JP7542672B2 - 核酸を解析するための方法および組成物 - Google Patents

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Description

関連特許出願
本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号ＣＢＳ－２００１－ＰＶにより指定される、２０１８年１月１２日に出願した米国仮特許出願第６２／６１７，０５５号の利益を主張するものである。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号ＣＢＳ－２００１－ＰＶ２により指定される、２０１８年１月１７日に出願した米国仮特許出願第６２／６１８，３８２号の利益を主張するものでもある。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号ＣＢＳ－２００１－ＰＶ３により指定される、２０１８年１１月２０日に出願した米国仮特許出願第６２／７６９，７８７号の利益を主張するものでもある。上述の出願の全内容は、本文、表および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
本技術は、一部は、核酸を解析するための方法および組成物に関する。一部の態様では、本技術は、核酸ライブラリーを調製するための方法および組成物に関する。一部の態様では、本技術は、核酸断片の末端を解析するための方法および組成物に関する。
生命体（例えば、動物、植物および微生物）および遺伝情報を複製する他の形態（例えば、ウイルス）の遺伝情報は、核酸（すなわち、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））にコードされている。遺伝情報は、化学的核酸または仮説的核酸の一次構造に相当するひと続きのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。
様々なハイスループットシーケンシングプラットフォームが、核酸を解析するために使用される。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームは、アダプターがライゲーションされたＤＮＡ断片のクローン増幅を含む。別のプラットフォームは、核酸分子または個々のヌクレオチドが小さいチャネルを通って移行することに依拠する、ナノポアに基づくシーケンシングである。ある特定のシーケンシングプラットフォームのライブラリー調製は、ＤＮＡの断片化、断片末端の修飾、およびアダプターのライゲーションを含むことが多く、核酸断片の増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）を含むことがある。
特定のタイプの核酸解析のための適切なシーケンシングプラットフォームの選択は、誤りの原因、誤り率、ならびにシーケンシングの速度およびコストを含む、利用可能な技術についての詳細な理解を必要とする。シーケンシングコストは低下してきたが、ライブラリー調製のスループットおよびコストは、制限要因であり得る。ライブラリー調製の一態様は、核酸断片の末端を、それらが特定のシーケンシングプラットフォームに好適であるように、修飾することを含む。核酸末端は、有用な情報を含有し得る。したがって、核酸末端に含有されている情報を保存しつつ、核酸末端を（例えば、ライブラリー調製のために）修飾する方法は、核酸の処理および解析に有用であると予想される。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、ａ）標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み；ｄ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、方法が、提供される。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、ループが、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含み、ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；ｂ）ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内のＲＮＡヌクレオチドで切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、ループが、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含み；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸中のオーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸末端を修飾する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、切断条件下で切断され得る１つまたは複数の切断部位を含み、ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖および第１のオーバーハングおよび第２のオーバーハングを含み、各オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第１および第２のオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；ｂ）ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物を１つまたは複数の切断部位で切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップと；ｃ）切断されたハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、切断条件下で切断され得る１つまたは複数の切断部位を含み；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖および第１のオーバーハングおよび第２のオーバーハングを含み、各オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第１および第２のオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸末端を修飾する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；ｂ）ハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸末端を修飾する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第１の末端のオーバーハングが、パリンドローム配列を含み、ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端にオーバーハングを含み、第２の末端のオーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有の第２の末端のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、ｉｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第２の末端のオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、ｖｉ）第１の末端のオーバーハングが、他の第１の末端のオーバーハングとハイブリダイズし、第２の末端のオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによって環状ハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；ｂ）ハイブリダイゼーション産物とエキソヌクレアーゼとを接触させることによって、エキソヌクレアーゼ処理されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと；ｃ）エキソヌクレアーゼ処理されたハイブリダイゼーション産物をせん断することによって、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと；ｄ）オリゴヌクレオチド種における配列を含む断片を、オリゴヌクレオチド種における配列を含まない断片から分離することによって、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断され、分離されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第１の末端のオーバーハングが、パリンドローム配列を含み；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端にオーバーハングを含み、第２の末端のオーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有の第２の末端のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第２の末端のオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み；ｄ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸末端を修飾する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（１）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；ｂ）ハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、ｉ）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、またはｉｉ）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸末端を修飾する方法であって、標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、ＲＮＡヌクレオチドを含む少なくとも１つのオーバーハングを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｂ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み；ｄ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、方法が、提供される。
