CN114410741A - 简便rna建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种简便RNA建库方法，其特征在于：其步骤包括：(1)提取样本中RNA，加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化；(2)RNA逆转录，获得DNA/RNA杂交双链；(3)接头连接：使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头；(4)文库扩增及回收。本发明的简便RNA建库方法，利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理，只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步，极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合使用rRNA逆转录阻碍探针快速去除rRNA的技术，可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个过程仅需2h，操作简单、RNA损失小、成本低，非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种简便RNA建库方法，属于生物技术领域。
背景技术
RNA二代测序技术(RNA Next-generation sequencing,RNA-seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此，RNA-seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。
RNA NGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程，是RNA-seq的关键步骤。传统的RNA建库方法操作繁琐，需要通过RNA片段化、逆转录、二链合成、磁珠回收、末端修复、接头连接、磁珠回收、文库扩增和磁珠回收等9个步骤才能完成RNA文库的构建，整个流程操作繁琐，RNA损失严重、耗时长(需要5个小时)，非常不适合自动化建库和低丰度RNA建库。此外，由于RNA中包含90％左右的核糖体RNA(rRNA)，因此在RNA建库前需要进行rRNA的去除。常规的RNaseH切割法和杂交捕获法去除rRNA需要近2个小时，大大地增加了RNA建库的难度和耗时。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便RNA建库方法，极大地简化了RNA建库过程中rRNA去除的流程。
一种简便RNA建库方法，其特征在于：其步骤包括：
(1)提取样本中RNA，加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化，其中的rRNA逆转录阻碍探针可以参考202110257924.X记载的内容，在该步骤中，片段化的过程与逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针退火的过程是同步进行的，更节约程序；
(2)RNA逆转录，获得DNA/RNA杂交双链；
(3)接头连接：使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头；
(4)文库扩增及回收。
优选的，步骤(3)中平末端双链DNA接头是由AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT和CTCTTCCGATCT两条序列退火形成的双链DNA接头，GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT长链的5’端预腺苷化，3’端进行NH2C6修饰或者ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭；CTCTTCCGATCT短链的3’进行ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭。
优选的，双链DNA接头中长链与短链按照1：2-1：100的摩尔浓度比例混合后进行退火。
优选的，双链DNA接头使用浓度为0.01-1uM。
优选的，步骤(3)的连接反应使用的反应缓冲液中包含10-200mM三羟甲基氨基甲烷、3-30mM氯化镁、3-30mM二硫苏糖醇和3-30％聚乙二醇8000。
优选的，步骤(1)中逆转录引物序列为GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCN6-20，其中N6-20为6-20个碱基的随机引物。
优选的，逆转录引物的使用浓度为10-500uM。
优选的，步骤(1)中片段化的程序为95℃7min，75℃1min，55℃1min，保存于25℃。
优选的，步骤(2)中逆转录体系包括逆转录酶，所述逆转录酶为AMV、M-MLV、TGIRT和RTX逆转录酶的一种或多种。
优选的，所述逆转录酶的使用浓度为5-1000uM。
优选的，逆转录反应体系还包含10-100mM三羟甲基氨基甲烷、50-150mM氯化钾、1-5mM氯化镁、2-10mM二硫苏糖醇和0.2-5U的RNA酶抑制剂；逆转录反应的程序为25℃10min，42℃15min，70℃5min。
本发明的简便RNA建库方法，利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理，只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步，极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合使用rRNA逆转录阻碍探针快速去除rRNA的技术，可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个建库过程仅需2h，操作简单、RNA损失小、成本低，非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。
附图说明
图1随机引物长度对逆转录效率的影响。
图2简便RNA建库原理和流程示意图。
图3简便RNA建库文库电泳结果。
图4用于简便RNA建库的逆转录酶筛选。
图5用于简便RNA建库的DNA聚合酶筛选。
图6简便RNA建库和传统RNA建库流程对比。
图7简便RNA建库和传统RNA建库文库产量对比。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示，N为随机碱基，即A、T、C、G中任意一种碱基。
表1探针及引物序列
实施例1：随机引物长度对逆转录效率的影响
在本实施例中，我们验证了6-20nt随机引物长度(表1序号1-8)对逆转录效率的影响。具体实施方式如下：
表2
94℃2min，94℃-25℃0.1℃/s，4℃保存。
表3
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 16μL |
| 0.1M DTT | 2μL |
| SuperScript<sup>TM</sup> III RT(200U/μL，ThermoFisher) | 1μL |
| SUPERase·In<sup>TM</sup> RNase抑制剂(20U/μL) | 1μL |
| Total | 20μL |
25℃10min，42℃15min，85℃5min，4℃保存。对Actin和28S RNA进行qPCR定量分析，定量引物见表1。
结果如图1所示，8-14个碱基的随机引物具有更好的逆转录效率。
实施例2：简便RNA建库流程的建立。
在本实施例中，我们建立了简便RNA建库的流程。具体实施方式如下：
P5接头退火：将100μM P5-1与100μM P5-2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃5min，94-15℃0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
1)RNA片段化和核糖体RNA去除：
表4：
| 组分 | 用量 |
| RNA | 10pg-1μg |
| 0.3mM P7-N10 | 1μL |
| rRNA逆转录阻碍探针(202110257924.X) | 1μL |
| 5×First-Strand Buffer | 2μL |
