现tur基因可以将变形杆菌属和其它菌属区分开，同时也可以区分奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌和豪氏变形杆菌。而ureR基因可以有效地区分奇异变形杆菌和其它变形杆菌。为了更好的优化检测引物和探针，选取tur基因作为检测普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的目标基因；选取ureR基因作为检测奇异变形杆菌的目标基因。
进一步的，PCR预反应体系，经优化后的40μL反应体系包括预反应体系(qPCR Mix20.0uL，引物组3.0μL，探针组3.0μL，H2O 9.0uL)和模板DNA(10-100ng)5uL，将两者混匀、离心后进行PCR反应。
进一步的，PCR扩增的方法，将PCR八连管或者96孔板放置在拥有三个通道的荧光定量PCR仪中，选择3个荧光通道：FAM、HEX和Red610。设置扩增程序：第一步，94℃热启动和预变性5min；第二步，94℃变性10s；第三步60℃退火30s，并在第三步检测荧光；第二步与第三步共40个循环。
表3反应程序
附图说明
图1是本发明提供的对3种变形杆菌的特异性检测图；
图2是本发明提供的多重TaqMan Real-Time PCR扩增奇异变形杆菌的标准曲线；
图3是本发明提供的多重TaqMan Real-Time PCR扩增普通变形杆菌的标准曲线；
图4是本发明提供的多重TaqMan Real-Time PCR扩增潘氏变形杆菌的标准曲线；
图5是本发明提供的奇异变形杆菌测序图1；
图6是本发明提供的奇异变形杆菌测序图2；
图7是本发明提供的普通变形杆菌测序图；
图8是本发明提供的潘氏变形杆菌测序图；
图9为所述系统示意图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1检测3种变形杆菌的多重TaqMan Real-Time PCR引物组。
本发明在引物设计时分析了GeneBank上公布的所有奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌和豪氏变形杆菌的序列，并与同属于肠杆菌科下的普罗非登斯菌属和摩根氏菌属等的核苷酸序列进行比对，采用构建系统进化树的方法筛选检测的检测目标基因，最后发现tur基因可以将变形杆菌属和其它菌属区分开，同时也可以区分奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌和豪氏变形杆菌。而ureR基因可以有效地区分奇异变形杆菌和其它变形杆菌。为了更好的优化检测引物和探针，选取tur基因作为检测普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的目标基因；选取ureR基因作为检测奇异变形杆菌的目标基因，根据tur基因和ureR基因为目的基因所设计的引物和探针的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO:1 5'-AGTACGATTTCCCAGGTGAT-3
SEQ ID NO:2 5'-TGTCAATTGCACGCTCTGGC-3'
SEQ ID NO:3 5'-TCGTGCAGGTGAGAACGTTG-3'
SEQ ID NO:4 5'-ATTCGAATTTAGTGTGTGGC-3'
SEQ ID NO:5 5'-GAGTTTCTTGTGATGTGACA-3'
SEQ ID NO:6 5'-AATCAGGAAGATGACGAGTA-3'
引物序列也可以为上述引物序列的核苷酸互补序列。
所述探针的核苷酸序列、荧光基团和淬灭基团如下所示：
SEQ ID NO:7 5'-Red610-ACTCCAGTAATCCGTGGTTCAGCG-BHQ2-3'
SEQ ID NO:8 5'-HEX-CTGCTGCGTGGTACTAAACGTGAA-BHQ1-3'
SEQ ID NO:9 5'-FAM-CCGACCAAACCGATTGAATTACATACC-BHQ1-3'
探针序列也可以为上述探针序列的核苷酸互补序列。
实施例2检测3种变形杆菌的多重TaqMan Real-Time PCR试剂盒。
本发明提供了一种检测变形杆菌属及同时区分3种变形杆菌的多重TaqMan Real-Time PCR试剂盒。该试剂盒含有实施例1中的引物组与探针组、qPCR Mix和ddH2O组成的预反应体系，具体含量如下：
引物组中每条引物(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6)的浓度为5μmol/L；探针组中每条探针(SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:9)的浓度为5μmol/L；qPCR Mix为Takara公司生产，含有Taq酶，PCR buffer，dNTP，MgCl2；ddH2O为无DNA酶和RNA酶的去离子水。
