WO2022245142A1 - 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트 - Google Patents

장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트 Download PDF

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WO2022245142A1
WO2022245142A1 PCT/KR2022/007157 KR2022007157W WO2022245142A1 WO 2022245142 A1 WO2022245142 A1 WO 2022245142A1 KR 2022007157 W KR2022007157 W KR 2022007157W WO 2022245142 A1 WO2022245142 A1 WO 2022245142A1
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paratyphoid
fever
typhoid
kit
salmonella
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PCT/KR2022/007157
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김윤원
김영진
김대원
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주식회사 이뮨메드
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/56911—Bacteria
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    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a kit for simultaneous differential diagnosis of typhoid and paratyphoid infections containing Salmonella typhi and Salmonella paratyphi specific recombinant antigens, a diagnostic composition, and a method for diagnosing typhoid and paratyphoid using the same.
  • Salmonella is a bacterium that causes important intestinal infections belonging to the Enterobacteriaceae family in terms of bacterial taxonomy. It shows various clinical symptoms.
  • Salmonella pathogens are pets, livestock and wild animals such as poultry, pigs, cattle and dogs, but typhoid bacteria are pathogens only for humans.
  • the typhoid fever is mainly transmitted through contaminated drinking water, food, and fish and shellfish due to pathogens discharged in the feces and urine of patients or carriers.
  • pathogens discharged in the feces and urine of patients or carriers usually, it is contagious because bacteria are excreted in feces or urine during the recovery period from 1 week after onset, and it is not constant after the recovery period. If untreated, about 10% of patients excrete the bacteria by 3 months after onset, and 2-5% become permanent carriers.
  • typhoid infection causes more than 20 million patients worldwide every year, 30% of which die, and 90% of these deaths occur in Asia. It occurs in most countries around the world except for some developed countries such as the United States, Canada, Western Europe, Australia, and Japan, and is particularly prevalent in Asia, Africa, and Latin America.
  • the annual incidence in developing countries is between 150 and 1,000 per 100,000 population, and it mainly occurs between the ages of 4 and 19. In Korea, it is classified as a Group 1 legal infectious disease, and in the late 1960s, an average of more than 4,000 patients occurred annually, showing a fatality rate of about 1.48%. It is believed that the outbreak is continuously occurring throughout the year.
  • it is expected that the number of patients with domestic disease will continue to increase due to various reasons such as increased overseas travel, environmental pollution, and increased resistant strains.
  • a culture test (confirmation when bacteria are cultured in blood, feces, urine, bone marrow, bile, etc.) is most commonly performed.
  • blood culture tests among bacterial culture tests show a positive rate of about 80% in the first week of onset, but decrease to about 50% in the third week, and are affected by antibiotic administration.
  • Stool and urine culture tests show a low positive rate in the early days, but show a positive rate of about 75% by the third week of onset.
  • bone marrow culture shows a high positive rate of about 90%, and pathogens can be proven because bacteria grow in bone marrow culture even if blood culture is negative regardless of whether or not antibiotics are taken.
  • Vi antigen is a capsular antigen, a heat-labile polysaccharide, and only S. Typhi has Vi antigen, but there is a problem in that Vi antigen may be lost during the isolation process or passaging ( Korean Registered Patent No. 10-0578114).
  • typhoid causative bacteria share the same antigen as other Salmonella serotypes and share antigenic determinants that cross-react with other Enterobacteriaceae bacteria, so false positives may occur due to cross-reactions. It is of poor diagnostic value.
  • kits for diagnosing typhoid fever has been reported, but a kit for simultaneously diagnosing and discriminating typhoid fever and paratyphoid fever has not been reported.
  • the present invention is significant in that it provides a typhoid fever and paratyphoid diagnosis kit with higher specificity than previous kits, and also provides a simultaneous differential diagnosis kit for typhoid fever and paratyphoid fever for the first time.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a rapid diagnosis of typhoid and paratyphoid infections within minutes and a diagnostic method with improved sensitivity and specificity. As a result, typhoid and paratyphoid can be simultaneously distinguished and rapidly diagnosed, The present invention was completed by confirming that infection by the bacteria can be quickly diagnosed by improving sensitivity and specificity compared to the kit of.
  • the inventors of the present invention provide a kit for simultaneous differential diagnosis of typhoid and paratyphoid infection including Salmonella typhi and Salmonella paratyphi specific recombinant antigens capable of simultaneously diagnosing the presence or absence of typhoid and paratyphoid infection, a diagnostic composition, and a method for diagnosing typhoid and paratyphoid using the same developed and completed this application.
  • One object of the present invention is to provide a kit for simultaneous differential diagnosis of typhoid fever and paratyphoid infection, including antigens of Salmonella typhi and Salmonella paratyphi.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for simultaneous differential diagnosis of typhoid fever and paratyphoid infection, comprising the antigen.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing typhoid fever and paratyphoid infection using the kit.
  • Another object of the present invention is to simultaneously treat typhoid fever and paratyphoid infection with Salmonella Typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen, Salmonella Paratyphi A serotype-specific FliC-a recombinant antigen, and Salmonella common antigen. It is to provide a use for preparing a composition for differential diagnosis.
  • a simultaneous differential diagnosis kit for typhoid fever and paratyphoid fever including the Salmonella Typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen, the Salmonella Paratyphi A serotype-specific FliC-a recombinant antigen, and the Salmonella common antigen of the present invention
  • Salmonella Typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen including the Salmonella Typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen, the Salmonella Paratyphi A serotype-specific FliC-a recombinant antigen, and the Salmonella common antigen of the present invention
  • 1 is a schematic diagram of the pBHA plasmid.
  • Figure 2 is a schematic diagram of pET32a plasmid.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a recombinant gene cloning step.
  • Figure 4 is a schematic diagram confirming the protein expression and purification of typhoid and paratyphoid recombinant antigens.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a kit capable of simultaneously differentially diagnosing typhoid fever and paratyphoid infection.
  • Figure 6 is a schematic diagram showing a positive result reading method for typhoid fever and paratyphoid fever of the kit of the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph confirming the antigenicity of the recombinant protein of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of comparing the sensitivity of the kit into which the recombinant protein of the present invention was introduced and the kit into which the extraction antigen was introduced.
  • FIG. 9 is a photograph showing the sensitivity of the kit of the present invention to typhoid fever-positive specimens.
  • FIG. 10 is a photograph showing the sensitivity of the kit of the present invention to paratyphoid-positive specimens.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of simultaneous diagnosis on specimens co-infected with typhoid fever and paratyphoid fever of the kit of the present invention.
  • FIG. 12 is a photograph showing the specificity of the kit of the present invention for typhoid or paratyphoid negative specimens.
  • the present invention provides Salmonella Typhi serotype specific OMPX recombinant antigen, Salmonella Paratyphi A serotype specific FliC-a recombinant antigen and Salmonella common antigen
  • Salmonella Typhi serotype specific OMPX recombinant antigen Salmonella Paratyphi
  • Salmonella Paratyphi A serotype specific FliC-a recombinant antigen
  • Salmonella common antigen A kit for simultaneous differential diagnosis of typhoid and paratyphoid fever is provided.
  • typhoid fever used in the present invention is an acute infectious disease of the digestive system caused by infection with Salmonella typhi and is classified as a first-class statutory infectious disease. Typhoid is a disease with symptoms throughout the body, such as fever and abdominal pain. Salmonella typhi is transmitted through the oral cavity by ingestion of contaminated food and water. Bacteria reach the small intestine, invade and proliferate in the intestinal wall and mesenteric lymph nodes, enter the bloodstream from the lymphatic vessels through the chest duct, and are transported to tissues such as the liver, spleen, and bone marrow, causing systemic infections.
  • Gastrointestinal symptoms such as abdominal pain, vomiting, diarrhea or constipation usually appear, and it is a systemic disease accompanied by various symptoms such as fever.
  • Typhoid can be diagnosed when Salmonella typhi is detected in a patient's blood, feces, urine, or bone marrow specimens.
  • Bacterial culture test is the most basic, and bacteria can be isolated from blood in the early stage of infection, and bacteria appear in urine or feces one week after infection.
  • Salmonella typhi used in the present invention is a gram-negative bacillus that has flagellum and exhibits motility. It is aerobic or facultative anaerobic and grows well on an agar medium at 37°C. Salmonella typhi invades orally and after an incubation period of 10 to 14 days, it causes typhoid fever and is highly toxic.
  • OMPX used in the present invention refers to the outer membrane proteins (OMPs) X of Salmonella typhi, and the OMP antigen has a common antigen for each serotype and is recognized as important for Salmonella immunity, cellular immunity and body fluids. It is recognized as an immune substance that simultaneously activates sexual immunity.
  • Salmonella typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • Paratyphoid fever used in the present invention is an infectious disease caused by infection with Salmonella Paratyphi and manifested in the form of systemic infection or gastroenteritis. It has symptoms similar to typhoid fever, but the severity and course of symptoms are milder and the mortality rate is much lower. Paratyphoid is a disease with symptoms throughout the body, such as fever and abdominal pain, and is transmitted through the oral cavity by ingestion of food or water contaminated with Salmonella paratyphi. Gastrointestinal symptoms such as abdominal pain, vomiting, diarrhea or constipation usually appear, and it is a systemic disease accompanied by various symptoms such as fever. Paratyphoid can be diagnosed when Salmonella paratyphi is detected in a patient's blood, feces, urine, bone marrow, etc. specimens.