一部の態様では、複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、ＲＮＡヌクレオチドを含む少なくとも１つのオーバーハングを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールとを結合させるステップであって、ｉ）標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含み、ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールが結合し、それによって結合産物の第１のセットが形成される、ステップと；ｂ）結合産物の第１のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと；ｃ）切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールとを結合させるステップであって、ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の末端および第２の末端を含み、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含み、第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なり、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、第１の末端において、切断産物の少なくとも１つの末端に結合する条件下で、切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールが結合し、それによって結合産物の第２のセットが形成される、ステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、ａ）オリゴヌクレオチド種の第１のプールであって、ｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、第１のプールと；ｂ）オリゴヌクレオチド種の第２のプールであって、ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の末端および第２の末端を含み、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、第２のプールとを含み；第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なる、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールとを結合させるステップであって、ｉ）標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを第１の末端に含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含み、ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールが結合し、それによって結合産物の第１のセットが形成される、ステップと；ｂ）結合産物の第１のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと；ｃ）切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールとを結合させるステップであって、ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖より短く、第１の鎖と第２の鎖が、オリゴヌクレオチドの第１の末端において相補的であり、第２の鎖が、オリゴヌクレオチドの第２の末端における一本鎖を含み、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の第２のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２の鎖上に第２のプライマー結合ドメインを含み、第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なり、ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、切断産物の少なくとも１つの末端に結合する条件下で、切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールが結合し、それによって結合産物の第２のセットが形成される、ステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、ａ）オリゴヌクレオチド種の第１のプールであって、ｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、第１のプールと；ｂ）オリゴヌクレオチド種の第２のプールであって、ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖より短く、第１の鎖と第２の鎖が、オリゴヌクレオチドの第１の末端において相補的であり、第２の鎖が、オリゴヌクレオチドの第２の末端における一本鎖を含み、ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の第２のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２の鎖上に第２のプライマー結合ドメインを含む、第２のプールとを含み；第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なる、組成物も、提供される。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸を生成するステップであって、標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含む、ステップと；ｂ）脱リン酸化された標的核酸と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、核酸を解析する方法であって、ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、ｉ）標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、ｉｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；ｂ）ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成するステップであって、配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含む、ステップと；ｃ）リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成し、フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップとを含む方法が、提供される。
一部の態様では、核酸の集団をアッセイする方法であって、試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングをアッセイするステップであって、それによって集団のオーバーハングプロファイルを生成するステップと；オーバーハングプロファイルに基づいて、試料の特性を判定するステップとを含む方法が、提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるある特定の方法またはある特定の方法の部分を実行する、システム、機械およびコンピュータプログラム製品も、提供される。
ある特定の実施形態は、下記の説明、実施例、特許請求の範囲および図面でさらに説明される。
図面は、本技術のある特定の実施形態の説明に役立つものであり、限定するものではない。説明を明確かつ容易にするために、図面は、正確な縮尺で作成されたものではなく、一部の事例では、様々な態様が、特定の実施形態の理解を助長するために、誇張または拡大して示されることがある。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸ライブラリーを生成する方法であって、
