KR20050095972A - 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정물질의 동정 및 정량방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일가닥 핵산 서열에 따른 분자비콘을 제조하고, 상기 제조된 분자비콘을 이용하여 특정물질의 동정 및 정량하는 방법에 관한 것이다. 분자비콘은 특정물질과 특이적으로 결합할 수 있으며 두 물질이 동시에 있으면 열역학적으로 안정한 복합체를 형성하는 성질이 있다.
따라서, 본 발명에 의해 제조된 분자비콘 및 상기 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 정량분석은 미생물, 세포, 단백질을 포함하는 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석 등에 사용할 수 있어 궁극적으로는 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용될 수 있다.

Description

분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법{Method for identification and analysis of specific molecules using molecular beacons}
본 발명은 특정물질의 동정 및 정량적 분석방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 분자비콘의 복합체 형성능력을 이용하여 특정물질의 동정 및 정량적인 변화에 대한 탐색 및 분석하는 단순하고 새로운 방법에 관한 것이다.
특정물질의 동정 및 정량적인 변화에 대한 탐색 및 분석하는 기술은 물리학 및 생화학의 발달로 많이 개발되었으나 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다. 특정물질을 분석하는 방법은 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 전 과정의 한 부분이며 이런 방법은 미생물 및 바이러스 동정, 세포, 단백질, 유기물질 분석 등에 유용하게 사용할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.
핵산은 뉴클레오타이드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체이며 뉴클레오타이드는 작은 유기화합물로 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)이다. 단일가닥핵산은 상보적인 단일가닥핵산과는 염기쌍의 수소결합에 의해 이중가닥 이중가닥으로 존재하는데, 단일가닥은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오타이드들간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.
일반적으로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)과 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소적 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥 핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들을 선별되고 있다. 특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법은 셀렉스 (SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 선별된 산물인 단일가닥핵산 리간드를 압타머(aptamer)라 하며(Tuerk C. and Gold L.; Science, 249, pp505-510, 1990), SELEX를 통하여 자연상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다. SELEX 방법은 압타머 리간드가 생체에서 안정성 및 운반성, 선택성 및 친화력 등을 고려하여 변형된 뉴클레오타이드를 이용하여 개발되고 있다.
이와 같이 선별된 단일가닥 핵산리간드를 바탕으로 특정물질을 동정 및 분석하는 기술은 열량측정법(calorimetric method, Stojanovic MN, Landry DW.; J. AM. CHEM. SOC., 124, pp9678-9679, 2002), 전기화학형광법 및 효소법(Electrochemiluminescence and enzymatic method, Bruno JG, Kiel JL.; Biotechniques; 32(1), pp178-80, pp182-3, 2002), 바이오칩 및 신호증폭방법(미국 특허 US 6,544,776) 등이 개발되고 있으나 구체적으로 보도된 바는 없다.