  • Salmonella Paratyphi used in the present invention is a bacterium that causes Paratyphoid fever.
  • FliC is a flagellar antigen (H-antigen) protein
  • FliC-a is a flagellar antigen derived from Salmonella paratype A.
  • Most Salmonella bacteria have a FliC gene encoding phase 1 flagella and a fliB gene encoding phase 2 flagella, which are regulated and expressed by Hin recombinase.
  • the Salmonella paratype A serotype-specific FliC-a recombinant antigen may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • Salmonella refers to typhoid bacteria (Salmonella Typhi; S. Typhi) and other Salmonella bacteria ( S. Paratyphi, S. Typhimurium, S. Enteritidis etc.), Salmonella, a pathogen, is a gram-negative rod bacterium. Numerous serotypes belonging to the Salmonella genus act as pathogens in humans and animals. However, unlike other Salmonella, typhoid fever only infects humans and shows symptoms.
  • antigen of the present invention is a substance that causes an immune response to produce, in particular, an antibody, and is generally regarded as a foreign substance in living organisms.
  • Antigens are mainly proteins as pathogens or viruses, but various things such as polysaccharides, artificially synthesized substances, adherents, and mutant cells (cancer cells) in one's own body can also be antigens.
  • the recombinant antigen for each Salmonella serotype of the present invention may include various proteins constituting bacteria, and specifically, membrane (M) protein, envelope (E) protein, non-structure (NS) protein, etc. It may be included, and more specifically, the Salmonella serotype-specific recombinant antigen of the present invention may be outer membrane proteins (OMPs) or structural proteins, but is not limited thereto.
  • M membrane
  • E envelope
  • NS non-structure
  • OMPs outer membrane proteins
  • structural proteins but is not limited thereto.
  • protein of the present invention has the same meaning as “peptide” and “polypeptide” and may be used interchangeably without limitation.
  • the peptide refers to a polymer composed of amino acids linked by amide bonds (or peptide bonds).
  • the method for producing the peptide is not particularly limited thereto, but is preferably prepared using genetic recombination and a protein expression system, in vitro synthesis through chemical synthesis such as peptide synthesis, cell-free protein synthesis, and automated peptides. It can be prepared by various methods well known in the art, such as a method using a synthesizer.
  • the "recombinant antigen" of the present invention may be chemically synthesized or produced in a microorganism or eukaryotic cell using a genetic recombination method, but the preparation method is not necessarily limited thereto.
  • a vector for using the genetic recombination method it is preferable to use a transfer vector capable of expressing a recombinant antigen without being infective to humans and animals.
  • vector refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to express the target polypeptide in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an arbitrary operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can integrate into the genome itself.
  • the vector is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pBR-based, pUC-based, and pBluescriptII-based plasmid vectors , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, etc. can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for chromosomal insertion into a cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for determining whether the chromosome is inserted may be further included. Selectable markers are used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and to give selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • Salmonella common antigen refers to a phage integrase protein commonly included in Salmonella bacteria.
  • the Salmonella common antigen may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • Salmonella typhoid and paratyphoid recombinant antigens may include serum albumin protein.
  • the linker is not particularly limited thereto as long as it exhibits the activity of the fusion protein, but is specifically glycine, alanine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, lysine, It can be linked using amino acids such as arginic acid, and more specifically, it can be linked using several valine, leucine, aspartic acid, glycine, alanine, proline, etc., and more specifically, considering the ease of genetic manipulation. Thus, 1 to 20 amino acids such as glycine, valine, leucine, and aspartic acid may be connected and used.
  • the recombinant antigen may include a polypeptide having a sequence different from the wild-type amino acid sequence of each domain included therein by at least one amino acid residue.
  • Amino acid exchanges in proteins and polypeptides that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art. The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ Exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • proteins with increased structural stability to heat, pH, etc. or increased protein activity may be included due to mutation or modification in the amino acid sequence.
  • the recombinant antigen or a polypeptide constituting the recombinant antigen is prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or a gene encoding the recombinant antigen is amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method. It can then be cloned into an expression vector and expressed.
  • a kit for simultaneous differential diagnosis of typhoid fever and paratyphoid fever, including typhoid and paratyphoid antigens, with excellent specificity was developed.
  • the Salmonella typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen of the kit may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the Salmonella paratyphi A serotype-specific FliC-a recombinant antigen of SEQ ID NO: 2 It may be encoded by a nucleotide sequence, and the Salmonella common antigen may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the antigen may be isolated from a cell, but is not limited thereto.
  • the antigen may be expressed from a polynucleotide encoding the antigen.
  • polynucleotide of the present invention is a polymeric material to which nucleotides are bound, and refers to DNA encoding genetic information.
  • the polynucleotide sequence encoding the recombinant antigen can be easily derived from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 by those skilled in the art, and specifically, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 It may be, but is not limited thereto.
  • nucleotide sequence encoding the recombinant antigen in the present invention is not only the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically, the sequence.
  • nucleotide sequence exhibiting 98% or more, and most specifically, 99% or more homology any nucleotide sequence that encodes a protein exhibiting substantially the same or corresponding efficacy as each of the above proteins is included without limitation.
  • homology refers to the degree of similarity of nucleotide sequences or amino acid sequences encoding proteins. When the homology is sufficiently high, the expression product of the corresponding gene may have the same or similar activity. In addition, homology can be expressed as a percentage according to the degree of matching with a given amino acid sequence or nucleotide sequence. As used herein, a homologous sequence having the same or similar activity as a given amino acid sequence or nucleotide sequence is indicated by "% homology". For example, hybridization using standard software, specifically BLAST 2.0, that calculates parameters such as score, identity and similarity, or under defined stringent conditions.
  • the recombinant antigen of the present invention contains at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92% of the amino acid sequence of SEQ ID NO. , 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, may include a polynucleotide encoding a protein exhibiting 99% or more homology.
  • polynucleotides encoding the proteins are within a range that does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region in consideration of codons preferred in organisms to express the protein due to codon degeneracy.
  • the polynucleotide may be included without limitation as long as it is a polynucleotide sequence encoding each protein.
  • hybridization under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known sequence for example, a complementary sequence to all or part of the polynucleotide sequence, to encode the conjugate, fusion protein, or protein having drug activity Any sequence can be included without limitation.
  • stringent conditions means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., ibid.). For example, genes with high homology, 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more homology 60 °C 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60 °C 0.1XSSC, 0.1% SDS, which is a condition for hybridization with each other and no hybridization with genes with lower homology, or washing conditions for normal Southern hybridization, more specifically As examples, conditions for washing once, specifically 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C. 0.1XSSC, 0.1% SDS can be listed.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, parameters well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • the simultaneous differential diagnosis kit for typhoid fever and paratyphoid fever of the present invention may be used to diagnose typhoid fever or paratyphoid infection, and specifically, may simultaneously detect specific IgM and IgG of the bacteria, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit of the present invention may be characterized by detecting both IgM antibodies and IgG antibodies of the bacteria.
  • immunoglobulins also called an antibody, is a substance that specifically binds to an antigen to cause an antigen-antibody reaction.
  • immunoglobulins that specifically bind to external antigens such as bacteria or viruses in the immune system to recognize and neutralize antigens are called immune antibodies.
  • the immunoglobulin is generally classified into five types (IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE).
  • the IgM of the present invention is an antibody initially produced during an immune response, and is in the form of a combination of five Y branches.
  • IgG is an antibody mainly responsible for the immune response, and is produced by changing IgM to IgG as the immune response progresses.
  • the IgM may be used as an indicator for determining whether a primary infection or current infection is related to the initial immune response, and IgG may be used as an indicator for determining whether a secondary infection or past infection is present.
  • diagnosis means to confirm a pathological state. Specifically, for the purpose of the present invention, diagnosis is to determine whether typhoid and paratyphoid are infected with a disease caused by typhoid and paratyphoid by confirming the presence or absence of a specific antigen-antibody reaction.
  • diagnosis may be used synonymously with “detection”.
  • kit is used as a means for confirming the presence or absence of the antibody (Bacillus typhoid and paratyphoid) contained in the sample.
  • the kit of the present invention has three reaction lines (Test lines), the Salmonella common antigen is immobilized in the first reaction line, the Salmonella typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen is immobilized in the second reaction line, and the third reaction line A Salmonella paratypic A serotype-specific FliC-a recombinant antigen can be fixed, and more specifically, when the reaction occurs in the first and second reaction lines, it can be diagnosed that the sample is infected with typhoid fever, When reactions occur in the first and third reaction lines, it can be diagnosed that the sample is infected with Paratyphoid fever.
  • the kit includes a strip for detecting IgM antibodies against typhoid fever and paratyphoid fever, and a strip for detecting IgG antibodies against typhoid fever fever and paratyphoid fever, and can detect both IgM antibodies and IgG antibodies against typhoid fever and paratyphoid fever, In this case, it is possible to clearly identify which serotype of Salmonella the subject was diagnosed as primary or secondary infection, as well as which serotype of Salmonella he was infected with in the past or present.