標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
ａ）前記標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み；
ｂ）前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含み、前記オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
ｃ）前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み；
ｄ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、前記核酸組成物と前記複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。
（項目２）
前記複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、第１の末端にオーバーハングを含み、二重鎖部分を含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、項目６に記載の方法。（項目８）
前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、項目６、７または８に記載の方法。
（項目１０）
オーバーハングを含まない前記オリゴヌクレオチドが、平滑末端化された第１の末端を含み、二重鎖部分を含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
オリゴヌクレオチドの末端が、前記ハイブリダイゼーション産物において前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物において前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる前記標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域と、２本の非相補鎖を含む少なくとも１つの末端とを含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域を含み、各末端に２本の非相補鎖を含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
オーバーハングを含む前記標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。（項目２３）
前記標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
標的核酸中の前記オーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
標的核酸中の前記オーバーハングが、未修飾オーバーハングである、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記標的核酸が、前記複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされる前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、前記ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
標的核酸の末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、前記ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
標的核酸の５’末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合で連結される条件下で、前記ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させることによって、ライゲーション産物を形成するステップを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
標的核酸の３’末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合で連結される条件下で、前記ライゲーション産物とニックシーリングリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させることによって、ニックがシールされたライゲーション産物を形成するステップを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ライゲーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップの前に、前記標的核酸とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸を生成するステップを含む、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記脱リン酸化された標的核酸とホスホリル転移活性を有する作用因子とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップの前に、前記複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、前記オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、項目１～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記オリゴヌクレオチド種の前記第２の末端の前記２本の非相補鎖のうちの少なくとも一方が、プライマー結合ドメインを含む、項目１～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記オリゴヌクレオチド種の前記第２の末端の前記２本の非相補鎖の各々が、プライマー結合ドメインを含む、項目１～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記非相補鎖の一方が、第１のプライマー結合ドメインを含み、他方の非相補鎖が、第２のプライマー結合ドメインを含み、前記第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成するステップであって、前記配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含む、ステップを含む、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成し、前記フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を前記解析から削除するステップを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記標的核酸が、対象からの試料から得られる、項目１～３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記対象がヒトである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
核酸ライブラリーを生成する方法であって、
ａ）標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールとを結合させるステップであって、
ｉ）前記標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを第１の末端に含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含み、
ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、前記核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の前記第１のプールが結合し、それによって結合産物の第１のセットが形成される、ステップと；
ｂ）結合産物の前記第１のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと；
ｃ）前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールとを結合させるステップであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の鎖および第２の鎖を含み、前記第１の鎖が、前記第２の鎖より短く、前記第１の鎖と前記第２の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第１の末端において相補的であり、前記第２の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第２の末端における一本鎖を含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の前記第２のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖上に第２のプライマー結合ドメインを含み、前記第１のプライマー結合ドメインと前記第２のプライマー結合ドメインが異なり、
ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物の少なくとも一方の末端に結合する条件下で、前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の前記第２のプールが結合し、それによって結合産物の第２のセットが形成される、ステップと
を含む方法。
（項目４３）
ｄ）増幅条件下で、結合産物の前記第２のセットと２つまたはそれより多くの増幅プライマー種とを接触させることによって、増幅産物を生成するステップであって、第１のプライマー種が、前記第１のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のプライマー種が、前記第２のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む、ステップ
をさらに含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記標的核酸が、５００ｂｐより大きい核酸断片を含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記標的核酸が、１０００ｂｐより大きい核酸断片を含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４６）
（ｂ）が、結合産物の前記第１のセットと、前記結合産物を切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることを含む、項目４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
（ｂ）が、機械的せん断を含む、項目４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドの前記第２の末端の結合を遮断することができる、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、前記第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目４２～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、前記切断産物への前記オリゴヌクレオチドの前記第２の末端の結合を遮断することができる、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングするステップをさらに含む、項目４３～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記シーケンシングプロセスが、短い配列リードを生成する、項目５２に記載の方法。（項目５４）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、項目４２～５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、二重鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、（１）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、項目５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、項目５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、項目４２～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、項目５９、６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の前記第１のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、項目４２～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、結合産物の前記第１のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる前記標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
（ｂ）の後に前記切断産物の末端を修復するステップを含む、項目４２～６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
（ｂ）の後に前記切断産物の前記末端に１つまたは複数の不対合ヌクレオチドを付加させるステップを含む、項目４２～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物に付加された前記１つまたは複数のヌクレオチドに相補的である１つまたは複数のヌクレオチドを前記第１の末端に含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記第１の末端において、前記切断産物の少なくとも一方の末端とハイブリダイズする、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の前記第２のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドが結合される切断産物の末端に共有結合で連結され得る、項目４２～６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、結合産物の前記第２のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドが結合される前記切断産物の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、ネイティブ標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含まない、項目４２～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含まない、項目４２～７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上の前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、項目４２～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上の前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、項目４２～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、項目４２～７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、項目４２～７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
オーバーハングを含む前記標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、項目４２～７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、項目４２～７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、項目４２～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、項目４２～７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、項目８０または８１に記載の方法。
（項目８３）
前記標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、項目４２～８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、項目４２～８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
標的核酸の前記オーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、項目４２～８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
標的核酸中の前記オーバーハングが、未修飾オーバーハングである、項目４２～８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記標的核酸が、前記複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さについて修飾されない、項目４２～８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされる前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の前記第１のセットを曝露するステップを含む、項目４２～８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
標的核酸の末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の前記第１のセットとリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記切断産物の末端が、それが結合される前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の前記第２のセットを曝露するステップを含む、項目４２～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