| 10mM dNTPs | 1μL |
| 补DEPC水至 | 7μL |
5×First-Strand Buffer:250mM Tris，375mM KCl，15mM MgCl2，pH 8.3。
94℃10min，75℃1min，55℃1min，4℃保存。
2)RNA逆转录
表5
25℃10min，42℃15min，70℃5min，4℃保存。
3)预腺苷化平末端双链DNA接头连接
表6
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 10μL |
| 5×Ligation Buffer | 3μL |
| T4 DNA ligase K159L(1000U/μL) | 1μL |
| 10μM P5接头(表1序号9-10) | 1μL |
| Total | 15μL |
5×Ligation Buffer：80mM Tris,24mM MgCl2。
15-40℃15min，4℃保存。
4)文库扩增及回收
表7
5×HiFi Buffer：25mM Tris,100mM(NH4)2SO4，700mM KCl,0.05％Triton X-100,1.5mM dNTPs,4M海藻糖,25％DMSO,pH 7.5。
98℃3min，7-22cycles(98℃10s，60℃30s，72℃30s)，72℃3min，保存于4℃。
反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。
简便RNA建库原理如图2所示，RNA经逆转录后转化成DNA/RNA杂交双链，使用T4DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头。由于T4 DNA连接酶突变体K159L只能催化带有腺苷酰化修饰接头的连接，所以这种连接方式基本不存在接头和底物自连。文库大小分布如图3，简便RNA建库具有良好的建库产出和文库大小分布。
实施例3：逆转录酶的筛选。
在本实施例中，我们筛选了适用于简便RNA建库的逆转录酶，具体实施方式与实施例2相同。结果如图4所示，各种逆转录酶均具有很好的文库产出，其中Hifair III逆转录酶建库效果最好。
实施例4：DNA聚合酶的筛选。
在本实施例中，我们筛选了适用于简便RNA建库的DNA聚合酶，具体实施方式与实施例2相同。结果如图5所示，各种DNA聚合酶均具有很好的文库产出。
实施例5：不同RNA投入量建库。
在本实施例中，我们利用搭建好的简便RNA建库体系，验证10pg-1ug RNA的建库效果，具体实施方式与实施例2相同。结果如表8所示，简便RNA建库技术对10pg-1ug的RNA投入量以及单细胞都具有很好的建库产量和rRNA去除效果。这说明简便RNA建库技术能够适用于复杂投入量范围的RNA建库，尤其是低投入量(甚至是单细胞)的RNA建库。
表8
| RNA投入量 | 循环数 | 文库产出/ng | rRNA占比 | 比对率 |
| 1000ng | 10 | 541 | 0.8％ | 99.8％ |
| 100ng | 12 | 313 | 0.9％ | 99.7％ |
| 10ng | 15 | 309 | 1.7％ | 99.2％ |
| 1ng | 18 | 248 | 3.1％ | 98.6％ |
| 100pg | 22 | 257 | 4.9％ | 96.1％ |
| 10pg | 25 | 201 | 5.3％ | 93.3％ |
| 单细胞 | 26 | 229 | 7.2％ | 92.5％ |
实施例6：简便RNA建库与常规RNA建库的比较。
在本实施例中，我们比较了常规RNA建库与简便RNA建库的性能，常规rRNA法建库使用New England Biolabs的
rRNA Depletion Kit和UltraTM II DirectionalRNA Library Prep Kit for Illumina按照其说明书进行文库构建。
两种建库流程见图6，简便RNA建库可以极大简化RNA建库的流程，在2个小时即可完成RNA文库的构建。建库结果如图7，在文库产量上，简便RNA建库产量更高，这说明简便RNA建库对RNA模板的利用率更高，损失更小。
综上，本发明的简便RNA建库方法利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理，只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步，极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合我们公布的快速rRNA去除技术(202110257924.X)，可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个过程建库过程仅需2h，操作简单、RNA损失小、成本低，非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。
Claims (10)
1.一种简便RNA建库方法，其特征在于：其步骤包括：
(1)提取样本中RNA，加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化；
(2)RNA逆转录，获得DNA/RNA杂交双链；
(3)接头连接：使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头；
(4)文库扩增及回收。
2.根据权利要求1所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(3)中平末端双链DNA接头是由AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT和CTCTTCCGATCT两条序列退火形成的双链DNA接头，GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT长链的5’端预腺苷化，3’端进行NH2C6修饰或者ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭；CTCTTCCGATCT短链的3’进行ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭。
3.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法，其特征在于：双链DNA接头中长链与短链按照1：2-1：100的摩尔浓度比例混合后进行退火。
4.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法，其特征在于：双链DNA接头使用浓度为0.01-1uM。
5.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(3)的连接反应使用的反应缓冲液中包含10-200mM三羟甲基氨基甲烷、3-30mM氯化镁、3-30mM二硫苏糖醇和3-30％聚乙二醇8000。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(1)中逆转录引物序列为GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCN6-20，其中N6-20为6-20个碱基的随机引物。
7.根据权利要求6所述的简便RNA建库方法，其特征在于：逆转录引物的使用浓度为10-500uM。
8.根据权利要求7所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(1)中片段化的程序为95℃7min，75℃1min，55℃1min，保存于25℃。
9.根据权利要求1所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(2)中逆转录体系包括逆转录酶，所述逆转录酶为AMV、M-MLV、TGIRT和RTX逆转录酶的一种或多种，所述逆转录酶的使用浓度为5-1000uM。
10.根据权利要求9所述的简便RNA建库方法，其特征在于：逆转录反应体系还包含10-100mM三羟甲基氨基甲烷、50-150mM氯化钾、1-5mM氯化镁、2-10mM二硫苏糖醇和0.2-5U的RNA酶抑制剂；逆转录反应的程序为25℃10min，42℃15min，70℃5min。
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