특정물질의 동정 및 분석은 물리, 화학적인 성질을 이용하여 많이 수행되고 있으며 물질상호간의 특이성 및 친화력을 이용한 분석은 통상적으로 면역학적인 방법을 바탕으로 개발된 방법으로 수행되고 있다. 면역학적인 방법은 항원-항체 반응에 따라 항체가 시료에 있는 특정한 항원과 결합하여 복합체를 형성하며 이 때 표지된 이차 항체를 사용하여 항원-항체 복합체를 분석하는 기법이다. 예를 들면, ELISA는 일차 항체를 고체매질에 고정하며 항원이 있는 시료와 반응시킨 후, 이 복합체를 인지하는 표지된 이차 항체를 처리하여 특정항원에 대한 분석하는 방법이다. 표지된 이차 항체가 고체매질에 고정된 일차항체-항원 복합체를 인지하여 결합하면 표지체가 고체매질에 결합하게 된다. ELISA에 사용하는 프로브는 형광지시약, 디옥시제닌(dioxygenin), 호오스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등으로 표지한다. 단백질 분석기술은 단백질과 단백질간의 상호작용에서 발생하는 매우 약한 신호를 감지할 수 있어야 한다. 현재까지 검출방법은 주로 형광법이 많이 쓰이고 있으며 전기화학적 검출 방법 등이 개발되고 있다. 상기와 같이 다양한 과정을 통해 특정 단백질의 구분 및 정량에 대한 탐색 및 분석하는 방법들이 개발되어 있지만 고가의 기기 및 시약을 사용하고 있으며 복잡한 과정을 수행해야 하는 등의 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 분자비콘(molecular beacon)을 사용하여 반응을 수행한 후, 형광법으로 특정물질 동정, 정량적인 변화를 분석하여 분자비콘을 이용한 특정물질 분석 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 분자비콘 및 특정물질이 존재할 경우, 열역학적으로 안정한 복합체를 일차적으로 형성하는 성질을 이용하여 특정물질을 동정, 정량적인 변화를 확인함에 따라 이들 이용하여 미생물, 세포, 단백질을 포함한 다양한 생체분자에 대한 탐색 및 분석하는 시스템을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정물질의 분석을 위한 단일가닥 핵산(nucleic acid, NA) 리간드(R-NA), 5' 말단부분에 형광물질(Fluorophore, F)이 결합된 단일가닥핵산(F-NA), 3'말단부분에 형광신호를 제어하는 물질(Quencher, Q)이 결합된 단일가닥핵산(Q-NA) 및 상기 R-NA와 F-NA 사이 또는 R-NA와 Q-NA 사이를 연결하는 단일가닥핵산(H-NA)으로 구성된 분자비콘(molecular beacon)을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 단일가닥 핵산의 염기서열 및 길이를 설계하여 분자비콘을 제조하는 제 1단계 ; (ⅱ) 제 1단계에서 제조된 분자비콘과 특정물질이 포함된 시료와 반응하여 복합체를 형성하는 제 2단계; 및 (ⅲ) 제 2단계에서 형성된 복합체를 탐색하는 제 3단계를 포함하는 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 특정물질에 대한 특이적 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 리간드을 포함하는 분자비콘 및 반응용액을 포함하는 특정물질의 동정 및 정량적 분석을 위한 분석키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 특정물질의 분석을 위한 단일가닥 핵산 리간드(R-NA), 5' 말단부분에 형광물질(Fluorophore, F)이 결합된 단일가닥핵산(F-NA), 3'말단부분에 형광신호를 제어하는 물질(Quencher, Q)이 결합된 단일가닥핵산(Q-NA) 및 상기 R-NA와 F-NA 사이 또는 R-NA와 Q-NA 사이를 연결하는 단일가닥핵산(H-NA)으로 구성된 분자비콘(molecular beacon)을 제공한다(도 1 참조).
이때, F-NA 및 Q-NA는 상기 단일가닥 핵산 리간드와 상보적인 서열이고, H-NA는 5 내지 15개의 핵산서열이다. 또한, 상기 F-NA와 Q-NA는 1 내지 10 bp의 거리를 두고 단일가닥 핵산 리간드와 상보적인 결합을 이루는 것이 바람직하다. 본 발명의 F-NA와 Q-NA는 8 내지 12 bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 또는 5 내지 20 펩티드 핵산서열인 것이 바람직하나, 9 내지 11 bp의 염기서열인 것이 더욱 바람직하며, H-NA는 5 내지 15의 우라실(Uracil) 서열이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "분자비콘(Molecular beacon)"이라 함은 단일가닥 핵산 리간드와 상보적인 단일가닥 핵산으로 형광신호를 조절할 수 있는 시스템을 말한다. 분자비콘은 F-NA의 형광을 제어하는 시스템을 제공하는데, 단일가닥핵산 리간드의 염기서열에 상보적인 단일가닥 즉, 분자비콘에서 형광물질(Fluorophore, F)과 결합된 핵산가닥(F-NA) 과 형광신호를 제어하는 물질(Quencher, Q)과 결합된 핵산가닥(Q-NA)으로 구성되고 이들 도메인을 연결하는 두개의 연결단일가닥핵산(H-NA)으로 구성되어 있으며, 단일가닥 핵산리간드에 F-NA와 Q-NA가 결합하여 서로 인접하며 Q에 의해 F의 형광을 제어하게 되고 두 물질이 해리되어 F에 의해 형광이 발생하는 시스템인 분자비콘이다(도 3 참조).