切断産物の末端が、前記標的核酸が結合される前記オリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の前記第２のセットとリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
（ａ）の前に、前記標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、項目４２～９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
（ａ）の前に、前記脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する作用因子とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
（ａ）の前に、オリゴヌクレオチド種の前記第１のプールとホスファターゼ活性を有する作用因子とを、前記オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種の第１のプールを生成するステップを含む、項目４２～９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
（ｃ）の前に、オリゴヌクレオチド種の前記第２のプールとホスホリル転移活性を有する作用因子とを、５’リン酸が前記第１の鎖の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、項目４２～９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記標的核酸が、対象からの試料から得られる、項目４２～９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記対象がヒトである、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
（ａ）の前に、前記標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、項目４２～９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記標的核酸が、（ａ）の前に長さによって分離されない、項目４２～９７のいずれか一項に記載の方法。
図１Ａ～図１Ｃは、ヘアピンアダプター構成の例を示す。図１Ａは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプライミング部位（Ｐ５およびＰ７）が組み込まれており、チミン－アデニン（ＴＡ）ライゲーション用の単一の３’オーバーハングチミン（Ｔ）と、リン酸化された５’末端とを有する、シーケンシングアダプターのステムループ構造を示す。図１Ｂは、リン酸化されているのではなく、存在するオーバーハング（ＯＶ）のタイプおよび長さを示す固有末端識別子（ＵＥＩ）を含む、アダプターを示す。図１Ｃは、固有分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含むアダプターを示す。ヌクレアーゼ活性によるチューバックを防止するために、オリゴ／アダプターの両方の末端の最後の２塩基間にホスホロチオエート結合が存在する。＊、ホスホロチオエート結合。Ｇ、グアニン（ＲＮＡ塩基）。Ｔ、チミン。ＵＥＩ、固有末端識別子。ＵＭＩ、固有分子識別子。ＯＶ、オーバーハング。Ｐ、リン酸。Ｐ５、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５アダプター配列。Ｐ７、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７アダプター配列。 図２Ａは、短い挿入物を有するアダプター（上部）または長い挿入物を有するアダプター（下部）の例を示す。５’オーバーハングを有する、短い挿入物のアダプターの例が、上部左側に示されており、３’オーバーハングを有する、短い挿入物のアダプターの例が、上部右側に示されている。ＯＶ、オーバーハング。ＵＥＩ、固有末端識別子。Ａ、アデニン。Ｕ、ウラシルまたはデオキシウリジン。図２Ｂは、３’オーバーハングを有する、短い挿入物のアダプターを使用する、ワークフローの例を示す。第１のステップは、ＤＮＡ鋳型をリン酸化することを含む。ここに例示されているように、鋳型の例は、上および下の鎖上に３’オーバーハングを有する。次のステップは、リン酸化された鋳型に３’オーバーハングＵＥＩアダプターをライゲーションすることを含む。示されているように、ニックがライゲーション産物に存在する。さらなるステップは、ＵＥＩアダプターＤＮＡ鎖をデオキシウリジンで酵素的に切断することを含む。さらなるステップは、鎖置換ポリメラーゼを使用してニックでフィルインして、完全な二本鎖分子を形成することを含む。無処理のままであるまたはフィルインされた、ライゲーションされていないまたは残留ＵＥＩアダプターを、消失させることができる。Ａ、アデニン。Ｕ、ウラシルまたはデオキシウリジン。Ｐ、リン酸。 同上。 図３は、元のＤＮＡ抽出物（サイズ選択されていない）からの、ならびに二重ＳＰＲＩ選択によって高分子量（ＨＭＷ）および低分子量（ＬＭＷ）断片へとサイズ選択された、マッピングされたライブラリー分子長を示す。パネルＡは、ｉｎｄｉｖ１全ＤＮＡ、精製スタイル１についての結果を示す。パネルＢは、ｉｎｄｉｖ１全ＤＮＡ、精製スタイル２についての結果を示す。パネルＣは、ｉｎｄｉｖ１ ＨＭＷ画分についての結果を示す。パネルＤは、ｉｎｄｉｖ１ ＬＭＷ画分についての結果を示す。パネルＥは、ｉｎｄｉｖ２ ＬＭＷ画分についての結果を示す。パネルＦは、ｉｎｄｉｖ２ ＨＭＷ画分についての結果を示す。 図４は、固有末端識別子（ＵＥＩ、「バーコード」）が、末端上に存在しない（０）、１つの末端上に存在する（１）、または両方の末端に正しく存在する（２）、ペアエンドでマッピングされたリードを示す。パネルＡは、ｉｎｄｉｖ１全ＤＮＡ、精製スタイル１についての結果を示す。パネルＢは、ｉｎｄｉｖ１全ＤＮＡ、精製スタイル２についての結果を示す。パネルＣは、ｉｎｄｉｖ１ ＨＭＷ画分についての結果を示す。パネルＤは、ｉｎｄｉｖ１ ＬＭＷ画分についての結果を示す。パネルＥは、ｉｎｄｉｖ２ ＬＭＷ画分についての結果を示す。パネルＦは、ｉｎｄｉｖ２ ＨＭＷ画分についての結果を示す。 図５は、様々な位置に遮断物がある固有末端識別子（ＵＥＩ）アダプターの例を示す。 図６は、遮断された固有末端識別子（ＵＥＩ）アダプターのリン酸化された鋳型へのライゲーション、ニックでのフィルイン、および平滑末端化された二本鎖分子の作出を含む、ワークフローの例を示す。Ｐ、リン酸。ＵＥＩ、固有末端識別子。イソ－ｄＣ、イソデオキシ－シトシン。 図７Ａ～図７Ｃは、シーケンシングライブラリー中の無細胞ＤＮＡ断片についての、ホスファターゼ処理なし（図７Ａ）、無細胞ＤＮＡ鋳型のホスファターゼ処理（図７Ｂ）、ならびに鋳型およびライブラリーアダプターのホスファターゼ処理（図７Ｃ）という３つの条件下での、サイズ分布を示す、テープステーション結果（すなわち、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００）を示す。アダプター－ダイマーアーチファクトは、約１２０ｂｐで予想される。１ヌクレオソームは、２８０～２９０ｂｐでピークに達し、追加のヌクレオソームごとに約１７０ｂｐずつ増すと予想される。図７Ａ～図７Ｃは、アダプターダイマーの低減および無細胞ＤＮＡ関連ピークの相対的増加により例証される、ホスファターゼ処理後の改善を実証する。 同上。 同上。 図８Ａは、１つの５’パリンドロームオーバーハングを有し、かつ、様々な長さの５’および３’ランダムオーバーハングを有する、アダプターセットの例を示す。図８Ｂは、ネイティブ５’および３’オーバーハングを有する、長いｄｓＤＮＡ断片（高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡ鋳型）にライゲーションされたオーバーハングアダプターセットを示す。図８Ｂの説明図は、上から下へ、「メイトペア」ＤＮＡ調製のステップ３（ライゲーション）、ステップ５（せん断）およびステップ６（ビオチン化断片を単離する）後の例を示す。ＵＥＩ、固有末端識別子。ＯＶ、オーバーハング。 同上。 図９Ａは、第１相で鎖置換ポリメラーゼを使用して固有末端識別子（ＵＥＩ）配列を結合させ、第２相でシーケンサー特異的配列（例えば、シーケンシングアダプター）を結合させる方法の例を示す。パネルＡは、固有末端識別子（ＵＥＩ）配列（灰色で示す）およびランダム配列（黒色で示す）で構成されている、Ｙアダプター（左側）およびヘアピンアダプター（右側）を示す。一部の事例では、Ｙアダプターは、ヘアピンアダプターの切断されたバージョンである。パネルＢは、標的核酸へのヘアピンアダプターのライゲーションを示し、このライゲーション産物を切断することができる。切断後のライゲーション産物は、Ｙ－アダプターライゲーション産物と同じである。パネルＣは、完全相補的二本鎖の平滑末端化された断片を作出するための鎖置換ポリメラーゼによるニックでのフィルインステップを示す。パネルＤは、最適な任意のシーケンシングライブラリー調製のための準備が整った状態である核酸断片（第２相）を示す。Ｘ、切断可能な部位。ＵＥＩ、固有末端識別子。ＯＶ、オーバーハング。Ｐ、リン酸。 図９Ｂは、ネイティブ核酸断片の末端にＹアダプターまたはヘアピンアダプターを結合させる方法を示す。