  • the typhoid and paratyphoid co-infection diagnosis kit of the present invention includes: (a) a sample pad for absorbing samples; (b) a gold conjugation pad that binds to human antibodies in the sample; (c) Nitrocellulose membrane (NC membrane; membrane) treated with a test line containing Salmonella typhi or Salmonella paratyphi antigen and a control line containing control protein. ; and (d) a test strip including an absorption pad on which a remaining amount of the sample is absorbed.
  • a preferred kit for simultaneous differential diagnosis of typhoid fever and paratyphoid fever of the present invention includes a test strip including a sample pad, a gold binding pad, a membrane, and an absorbent pad.
  • the sample pad is overlaid on the gold bond pad to form a first overlapping portion
  • the gold bond pad is overlaid on the membrane to form a second overlapping portion.
  • the membrane and the absorbent pad form a third overlapping portion.
  • the sample is deposited on the gold bonding pad by capillary action, for example, a gold-labeled goat anti-human IgM antibody or a gold-labeled goat anti-human IgG antibody ( gold-labeled goat anti-human IgG antibody) and the like.
  • the gold particles forming the gold-label preferably have a diameter size of 20 to 55 nm, more preferably 20 to 40 nm, and act as an indicator dye.
  • the antibody in the sample binds to gold-labeled goat anti-human IgM antibody to form a complex, and the complex moves along the membrane.
  • sample of the present invention refers to a material derived from an individual infected with typhoid fever or paratyphoid fever and having the disease or possibly developing the disease, specifically blood, whole blood, serum, plasma, lymph, urine, It may be feces, tissues, cells, organs, bone marrow, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or a combination thereof, and more specifically, serum, plasma, or whole blood, but the subject's IgM and IgG may be obtained, and typhoid or paratyphoid specific As long as IgM and IgG expression can be confirmed, the type is not limited thereto.
  • the sample may be diluted before being applied to the sample pad of the diagnostic kit of the present invention or may be used without dilution.
  • a typhoid or paratyphoid-specific antibody for each serotype in the sample it binds to the typhoid or paratyphoid antigen in the diagnostic kit of the present invention, and a color change occurs in the reaction line on the membrane so that it can be visually identified.
  • typhoid or paratyphoid specific antibody for each serotype in the sample it does not bind to the antigen of the present invention and no change occurs in the reaction line on the membrane.
  • a typhoid or paratyphoid specific antibody binds to a serotype-specific typhoid or paratyphoid antigen immobilized on a reaction line on a membrane.
  • the antibody of the sample and the gold label (goat anti-human IgM, etc.) and the antigen on the membrane form a complex to show a reddish-purple band, and accordingly, antibodies to typhoid or paratyphoid by serotype are present in the sample. will give a positive reaction.
  • a positive reaction result for typhoid fever or paratyphoid infection is a case where a reaction line containing an antigen having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3 develops color in addition to the control line.
  • the control line is for confirming the presence or absence of abnormalities in the diagnostic kit.
  • a negative result for typhoid fever or paratyphoid infection is a case where only the control line develops color.
  • the control line contains a control protein that binds to the gold-label, for example a rabbit anti-goat IgG polyclonal antibody, a goat anti-human IgG polyclonal antibody, a rabbit anti-human IgM polyclonal antibody or a goat anti-goat IgG polyclonal antibody.
  • Human IgM polyclonal antibodies and the like may be included, and these control proteins may be included at a concentration of 0.1 mg/ml to 2.0 mg/ml.
  • the reaction line includes typhoid or paratyphoid antigens having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, and these antigen proteins are included in the reaction line at a concentration of 0.5 to 2.0 mg/ml.
  • the gold bonding pad may contain a suitable marker, for example dried colloidal gold labeled portein A, a gold-labeled anti-human IgG antibody or gold-labeled protein as a marker. may include a gold-labeled anti-human IgM antibody, etc., and may be preferably located adjacent to the sample pad. If the gold-labeled marker is included in the gold binding pad in excess, the antibody to typhoid or paratyphoid to be analyzed may increase to a non-specific signal even in a relatively low region, resulting in a false positive result.
  • the gold-colloid stock solution It may be diluted to have an optical density (OD) of 1 to 6, preferably an absorbance of 2 to 4.
  • the absorption pad is positioned at the opposite end of the membrane and absorbs a biological sample, such as serum or plasma, that has moved along the membrane by capillary action.
  • the term "individual" of the present invention may mean all animals, including humans, who have or are likely to develop typhoid fever or paratyphoid infection or a disease thereof.
  • the animal may be not only humans but also mammals such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, and cats that require treatment for similar symptoms, but are not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention is a Salmonella Typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen, a Salmonella Paratyphi A serotype-specific FliC-a recombinant antigen and a Salmonella common antigen, including typhoid fever and Provided is a composition for simultaneous differential diagnosis of paratyphoid fever.
  • composition of the present invention may include any one or more of the above antigens.
  • Another aspect of the present invention provides an information providing method for diagnosing typhoid fever and paratyphoid fever, comprising the step of detecting an antibody in a sample isolated from an individual using the kit of the present invention.
  • kit "subject”, “sample”, “detection”, “typhoid”, “paratyphoid” and “diagnosis” are as defined above.
  • a sample for example, serum
  • a sample pad which is an area where the sample of the diagnostic kit is absorbed.
  • the sample Upon spotting, the sample reaches a gold conjugation pad by capillary action, and antibodies in the sample are transferred to a marker in the gold conjugation pad, such as gold-labeled protein A, gold-labeled antibody. It binds to a gold-labeled anti-human IgG antibody and a gold-labeled anti-human IgM antibody to form a colloid.
  • the sample to be detected is not immobilized on the gold binding pad and continues to move to reach a test line where typhoid or paratyphoid antigens for each serotype are immobilized.
  • an antigen-antibody reaction with the serotype-specific antigen occurs, that is, an antibody bound to a specific marker in the patient's gold binding pad binds to the typhoid fever or paratyphoid antigen immobilized on the reaction line, resulting in red By forming a purple band, it can be observed with the naked eye.
  • the remaining markers in the gold binding pad that do not react with the antibody in the sample reach the control line and react with the control protein to form a reddish-purple band, indicating the suitability of the test.
  • the reaction when the reaction occurs in the first reaction line and the second reaction line of the kit of the present invention, it is diagnosed that the sample is infected with typhoid fever, and the first reaction line and the third reaction line If a reaction occurs in the gland, the sample may be diagnosed as being infected with paratyphoid fever.
  • Another object of the present invention is to simultaneously treat typhoid fever and paratyphoid infection with Salmonella Typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen, Salmonella Paratyphi A serotype-specific FliC-a recombinant antigen, and Salmonella common antigen.
  • a use for preparing a composition for differential diagnosis is provided.
  • kits for simultaneously distinguishing and diagnosing typhoid fever and paratyphoid fever antigens that can be included in the kit were selected.
  • OMPX OMPX
  • FliC-a H-1a
  • phage integrase protein a structural protein of flagellin of Salmonella Paratyphi A
  • phage integrase protein commonly included in Salmonella bacteria were selected as antigens.
  • the Salmonella typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the Salmonella paratype A serotype-specific FliC-a recombinant antigen has SEQ ID NO: 2
  • the Salmonella common antigen has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • pET32a vector As a protein expression vector, pET32a vector (FIG. 2) in which Trx (Thioredoxin) and 6 histidines were fused was used.
  • Trx Thioredoxin
  • the three recombinant genes and pET32a plasmid DNA synthesized in Example 2-1 were purified using Gene all's plasmid rapid prep kit (Hybrid-Q plasmid rapidprep), and Takara's EcoRI, XhoI restriction enzymes and reaction buffer into the cleavage reaction at 37 ° C. for 3 hours.
  • the three genes and the expression vector pET32a were subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and compared with the DNA size markers, OMPX was 525 bp, FliC-a was 1509 bp, integrase was 774 bp, pET32a After excising the gene product at 5900 bp of the vector, pure DNA was isolated using MP bio's Gel extraction kit.
  • DNA quantification was performed on the three kinds of recombinant genes and the pET32a vector that had been purified, and the recombinant gene and vector DNA were reacted at 25 ° C. for more than 2 hours using NEB T4 ligase at a 5: 1 molar ratio. .
  • E.coli BL21
  • LB plate medium containing the antibiotic ampicillin
  • cultured for 16 hours in an incubator at 37°C The resulting single colony was grown in LB liquid medium to isolate pure plasmid DNA.
  • the three kinds of pure recombinant DNAs were digested again with EcoRI and XhoI restriction enzymes, and finally it was confirmed that the pET32a vector and the three kinds of DNAs were separated (FIG. 3).
  • BL21 cells containing the recombinant DNA identified in Example 2-2 were cultured in LB liquid medium containing ampicillin for 12 hours. After incubation, the culture medium was centrifuged at 4°C and 6000 RPM for 20 minutes. After discarding the supernatant, the pellet was suspended in 1xPBS, and the cells were disrupted (sonication). Thereafter, the lysate was centrifuged at 4°C (14000 RPM, 15 minutes), and the supernatant was used as a soluble protein sample and the pellet as an insoluble protein sample.
  • IgM gold pad buffer was dispensed so that it could be evenly absorbed to prepare an IgM gold pad.