상기 분자비콘은 특정물질과 결합하는 염기서열인 핵심부분을 포함하는 염기서열로 구성되는 단일가닥핵산리간드인 R-NA, 상기와 상보적인 단일가닥핵산인 F-NA 및 Q-NA, 그리고 이들을 연결하는 H-NA로 구성된 단일분자로 구성하는데, 상보적인 단일가닥핵산인 F-NA 및 Q-NA는 복합체를 형성하는 단일가닥핵산인 R-NA의 염기서열을 고려하여 설계한다. 혹은 상보적인 단일가닥핵산중 하나만 R-NA에 연결하고 나머지는 독립분자로 제작하여 분자비콘을 구성할 수도 있다.
상기 단일가닥핵산 리간드의 염기서열은 SELEX에 의해 선별된 단일가닥핵산의 염기서열로, 특정물질을 인식하는 부위를 포함하며, 15 내지 100 bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산이다. 예를들면, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 단일가닥핵산 리간드는 기보고된 TNF-α와 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산(미국특허 제5,972,599호; 서열번호 1)의 염기서열을 포함한다.
또한, 상기 F-NA와 Q-NA은 단일가닥핵산 리간드의 염기서열과 상보적인 가닥으로, F-NA와 Q-NA는 단일가닥핵산 리간드상에서 1 내지 10 염기정도 이격되어, 사이가 떨어져 결합할 수 있으며, 단일가닥핵산 리간드와 형성하는 구조체의 안정성을 고려한 부위로 8 내지 12 bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 혹은 5 내지 20 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 서열을 갖는 물질 등을 포함한다.
또한, 상기 반응부위는 F 및 Q이며, F-NA 및 Q-NA가 단일가닥핵산 리간드에 결합하여 F-NA의 F 형광을 Q-NA의 Q가 제어하는 분자비콘으로, Q 반응기는 3'-DABCYL(4-(4-dimethyl-aminophenylazo)benzoic acid) 또는 블랙 홀 소진제(Black Hole Quencher), F 반응기는 5'- 플로레신(Fluorescein), Cy3, Cy5, 텍사스 레드(Texas red) 등을 사용할 수 있다. 예를들면, 본 발명의 바람직한 F-NA는 단일가닥핵산 리간드에 상보적으로 결합하고 핵산의 5'에 Cy5가 결합된 단일가닥염기서열(서열번호 2), Q-NA는 단일가닥핵산 리간드에 상보적으로 결합하고 핵산의 3'에 DABCYL이 결합된 단일가닥염기서열(서열번호 3)이며 유기 합성할 수도 있다.
또한, 본 발명은 (i) 단일가닥 핵산의 염기서열 및 길이를 설계하여 분자비콘을 제조하는 제 1단계 ; (ⅱ) 제 1단계에서 제조된 분자비콘과 특정물질이 포함된 시료와 반응하여 복합체를 형성하는 제 2단계; 및 (ⅲ) 제 2단계에서 형성된 복합체의 형광성을 탐색하는 제 3단계를 포함하는 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법을 제공한다.
본 발명의 제 1단계는 단일가닥 핵산의 염기서열 및 길이를 설계하여 분자비콘을 제조하는 단계이다. 이때, 단일가닥 핵산을 구성하는 단일가닥핵산 리간드 서열은 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)법에 의해 선별되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 기보고된 TNF-α와 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산리간드(서열번호 1)의 염기서열을 포함한다.
본 발명의 제 2단계는 상기 제 1단계에서 제조된 분자비콘과 특정물질이 포함된 시료와 반응하여 복합체를 형성하는 단계이다. 이때, 특정물질은 이에 한정하는 것은 아니나, 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기 세포주 및 조직은 원핵생물 또는 진핵생물에서 유래한 것을 포함하며, 진핵생물은 인간, 동물, 식물을 의미한다.
상기 제 2단계의 반응을 위한 온도는 SELEX 수행온도보다 낮은 온도에서 수행하며, 15 ~ 40℃인 것이 바람직하다. 제 1단계에서 제조된 분자비콘의 온도에 대한 반응성은 22℃에서는 F-NA의 형광물질을 Q-NA의 소진제(Quencher)가 제어하여 형광정도가 매우 낮으나, 37℃에서는 F-NA 또는 Q-NA가 서로 해리되어 형광정도가 상대적으로 증가한다(도 4 참조). 따라서, 본 발명의 분자비콘은 특정물질과 복합체를 형성하는 성질, 주어진 환경에서 분자비콘 그리고 단일가닥핵산-특정물질의 복합체 간에 자유에너지의 차이, 즉, 분자비콘의 자유에너지가 단일가닥핵산-특정물질의 복합체보다 높게 설계, 제조하여 특정물질을 동정 및 정량적인 분석이 가능하다.