パネルＡは、オーバーハングと、固有末端識別子（ＵＥＩ）配列（灰色で示されている）と、プライミング配列（プライミング配列１（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５プライミング配列）およびプライミング配列２（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７プライミング配列）；黒色で示されているプライミング領域）とで構成されている、Ｙアダプター（左側）およびヘアピンアダプター（右側）を示す。パネルＢは、標的核酸へのアダプターのライゲーションを示す。アダプターがリン酸化されないので、ライゲーションは、鋳型の５’末端でのみ起こり、ニックが残る。パネルＣは、５’アダプター鎖がリン酸化され、アダプターの３’末端をライゲーションすると、ニックが修復されることを示す。ニック修復後、ヘアピンアダプターライゲーション産物を切断部位で切断することができる（上部）。切断後のライゲーション産物は、Ｙ－アダプターライゲーション産物と同じである（下部）。この方法は、最適な任意のシーケンシングライブラリー調製のための準備が整った状態である二本鎖核酸断片（第２相）、および／または最適なシーケンサーための準備が整った状態である二本鎖核酸断片を生成し、これは、使用されるプライミング配列に依存し得る。ＯＶ、オーバーハング。Ｐ、リン酸。Ｐ１、プライミング配列１。Ｐ２、プライミング配列２。 図１０Ａ～１０Ｃは、ＲＮＡ塩基含有オーバーハング（「ＲＮＡオーバーハング」）を有するオリゴヌクレオチドアダプターを使用して固有末端識別子（ＵＥＩ）配列をネイティブＤＮＡ鋳型に結合させる方法の例を示す。図１０Ａは、ＲＮＡオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドアダプターの構成の例を示す。黒色の領域は、シーケンサー特異的アダプター配列（例えば、Ｐ５、Ｐ７）を有するまたは有さない、非相補的塩基または遮断塩基を表す。図１０Ｂおよび１０Ｃは、ＲＮＡオーバーハング末端をリン酸化ＤＮＡ鋳型にライゲーションし、その結果、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を作出する方法の例を示す。オリゴヌクレオチドアダプター構成に依存して、リガーゼまたは標準的な鎖置換フィルインにより、ニックを修復することができる。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有するアダプターダイマーを消化することができる。Ｘ、切断可能な部位。ＵＥＩ、固有末端識別子。ＯＶ、オーバーハング。Ｐ、リン酸。 同上。 同上。 図１１は、オリゴヌクレオチドアダプターを高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡに結合させる方法を示す。 図１２は、オリゴヌクレオチドアダプターを高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡに結合させる方法を示す。 図１３は、オリゴヌクレオチドアダプター設計を示す。 図１４は、オリゴヌクレオチドアダプターを高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡに結合させる方法を示す。 図１５は、感度実験の結果を示す。オーバーハング配列は、それらがリバースリードに存在した場合にのみ考慮される。パネルＡ：１００％機械的せん断ＤＮＡの２つの複製ライブラリーにわたってのオーバーハングカウントであって、合計で割った１ライブラリー当たりのオーバーハングカウント。値は、２つのライブラリーにわたっての平均値であり、エラーバーは、最大値および最小値を示す。パネルＢ：１００％ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡの２つの複製ライブラリーにわたってのオーバーハングカウントであって、合計で割った１ライブラリー当たりのオーバーハングカウント。値は、２つのライブラリーにわたっての平均値であり、エラーバーは、最大値および最小値を示す。パネルＣ：ＭｌｕＣＩの濃度の増加に伴うＭｌｕＣＩ標的配列存在量。ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡのパーセントが増加するにつれて（ｘ軸）、５’オーバーハング配列の中のその標的配列（ＡＡＴＴ）の出現頻度が増加する（ｙ軸）。複製ライブラリーが利用可能な場合、エラーバーは、最小値および最大値を示す。パネルＤ：ＭｌｕＣＩ標的配列は、１％ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡの場合であっても識別可能である。点は、すべてのオーバーハング配列のカウントの総和で割った１ライブラリー当たりの個々のオーバーハング配列のカウントである。機械的せん断ＤＮＡのみの２つの複製ライブラリーにわたってのカウント平均値（ｘ軸）が、１％ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡの２つの複製ライブラリーにわたってのカウント平均値（ｙ軸）に対して示されている。機械的せん断ＤＮＡにおけるカウントを予想値として使用して、１％ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡにおける各カウントのパーセント誤差を計算した。小数点第３位に丸められたこの値が分布の９９．９パーセンタイルに入るまたはそれより高いすべての配列が、示されている。標的配列（ＡＡＴＴ）は、最高パーセント誤差（６．２％；９９．９パーセンタイル；ｐ＜０．００１）を有する。 図１６は、ミクロコッカスヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＣＩ）により作出されたオーバーハングについてのオーバーハングプロファイルおよび塩基組成を示す。結果は、２つの独立したライブラリーの代表値である；オーバーハング存在量プロット上のエラーバーは、最大値および最小値を示す。ライブラリーの投入ＤＮＡは、ＧＭ１２８７８細胞から抽出されたヒトゲノムＤＮＡである。 図１７は、対照オリゴのヒトｃｆＤＮＡ長およびオーバーハングプロファイルに対する採血チューブの効果を示す。予想対照オリゴオーバーハング長と実測対照オリゴオーバーハング長との差異は、ＲＴＴにおける４時間までのおよび２４時間までのＹＴＴにおけるオーバーハング長の喪失を実証する。－１（１塩基分チューバックされた）と－５（分布の９９パーセンタイル）の間の予想長との差異の出現頻度が示されている。ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水 ｐＨ７．４（対照）。ＲＴＴ、赤色キャップのチューブ（血清）。ＰＴＴ、紫色キャップのチューブ（ＥＤＴＡカリウム塩）。ＹＴＴ、黄色キャップのチューブ（クエン酸塩）。Ｃｏｎｔｒｏｌ、スパイクも抽出も施されていない対照オリゴ。 図１８は、オーバーハング判定の精度を示す。フォワードリードのみからのＵＥＩに対するリバースリードのみからのＵＥＩデータ。オーバーハング判定の精度は、リバースリードの平滑形でないＵＥＩのみが考慮されたとき最も高い。Ｘ軸：リバースリードにおける非平滑形ＵＥＩを除外する、正しい対照オリゴの正しい末端にライゲーションされたＵＥＩのパーセント。Ｙ軸：同じ値、しかしフォワードリードにおける非平滑形ＵＥＩを除外する。 図１９は、提案ギャップおよびフラップの概略図を示す。ライブラリー調製プロトコールは、２つの別々の反応でライゲーションを完了する。黒色の丸は、リン酸が鋳型の５’末端に存在する、第１のライゲーションを表す。アダプターにはリン酸がないため、リン酸をアダプターの５’末端に付加するために第２のライゲーションイベント（白丸）が必要であり、これにより二本鎖ライブラリー分子の完全形成が可能になる。Ｐ５アダプターは、フォワードリードにあり、Ｐ７アダプターは、リバースリードにある。次のことが観測された：１）２本の元の鎖のうちの一方のみの過剰、および２）Ｐ５ ＵＥＩがＰ７ ＵＥＩより不正確である。まとめると、これらの観測により、ライゲーション中のオーバーハングのギャップおよびフラップに起因し得るいくつかの失敗モードの存在が明らかになった。描かれているような、１つの平滑末端と１つのオーバーハングとを有する鋳型を仮定すると、アダプターライゲーション中のいくつかの失敗モードは、２本の鎖のうちの１本を喪失させ得る。上のパネルは、５’オーバーハングの長さのミスマッチがギャップを生じさせる、誤りモードを示す。下のパネルは、３’オーバーハングの長さのミスマッチがフラップを生じさせる、誤りモードを示す。両方の場合、これらの誤りは、第１のライゲーション（黒色）中に「誤った」共有結合を余儀なくさせ、その結果、第２のライゲーション（白色）が阻害される。これは、１本の鎖のみの変換、および他の鎖の喪失をもたらす。さらに、これらの場合、Ｐ５ ＵＥＩは、間違ったオーバーハング長を報告することになるが、Ｐ７ ＵＥＩは、正しい。Ｐ７ ＵＥＩのはるかに高い精度が、それらが平滑形またはオーバーハングであるときに観測され、この理由のため、ある特定の解析中にＰ７ ＵＥＩを使用した。可能性は低いが、３’オーバーハングにギャップがまたは５’オーバーハングにフラップが生じた場合、どちらの鎖もライブラリーに変換されないと予想される。 図２０は、本明細書に記載されるオーバーハングアダプターを使用して生成された各ライブラリーに存在するＤＮＡオーバーハングのシーケンシングデータから生成されたヒートマップを示す。このヒートマップは、ウォードの階層的クラスタリング法を使用して生成された。各列は、がんドナー（黒色バー）または健康なドナー（バーなし）からの単一無細胞ＤＮＡライブラリーを表す。各行は、長さ１～６ヌクレオチドの固有オーバーハング（５’または３’）を表し、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド、すなわちＣｐＧを含有する行（オーバーハング）が灰色バーで示されている。ヒートマップ行列内では、色が濃いほど、そのオーバーハングが占めるライブラリー内での（対数スケールで描かれた）比率が増す。より薄い色は、そのオーバーハングの枯渇を示す。図の下部の目盛り：Ｎ＝５０ 報告されたがんなし；Ｎ＝２１ がん。 図２１は、ある特定のモデルで使用された変数を示す。 図２２は、健康な試料に対してがん試料についてのロジスティック回帰分類器を示す。 図２３は、健康な試料に対してがん試料についての分類レポートおよび受診者動作特性（ＲＯＣ）を示す。 図２４は、健康な試料に対して消化管（ＧＩ）がん試料についてのモデル要約を示す。 図２５は、他の試料（健康および他のがんを含む）に対して消化管（ＧＩ）がん試料についてのモデル要約を示す。
