JP5550797B2 - ヒト心筋由来トロポニンｉに特異的にかつ速やかに結合できる変異体タンパク質 - Google Patents
ヒト心筋由来トロポニンｉに特異的にかつ速やかに結合できる変異体タンパク質 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合できる変異体タンパク質に関する。
非特許文献１および非特許文献２は、心筋由来トロポニンＩの濃度が、急性心筋梗塞に罹患した患者の血液中で急速に高くなることを開示している。
Aleksei G. Katrukha et. al., "Troponin I is released in bloodstream of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex", Clinical Chemistry, Vol. 43, Issue 8, p.p. 1379-1385 (1997)
Till Keller et. al.,."Sensitive Troponin I Assay in Early Diagnosis of Acute Myocardinal Infarction", The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE, Vol. 361, pages 868-877 (2009)
本発明の目的は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる変異体タンパク質を提供することである。
本発明は、ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合する変異体タンパク質であって、以下を具備する：
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１、
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２、および
リンカ５３、ここで
前記第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１は、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域５１Ｌ、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１Ｈを具備し、
前記第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２は、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域５２Ｌ、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２Ｈを具備し、
前記リンカ５３は、そのＮ末端およびＣ末端にシステイン分子を具備し、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端および第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端の間に設けられ、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合しており、かつ
前記リンカ５３は、第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合している。
本発明は、変異体タンパク質をヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる方法であって、以下の工程を具備する：
前記変異体タンパク質を用意する工程（ａ）、ここで
前記変異体タンパク質は以下を具備する：
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１、
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２、および
リンカ５３、ここで
前記第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１は、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域５１Ｌ、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１Ｈを具備し、
前記第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２は、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域５２Ｌ、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２Ｈを具備し、
前記リンカ５３は、そのＮ末端およびＣ末端にシステイン分子を具備し、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端および第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端の間に設けられ、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合しており、かつ
前記リンカ５３は、第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合している；ならびに
前記変異体タンパク質に前記ヒト心筋由来のトロポニンＩを接触させ、前記変異体タンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる工程（ｂ）。
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１、
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２、および
リンカ５３、ここで
前記第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１は、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域５１Ｌ、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１Ｈを具備し、
前記第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２は、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域５２Ｌ、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２Ｈを具備し、
前記リンカ５３は、そのＮ末端およびＣ末端にシステイン分子を具備し、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端および第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端の間に設けられ、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合しており、かつ
前記リンカ５３は、第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合している。
本発明は、変異体タンパク質をヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる方法であって、以下の工程を具備する：
前記変異体タンパク質を用意する工程（ａ）、ここで
前記変異体タンパク質は以下を具備する：
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１、
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２、および
リンカ５３、ここで
前記第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１は、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域５１Ｌ、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１Ｈを具備し、
前記第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２は、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域５２Ｌ、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２Ｈを具備し、
前記リンカ５３は、そのＮ末端およびＣ末端にシステイン分子を具備し、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端および第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端の間に設けられ、
前記リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合しており、かつ
前記リンカ５３は、第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合している；ならびに
前記変異体タンパク質に前記ヒト心筋由来のトロポニンＩを接触させ、前記変異体タンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる工程（ｂ）。
本発明は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる変異体タンパク質を提供する。
以下、本発明の実施形態が説明される。
（用語の説明）
まず、本明細書において用いられる用語が説明される。
図１は、抗体を示す。広く知られているように、抗体１は「Ｙ」文字の形状を有する。抗体１は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域からなる。抗体１は、２本の重鎖２および２本の軽鎖３からなる。各重鎖２は、重鎖定常領域１（参照符号：２２）、重鎖定常領域２（参照符号：２３）、重鎖定常領域３（参照符号：２４）、および重鎖可変領域２１からなる。各軽鎖３は、軽鎖可変領域３１および軽鎖定常領域３２からなる。
まず、本明細書において用いられる用語が説明される。