  • IgG gold pad was also prepared through the same method as the IgG gold pad buffer. The prepared gold pad was dried for 24 hours.
  • drip materials were prepared.
  • IgM/IgG strip T- line 1 (Phage integrase protein)
  • IgM/IgG strip T - line 3 (FliC-a protein)
  • the control line mixture solution on line 1, the IgM test line mixture solution on line 2, the IgM test line solution on line 3, and the IgM test line solution on line 4 of the membrane-attached support card using a dispenser. After dripping the IgG test line mixture solution at 4, it was dried for 48 hours. After drying, the prepared gold pad was attached to the bottom of the membrane with an overlap of 1 to 2 mm, a sample pad was attached to the bottom of the support card, and an absorption pad was attached to the top of the membrane with an overlap of 1 to 1.5 mm.
  • a strip was manufactured by cutting the uncut sheet to 4 mm using a rotary slitter, and then a kit was manufactured through an assembly conveyor (pressing machine).
  • the Salmonella common antigen was fixed to the first reaction line
  • the Salmonella typhi serotype-specific OMPX recombinant antigen was fixed to the second reaction line
  • the third reaction A Salmonella paratype A serotype-specific FliC-a recombinant antigen was immobilized on the line (FIG. 5).
  • a kit capable of distinguishing between typhoid fever and paratyphoid fever and simultaneously differential diagnosis was prepared.
  • Sensitivity was confirmed when the recombinant antigen used in the kit of the present invention was introduced in comparison with the kit in which antigens extracted from typhoid and paratyphoid were introduced. More specifically, 300 ⁇ l of sample diluent was added to positive samples of confirmed typhoid and paratyphoid patients collected from overseas (Bangladesh), and 10 positive samples were converted into kits into which recombinant antigens were introduced and antigens extracted from typhoid and paratyphoid bacteria were introduced. The kit was reacted for 15 minutes.
  • a positive sample was diluted in a sample diluent and a qualitative diagnostic test was performed.
  • kit of the present invention had a higher typhoid positive reaction than kits of the same principle sold on the market.
  • the kit of the present invention has high sensitivity to paratyphoid positive reaction.
  • the kit of the present invention can diagnose simultaneous infection of typhoid fever and paratyphoid fever.
  • a qualitative diagnostic test was performed by diluting a negative sample in a sample diluent.
  • the kit of the present invention did not react to negative samples and showed a positive reaction to positive samples with high probability.

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Abstract

본 발명은 장티푸스 및 파라티푸스 항원을 포함하는 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단 키트, 진단용 조성물 및 이를 이용한 장티푸스 및 파라티푸스 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단 키트를 이용하면 보다 정확하게 장티푸스 및 파라티푸스의 감염 유무를 동시에 구분하며 진단할 수 있다.

Description

장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트
본 발명은 살모넬라 타이피 및 살모넬라 파라타이피 특이 재조합 항원을 포함하는 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단 키트, 진단용 조성물 및 이를 이용한 장티푸스 및 파라티푸스 진단 방법에 관한 것이다.
살모넬라는 세균 분류학상 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 중요한 장내 감염을 일으키는 세균으로서, 살모넬라 감염증의 임상 증상은 국소감염, 위장관염, 장염, 균혈증, 만성보균상태 등 경한 장내 감염으로부터 심한 질환에 이르기까지 다양한 임상 증상을 보인다.
대부분의 살모넬라균은 가금류, 돼지, 소, 개 등의 애완동물, 가축 및 야생동물 모두를 병원소로 하지만 장티푸스균은 오직 사람만을 병원소로 한다.
상기 장티푸스는 주로 환자나 보균자의 대·소변으로 배출된 병원체로 인하여 오염된 식수와 음식물, 어패류를 통해서 전염된다. 보통 발병 1주 후부터 회복기에 대변이나 소변으로 균을 배출하므로 전염가능하며, 회복기 이후부터는 일정하지 않다. 치료하지 않는 경우 약 10%의 환자는 발병 후 3개월까지 균을 배출하고 2~5%는 영구보균자가 된다. 체내로 균이 들어온 후 소장의 점막 상피를 침투하면, 대식 세포에 의해 탐식되고 균혈증을 유발시키는데, 장티푸스균의 병원소는 오직 사람이며 만성보균자가 될 수 있기 때문에, 장티푸스 보균자의 색출과 환자 관리를 잘하면 장티푸스 감염을 효과적으로 예방할 수 있다.
환자의 치료가 적절히 이루어지지 않을 경우 약 10%의 환자는 발병 후 3개월까지 균을 배출하기 때문에, 장티푸스 보균자의 진단이 정확히 이루어지고 적절한 대처가 이루어져야 해당 보균자로부터 지속적으로 확산을 막을 수 있다.
세계보건기구(WHO)에 의하면 장티푸스 감염으로 인해 전세계적으로 매년 약 2,000만 명 이상의 환자가 발생하고 이 중 30%가 사망에 이르며 이들 사망의 90%는 아시아 지역에서 발생하고 있다. 미국, 캐나다, 서부 유럽, 호주, 일본 등의 일부 선진국을 제외한 전세계 대부분의 국가에서 발생하며, 특히 아시아, 아프리카, 라틴아메리카에서 발병하고 있는 실정이다. 개발도상국의 연간 발생률은 인구 10만 명당 150~1,000명 수준이며, 4~19세에 주로 발병하는 특성을 보인다. 국내에서는 제 1군 법정감염병으로 분류되어 1960년도 후반에 연평균 4,000명 이상의 환자가 발생하여 약 1.48%의 치명률을 보였으며, 현재도 매년 200명 내외로 미신고 사례를 감안할 때 인구 10만 명당 1명 이상으로 연중 지속적으로 발병하고 있는 것으로 파악된다. 또한, 해외여행의 증가 및 환경오염, 내성 균주의 증가 등 다양한 원인으로 국내의 발병환자는 계속 증가할 것으로 예상된다.
정확한 진단을 위해서는 배양검사(혈액, 대변, 소변, 골수, 담즙 등에서 균이 배양되면 확진)가 가장 일반적으로 이루어진다. 그러나 세균배양 검사 중 혈액 배양검사에서는 발병 첫째 주에는 80% 정도의 양성률을 보이지만, 셋째 주에는 50% 정도로 감소하며 항생제 투여에 의한 영향을 받는다. 대·소변 배양 검사는 초기에는 양성률이 낮으나 발병 셋째 주에 75% 정도의 양성률을 보인다. 또한, 골수 배양은 약 90%의 높은 양성률을 나타내며, 항생제 복용 여부와 관계없이 혈액배양에서 음성이라도 골수배양에서 균이 자라므로 병원균을 증명할 수 있다. 그러나, 배양검사를 통한 장티푸스의 확인진단은 균 분리가 가장 중요하나 시간적인 소모와 잦은 항생제의 사용으로 인하여 균양성률의 감소가 나타나고 있으며, 혈청형확인을 위한 O & H 항원의 확인까지는 수일에서 수주의 시간이 소요되기 때문에 신속한 진단이 어렵다는 문제점이 있다.
한편 1987년 국내에서 보고된 자료에 따르면 장티푸스 균의 항체 진단 시 Vi 항원에 대한 항체 진단이 효율적이며 감염 초기에도 Vi에 대한 항체 검출이 가능함을 확인하였고, Vi 항원을 이용한 항체 진단법에는 Vi-수동혈구응집법(Vi-Passive hemagglutination assay, Vi-PHA), 간접면역형광항체법(indirect fluorescent antibody test, IFAT), 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 등이 있다. Vi-indirect fluorescent antibody test (Vi-IFAT ≥ 1:64) 혈청학적 검사는 급성감염과 만성 보균상태의 감별에 도움이 되는데 보균자에서는 Vi 항체가 증가될 수 있다. 그러나 Vi항원은 열민감 다당(heat-labile polysaccharide)인 피막항원(capsular antigen)으로, Vi항원을 가지고 있는 균은 S. Typhi 뿐이나 분리 과정 혹은 계대 중에 Vi항원이 손실될 수 있는 문제점이 있다(한국등록특허 10-0578114).
또한, 혈청학적 검사 시 장티푸스 원인균은 다른 살모넬라 혈청형과 같은 항원을 공유하고 있으며, 다른 장내세균과(Enterobacteriaceae) 세균과 교차반응을 하는 항원결정인자를 공유하고 있어서, 교차반응으로 인한 위양성이 발생할 수 있어서 진단적 가치가 떨어진다.
이로 인해, 기존의 진단법의 한계인 감염 초기에 효과적으로 진단할 수 있는 검사법의 개발이 필요한 실정이다.
이와 관련하여 장티푸스의 진단 키트에 대하여는 보고된 바 있으나, 상기 장티푸스 및 파라티푸스를 동시에 진단하며 감별하는 키트에 대하여는 보고된 바가 없다.