또한 상기 제 2단계의 반응용액은 염의 조성, 비특이적 결합을 방지하는 요소 등으로 구성되며, 바람직하게는 50mM 트리스(Tris)·염산(pH 7.4), 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 0.1% 소듐아지드를 함유한 선택버퍼와 0.2% 우혈청알부민 포함하는 선택버퍼를 사용한다.
본 발명의 제 3단계는 상기 제 2단계에서 형성된 복합체의 형광성을 탐색하는 단계이다. 이때, 탐색은 해리된 F-NA의 형광물질을 탐지하는 것이다. 즉, 분자비콘 및 단일가닥핵산-특정물질의 복합체는 주어진 환경에서 이들 간의 특이성 및 특정물질 양에 따라 형성되는 복합체의 종류 및 형성정도가 결정되며 이로부터 특정물질을 동정하여 정량할 수 있다. 즉, Q-NA에 의해 F-NA의 형광이 제어되는 분자비콘에 특정물질을 처리하면 단일가닥핵산리간드와 특정물질이 반응하여 단일가닥핵산-특정물질 복합체가 형성되면서 단일가닥핵산리간드에서 Q-NA와 F-NA가 해리되어 F-NA에 의해 형광이 발생한다. 즉, 단일가닥핵산리간드와 특정물질의 특이성 및 양에 의해 결정되는 형광정도를 분석하여 특정물질의 종류 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.
또한, 본 발명은 특정물질에 대한 특이적 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 리간드을 포함하는 분자비콘 및 반응용액을 포함하는 특정물질의 동정 및 정량적 분석을 위한 분석키트를 제공한다. 이때, 분석키트는 단일가닥핵산 어레이의 형태로 제작이 가능하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 단일가닥핵산 분자비콘의 제조 및 형광측정
특정물질의 동정 및 정량을 위한 단일가닥핵산 리간드(이하, R-NA라 함), 5'말단에 형광물질이 표지된 단일가닥핵산(이하, F-NA라 함), 3'말단에 소진제(Quencher)가 부착된 단일가닥핵산(이하, Q-NA라 함) 및 두가지 핵산을 연결하는 단일가닥핵산(이하, H-NA라 함)로 구성된 단일가닥핵산 분자비콘을 제조하였다(도 1).
1-1. 단일가닥핵산 분자비콘 (1)의 제조
특정물질로서 TNF-α와 특이적으로 결합하는 서열번호 1로 기재되는 단일가닥핵산 리간드인 R-NA (미국특허등록 제5,972,599호; 5'-GUC GAA CUA GCG CUG GAG CGU GCG UUG GU-3'), 상기 단일가닥핵산 리간드에 상보적인 서열번호 2로 기재되는 단일가닥 핵산서열인 F-NA (5'- CCA GCG CTA G-3')과 서열번호 3으로 기재되는 단일가닥 핵산서열인 Q-NA (5'-CTT CGC ACG C-3') 및 상기 R-NA와 F-NA 및 R-NA와 Q-NA사이를 연결하는 연결 단일가닥 핵산서열인 U8의 H-NA로 구성된 단일가닥핵산서열을 설계하여 분자비콘 (1)을 제작하였다. 이때, F-NA의 5' 말단에는 Cy3, Q-NA의 3' 말단에는 DABCYL(4-(4-dimethyl-aminophenylazo)benzoic acid)을 각각 표지하여 분자비콘을 제작하였다.
1-2. 단일가닥핵산 분자비콘 (2)의 제조
특정물질로서 TNF-α와 특이적으로 결합하는 서열번호 1로 기재되는 단일가닥핵산 리간드인 R-NA, 상기 단일가닥핵산 리간드에 상보적인 서열번호 2로 기재되는 단일가닥 핵산서열인 F-NA와 서열번호 3으로 기재되는 단일가닥 핵산서열인 Q-NA 및 상기 R-NA와 F-NA 사이를 연결하는 연결 단일가닥 핵산서열인 U8의 H-NA로 구성된 단일가닥핵산서열을 설계한 후, Q-NA를 독립분자로 설계하여 분자비콘 (2)를 제조하였다. 이때, F-NA의 5' 말단에는 Cy3, Q-NA의 3' 말단에는 DABCYL(4-(4-dimethyl-aminophenylazo)benzoic acid)을 각각 표지하여 분자비콘을 제작하였다.