図１は、抗体を示す。広く知られているように、抗体１は「Ｙ」文字の形状を有する。抗体１は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域からなる。抗体１は、２本の重鎖２および２本の軽鎖３からなる。各重鎖２は、重鎖定常領域１（参照符号：２２）、重鎖定常領域２（参照符号：２３）、重鎖定常領域３（参照符号：２４）、および重鎖可変領域２１からなる。各軽鎖３は、軽鎖可変領域３１および軽鎖定常領域３２からなる。
各Ｆａｂ領域は、１つの重鎖可変領域２１、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、１つの軽鎖可変領域３１、および１つの軽鎖定常領域３２からなる。軽鎖３はリンカ４により重鎖２に連結されている。重鎖２は先端に１つの重鎖可変領域２１を有している。軽鎖３は先端に１つの軽鎖可変領域３１を有している。抗体１には抗原が特異的に結合する。より詳細には、抗原は重鎖可変領域２１および軽鎖可変領域３１からなるＦｖ領域に特異的に結合する。本明細書においては、抗原はヒト心筋由来のトロポニンＩである。
抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つのＦａｂ領域からなる。言い換えれば、Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変領域３１、１つの重鎖可変領域２１、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、およびリンカ４からなる。軽鎖定常領域３２は、リンカ４を介して重鎖定常領域１（参照番号：２２）に連結している。
Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、２つのＦａｂ領域からなる。上記の通り、各Ｆａｂ領域は、１つの軽鎖可変領域３１、１つの重鎖可変領域２１、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、およびリンカ４からなる。これらの２つのＦａｂ領域は、他のリンカ（図示せず）を介して互いに連結されている。好ましくは、一方の重鎖定常領域１（参照番号：２２）が、他のリンカ（図示せず）を介して他方の重鎖定常領域１（参照番号：２２）に連結している。
ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、軽鎖可変領域３１、重鎖可変領域２１、およびリンカからなる。軽鎖可変領域３１は、リンカ（図示せず）を介して重鎖可変領域２１に連結している。
図２に示されるように、本実施形態の変異体タンパク質は、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１、第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２、およびリンカ５３からなる。リンカ５３は、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１および第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２の間に設けられる。他のリンカと区別するために、このリンカ５３は、イントラリンカ５３と呼ばれ得る。
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１は、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域５１Ｌ、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１Ｈを具備する。第１軽鎖可変領域５１Ｌおよび第１重鎖可変領域５１Ｈの間には、第１フラグメントリンカ５１Ｗが設けられる。第１フラグメントリンカ５１Ｗの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：８０）である。
一例として、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１は、配列番号：６１により表されるアミノ酸配列からなる。言い換えれば、配列番号：６１により表されるアミノ酸配列は、配列番号：７６、配列番号：８０、および配列番号：７７により表される３つのアミノ酸配列をこの順で連結することによって得られるアミノ酸配列と同一である。
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２は、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域５２Ｌ、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２Ｈを具備する。第２軽鎖可変領域５２Ｌおよび第２重鎖可変領域５２Ｈの間には、第２フラグメントリンカ５２Ｗが設けられる。第２フラグメントリンカ５２Ｗの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：８１）である。
一例として、第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２は、配列番号：７１により表されるアミノ酸配列からなる。言い換えれば、配列番号７１により表されるアミノ酸配列は、配列番号：７８、配列番号：８１、および配列番号：７９により表される３つのアミノ酸配列をこの順で連結することによって得られるアミノ酸配列と同一である。
イントラリンカ５３は、配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１Ｈおよび配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２Ｈの間に設けられる。より具体的には、イントラリンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端および第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端の間に挟まれる。配列番号：７７に記述されているように、第１重鎖可変領域５１Ｈは、そのＣ末端にシステイン分子を有している。同様に、配列番号：７９に記述されているように、第２重鎖可変領域５２Ｈもまた、そのＣ末端にシステイン分子を有している。イントラリンカ５３のＮ末端およびＣ末端も、システイン分子を有している。
従って、イントラリンカ５３のＮ末端又はＣ末端のどちらか一方に位置する一方のシステイン分子は、配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端に位置するシステイン分子と反応し、ジスルフィド結合を形成する。このようにして、リンカ５３は、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合する。
同様に、イントラリンカ５３のＣ末端又はＮ末端に位置する他方のシステイン分子は、配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端に位置するシステイン分子と反応し、ジスルフィド結合を形成する。このようにして、リンカ５３は、第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端にジスルフィド結合を介して結合する。
リンカ５３の例は、CGGKGGKGGKGGKGGKGGKGGKGGKGGC（配列番号：７５）である。
このようにして、図２に示されるように、リンカ５３が、第１重鎖可変領域５１ＨのＣ末端および第２重鎖可変領域５２ＨのＣ末端の間に設けられる。
本実施形態による変異体タンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、第１軽鎖可変領域５１ＬのＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。Ｃ末端もまた、修飾され得る。
同様に、本実施形態による変異体タンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、第２軽鎖可変領域５２ＬのＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。Ｃ末端もまた、修飾され得る。
本実施形態による変異体タンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、第１重鎖可変領域５１ＨのＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。
同様に、変異体タンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、第２重鎖可変領域５２ＨのＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。
本実施形態による変異体タンパク質はヒト心筋由来トロポニンＩに接触されると、変異体タンパク質はヒト心筋由来トロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合する。より具体的には、本実施形態による変異体タンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩと混合されると、変異体タンパク質はヒト心筋由来トロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合する。
本実施形態による変異体タンパク質は、一般的なタンパク質発現技術を用いて産生され得る。より具体的には、まず、本実施形態による変異体タンパク質をコードする遺伝子配列を具備するベクターを用意する。ベクターの例は、プラスミドである。次に、このベクターを用いて細胞（例えば、大腸菌）が形質転換される。この細胞は培養され、本実施形態による変異体タンパク質を産生する。
ｓｃＦｖ抗体フラグメントを効率的に得るためには、ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、リフォールディング法により産生されることが望ましい。非特許文献３は、リフォールディング法を開示している。
Jun Kamishikiryo et. al., "Molecular Basis for LLT1 Protein Recognition by Human CD161 Protein (NKRP1A/KLRB1)", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 286, NO. 27, p.p. 23823-23830.