따라서, 본 발명은 이전의 키트보다 특이도가 뛰어난 장티푸스 및 파라티푸스 진단 키트를 제공하며, 또한 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트를 최초로 제공한다는 것에 이의 의의가 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 수 분 이내에 장티푸스 및 파라티푸스 균 감염의 신속 진단 및 민감도와 특이도가 향상된 진단 방법을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 장티푸스 및 파라티푸스를 동시에 구분하여 신속히 진단 할 수 있으며, 기존의 키트보다 민감도 및 특이도를 향상시켜, 상기 균에 의한 감염을 빠르게 진단할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 장티푸스 및 파라티푸스의 감염 유무를 동시에 진단할 수 있는, 살모넬라 타이피 및 살모넬라 파라타이피 특이 재조합 항원을 포함하는 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단 키트, 진단용 조성물 및 이를 이용한 장티푸스 및 파라티푸스 진단 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 살모넬라 타이피 및 살모넬라 파라타이피의 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여, 장티푸스 및 파라티푸스 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원의 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단용 조성물 제조 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트를 이용하면 두 질병을 구분 하면서도 보다 정확하게 장티푸스 및 파라티푸스의 감염 유무를 동시에 진단할 수 있다.
도 1은 pBHA 플라스미드의 모식도이다.
도 2는 pET32a 플라스미드의 모식도이다.
도 3은 재조합 유전자 클로닝 단계를 나타낸 모식도이다.
도 4는 장티푸스 및 파라티푸스 재조합 항원의 단백질 발현 및 정제를 확인한 모식도이다.
도 5는 장티푸스 및 파라티푸스 감염을 동시에 감별진단할 수 있는 키트의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 키트의 장티푸스 및 파라티푸스의 양성 결과 판독 방법을 나타내는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 재조합 단백질의 항원성을 확인한 사진이다.
도 8은 본 발명의 재조합 단백질이 도입된 키트의 민감성을 추출 항원이 도입된 키트와 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 본 발명의 키트의 장티푸스 양성 검체에 대한 민감성을 나타내는 사진이다.
도 10은 본 발명의 키트의 파라티푸스 양성 검체에 대한 민감성을 나타내는 사진이다.
도 11은 본 발명의 키트의 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감염 검체에 대한 동시 진단 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 본 발명의 키트의 장티푸스 또는 파라티푸스 음성 검체에 대한 특이성을 나타내는 사진이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "장티푸스(typhoid fever)"는 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)에 감염되어 발생하는 소화기 계통의 급성전염병이며 제1종법정전염병으로 분류되어 있다. 장티푸스는 발열과 복통 등의 신체 전반에 걸친 증상이 나타나는 질환으로 살모넬라 타이피는 오염된 식품, 물 등의 섭취에 의해 구강을 통해 체내에 감염된다. 균은 소장에 도달하여 장벽 및 장관막 림프절에 침입하여 증식하고 림프관에서 흉관을 거쳐 혈류로 들어가 간, 비장, 골수 등의 조직에 운반되어 전신감염증을 일으킨다. 보통 복통, 구토, 설사 또는 변비 등 위장관계 증상이 나타나며 발열 등의 다양한 증상을 동반하는 전신 질환이다. 환자의 혈액, 대변, 소변, 골수 등의 검체에서 살모넬라 타이피가 검출되면 장티푸스로 진단할 수 있다. 세균배양검사가 가장 기본이며 감염 초기에는 혈액에서 균이 분리될 수 있으며 감염 1주일 후에는 소변이나 대변에서 균이 나타난다.
본 발명에서 사용되는 용어 "살모넬라 타이피(Salmonella typhi)"는 그람음성의 간균으로 주모성의 편모를 가지고 운동성을 나타내는 장내세균이다. 호기성 또는 통성혐기성으로 37℃에서 보통 한천배지에 잘 발육한다. 살모넬라 타이피는 경구적으로 침입하고 10 ~ 14일 정도의 잠복기를 거처 장티푸스(typhoid fever)를 일으키며 독력이 강하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "OMPX"는 살모넬라 타이피의 세포외막단백질(outer membrane proteins, OMPs) X로서, OMP 항원은 혈청형별로 공통되는 항원을 가지면서 살모넬라 면역에 중요하게 인식되는 세포성 면역과 체액성 면역을 동시에 활성화시키는 면역물질로 인식되고 있다.
상기 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원은 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "파라티푸스(Paratyphoid fever)"는 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi)에 감염되어 발생하며 전신의 감염증 또는 위장염의 형태로 나타나는 감염성 질환이다. 장티푸스와 유사한 증상을 나타내지만 증상의 강도나 경과가 더 가볍고 사망률도 훨씬 낮다. 파라티푸스는 발열과 복통 등의 신체 전반에 걸친 증상이 나타나는 질환으로 살모넬라 파라타이피로 오염된 식품, 물 등의 섭취에 의해 구강을 통해 체내에 감염된다. 보통 복통, 구토, 설사 또는 변비 등 위장관계 증상이 나타나며 발열 등의 다양한 증상을 동반하는 전신 질환이다. 환자의 혈액, 대변, 소변, 골수 등의 검체에서 살모넬라 파라타이피가 검출되면 파라티푸스로 진단할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi)"는 상기 파라티푸스를 일으키는 균이다.
본 발명의 용어 "FliC" 는 편모항원(H-antigen) 단백질로서, "FliC-a"는 살모넬라 파라타이피 A 유래의 편모항원이다. 살모넬라균은 대부분 phase 1 편모를 암호화하는 FliC 유전자와 phase 2 편모를 암호화하는 fliB 유전자를 가지고 있으며, Hin 재조합 효소에 의하여 조절 발현 된다.
상기 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원은 서열번호 2의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "살모넬라"는 장티푸스균(Salmonella Typhi; S. Typhi)과 기타 살모넬라균(S. Paratyphi, S. Typhimurium, S. Enteritidis 등)의 감염에 의한 질병으로, 병원체인 살모넬라균은 그람음성 막대균이다. 살모넬라균 속에 속하는 수많은 혈청형들은 사람과 동물에 병원체로 작용한다. 그러나 장티푸스(Typhoid fever)는 기타 살모넬라와는 달리 사람에게만 감염되어 증상을 나타낸다.
본 발명의 용어 "항원(Antigen)"은 면역 반응을 일으켜 특히 항체를 생산하게끔 만드는 물질로서, 일반적으로 생명체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체이다. 항원은 주로 병원균이나 바이러스로서 단백질이지만 다당류, 인공적으로 합성된 물질, 부착소, 자신의 몸 속에 생긴 변이세포(암세포) 등의 다양한 것들도 항원이 될 수 있다.
본 발명의 살모넬라 혈청형별 재조합 항원은 박테리아를 구성하는 다양한 단백질을 포함할 수 있으며, 구체적으로 막(Membrane; M) 단백질, 피막(Envelope; E) 단백질, 비구조(Non Structure; NS) 단백질 등이 포함될 수 있고, 보다 구체적으로 본 발명의 살모넬라 혈청형별 재조합 항원은 세포외막단백질(outer membrane proteins, OMPs) 또는 구조 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "단백질"은 "펩티드(peptide)"및 "폴리펩티드"와 동일한 의미로서 제한 없이 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 아미드 결합(또는 펩티드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 상기 펩티드의 제조방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하는 방법, 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 무세포 단백질 합성법, 자동 펩티드 합성기를 이용한 방법 등과 같은, 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 "재조합 항원"은 화학적으로 합성할 수도 있고 유전자 재조합 방법을 이용하여 미생물 또는 진핵세포에서 제조될 수도 있으나, 그의 제조방법이 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 유전자 재조합 방법을 이용하기 위한 벡터로는 인간 및 동물에는 감염성이 없으면서 재조합 항원을 발현시킬 수 있는 전이벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
상기 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명의 용어 "살모넬라 공통 항원"은 살모넬라 균이 공통으로 포함하고 있는 파지 인테그라제 단백질(phage integrase protein)를 의미한다.
상기 살모넬라 공통 항원은 서열번호 3의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양한 살모넬라 장티푸스 및 파라티푸스 재조합 항원을 포함하면서, 항원 간의 교차 반응으로 인한 위양성 또는 위음성 등의 문제가 발생하지 않는 특이성이 우수한 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트용 재조합 항원을 개발하였다.
또한, 상기 살모넬라 장티푸스 및 파라티푸스 재조합 항원은 혈청 알부민(serum albumin) 단백질을 포함할 수 있다.
상기 링커는 융합단백질의 활성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 더욱 구체적으로는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 더더욱 구체적으로는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 20개씩 연결하여 사용할 수 있다.
상기 재조합 항원은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 재조합 항원 또는 상기 재조합 항원을 구성하는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 재조합 항원을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 장티푸스 및 파라티푸스 항원을 포함하는, 특이성이 우수한 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트를 개발하였다. 구체적으로, 상기 키트의 상기 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원은 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 상기 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원은 서열번호 2의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 상기 살모넬라 공통 항원은 서열번호 3의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으며, 상기 항원은 균체에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 항원은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드가 결합한 고분자 물질로서, 유전 정보를 코딩하고 있는 DNA를 의미한다. 상기 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 1 내지 3의 염기 서열로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 도출 가능하며, 구체적으로 서열번호 1 내지 3의 염기 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 재조합 항원을 코딩하는 염기 서열은 상기 서열번호 1 내지 3의 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 결합체 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 용어 "상동성" 이란, 단백질을 코딩하는 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 또한, 상동성은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도에 따라 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명의 재조합 항원은 상기 각각의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 공지의 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 결합체, 융합 단백질 및 약물의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃ 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃ 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃ 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다.