실시예 2. 단일가닥핵산 분자비콘의 서열길이의 영향
분자비콘의 형광측정을 위해 길이조건 및 온도조건을 달리하여 형광치를 조사하였다.
구체적으로, 분자비콘을 구성하는 상보적인 단일가닥핵산(F-NA 또는 Q-NA)의 염기서열 길이가 염기 15개 이상인 경우, 9개 내지 11개인 경우 및 7개 이하인 경우의 분자비콘을 제조하여 온도에 대한 안정성을 살펴보았다(도 2).
그 결과, 염기서열의 길이가 15개 이상인 경우에는 22℃ 및 37℃ 모두에서 안정성이 유지되었고, 9개 내지 11개인 경우에는 22℃에서는 안정성이 유지되나 37 ℃ 경우는 구조체가 불안정하였으며, 7개 이하인 경우에는 22℃ 및 37℃ 모두에서 구조체가 불안정하였는 바, 상보적인 단일가닥핵산(F-NA 또는 Q-NA)의 염기서열 길이는 9개 내지 11개인 경우를 사용하는 것이 바람직함을 확인하였다.
실시예 3. 분자비콘의 형광측정
상기 실시예 1-1에서 제조된 100 nM의 분자비콘(1)을 버퍼에 용해시키고, 94℃에 5분, 22℃ 및 37℃에서 30분간 처리한 다음, 형광측정장치(Turner Biosystem 사, PicofluorTM, Handheld Dual Channel Fluorometer)로 형광을 측정하였다(도 4). 이때, 사용한 반응용액은 50mM의 트리스(Tris)·염산(pH 7.4), 5mM의 염화칼륨, 100mM의 염화나트륨, 1mM의 염화마그네슘, 0.1% 소듐아지드를 함유한 선택버퍼 및 0.2% 우혈청알부민을 포함하는 선택버퍼를 사용하였다.
또한, 상기 실시예 1-2에서 제조된 분자비콘(2)의 경우, 100 nM의 단일가닥핵산(F-NA - H-NA - R-NA) 및 300 nM의 Q-NA를 버퍼에 용해시키고, 94℃에 5분, 22℃ 및 37℃에서 30분간 처리한 다음, 형광측정장치(Turner Biosystem 사, PicofluorTM, Handheld Dual Channel Fluorometer)로 형광을 측정하였다. 이때, 사용한 반응용액은 50mM의 트리스(Tris)·염산(pH 7.4), 5mM의 염화칼륨, 100mM의 염화나트륨, 1mM의 염화마그네슘, 0.1% 소듐아지드를 함유한 선택버퍼 및 0.2% 우혈청알부민을 포함하는 선택버퍼를 사용하였다.
그 결과, 대조군인 40 nM F-NA의 형광치는 1020이었다. 한편, 분자비콘(1)의 경우 22℃에서는 40 형광치이고, 37℃에서는 120 형광치를 나타내었으며, 분자비콘(2)의 경우 또한 유사한 결과를 얻었다. 22℃에서는 F-NA의 5'말단에 표지된 형광을 인접한 Q-NA의 3'말단에 표지된 소진제(Quencher)가 소멸시키기 때문이며, 분자비콘의 안정성이 낮아지는 37℃에서는 R-NA에 상보적으로 결합되어 있던 F-NA 또는 Q-NA가 해리되어 이로인해 F-NA의 5' 말단에 표지된 형광이 증가되기 때문이다.
실시예 4. 단일가닥핵산 분자비콘을 이용한 특정물질의 분석
본 발명에 의해 제조된 분자비콘을 이용하여 특정물질의 동정 및 정량분석을 실시하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제조된 80 nM의 분자비콘(1) 및 1μM의 TNF-α (Genzyme Inc., Cambridge Mass.)시료를 동시에 37℃에서 30분간 및 22℃에서 10분간 반응시킨 후, 형광측정장치로 형광을 측정하였다. 이때, 사용된 반응용액은 50mM의 트리스(Tris)·염산(pH 7.4), 5mM의 염화칼륨, 100mM의 염화나트륨, 1mM의 염화마그네슘, 0.1% 소듐아지드를 함유한 선택버퍼 및 0.2% 우혈청알부민을 포함하는 선택버퍼를 사용하였다. 상기 실험은 3번 반복 수행하였으며, 시료 처리 전후의 형광치 변화를 관찰하였다(도 5).