经优化后的40μL反应体系包括预反应体系(qPCR Mix 20.0uL，引物组3.0μL，探针组3.0μL，H2O 9.0uL)和模板DNA(10-100ng)5uL，将两者混匀、离心后进行PCR反应。
实施例3检测3种变形杆菌的多重TaqMan Real-Time PCR的扩增程序。
将装有反应体系的0.1mL的PCR八连管或者96孔板放置在拥有三个通道的荧光定量PCR仪中，选择3个荧光通道：FAM、HEX和Red610；设置扩增程序：第一步，94℃热启动和预变性5min；第二步，94℃变性10s；第三步60℃退火30s，并在第三步检测荧光；第二步与第三步共40个循环。
实施例4检测结果的判定。
测定通道FAM、HEX和Red610，FAM通道用于检测奇异变形杆菌；HEX通道用于检测普通变形杆菌；Red610通道用于检测潘氏变形杆菌；
阳性结果的判定：当FAM通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为奇异变形杆菌阳性；当HEX通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为普通变形杆菌阳性；当Red610通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为潘氏变形杆菌阳性；
可疑结果的判定：测定FAM、HEX和Red610通道，35≤CT值≤40，则结果判定为可疑，需要重复检测一次，如果重测结果仍然为可疑则判定为阳性；如果重测结果无CT值则判断为阴性。
阴性结果的判定：测定FAM、HEX和Red610通道，当无CT值或无典型的S型扩增曲线，则结果判定为阴性。
实施例5特异性试验。
选择与变形杆菌十分相似的普罗非登斯菌、摩根氏菌和沙门氏菌进行特异性试验。将本发明提供的试剂盒用于对奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌、罗非登斯菌、摩根氏菌和沙门氏菌进行检测，结果显示在FAM、HEX和Red610通道都有典型的S型扩增曲线CT值分别为22.51、28.34、29.12，而潘氏变形杆菌、罗非登斯菌、摩根氏菌和沙门氏菌都没有CT值和S型扩增曲线，扩增结果见图1.
选择与变形杆菌相似度不高的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌、副猪嗜血杆菌进行扩增，均无CT值和S型扩增曲线。
表明本发明设计的引物探针具有良好的特异性。
实施例6灵敏度试验。
制作标准曲线法对本发明所提供的方法进行灵敏度检测，采用NanoDrop2000对含有待测片段的质粒进行含量测定，然后对质粒进行等倍稀释(X10)作为反应的模板DNA。采用本发明提供的检测方法和试剂盒对等倍稀释的待测质粒进行PCR，并制作标准曲线(R2≥0.98)(图2、3、4)并判断该检测方法的灵敏度。结果表明本发明提供的检测方法的检测低限为奇异变形杆菌≥446CFU/mL，普通变形杆菌≥508CFU/mL，潘氏变形杆菌≥580CFU/mL。
实施例7对仔猪的粪便样本进行检测
采用商品化的粪便基因组提取试剂盒提取20份仔猪的粪便样本的基因组，分别使用普通PCR法和本发明提供的方法和试剂盒对20份仔猪粪便DNA样本进行检测。结果显示，采用普通PCR方法仅从3份样本中扩增出目的条带；而采用本发明提供的方法从18份样本中鉴定出了变形杆菌属，其中有14份样本既含有奇异变形杆菌又普通变形杆菌，有1份样本含有奇异变形杆菌、普通变形杆菌和潘氏变形杆菌，有2份样本只含有奇异变形杆菌，有1份样本只含有普通变形杆菌。选取4份扩增产物进行纯化和测序(图5、6、7、8)，通过BLAST比对结果显示：2份扩增片段为奇异变形杆菌，1份扩增片段为普通变形杆菌，1份为潘氏变形杆菌，测序结果与实验结果一致。表明本发明提供的检测方法和试剂盒比不同PCR法有更高的灵敏度，同时可以清楚的区分不同的变形杆菌，填补了当前变形杆菌检测中的不足。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆市畜牧科学院
<120> 检测和区分奇异变形杆菌、普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的系统和方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
agtacgattt cccaggtgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tgtcaattgc acgctctggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tcgtgcaggt gagaacgttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