또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 발명의 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트는 장티푸스 또는 파라티푸스의 감염 여부를 진단하는 것일 수 있으며, 이는 구체적으로 상기 균들의 특이 IgM 및 IgG를 동시에 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 진단 키트는 상기 균의 IgM 항체 및 IgG 항체 둘 모두를 검출하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "IgM" 및 "IgG"는 면역글로불린(Immunoglobulin; Ig)의 하위 그룹에 속하는 물질이다. 면역글로불린은 항체(Antibody)로도 불리우며, 항원과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 구체적으로, 면역 체계에서 세균이나 바이러스 같은 외부항원들과 특이적 결합을 하여 항원을 인식하게 하고 동시에 무력화시키는 작용을 하는 면역글로불린은 면역 항체라고 하는데 보통 항체라고 하면 면역 항체를 뜻한다. 상기 면역글로불린은 일반적으로 5가지 종류(IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE)로 분류된다.
본 발명의 IgM은 면역 반응 시 최초로 만들어지는 항체로서, 다섯 개의 Y가지가 결합된 형태이다. 또한, IgG는 면역 반응을 주로 담당하는 항체로서, 면역 반응이 진행되면서 IgM이 IgG로 바뀌어 생산된다. 상기 IgM은 최초 면역 반응과 관계되어 1차 감염 또는 현재 감염 여부를 확인할 수 있는 지표로 이용될 수 있고, IgG는 2차 감염 또는 과거 감염 여부를 확인할 수 있는 지표로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 용어 "진단"은, 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 목적상, 진단은 장티푸스 및 파라티푸스 특이적인 항원-항체 반응 유무를 확인하여, 장티푸스 및 파라티푸스균에 의해 야기되는 질병의 감염 여부를 확인하는 것이다.
상기 용어 "진단"은 "검출"과 같은 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 용어 "키트"는, 시료에 포함된 항체(장티푸스균 및 파라티푸스균)의 존재 여부를 확인하기 위한 수단으로 사용된다.
본 발명의 키트는 3개의 반응선(Test line)을 가지며, 제1반응선에는 살모넬라 공통 항원이 고정되고, 제2반응선에는 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원이 고정되고, 제3반응선에는 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원이 고정될 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 제1반응선 및 제2반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 장티푸스에 감염된 것으로 진단할 수 있으며, 제1반응선 및 제3반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 파라티푸스에 감염된 것으로 진단할 수 있다.
또한, 상기 키트는 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgM 항체를 검출하는 스트립, 및 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgG 항체를 검출하는 스트립을 포함하여, 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgM 항체 및 IgG 항체 둘 모두를 검출할 수 있어, 진단 대상이 어떠한 혈청형의 살모넬라에 1차 감염 또는 2차 감염되었는지 뿐만 아니라 과거 또는 현재에 어떠한 혈청형의 살모넬라에 감염되었는지 명확하게 확인할 수 있다.
본 발명의 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감염진단 키트는 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 인간의 항체와 결합하는 금 결합 패드(gold conjugation pad); (c) 살모넬라 타이피 또는 살로넬라 파라타이피 항원을 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line)이 처리되어 있는 나이트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane; NC membrane; membrane); 및 (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트는 샘플패드, 금 결합 패드, 멤브레인 및 흡수패드를 포함하는 테스트 스트립을 포함하고 있다. 샘플패드는 금 결합 패드 위에 겹쳐져 있어 제1 중첩 부분을 형성하고, 금 결합 패드는 멤브레인 위에 겹쳐져 있어 제2 중첩 부분을 형성한다. 또한 멤브레인과 흡수패드는 제3중첩 부분을 형성한다. 시료가 샘플패드 상에 점적되면 모세관 현상에 의하여 시료는 금 결합 패드, 예를 들어 골드-라벨된 염소 항 인간 IgM 항체(goldlabeled goat anti-human IgM antibody) 또는 골드-라벨된 염소 항 인간 IgG 항체(goldlabeled goat anti-human IgG antibody) 등을 포함하고 있는 금 결합 패드를 통과하게 된다. 골드-라벨을 형성하는 금 입자는 바람직하게 20 내지 55nm의 지름 크기, 보다 바람직하게는 20 내지 40nm의 지름 크기를 가지며, 염색 지시자(indicator dye)로서 작용한다. 상기 금 결합 패드를 통과함에 따라, 시료 내의 항체는 골드-라벨된 염소 항 인간 IgM 항체(goldlabeled goat anti-human IgM antibody) 등과 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 멤브레인을 따라 이동한다.
본 발명의 용어 "시료"란, 장티푸스 또는 파라티푸스균에 감염되어, 상기 질환이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있으며, 보다 구체적으로, 혈청, 혈장, 전혈일 수 있으나, 개체의 IgM 및 IgG를 확보할 수 있고 그로부터 장티푸스 또는 파라티푸스 특이 IgM 및 IgG 발현 여부를 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 패드에 점적하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다. 시료에 혈청형별 장티푸스 또는 파라티푸스 특이 항체가 있는 경우에는 본 발명의 상기 진단 키트 내 장티푸스 또는 파라티푸스 항원과 결합하여 육안으로 식별할 수 있도록 멤브레인 위의 반응선에서 색 변화가 일어난다. 그러나 시료에 혈청형별 장티푸스 또는 파라티푸스 특이 항체가 없는 경우에는 본 발명의 상기 항원과 결합하지 않아 멤브레인 위의 반응선에서 아무런 변화가 일어나지 않는다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 장티푸스 또는 파라티푸스 특이 항체는 멤브레인 위의 반응선에 고정되어 있는 혈청형별 장티푸스 또는 파라티푸스로 항원에 결합한다. 이 항원-항체 복합체의 형성으로 시료의 항체와 골드 라벨(염소 항 인간 IgM 등)과 멤브레인 상의 항원이 복합체를 형성하여 붉은 보라색 밴드를 나타내고 이에 따라 시료 내에 혈청형별 장티푸스 또는 파라티푸스에 대한 항체가 존재하는 양성 반응을 나타내게 된다.
장티푸스 또는 파라티푸스 감염에 대한 양성 반응 결과는 대조선 외에 서열번호 1 내지 3의 염기 서열을 가지는 항원을 포함하고 있는 반응선이 발색하는 경우이다. 상기 대조선은 진단 키트의 이상 유무를 확인하기 위한 것이다. 장티푸스 또는 파라티푸스 감염에 대한 음성 반응 결과는 대조선만이 발색하는 경우이다. 상기 대조선은 골드-라벨과 결합하는 대조군 단백질을 포함하고 있는데, 이는 예를 들어 토끼 항-염소 IgG 다클론 항체, 염소 항-인간 IgG 다클론 항체, 토끼 항-인간 IgM 다클론 항체 또는 염소 항-인간 IgM 다클론 항체 등을 포함할 수 있으며, 이들 대조군 단백질을 0.1mg/ml 내지 2.0mg/ml의 농도로 포함할 수 있다. 상기 반응선은 서열번호 1 내지 3의 염기 서열을 가지는 장티푸스 또는 파라티푸스 항원을 포함하고 있으며, 이들 항원 단백질은 0.5 내지 2.0mg/ml의 농도로 반응선에 포함된다.
금 결합 패드는 적합한 마커, 예를 들어 마커로서 건조된 콜로이드성 골드-라벨된 프로틴 A(gold labeled portein A), 골드-라벨된 항-인간 IgG 항체(glodlabeled anti-human IgG antibody) 또는 골드-라벨된 항-인간 IgM 항체(goldlabeled anti-human IgM antibody) 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게 샘플패드에 인접하여 위치할 수 있다. 상기 골드 라벨된 마커가 금 결합 패드에 과량으로 포함될 경우에는 분석하고자 하는 장티푸스 또는 파라티푸스에 대한 항체가 비교적 낮은 영역에서도 비특정신호로 증가됨으로써 위양성 결과를 초래할 수 있으므로, 본 발명에서는 골드-콜로이드 원액을 희석하여 흡광도(optical density; OD)가 1 내지 6, 바람직하게는 흡광도가 2 내지 4의 농도로 포함할 수 있다. 흡수패드는 막의 반대편 말단에 위치하며 모세관 현상에 의해 막을 따라 이동한 생물학적 시료, 예를 들면 혈청, 혈장 등을 흡수한다.
본 발명의 용어 "개체"는, 장티푸스 또는 파라티푸스 감염, 이의 질환이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단용 조성물을 제공한다.
상기 용어, "살모넬라 타이피", "OMPX", "살모넬라 파라타이피", "FliC-a", "항원", "살모넬라 공통 항원" 및 "진단"은 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "조성물"은 상기 항원 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 키트를 이용하여, 개체로부터 분리된 시료에서 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 용어, "키트", "개체", "시료", "검출", "장티푸스", "파라티푸스" 및 "진단"은 상기에서 서술한 바와 같다.