（実施例）
以下、本実施形態を裏付ける実施例が説明される。
以下、本実施形態を裏付ける実施例が説明される。
（実施例１）
表１、表２、表３、および表４は、実施例において用いられたプライマーを示す。
表１は、軽鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー１〜２１、配列番号：０２〜配列番号：２２）を示す。
表２は、重鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー２２〜４４、配列番号：２３〜配列番号：４５）を示す。
表３は、軽鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー４５〜４９、配列番号：４６〜配列番号：５０）を示す。
表４は、重鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー５０〜５５、配列番号：５１〜配列番号：５６）を示す。
表１、表２、表３、および表４は、実施例において用いられたプライマーを示す。
表１は、軽鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー１〜２１、配列番号：０２〜配列番号：２２）を示す。
表２は、重鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー２２〜４４、配列番号：２３〜配列番号：４５）を示す。
表３は、軽鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー４５〜４９、配列番号：４６〜配列番号：５０）を示す。
表４は、重鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー５０〜５５、配列番号：５１〜配列番号：５６）を示す。
（第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントの調製）
配列番号：６１によって表されるアミノ酸配列からなる第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１が、以下の工程（ａ１）、工程（ａ２）、工程（ｂ−１）、工程（ｂ−２）、工程（ｂ−３−１）、工程（ｂ−３−２）、工程（ｂ−４）、工程（ｃ−１）、工程（ｃ−２）、および工程（ｃ−３）を経て調製された。
配列番号：６１によって表されるアミノ酸配列からなる第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５１が、以下の工程（ａ１）、工程（ａ２）、工程（ｂ−１）、工程（ｂ−２）、工程（ｂ−３−１）、工程（ｂ−３−２）、工程（ｂ−４）、工程（ｃ−１）、工程（ｃ−２）、および工程（ｃ−３）を経て調製された。
工程（ａ１） ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマ（マウス脾臓由来）の調製
ヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるアミノ酸（配列番号：０１、シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入、CRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK）が、sulfo-SMCCクロスリンカー（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結された。
ヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるアミノ酸（配列番号：０１、シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入、CRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK）が、sulfo-SMCCクロスリンカー（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結された。
より具体的には、sulfo-SMCCクロスリンカー（０．５ｍｇ）が、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第１水溶液を得た。この第１水溶液は、５０℃の温度下で１０分、放置された。
ヒト血清アルブミン（１０ｍｇ）が１ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第２水溶液を得た。
第１水溶液は第２水溶液と混合され、混合物を得た。混合物は、３０分間、静置された。このようにして、sulfo-SMCCクロスリンカーがヒト血清アルブミンに結合された。
混合物は、カラム（ＧＥヘルスケアより商品名：ＰＤ１０として入手）に通され、未反応のsulfo-SMCCクロスリンカーを除去した。
上記アミノ酸（配列番号：０１、１．５ｍｇ）がジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという）により溶解され、ＤＭＳＯ溶液を得た。２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する混合物（１ｍＬ）にＤＭＳＯ溶液（１００マイクロリットル）が添加された。その後、一晩、混合物は放置され、sulfo-SMCCクロスリンカーがアミノ酸（配列番号：０１）に結合された。
このようにして、トロポニンＩに含まれるアミノ酸配列（配列番号：０１）が修飾されたヒト血清アルブミンが得られた。以下、このヒト血清アルブミンは「トロポニン修飾ＨＳＡ」という。
完全フロイトアジュバント（和光純薬工業株式会社から購入）およびトロポニン修飾ＨＳＡが混合され、混合物を得た。この混合物がＢＡＬＢ／ｃマウス（アルビノマウスの一種）に注入された。ＢＡＬＢ／ｃマウスとは、アルビノマウスの一種である。
２週間後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）およびトロポニン修飾ＨＳＡの混合物がＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。これをもう一度繰り返した。このようにして、１ヶ月かけて、ＢＡＬＢ／ｃマウスはトロポニン修飾ＨＳＡにより免疫された。言い換えれば、上記混合物をＢＡＬＢ／Ｃマウスに与えることによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスの体内において、トロポニン修飾ＨＳＡに対する抗体が産生された。
免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓が摘出された。非特許文献４に記載された細胞融合法に従って、ハイブリドーマを得た。その後、ハイブリドーマは培養液中で培養された。培養の後のハイブリドーマ（細胞）の数は、およそ５×１０６であった。このようにして得られたハイブリドーマは、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能であった。
G.Kohler et al., Nature, 256, 495(1975)
工程（ａ２） ハイブリドーマ細胞からの全マウスＲＮＡの抽出
培養されたハイブリドーマの細胞膜を破壊するために、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）が、ハイブリドーマを含有する培養液に添加され、そして充分に培養液は攪拌された。
培養されたハイブリドーマの細胞膜を破壊するために、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）が、ハイブリドーマを含有する培養液に添加され、そして充分に培養液は攪拌された。
次に、０．２ｍＬの体積を有するクロロホルム液（純度：９９．９％）が培養液に添加され、そして再度、充分に培養液は攪拌された。
培養液は、１１７６００ｍ／ｓ２の重力加速度で、４℃の温度下、１５分間、遠心分離に供された。上清（５００μＬ）が取得された。得られた上清にイソプロパノール（５００μＬ）を添加し、室温下で１０分間、静置された。
培養液は、再度、上記の条件と同一の条件を有する遠心分離に供され、沈殿物を得た。得られた沈殿物に７５％エタノール水溶液（１ｍＬ）を添加し、エタノール溶液を得た。
エタノール溶液は、７３５００ｍ／ｓ２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。沈殿物は、乾燥された。このようにして、全マウスＲＮＡが得られた。
工程（ｂ−１） 全マウスＲＮＡからのｍＲＮＡの抽出
ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（ａ２）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡが抽出された。
ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（ａ２）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡが抽出された。
ＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）が１本のマイクロチューブに注入された。このマイクロチューブは、ブロックインキュベーター（アステック株式会社より入手）にセットされ、１時間、７０℃に加温された。
全マウスＲＮＡが、ＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）に溶解された。
キットに含まれている２×バインディング緩衝液（１００μＬ）およびキットに含まれているオリゴテックス（１０μＬ）がＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）に混合された。その後、混合物は７０℃の温度下で３分間、静置された。さらに室温で１０分間、混合物は静置された。
混合物は、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。上清が除去され、キットに含まれている洗浄バッファー（３５０μＬ）に沈殿物が懸濁された。懸濁液は、キットに含まれているカラムに供給された。カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。
カラムを洗浄するために、カラムに洗浄バッファー（３５０μＬ）が供給された。再度、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。
カラムの底部にサンプル採取用のマイクロチューブが装着された。
カラムに含有されているｍＲＮＡを抽出するために、マイクロチューブに含有されているＲＮａｓｅフリーの水（２０μＬ）がカラムに供給された。その後、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。再度、ＲＮａｓｅフリーの水（２０μＬ）がカラムに供給され、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。
このようにして、ｍＲＮＡを含有する抽出液がマイクロチューブ内に得られた。
工程（ｂ−２） ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写
得られた抽出液に含まれるｍＲＮＡが、逆転写酵素（商品名：Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。
得られた抽出液に含まれるｍＲＮＡが、逆転写酵素（商品名：Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。
工程（ｂ−３−１） ｃＤＮＡを用いた、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー１〜２１（配列番号：０２〜２２）、およびリバースプライマー１〜５（配列番号：４６〜５０）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：５８、以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー１〜２１（配列番号：０２〜２２）、およびリバースプライマー１〜５（配列番号：４６〜５０）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：５８、以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
このＰＣＲ法のプロトコールは表５の通り。
サイクル回数：３５回。
最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：５８）を含有していた。
増幅されたＶＬ遺伝子断片の確認および精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
工程（ｂ−３−２） ｃＤＮＡを用いた、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー２２〜４４（配列番号：２３〜４５）、およびリバースプライマー６〜１１（配列番号：５１〜５６）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：５７、以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー２２〜４４（配列番号：２３〜４５）、およびリバースプライマー６〜１１（配列番号：５１〜５６）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：５７、以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
このＰＣＲ法のプロトコールは、ＶＬ遺伝子断片のプロトコールと同一であった。
最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：５７）を含有していた。
ＶＨ遺伝子断片の生成の確認およびＶＨ遺伝子断片の精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
工程（ｂ−４） ＶＬ遺伝子断片およびＶＨ遺伝子断片の連結
精製されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：５７）は、精製されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：５８）にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（配列番号：５９、以下、「ｓｃＦｖ遺伝子フラグメント１」という）を得た。得られた遺伝子断片（配列番号：５９）の５’末端および３’末端は、制限酵素サイトＮｃｏ１およびＮｏｔ１によって修飾されていた。
精製されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：５７）は、精製されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：５８）にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（配列番号：５９、以下、「ｓｃＦｖ遺伝子フラグメント１」という）を得た。得られた遺伝子断片（配列番号：５９）の５’末端および３’末端は、制限酵素サイトＮｃｏ１およびＮｏｔ１によって修飾されていた。
工程（ｃ−１） 遺伝子のベクターへの導入
ｓｃＦｖ遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。
ｓｃＦｖ遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。
最初に、ｓｃＦｖ遺伝子断片は、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ｓｃＦｖ遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含有する水溶液を得た。
タンパク質発現用ベクターもまた、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。タンパク質発現用ベクターも、電気泳動により精製され、タンパク質発現用ベクターを含有する水溶液を得た。
これら２つの水溶液が混合され、混合液を得た。
混合液に、酵素（東洋紡株式会社より商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２として購入）が添加され、そして混合液は１６℃の温度下で２時間放置された。このようにして、ｓｃＦｖ遺伝子断片がタンパク質発現用ベクターにライゲーションされた。
このようにしてｓｃＦｖ遺伝子断片がライゲーションされたタンパク質発現用ベクターを用いて、大腸菌（商品名：ＤＨ５αコンピテントセル、タカラバイオ株式会社より入手）が形質転換された。
その後、大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で１６時間、インキュベートされた。インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（５ｍＬ）に供給され、そして１６時間インキュベートされた。
タンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に含まれる不要な遺伝子配列を除去するために、このＬＢ液体培地からタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）がキット（株式会社キアゲンより商品名：ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔとして入手）を用いて抽出された。抽出されたタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）、プライマー５６（配列番号：６２）、およびプライマー５７（配列番号：６３）を用いたＰＣＲ法により、タンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のシグナル配列（ＤＮＡ配列、配列番号：６０）が除去された。このようにして、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメント１をコードする発現ベクターを得た。
工程（ｃ−２） ベクターへの配列の置換