그 결과, 첫 번째는 910, 두 번째는 900, 세 번째는 930 형광치를 보였다. 즉, 시료의 TNF-α가 분자비콘과 결합하여 복합체를 형성하였으며, 분자비콘-TNF-α 복합체에 의해 형광을 발생하는 양이 증가하여 형광치가 상대적으로 증가되었음을 확인하였다. 따라서, 특정시료의 확인 및 정량적인 분석이 가능함을 확인하였다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 분자비콘 및 상기 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 정량분석은 미생물, 세포, 단백질을 포함하는 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석 등에 사용할 수 있어 궁극적으로는 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용될 수 있다.
도 1 은 본 발명의 분자비콘 구성을 나타낸 도면이고,
도 2 은 단일가닥핵산의 다양한 염기서열 길이(a는 염기 15 개 이상, b는 염기 9 내지 11, c는 염기 7 이하의 경우) 및 온도(22℃ 와 37℃의 경우)에 대한 안정성 여부를 나타낸 도면이고,
도 3 은 분자비콘의 작용에 관한 개략도이고,
도 4 은 분자비콘와 특정물질 복합체 형성에 있어서, 온도(22℃ 및 37℃)에 따른 반응안정성을 나타낸 도면이고,
도 5 은 분자비콘으로 특정물질을 동정, 분석하는 방법을 나타낸 도면이다.
<110> GenoProt Inc. KIM, Sung Chun <120> Method for identification and analysis of specific molecules using molecular beacons <130> DIF/2004-03-0021/CHC <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand nucleic acid ligand for TNF alpha <400> 1 gucgaacuag cgcuggagcg ugcguuggu 29 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorescence-tagged complementary sequence of single strand nucleic acid ligand for TNF alpha <400> 2 ccagcgctag 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Quencher-tagged complementary sequence of single strand nucleic acid ligand for TNF alpha <400> 3 cttcgcacgc 10

Claims (10)

  1. 특정물질의 분석을 위한 단일가닥 핵산 리간드(R-NA), 5' 말단부분에 형광물질(Fluorophore, F)이 결합된 단일가닥핵산(F-NA), 3'말단부분에 형광신호를 제어하는 물질(Quencher, Q)이 결합된 단일가닥핵산(Q-NA) 및 상기 R-NA와 F-NA 사이 또는 R-NA와 Q-NA 사이를 연결하는 단일가닥핵산(H-NA)로 구성된 분자비콘(molecular beacon).
  2. 제 1항에 있어서, F-NA 및 Q-NA는 상기 단일가닥 핵산 리간드와 상보적인 서열이고, H-NA는 5 내지 15개의 핵산서열인 것을 특징으로 하는 분자비콘.
  3. 제 2항에 있어서, F-NA와 Q-NA는 1 내지 10 bp의 거리를 두고 단일가닥 핵산 리간드와 상보적인 결합을 이루는 것을 특징으로 하는 분자비콘.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, F-NA와 Q-NA는 8 내지 12 bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 또는 5 내지 20 펩티드 핵산서열인 것을 특징으로 하는 분자비콘.
  5. (i) 단일가닥 핵산의 염기서열 및 길이를 설계하여 제 1항의 분자비콘을 제조하는 제 1단계 ; (ⅱ) 제 1단계에서 제작된 분자비콘과 특정물질이 포함된 시료와 반응하여 복합체를 형성하는 제 2단계; 및 (ⅲ) 제 2단계에서 형성된 복합체를 탐색하는 제 3단계를 포함하는 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 제 1단계의 단일가닥 핵산은 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)법에 의해 선정된 단일가닥핵산리간드에 기초하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 제 2단계의 특정물질은 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 분석방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 제 2단계의 반응을 위한 온도는 15 ~ 40℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 제 3단계의 탐색은 해리된 F-NA의 형광물질을 탐지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 특정물질에 대한 특이적 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 리간드을 포함하는 분자비콘 및 반응용액을 포함하는 특정물질의 동정 및 정량적 분석을 위한 분석키트.
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