구체적으로, 장티푸스 또는 파라티푸스 감염이 의심되거나, 이의 발병이 의심되는 환자로부터 시료, 예를 들어 혈청을 채취하고, 이 채취된 시료를 상기 진단 키트의 시료가 흡수되는 부위인 샘플패드(sample pad)에 점적하면, 시료는 모세관 현상에 의해 금 결합 패드(gold conjugation pad)에 도달하여 시료 내의 항체가 금 결합 패드 내의 마커, 예를 들어 골드-라벨된 프로틴 A(goldlabeled protein A), 골드-라벨된 항 인간 IgG 항체(gold-labeled anti-human IgG antibody) 및 골드-라벨된 항인간 IgM 항체(gold-labeled anti-human IgM antibody) 등에 결합하여 콜로이드를 형성하게 된다. 이때, 검출하고자 하는 시료는 상기 금 결합 패드에 고정화되지 않고 계속 이동하여 혈청형별 장티푸스 또는 파라티푸스 항원이 고정화되어 있는 반응선(test line)에 도달하게 된다. 장티푸스 또는 파라티푸스 감염 환자의 시료인 경우에는 상기 혈청형별 항원과 항원-항체 반응을 일으키게 되는데, 즉 환자의 금 결합 패드 내의 특정 마커에 결합된 항체는 반응선에 고정된 장티푸스 또는 파라티푸스 항원에 결합하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 육안으로 관찰할 수 있게 된다. 그리고, 시료 내 항체와 반응하지 않은 나머지 금 결합 패드 내의 마커는 대조선에 도달하여 대조군 단백질과 반응하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 검사의 적합성을 나타내게 된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 키트의 제1반응선 및 제2반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 장티푸스에 감염된 것으로 진단하는 것이고, 제1반응선 및 제3반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 파라티푸스에 감염된 것으로 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원의 장티푸스 및 파라티푸스 감염 동시 감별진단용 조성물 제조 용도를 제공한다.
상기 용어, “살모넬라 타이피”, “OMPX”, “살모넬라 파라타이피”, “FliC-a”, “항원”, “살모넬라 공통 항원”, “진단” 및 “조성물”은 상기에서 서술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전 하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 장티푸스 및 파라티푸스 항원 선정
장티푸스 및 파라티푸스를 동시에 구별하여 진단하는 키트를 개발하기 위하여, 키트에 포함될 수 있는 항원을 선정하였다.
보다 구체적으로, 상기 질병을 동시에 감별하며 진단하고자 할 경우, 항원간의 교차반응으로 인한 위양성 또는 위음성 등의 문제가 발생할 수 있기에, 이러한 문제를 일으키지 않기 위해, 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi)의 세포외막단백질인 OMPX, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A의 플라젤린(flagellin)의 구조 단백질인 FliC-a(H-1a) 및 살모넬라 균이 공통으로 포함하고 있는 phage integrase 단백질을 항원으로 선택하였다.
실시예 2. 장티푸스 및 파라티푸스 재조합 항원 생산
장티푸스 및 파라티푸스 항원을 포함하는 동시 감별진단 키트를 제조하기 위하여, 먼저 장티푸스 및 파라티푸스의 재조합 항원을 생산하였다.
2-1. 재조합 유전자 합성
실시예 1에서 항원으로 선택된 OMPX, FliC-a 및 phage integrase 단백질에 대한 유전자 정보를 확인하고, pBHA 벡터(도 1)에 각각 클로닝된 3종의 플라스미드 DNA를 수득하였다(Bioneer, Korea). 상기 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원은 서열번호 1, 상기 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원은 서열번호 2, 상기 살모넬라 공통 항원은 서열번호 3의 염기 서열을 가진다. 유전자 합성시 단백질 발현 벡터로 클로닝을 위해 5' 말단에는 EcoRⅠ(GAATTC) 제한효소를, 3' 말단에는 XhoⅠ(CTCGAG) 제한효소를 추가하여 합성하였다.
2-2. 유전자 재조합 플라스미드 제작
단백질 발현벡터는 Trx (Thioredoxin)와 6개의 히스티딘이 융합되어 있는 pET32a 벡터(도 2)를 사용하였다. 상기 실시예 2-1에서 합성한 3종의 재조합 유전자와 pET32a 플라스미드 DNA를 Gene all사의 플라스미드 래피드프렙 키트 (Hybrid-Q plasmid rapidprep)를 이용하여 순수 정제한 후 Takara의 EcoRⅠ, XhoⅠ 제한효소와 반응버퍼를 넣고 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 하였다. 제한효소 절단 반응이 완료된 상기 3종의 유전자와 발현 벡터 pET32a는 1% 아가로스 겔 전기영동을 한 후 DNA 사이즈 마커와 비교하여 OMPX 는 525 bp, FliC-a는 1509 bp, integrase는 774 bp, pET32a 벡터는 5900bp에서의 유전자 산물을 잘라낸 후 MP bio사의 겔 추출 키트 (Gel extraction kit)를 이용하여 DNA를 순수분리 하였다.
정제가 끝난 상기 3종의 재조합 유전자와 pET32a 벡터는 DNA 정량을 실시하였으며, 재조합 유전자와 벡터 DNA 몰농도를 5:1의 비율로 각각 NEB사의 T4 리가아제를 사용하여 25℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 라이게이션 (ligation) 후 E.coli (BL21)에 형질전환 후 항생제 암피실린이 포함된 LB 평판배지에 도말하여 37℃의 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 LB 액체 배지에서 키워 플라스미드 DNA를 순수 분리하였다. 순수 분리한 3종의 재조합 DNA는 다시 EcoRⅠ, XhoⅠ 제한효소로 절단하여 pET32a 벡터와 3종의 DNA가 분리된 것을 최종 확인하였다(도 3).
2-3. 재조합 단백질 정제 시료 준비
상기 실시예 2-2에서 확인된 재조합 DNA가 포함되어 있는 BL21 cell을 암피실린이 포함되어 있는 LB액체 배지에서 12시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 4℃, 6000 RPM으로 20분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 버리고 pellet을 1xPBS로 현탁 후 세포를 파쇄(Sonication) 하였다. 이후 파쇄액을 4℃원심분리(14000 RPM, 15분)후 상층액을 soluble protein 시료, pellet을 insoluble protein 시료로 사용 하였다.
2-4. 재조합 단백질 정제
상기 실시예 2-3에서 준비된 시료를 Ni-NTA resin(QIAGEN)을 사용해 정제한 후 H-1a(약 73 kDa), OMPX(약 35 kDa) 및 integrase(약 46 kDa) 단백질의 위치를 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이 상기 3종의 재조합 단백질이 정제되었음을 확인하였다.
실시예 3. 패드 제조
3-1. 검체희석액 제조
5L 비이커에 정제수, 1580mL, 10X PBS(pH 6.8) 200mL(1X), 10% BSA 200mL(1%), 10% NaN3 2mL(0.1%)을 넣고 30분간 교반한 뒤, 진공 펌프 필터링 세트를 사용하여 0.22㎛ 필터로 필터링한 후 실온에 보관하였다.
3-2. 샘플패드 버퍼 제조
2L 비이커에 정제수 336mL, 0.2M Sodium borate buffer(pH 8.6) 400mL(0.1M), 20% Tween 20 40ml(1%), 10% BSA 16mL(0.2%) 및 10% NaN3 8mL(0.1%)을 넣고 30분간 교반한 뒤, 진공 펌프 필터링 세트를 사용하여 0.22㎛ 필터로 필터링한 후 실온에 보관하였다.
3-3. 샘플패드 제조
스테인레스 트레이(36.2cm x 32.4cm x 6.5cm)에 랩을 씌우고 70% 알코올로 닦은 후 흡수 패드(20mm x 300mm)를 앞면이 위로 오도록 넣고 샘플패드 버퍼를 1장당 10mL씩 넣고 패드를 충분히 적셔지도록 한 뒤, 24시간 건조하였다.
3-4. IgM 스트립 골드패드 버퍼 제조
100mL 유리병에 정제수 14.3mL, 25% Trehalose 6.8mL(5%), Gold conjugate-Chicken IgY(OD10) 1.02mL(OD0.3) 및 Gold conjugate-Goat anti-human IgM(OD10) 11.88mL(OD3.5)을 넣고 파이펫에이드로 3회 피펫팅 한 후, 뚜껑을 닫고 유리병을 바닥에 놓고 5회 이상 원을 그리며 혼합한 뒤, 4℃에서 보관하였다.
3-5. IgG 스트립 골드패드 버퍼 제조
100mL 유리병에 정제수 12.58mL, 25% Trehalose 6.8mL(5%), Gold conjugate-Chicken IgY(OD10) 1.02mL(OD0.3), Gold conjugate-Goat anti-human IgG(OD10) 13.6mL(OD4)을 넣고 파이펫에이드로 3회 피펫팅 한 후, 뚜껑을 닫고 유리병을 바닥에 놓고 5회 이상 원을 그리며 혼합한 뒤, 4℃에서 보관하였다.
3-6. 골드패드 제조
아크릴판에 랩을 씌워 준비한 뒤, Glass fiber를 올리고 IgM 골드패드 버퍼 1mL을 골고루 흡수될 수 있도록 분주하여 IgM 골드패드를 제조하였다. IgG 골드패드 역시 IgG 골드패드 버퍼를 위와 같은 방법을 통해 제조하였다. 제조된 골드패드는 24시간 건조하였다.
실시예 4. 점적 물질 제조 (IgM/IgG)
장티푸스 및 파라티푸스 항원을 포함하는 동시 감별진단 키트를 제조하기 위하여, 점적물질을 제조하였다.