工程（ｃ−１）において得られた発現ベクターは、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：５９）を含む。この発現ベクターに含まれる配列のうち、塩基配列CACCACCACCACCACCACが、AGCTTTAACCGCAACGAATGCに置換された。
工程（ｃ−１）において得られた発現ベクターは、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：５９）を含む。この発現ベクターに含まれる配列のうち、塩基配列CACCACCACCACCACCACが、AGCTTTAACCGCAACGAATGCに置換された。
より具体的には、図３に示されるように、プライマー５８（配列番号：６４）、プライマー５９（配列番号：６５）、および工程（ｃ−１）において得られた発現ベクターを用いるＰＣＲ法が実施された。プライマー５８（配列番号：６４）は、置換される１０塩基を除き、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含むベクターの遺伝子配列の一部分に相補的であった。プライマー５９（配列番号：６５）は、置換される１１塩基を除き、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含むベクターの遺伝子配列の一部分に相補的であった。図３に示されるＰＣＲ法により、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする発現ベクターに含まれる１８塩基が、他の２１塩基に置換された。このようにして、変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子配列（配列番号：６６）を含有する発現ベクターが得られた。
工程（ｃ−３） ベクターを用いた蛋白質の取得
工程（ｃ−２）において得られたベクターを用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より購入、商品名：ＢＬ２１（ＤＥ３））が形質転換された。その後、この大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で３７℃の温度下、１６時間インキュベートされた。
工程（ｃ−２）において得られたベクターを用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より購入、商品名：ＢＬ２１（ＤＥ３））が形質転換された。その後、この大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で３７℃の温度下、１６時間インキュベートされた。
インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリン（５００ｍＬ）を含有するＬＢ液体培地に供給された。その後、６００ナノメートルの波長でのＬＢ液体培地の吸光度が０．５に調整されるように、シングルコロニーに含有される大腸菌が増殖された。
さらに、１Ｍの濃度を有するイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＬ）の水溶液がＬＢ液体培地に添加された。その後、３７℃の温度下で５時間、振盪しながら、大腸菌がインキュベートされた。このようにして、培養液が得られた。
得られた培養液は、４９０００ｍ／ｓ２の重力加速度、４℃の温度下、５分間、遠心分離に供された。大腸菌を含有する沈殿は、リン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＬ）に再度、懸濁された。
懸濁液は超音波処理に供され、大腸菌を破砕した。破砕された大腸菌物を含有する溶液は、９８０００ｍ／ｓ２の重力加速度、４℃の温度下、３０分間、遠心分離に供された。このようにして、沈殿物が得られた。
この沈殿物は、４％の濃度を有する界面活性剤（TritonX-100、和光純薬工業株式会社より入手）を含有するリン酸緩衝生理食塩水を用いて２回、洗浄された。さらに、沈殿物は界面活性剤を含有しないリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄された。
沈殿物に、表６に示される試薬を含有する水溶液Ａ（１０ｍＬ）が添加された。
水溶液Ａは６のｐＨを有していた。
その後、水溶液Ａは４℃の温度下で１８時間放置された。このようにして、沈殿物は溶解された。
水溶液Ａは、０．４５μｍのメッシュサイズを有するフィルター（Sartoriusより入手、商品名：Minisart）に通され、残渣を除去した。このようにして、濾液を得た。
濾液（１ｍＬ）に、表７に示される試薬を含有する水溶液Ｂ（２ｍＬ）が滴下により添加された。
水溶液Ｂは８．０のｐＨを有していた。このようにして、３ｍＬの容積を有する水溶液を得た。
水溶液（３ｍＬ）は、１リットルの溶液を有する水溶液Ｂに滴下により添加された。その後、得られた水溶液は、４℃の温度下で９６時間、攪拌された。このようにして、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：５１、配列番号：６１）が得られた。
その後、濾過ユニット（VIVAFLOW50、Sartoriusより入手）を用いて、溶液は１０ｍＬまで濃縮された。カラム（商品名：HiLoad 26/60 Superdex 75 pg、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、溶液に含まれる第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントが精製された。
（第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントの調製）
配列番号：７１によって表されるアミノ酸配列からなる第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２が、以下の工程（ｄ１）、工程（ｄ２）、工程（ｅ−１）、工程（ｅ−２）、工程（ｅ−３−１）、工程（ｅ−３−２）、工程（ｅ−４）、工程（ｆ−１）、工程（ｆ−２）、および工程（ｆ−３）を経て調製された。
配列番号：７１によって表されるアミノ酸配列からなる第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント５２が、以下の工程（ｄ１）、工程（ｄ２）、工程（ｅ−１）、工程（ｅ−２）、工程（ｅ−３−１）、工程（ｅ−３−２）、工程（ｅ−４）、工程（ｆ−１）、工程（ｆ−２）、および工程（ｆ−３）を経て調製された。
工程（ｄ１） ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマ（マウス脾臓由来）の調製
ヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるアミノ酸（配列番号：６７、シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入、CQPLELAGLGFAELQDL）が、sulfo-SMCCクロスリンカー（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結された。
ヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるアミノ酸（配列番号：６７、シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入、CQPLELAGLGFAELQDL）が、sulfo-SMCCクロスリンカー（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結された。
より具体的には、sulfo-SMCCクロスリンカー（０．５ｍｇ）が、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第１水溶液を得た。この第１水溶液は、５０℃の温度下で１０分、放置された。
ヒト血清アルブミン（１０ｍｇ）が１ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第２水溶液を得た。
第１水溶液は第２水溶液と混合され、混合物を得た。混合物は、３０分間、静置された。このようにして、sulfo-SMCCクロスリンカーがヒト血清アルブミンに結合された。
混合物は、カラム（ＧＥヘルスケアより商品名：ＰＤ１０として入手）に通され、未反応のsulfo-SMCCクロスリンカーを除去した。
上記アミノ酸（配列番号：６７、１．５ｍｇ）がジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという）により溶解され、ＤＭＳＯ溶液を得た。２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する混合物（１ｍＬ）にＤＭＳＯ溶液（１００マイクロリットル）が添加された。その後、一晩、混合物は放置され、sulfo-SMCCクロスリンカーがアミノ酸（配列番号：６７）に結合された。
このようにして、トロポニンＩに含まれるアミノ酸配列（配列番号：６７）が修飾されたヒト血清アルブミンが得られた。以下、このヒト血清アルブミンは「トロポニン修飾ＨＳＡ」という。