attcgaattt agtgtgtggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gagtttcttg tgatgtgaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
aatcaggaag atgacgagta 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
actccagtaa tccgtggttc agcg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ctgctgcgtg gtactaaacg tgaa 24
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ccgaccaaac cgattgaatt acatacc 27
Claims (3)
1.一种用于检测变形杆菌属及同时区分奇异变形杆菌和普通变形杆菌和潘氏变形杆菌的三重TaqMan Real-Time PCR的系统，其特征在于，所述系统包括：
预测模块，安装有分析所述变形杆菌的引物的核苷酸序列的数据库的计算机；
引物合成模块，用于合成所述预测模块预测的引物序列的设备，检测所述变形杆菌的PCR引物，所述引物序列的核苷酸互补序列组成引物组，探针序列的核苷酸互补序列组成探针组；
PCR扩增模块，用于扩增PCR的PCR仪，将所述引物组、探针组、qPCR Mix和ddH2O按照预定的配制方法配制PCR预反应体系，将待测DNA模板加入预反应体系混合离心后，使用3通道荧光定量PCR仪按照规定扩增程序进行检测，同时根据荧光强度对变形杆菌进行定量；
判断模块，安装有分析数据结果进行判定的提示装置，测定通道为FAM、HEX和Red610，根据通道的CT值来判定变形杆菌；
PCR引物组的引物序列为SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:1- SEQ IDNO:6共同组成该检测方法的引物组，所述引物的核苷酸序列如下所示：
P.penneri：
SEQ ID NO:1 5'-AGTACGATTTCCCAGGTGAT-3，
SEQ ID NO:2 5'-TGTCAATTGCACGCTCTGGC-3'；
P.vulgaris：
SEQ ID NO:3 5'-TCGTGCAGGTGAGAACGTTG-3'，
SEQ ID NO:4 5'-ATTCGAATTTAGTGTGTGGC-3'；
P.mirabilis：
SEQ ID NO:5 5'-GAGTTTCTTGTGATGTGACA-3'，
SEQ ID NO:6 5'-AATCAGGAAGATGACGAGTA-3'；
或PCR引物组的引物序列为上述引物序列的核苷酸互补序列；
PCR探针组的探针序列为SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9共同组成该检测方法的探针组，所述探针的核苷酸序列、荧光基团和淬灭基团如下所示：
P.penneri：
SEQ ID NO:7 5'-Red610-ACTCCAGTAATCCGTGGTTCAGCG-BHQ2-3'；
P.vulgaris：
SEQ ID NO:8 5'- HEX-CTGCTGCGTGGTACTAAACGTGAA-BHQ1-3'；
P.mirabilis：
SEQ ID NO:9 5'-FAM-CCGACCAAACCGATTGAATTACATACC-BHQ1-3'；
或PCR探针组的探针序列为上述探针序列的核苷酸互补序列。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的判断模块，测定通道为FAM、HEX和Red610，FAM通道用于检测奇异变形杆菌，HEX通道用于检测普通变形杆菌，Red610通道用于检测潘氏变形杆菌：
阳性结果的判定：当FAM通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为奇异变形杆菌阳性；当HEX通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为普通变形杆菌阳性；当Red610通道的CT值≤35且扩增曲线为典型的S型，则结果判定为潘氏变形杆菌阳性；
阴性结果的判定：测定FAM、HEX和Red610通道，当无CT值或无典型的S型扩增曲线，则结果判定为阴性。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，可疑结果的判定：测定FAM、HEX和Red610通道，35≤CT值≤40，则结果判定为可疑，需要重复检测一次，如果重测结果仍然为可疑则判定为阳性；如果重测结果无CT值则判断为阴性。
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