4-1. IgM/IgG 스트립 T- line 1(Phage integrase protein)
15 ml tube에 10 mM Potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.5% BSA, 0.1% Trehalose 및 Phage integrase protein 2.0 mg/ml을 배합하였다.
4-2. IgM/IgG 스트립 T - line 2(OMPX protein)
15 ml tube에 10 mM Potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.5% BSA, 0.1% Trehalose 및 OMPX protein 2.0 mg/ml을 배합하였다.
4-3. IgM/IgG 스트립 T - line 3(FliC-a protein)
15 ml tube에 10 mM Potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.5% BSA, 0.1% Trehalose 및 FliC-a protein 2.0 mg/ml을 배합하였다.
4-4. Control line
15mL 용기에 1X PBS 2mL, Goat anti-chicken IgY(2mg/mL) 2mL을 넣어 1mg/mL, 4mL을 제조하였다.
실시예 5. 멤브레인 점적 공정
5-1. Uncut sheet 제조
디스펜서를 이용하여 멤브레인이 부착된 지지카드의 라인 1에 Control line 배합액, 라인 2에 IgM test line 배합액, 라인 3에 IgM test line 용액, 라인 4에 IgM test line 용액을 점적하고, 라인 2 - 4에 IgG test line 배합액을 점적한 뒤, 48시간 건조하였다. 건조가 끝난 뒤, 제조된 골드패드를 멤브레인 아래쪽에 1 ~ 2mm 겹치도록 부착하고, 지지카드 하단에 맞추어 샘플패드를 부착하였으며, 멤브레인 위쪽에 1 ~ 1.5mm 겹치도록 흡수패드를 부착하였다.
5-2. 스트립 제조 및 조립
Rotary slitter를 이용하여 uncut sheet를 4mm로 컷팅하여 스트립을 제조한 뒤, 어셈블리 컨베이어(압착기)를 통해 키트를 제조하였다.
보다 구체적으로, 3개의 반응선(Test line)을 갖도록 제조하였으며, 제1반응선에는 살모넬라 공통 항원이 고정되고, 제2반응선에는 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원이 고정되고, 제3반응선에는 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원이 고정되도록 제조하였다(도 5).
실시예 6. 양성 결과 판독
상기 실시예를 통해 장티푸스 및 파라티푸스를 구별하며 동시 감별진단이 가능한 키트를 제조하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 시료를 투입하였을 때, 장티푸스에 대한 양성반응이 나올 때는 제1반응선 및 제2반응선에 반응이 나타나고, 파라티푸스에 대한 양성반응이 나올 때는 제1반응선 및 제3반응선에 반응이 나타나도록 구성하였다.
실시예 7. 재조합 단백질 항원성 확인
상시 실시예 2-4에서 정제된 3종의 재조합 단백질 3종에 대해 해외에서 수집한 장피푸스 및 파라티푸스 검체를 이용하여 항원성을 확인 하였다.
각각의 재조합 단백질을 디스팬서를 이용하여 맴브레인에 접적한 후 검체 희석에 150 ul 및 장티푸스 양성 검체 3 ul, 파라티푸스 양성 검체 3 ul 그리고 인체자원은행에서 분양받은 건강인 검체 3 ul를 검체 투입구에 주입한 후 15분 동안 반응 시켰다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 장티푸스 양성검체에서는 integrase와 OMPX가 점적된 맴브레인에서 양성 반응이 확인 되었으며(도 7의 A), 파라티푸스 양성 검체에서는 integrase와 H-1a가 점적된 맴브레인에서 양성 반응이 확인 되었다(도 7의 B).
또한, 도 7의 C에서 확인할 수 있듯이 건강인의 음성 검체에서는 integrase, OMPX 및 H-1a가 점적된 맴브레인에서 음성 반응을 확인 하였다.
이를 통하여, 본 발명에서 정제한 3종의 재조합 단백질을 사용해 장티푸스 및 파라티푸스 동시 진단 키트를 제작 하였음을 확인하였다.
실시예 8. 재조합 항원의 민감성 확인
장티푸스 및 파라티푸스 균으로부터 추출된 항원이 도입된 키트와 비교하여 본 발명의 키트에 사용된 재조합 항원이 도입 되었을 때 민감성을 확인 확인하였다. 보다 구체적으로, 해외(방글라데시)에서 수집한 장티푸스 및 파라티푸스 확진 환자의 양성 검체를 검체희석액 300 μl을 첨가하여, 10건의 양성 검체를 재조합 항원이 도입된 키트 및 장티푸스 및 파라티푸스 균으로부터 추출한 항원이 도입된 키트에 15분간 반응시켰다.
그 결과, 본 발명의 재조합 항원이 도입된 키트를 사용한 경우, 도 8의 A에서 볼 수 있듯이, 장티푸스 10건의 양성 검체 중 9건이 양성으로 나타났고, 도 8의 B에서 볼 수 있듯이, 파라티푸스 10건의 양성 검체 중 8건이 양성으로 나타났다.
반면, 추출 항원이 도입된 키트를 사용한 경우, 도 8의 A에서 볼 수 있듯이, 장티푸스 10건의 양성 검체 중 3건이 양성으로 나타났으며, 도 8의 B에서 볼 수 있듯이, 파라티푸스 10건의 양성 검체 중 0건이 양성으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 재조합 항원이 도입된 키트가 추출항원이 도입된 키트보다 성능이 우수하다는 것을 확인하였다.
실시예 9. 민감성 확인
본 발명의 키트의 민감성을 시험하기 위하여, 양성 검체를 검체희석액에 희석하여, 정성 진단 시험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 인체자원은행의 장티푸스 확진 환자, 해외에서 수집한 파라티푸스 확진 환자 및 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감염 환자로부터 수집한 양성 검체를 분양받아 검체 희석액 300 μl를 첨가하여, 10건의 양성 검체를 본 발명의 키트 및 타사(S사)의 키트에 15분간 반응시켰다.
그 결과, 본 발명의 키트를 사용한 경우, 도 9의 A에서 볼 수 있듯이, 장티푸스 10건의 양성 검체 결과 중 9건이 양성으로 나타났다.
반면, 타사(S사)의 키트를 사용한 경우, 도 9의 B에서 볼 수 있듯이, 장티푸스 10건의 양성 검체 결과 중 5건이 양성으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 키트가 시중에 판매되고 있는 동일 원리의 키트보다 장티푸스 양성 반응이 높은 것을 확인 하였다.
또한, 본 발명의 키트를 사용한 경우, 도 10에서 볼 수 있듯이, 파라티푸스 10건의 양성 검체 결과 중 8건이 양성으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 키트가 파라티푸스 양성 반응의 민감성이 높은 것을 확인 하였다.
아울러, 도 11에서 볼 수 있듯이 장티푸스 및 파라티푸스 5건의 양성 검체 결과 중 5건이 양성으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 키트가 장티푸스 및 파라티푸스의 동시 감염을 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 10. 특이성 확인
본 발명의 키트의 특이성을 시험하기 위하여, 음성 검체를 검체희석액에 희석하여, 정성 진단 시험을 수행하였다.
구체적으로, 일반인 음성 검체 3μl에 검체희석액 300μl을 첨가하여, 10건의 음성 검체를 본 발명의 키트에 15분간 반응시켰다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 10건의 음성 검체 결과 중 10건 모두 음성으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 키트가 음성 검체에 반응을 하지 않으며, 높은 확률로 양성 검체에 양성 반응을 나타내는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원은 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화되고, 상기 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원은 서열번호 2의 염기 서열에 의해 암호화되고, 상기 살모넬라 공통 항원은 서열번호 3의 염기 서열에 의해 암호화되는 것인, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 키트는 3개의 반응선(Test line)을 가지며, 제1반응선에는 상기 살모넬라 공통 항원이 고정되고, 제2반응선에는 상기 살모넬라 타이피 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원 및 상기 살모넬라 공통 항원이 고정되고, 제3반응선에는 상기 살모넬라 파라타이피 A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 상기 살모넬라 공통 항원이 고정된 것인, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1반응선 및 제2반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 장티푸스에 감염된 것으로 진단하는 것인, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1반응선 및 제3반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 파라티푸스에 감염된 것으로 진단하는 것인, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 키트는 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgM 항체 및 IgG 항체 둘 모두를 검출하는 것을 특징으로 하는, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 키트는 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgM 항체를 검출하는 스트립, 및 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgG 항체를 검출하는 스트립을 포함하는 것인, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단 키트.
  8. 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 혈청형 특이 OMPX 재조합 항원, 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi) A 혈청형 특이 FliC-a 재조합 항원 및 살모넬라 공통 항원을 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스 동시 감별진단용 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항의 키트를 이용하여, 개체로부터 분리된 시료에서 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 장티푸스 및 파라티푸스의 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1반응선 및 제2반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 장티푸스에 감염된 것으로 진단하는 것인, 장티푸스 및 파라티푸스의 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제1반응선 및 제3반응선에서 반응이 일어날 경우 시료가 파라티푸스에 감염된 것으로 진단하는 것인, 장티푸스 및 파라티푸스의 진단을 위한 정보제공방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 키트는 장티푸스 및 파라티푸스에 대한 IgM 항체 및 IgG 항체 둘 모두를 검출하는 것을 특징으로 하는, 장티푸스 및 파라티푸스의 진단을 위한 정보제공방법.
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