完全フロイトアジュバント（和光純薬工業株式会社から購入）およびトロポニン修飾ＨＳＡが混合され、混合物を得た。この混合物がＢＡＬＢ／ｃマウス（アルビノマウスの一種）に注入された。ＢＡＬＢ／ｃマウスとは、アルビノマウスの一種である。
２週間後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）およびトロポニン修飾ＨＳＡの混合物がＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。これをもう一度繰り返した。このようにして、１ヶ月かけて、ＢＡＬＢ／ｃマウスはトロポニン修飾ＨＳＡにより免疫された。言い換えれば、上記混合物をＢＡＬＢ／Ｃマウスに与えることによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスの体内において、トロポニン修飾ＨＳＡに対する抗体が産生された。
免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓が摘出された。非特許文献４に記載された細胞融合法に従って、ハイブリドーマを得た。その後、ハイブリドーマは培養液中で培養された。培養の後のハイブリドーマ（細胞）の数は、およそ５×１０６であった。このようにして得られたハイブリドーマは、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能であった。
工程（ｄ２） ハイブリドーマ細胞からの全マウスＲＮＡの抽出
培養されたハイブリドーマの細胞膜を破壊するために、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）が、ハイブリドーマを含有する培養液に添加され、そして充分に培養液は攪拌された。
培養されたハイブリドーマの細胞膜を破壊するために、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）が、ハイブリドーマを含有する培養液に添加され、そして充分に培養液は攪拌された。
次に、０．２ｍＬの体積を有するクロロホルム液（純度：９９．９％）が培養液に添加され、そして再度、充分に培養液は攪拌された。
培養液は、１１７６００ｍ／ｓ２の重力加速度で、４℃の温度下、１５分間、遠心分離に供された。上清（５００μＬ）が取得された。得られた上清にイソプロパノール（５００μＬ）を添加し、室温下で１０分間、静置された。
培養液は、再度、上記の条件と同一の条件を有する遠心分離に供され、沈殿物を得た。得られた沈殿物に７５％エタノール水溶液（１ｍＬ）を添加し、エタノール溶液を得た。
エタノール溶液は、７３５００ｍ／ｓ２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。沈殿物は、乾燥された。このようにして、全マウスＲＮＡが得られた。
工程（ｅ−１） 全マウスＲＮＡからのｍＲＮＡの抽出
ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（ａ２）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡが抽出された。
ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（ａ２）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡが抽出された。
ＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）が１本のマイクロチューブに注入された。このマイクロチューブは、ブロックインキュベーター（アステック株式会社より入手）にセットされ、１時間、７０℃に加温された。
全マウスＲＮＡが、ＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）に溶解された。
キットに含まれている２×バインディング緩衝液（１００μＬ）およびキットに含まれているオリゴテックス（１０μＬ）がＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）に混合された。その後、混合物は７０℃の温度下で３分間、静置された。さらに室温で１０分間、混合物は静置された。
混合物は、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。上清が除去され、キットに含まれている洗浄バッファー （３５０μＬ）に沈殿物が懸濁された。懸濁液は、キットに含まれているカラムに供給された。カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。
カラムを洗浄するために、カラムに洗浄バッファー （３５０μＬ）が供給された。再度、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。
カラムの底部にサンプル採取用のマイクロチューブが装着された。
カラムに含有されているｍＲＮＡを抽出するために、マイクロチューブに含有されているＲＮａｓｅフリーの水（２０μＬ）がカラムに供給された。その後、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。再度、ＲＮａｓｅフリーの水（２０μＬ）がカラムに供給され、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。
このようにして、ｍＲＮＡを含有する抽出液がマイクロチューブ内に得られた。
工程（ｅ−２） ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写
得られた抽出液に含まれるｍＲＮＡが、逆転写酵素（商品名：Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。
得られた抽出液に含まれるｍＲＮＡが、逆転写酵素（商品名：Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。
工程（ｅ−３−１） ｃＤＮＡを用いた、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー１〜２１（配列番号：０２〜２２）、およびリバースプライマー１〜５（配列番号：４６〜５０）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：６９、以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー１〜２１（配列番号：０２〜２２）、およびリバースプライマー１〜５（配列番号：４６〜５０）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：６９、以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
このＰＣＲ法のプロトコールは表８の通り。
サイクル回数：３５回。
最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：６９）を含有していた。
増幅されたＶＬ遺伝子断片の確認および精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
工程（ｅ−３−２） ｃＤＮＡを用いた、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー２２〜４４（配列番号：２３〜４５）、およびリバースプライマー６〜１１（配列番号：５１〜５６）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：６８、以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー２２〜４４（配列番号：２３〜４５）、およびリバースプライマー６〜１１（配列番号：５１〜５６）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：６８、以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
このＰＣＲ法のプロトコールは、ＶＬ遺伝子断片のプロトコールと同一であった。
最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：６８）を含有していた。
ＶＨ遺伝子断片の生成の確認およびＶＨ遺伝子断片の精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
工程（ｅ−４） ＶＬ遺伝子断片およびＶＨ遺伝子断片の連結
精製されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：６８）は、精製されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：６９）にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（配列番号：７０、以下、「ｓｃＦｖ遺伝子フラグメント２」という）を得た。得られた遺伝子断片（配列番号：７０）の５’末端および３’末端は、制限酵素サイトＮｃｏ１およびＮｏｔ１によって修飾されていた。
精製されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：６８）は、精製されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：６９）にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（配列番号：７０、以下、「ｓｃＦｖ遺伝子フラグメント２」という）を得た。得られた遺伝子断片（配列番号：７０）の５’末端および３’末端は、制限酵素サイトＮｃｏ１およびＮｏｔ１によって修飾されていた。
工程（ｆ−１） 遺伝子のベクターへの導入
ｓｃＦｖ遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。
ｓｃＦｖ遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。
最初に、ｓｃＦｖ遺伝子断片は、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ｓｃＦｖ遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含有する水溶液を得た。
タンパク質発現用ベクターもまた、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。タンパク質発現用ベクターも、電気泳動により精製され、タンパク質発現用ベクターを含有する水溶液を得た。
これら２つの水溶液が混合され、混合液を得た。
混合液に、酵素（東洋紡株式会社より商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２として購入）が添加され、そして混合液は１６℃の温度下で２時間放置された。このようにして、ｓｃＦｖ遺伝子断片がタンパク質発現用ベクターにライゲーションされた。
このようにしてｓｃＦｖ遺伝子断片がライゲーションされたタンパク質発現用ベクターを用いて、大腸菌（商品名：ＤＨ５αコンピテントセル、タカラバイオ株式会社より入手）が形質転換された。
その後、大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で１６時間、インキュベートされた。インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（５ｍＬ）に供給され、そして１６時間インキュベートされた。
タンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に含まれる不要な遺伝子配列を除去するために、このＬＢ液体培地からタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）がキット（株式会社キアゲンより商品名：ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔとして入手）を用いて抽出された。抽出されたタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）、プライマー５６（配列番号：６２）、およびプライマー５７（配列番号：６３）を用いたＰＣＲ法により、タンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のシグナル配列（ＤＮＡ配列、配列番号：６０）が除去された。このようにして、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメント２をコードする発現ベクターを得た。
工程（ｆ−２） ベクターへの配列の置換
工程（ｆ−１）において得られた発現ベクターは、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：７０）を含む。この発現ベクターに含まれる配列のうち、塩基配列CACCACCACCACCACCACが、AGCTTTAACCGCAACGAATGCに置換された。
工程（ｆ−１）において得られた発現ベクターは、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：７０）を含む。この発現ベクターに含まれる配列のうち、塩基配列CACCACCACCACCACCACが、AGCTTTAACCGCAACGAATGCに置換された。
より具体的には、図３に示されるように、プライマー６０（配列番号：７２）、プライマー６１（配列番号：７３）、および工程（ｃ−１）において得られた発現ベクターを用いるＰＣＲ法が実施された。プライマー６０（配列番号：７２）は、置換される10塩基を除き、ｓｃＦｖ遺伝子断片が含まれるベクターの遺伝子配列の一部分に相補的であった。プライマー６１（配列番号：７３）は、置換される11塩基を除き、ｓｃＦｖ遺伝子断片が含まれるベクターの遺伝子配列の一部分に相補的であった。図３に示されるＰＣＲ法により、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする発現ベクターに含まれる18塩基が、他の21塩基に置換された。このようにして、変異型ｓｃＦｖをコードする遺伝子配列（配列番号：７４）を含有する発現ベクターが得られた。
工程（ｆ−３） ベクターを用いた蛋白質の取得
工程（ｆ−２）において得られたベクターを用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より購入、商品名：ＢＬ２１（ＤＥ３））が形質転換された。その後、この大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で３７℃の温度下、１６時間インキュベートされた。
工程（ｆ−２）において得られたベクターを用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より購入、商品名：ＢＬ２１（ＤＥ３））が形質転換された。その後、この大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で３７℃の温度下、１６時間インキュベートされた。
インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリン（５００ｍＬ）を含有するＬＢ液体培地に供給された。その後、６００ナノメートルの波長でのＬＢ液体培地の吸光度が０．５に調整されるように、シングルコロニーに含有される大腸菌が増殖された。
さらに、１Ｍの濃度を有するイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＬ）の水溶液がＬＢ液体培地に添加された。その後、３７℃の温度下で５時間、振盪しながら、大腸菌がインキュベートされた。このようにして、培養液が得られた。
得られた培養液は、４９０００ｍ／ｓ２の重力加速度、４℃の温度下、５分間、遠心分離に供された。大腸菌を含有する沈殿は、リン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＬ）に再度、懸濁された。
懸濁液は超音波処理に供され、大腸菌を破砕した。破砕された大腸菌物を含有する溶液は、９８０００ｍ／ｓ２の重力加速度、４℃の温度下、３０分間、遠心分離に供された。このようにして、沈殿物が得られた。
この沈殿物は、４％の濃度を有する界面活性剤（TritonX-100、和光純薬工業株式会社より入手）を含有するリン酸緩衝生理食塩水を用いて２回、洗浄された。さらに、沈殿物は界面活性剤を含有しないリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄された。
沈殿物に、表９に示される試薬を含有する水溶液Ａ（１０ｍＬ）が添加された。
水溶液Ａは６のｐＨを有していた。
その後、水溶液Ａは４℃の温度下で１８時間放置された。このようにして、沈殿物は溶解された。
水溶液Ａは、０．４５μｍのメッシュサイズを有するフィルター（Sartoriusより入手、商品名：Minisart）に通され、残渣を除去した。このようにして、濾液を得た。
濾液（１ｍＬ）に、表１０に示される試薬を含有する水溶液Ｂ（２ｍＬ）が滴下により添加された。
水溶液Ｂは８．０のｐＨを有していた。このようにして、３ｍＬの容積を有する水溶液を得た。
水溶液（３ｍＬ）は、１リットルの溶液を有する水溶液Ｂに滴下により添加された。その後、得られた水溶液は、４℃の温度下で９６時間、攪拌された。このようにして、第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：５２、配列番号：７１）が得られた。
その後、濾過ユニット（VIVAFLOW50、Sartoriusより入手）を用いて、溶液は１０ｍＬまで濃縮された。カラム（商品名：HiLoad 26/60 Superdex 75 pg、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、溶液に含まれる第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：２）が精製された。
工程（ｇ） 変異体タンパク質の調製
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：６１）、第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：７１）、および配列番号：７５により表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、１：１：５のモル比で、トリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ：９．０）中に混合され、混合液を得た。混合液は、４℃で１２時間、静置された。このようにして、図２に示されるように、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：５１、配列番号：６１）、配列番号：７５により表されるアミノ酸配列からなるイントラリンカ５３、および第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：５２、配列番号：７１）がこの順で接続された変異体タンパク質が得られた。
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：６１）、第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：７１）、および配列番号：７５により表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、１：１：５のモル比で、トリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ：９．０）中に混合され、混合液を得た。混合液は、４℃で１２時間、静置された。このようにして、図２に示されるように、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：５１、配列番号：６１）、配列番号：７５により表されるアミノ酸配列からなるイントラリンカ５３、および第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（参照符号：５２、配列番号：７１）がこの順で接続された変異体タンパク質が得られた。
その後、混合液は、クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ75 5/150 GL、GEヘルスケア）を用いて精製された。
トリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ：９．０）は、トリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ：７．４）によって置換された。最後に、陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ、GEヘルスケア）を用いて、変異体タンパク質が精製された。
結合定数の測定
分子間相互作用解析装置Biacore T100（ＧＥヘルスケア社より購入）を用いて、変異体タンパク質の結合定数が、分子間相互作用解析装置Biacore T100に添付されているマニュアルに従って測定された。
分子間相互作用解析装置Biacore T100（ＧＥヘルスケア社より購入）を用いて、変異体タンパク質の結合定数が、分子間相互作用解析装置Biacore T100に添付されているマニュアルに従って測定された。
より具体的には、およそ５００のＲＵ（Resonance Unit）を有するヒト心筋由来トロポニンＩ（フナコシより購入）がＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア社より購入）上に固定された。このＣＭ５チップはBiacore T100内にセットされた。次に、精製された変異体タンパク質を含有する水溶液（濃度：１００ｎＭ，５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、および６．２５ｎＭ、容量：１５０マイクロリットル）がBiacore T100内に流され、変異体タンパク質の結合定数を測定した。表１１は、その結果を示す。
（参考例１）
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：６１）の結合定数が、上記の説明と同様に測定された。表１１は、その結果を示す。
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：６１）の結合定数が、上記の説明と同様に測定された。表１１は、その結果を示す。
（参考例２）
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：７１）の結合定数が、上記の説明と同様に測定された。表１１は、その結果を示す。
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：７１）の結合定数が、上記の説明と同様に測定された。表１１は、その結果を示す。
表１１から明らかなように、変異体タンパク質は、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントおよび第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントよりもずっと大きな結合定数Ｋａを有する。このため、第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントまたは第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントのいずれかが用いられた場合と比較して、変異体タンパク質は、より強くヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合する。
本発明による変異体タンパク質は、急性心筋梗塞を検出するためのセンサに用いられ得る。
５１：第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント
５１Ｌ 第１軽鎖可変領域
５１Ｈ 第１重鎖可変領域
５１Ｗ 第１フラグメントリンカ
５２：第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント
５２Ｌ 第２軽鎖可変領域
５２Ｈ 第２重鎖可変領域
５２Ｗ 第２フラグメントリンカ
５３：リンカ（イントラリンカ）
５１Ｌ 第１軽鎖可変領域
５１Ｈ 第１重鎖可変領域
５１Ｗ 第１フラグメントリンカ
５２：第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント
５２Ｌ 第２軽鎖可変領域
５２Ｈ 第２重鎖可変領域
５２Ｗ 第２フラグメントリンカ
５３：リンカ（イントラリンカ）
Claims (2)
- 第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント、
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント、および
リンカ、
を具備し、
前記第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域を具備し、
前記第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域を具備し、
前記リンカは、そのＮ末端およびＣ末端にシステイン分子を具備し、
前記リンカは、第１重鎖可変領域のＣ末端および第２重鎖可変領域のＣ末端の間に設けられ、
前記リンカは、第１重鎖可変領域のＣ末端にジスルフィド結合を介して結合しており、かつ
前記リンカは、第２重鎖可変領域のＣ末端にジスルフィド結合を介して結合している、 ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合する変異体タンパク質。 - 変異体タンパク質を用意する工程（ａ）、ならびに
前記変異体タンパク質にヒト心筋由来のトロポニンＩを接触させ、前記変異体タンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる工程（ｂ）、
を具備し、
前記変異体タンパク質は、
第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント、
第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント、および
リンカ、
を具備し、
前記第１変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、配列番号：７６によって表されるアミノ酸配列からなる第１軽鎖可変領域、および配列番号：７７によって表されるアミノ酸配列からなる第１重鎖可変領域を具備し、
前記第２変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、配列番号：７８によって表されるアミノ酸配列からなる第２軽鎖可変領域、および配列番号：７９によって表されるアミノ酸配列からなる第２重鎖可変領域を具備し、
前記リンカは、そのＮ末端およびＣ末端にシステイン分子を具備し、
前記リンカは、第１重鎖可変領域のＣ末端および第２重鎖可変領域のＣ末端の間に設けられ、
前記リンカは、第１重鎖可変領域のＣ末端にジスルフィド結合を介して結合しており、かつ
前記リンカは、第２重鎖可変領域のＣ末端にジスルフィド結合を介して結合している、
変異体タンパク質をヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる方法。
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