核酸の解析に有用な方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸ライブラリーの生成に有用な方法および組成物も、本明細書で提供される。核酸断片の末端の解析に有用な方法および組成物も、本明細書で提供される。ある特定の態様では、方法は、試料核酸とオリゴヌクレオチドとを結合させるステップを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、試料核酸中のオーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、試料核酸中の平滑末端にライゲーションすることができる平滑末端を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む。オリゴヌクレオチドは、異なる長さおよび異なる配列のオーバーハングを含むことができ、オーバーハング識別配列は、対応するオーバーハングの長さに特異的であり得る（およびオーバーハングの他の特徴に特徴的であり得る）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、切断部位を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造を形成することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングがあり、第２の末端に２本の非相補鎖がある。一部の実施形態では、試料核酸とオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、対応する長さおよび相補配列を有する試料核酸中のオーバーハングとハイブリダイズする条件下で結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物は、環状化核酸断片を含む。一部の実施形態では、方法は、平滑末端化核酸断片を生成するステップを含む。そのようなハイブリダイゼーション産物および／または平滑末端化核酸断片は、例えば、核酸ライブラリーの生成に、および／またはさらに解析もしくは処理に、有用であり得る。
核酸末端
核酸を解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。方法は、核酸末端を修飾するステップおよび／または解析するステップを含み得る。核酸末端は、核酸断片の末端を指す。一般に、直鎖状核酸断片は、２つの末端（すなわち、最初の部分と最後の部分）を含有する。そのような末端は、５’末端および３’末端と呼ばれることが多い。非直鎖状断片は、２つより多くの末端を含有し得る（例えば、分岐型断片は、３つまたはそれより多くの末端を含み得る）。二本鎖断片の場合、核酸末端は、オーバーハングを含有することもあり、または平滑末端化されていることもある（すなわち、オーバーハングを含有しない）。用語オーバーハングまたはオーバーハング領域は、一般に、核酸末端の一本鎖部分を指す。例えば、核酸断片は、１つまたは複数の対合ヌクレオチド（塩基）を含む二本鎖または「二重鎖」領域、および１つまたは複数の不対合ヌクレオチド（塩基）を含む一本鎖または「オーバーハング」領域を含み得る。通常は、オーバーハングは、核酸分子の末端の一本鎖領域を指し、二本鎖領域が隣接している一本鎖領域を指さない。オーバーハングは、５’オーバーハングであることもあり、または３’オーバーハングであることもある。５’オーバーハングは、二重鎖部分が終わり、一本鎖部分が始まる、接合部で開始し、オーバーハングの末端（遊離末端）で終わる、３’から５’の方向に従来の核酸方向性に従って読み取られる、核酸分子の末端の一本鎖領域を一般に指す。３’オーバーハングは、二重鎖部分が終わり、一本鎖部分が始まる、接合部で開始し、オーバーハングの末端（遊離末端）で終わる、５’から３’の方向に従来の核酸方向性に従って読み取られる、核酸分子の末端の一本鎖領域を一般に指す。
標的核酸は、１つのオーバーハングを（例えば、核酸断片の末端に）含むこともあり、２つのオーバーハングを（例えば、核酸断片の両方の末端に）含むこともある。標的核酸は、２つのオーバーハング、１つのオーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組合せを含むことがある。標的核酸は、２つの３’オーバーハング、２つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの平滑末端、１つの５’オーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組合せを含むことがある。一部の実施形態では、標的核酸中のオーバーハングは、ネイティブオーバーハングである。一部の実施形態では、標的核酸末端は、ネイティブ平滑末端である。ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、本明細書に記載される試料組成物とオリゴヌクレオチドとを結合させるステップの前の、修飾されていない（例えば、フィルインされていない、切断も消化も（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼにより）されていない、付加されても、付加してもいない）、オーバーハングおよび平滑末端を一般に指す。多くの場合、ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、本明細書に記載される試料組成物とオリゴヌクレオチドとを結合させるステップの前の、ｅｘ ｖｉｖｏで修飾されていない（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでフィルインされていない、ｅｘ ｖｉｖｏで切断も消化も（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼにより）されていない、ｅｘ ｖｉｖｏで付加されても、付加してもいない）、オーバーハングおよび平滑末端を一般に指す。ある特定の事例では、ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、対象または供給源から収集後に修飾されていない（例えば、対象または供給源からの収集後にフィルインされていない、対象または供給源からの収集後に（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼにより）切断も消化もされていない、対象または供給源からの収集後に付加されても、付加してもいない）、オーバーハングおよび平滑末端を一般に指す。ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、単離された試料を切断作用因子（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素）および／またはポリメラーゼと接触させることにより作出されたオーバーハング／末端を、一般に含まない。ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、機械的せん断（例えば、超音波処理（例えば、ＣｏｖａｒｉｓによるＡｄａｐｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ（商標）（ＡＦＡ）プロセス））により作出されたオーバーハング／末端を、一般に含まない。ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、単離された試料をエキソヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅ）と接触させることにより作出されたオーバーハング／末端を、一般に含まない。ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）により作出されたオーバーハング／末端を、一般に含まない。ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、固体支持体に結合された、別の分子のコンジュゲートされた、またはベクターにクローニングされたオーバーハング／末端を、一般に含まない。一部の実施形態では、ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、脱リン酸化に付されることがあり、脱リン酸化されたネイティブオーバーハングおよび脱リン酸化されたネイティブ平滑末端と呼ばれることがある。一部の実施形態では、ネイティブオーバーハングおよびネイティブ平滑末端は、リン酸化に付されることがあり、リン酸化されたネイティブオーバーハングおよびリン酸化されたネイティブ平滑末端と呼ばれることがある。
オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、核酸（例えば、試料からの核酸；標的核酸）は、オリゴヌクレオチドと結合される。オリゴヌクレオチドは、標的核酸とは明確に異なる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）ポリマーを一般に指し、オリゴ、アダプター、オリゴヌクレオチドアダプター、およびオリゴアダプターと呼ばれることがある。オリゴヌクレオチドは、短い長さ（例えば、５０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満、２０ｂｐ未満、１０ｂｐ未満、５ｂｐ未満）であり得、常にではないが標的核酸より短いことがある。オリゴヌクレオチドを人工的に合成することができる。一部の実施形態では、核酸（例えば、試料からの核酸；標的核酸）は、複数のオリゴヌクレオチド種とまたはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。オリゴヌクレオチド種のプールは、オリゴヌクレオチド種のセットと呼ばれることがあり、複数の異なるオリゴヌクレオチド種を含むことがある。本明細書における方法および組成物は、オリゴヌクレオチド種の１つより多くのプール（例えば、オリゴヌクレオチド種の第１のプールおよびオリゴヌクレオチド種の第２のプール）を含むことがある。そのような事例では、第１のプール内のオリゴヌクレオチドは、共通の特徴を共有することができ、第２のプール内のオリゴヌクレオチドは、異なる共通の特徴を共有することができる。プール内の共通の特徴としては、特定のドメインおよび／または特定の修飾を挙げることができる。一部の実施形態では、プール内の共通の特徴は、共通のプライマー結合ドメインを含む。
オリゴヌクレオチドの種は、他のオリゴヌクレオチド種に対して固有である特徴を一般に含有する。例えば、オリゴヌクレオチド種は、固有のオーバーハング特徴を含有することができる。固有のオーバーハング特徴としては、固有のオーバーハング長、固有のオーバーハング配列、または固有のオーバーハング配列とオーバーハング長の組合せを挙げることができる。例えば、オリゴヌクレオチド種は、特定のオーバーハング長について、所与のオーバーハング長を有する他のオリゴヌクレオチド種に対して固有の配列を含有することができる。一部の事例では、オリゴヌクレオチド種は、特定のオーバーハング長およびタイプ（例えば、５’または３’）について、所与のオーバーハング長およびタイプを有する他のオリゴヌクレオチド種に対して固有の配列を含有する。
オリゴヌクレオチドは、１つのオーバーハングを（例えば、オリゴヌクレオチドの１つの末端に）含むこともあり、２つのオーバーハングを（例えば、オリゴヌクレオチドの両方の末端に）含むこともある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つのオーバーハング、１つのオーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つの３’オーバーハング、２つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの平滑末端、１つの５’オーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングまたは平滑末端があり、第２の末端に２本の非相補鎖がある。本明細書に記載されるヘアピン構造オリゴヌクレオチドの場合、そのようなオリゴヌクレオチド（例えば、未切断状態のもの）は、一般に、１つのオーバーハング（例えば、５’オーバーハングまたは３’オーバーハング）を含み、ある特定の事例では、オーバーハングを含まない（すなわち、平滑末端を含む）。一般に、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸オーバーハング中の領域と相補的である領域を含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングの全長は、標的核酸オーバーハングの全長とハイブリダイズすることができる。したがって、全オリゴヌクレオチドオーバーハングは、全核酸オーバーハングと相補的であり得る。
多くの場合、「相補的」または「相補性」は、本明細書に記載の配列相補性を指し、「非相補的」または「非相補性」は、本明細書に記載の配列非相補性を指す。ある特定の態様では、「相補的」または「相補性」は、構造的相補性（例えば、オーバーハング相補性）を指すことがある。例えば、５’の８塩基対オーバーハングを有する標的核酸は、５’の８塩基対オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドと構造的相補性を有することができる。構造的相補性は、非特異的塩基対合を含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸中の塩基との非特異的塩基対合が可能である１つまたは複数のヌクレオチドを含む。例えば、５’の８塩基対オーバーハングを有する標的核酸は、５’の８塩基対オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドと構造的相補性を有することができ、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸オーバーハング中の対応する位置における可能性のある塩基のすべてまたは一部と非特異的に対合することができる１つまたは複数のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、すべてが標的核酸中の塩基との非特異的塩基対合が可能である、ヌクレオチドを含む。非特異的塩基対合が可能であるヌクレオチドは、「ユニバーサル塩基」と呼ばれることがあり、これは、上記の４つの典型的な塩基のいずれかを置換することができるものであり（例えば、ニトロインドール、５－ニトロインドール、３－ニトリピロール、イノシン、デオキシイノシン、２－デオキシイノシン）、または「縮重／ゆらぎ塩基」と呼ばれることがあり、これは、４つの典型的な塩基の（すべてではないが）２つまたは３つを置換することができるものである（例えば、非天然塩基ＰおよびＫ）。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、ユニバーサル塩基からなる。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド種のうちのまたはオリゴヌクレオチド種のプール内の各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む。オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列は、オーバーハング識別配列、識別配列、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別ポリヌクレオチド、オーバーハング識別ポリヌクレオチド、識別ポリヌクレオチド、バーコード、可変オーバーハングバーコード、固有末端識別子（ＵＥＩ）、末端識別子、または識別子と呼ばれることがある。オーバーハング識別配列は、そのそれぞれのオリゴヌクレオチドに存在するオーバーハングを一意的に識別し、オリゴヌクレオチドオーバーハングが特異的にハイブリダイズする標的核酸に存在するオーバーハングの各タイプ（例えば、長さ、５’もしくは３’、および／またはこれらに類するもの）を一意的に識別することができる。ある特定の実施形態では、オーバーハング識別配列は、オリゴヌクレオチドオーバーハングが特異的にハイブリダイズする標的核酸に存在するネイティブオーバーハングの各タイプ（例えば、長さ、５’もしくは３’、および／またはこれらに類するもの）を一意的に識別することができる。多くの場合、異なる長さのオーバーハングとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドオーバーハングに特異的なオーバーハング識別配列は、互いに異なり、固有のものである。通常は、ｉ）異なる長さのオーバーハングとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドオーバーハングにおよびｉｉ）異なるタイプ（すなわち、３’、５’）のオリゴヌクレオチドオーバーハングに特異的なオーバーハング識別配列は、互いに異なり、固有のものである。一般に、異なる長さのオーバーハングを有する、複数のオリゴヌクレオチド種またはオリゴヌクレオチド種のプールには、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的な２つのオーバーハング識別配列はない。言い換えると、オリゴヌクレオチドオーバーハングの所与の長さに特異的である所与のオーバーハング識別配列（または配列のセット）は、そのような所与の長さのオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドにのみ存在することになる。異なるオーバーハング長を有するオリゴヌクレオチドは、異なるオーバーハング識別配列（または配列のセット）を含むことになる。一部の実施形態では、特定の長さのオーバーハングを有するすべてのオリゴヌクレオチド種に対して１つのオーバーハング識別配列がある。一部の実施形態では、特定の長さのオーバーハングを有するすべてのオリゴヌクレオチド種に対して、一方のオーバーハング識別配列が５’オーバーハングの所与の長さに特異的であり、他方のオーバーハング識別配列が３’オーバーハングの所与の長さに特異的であるような、２つのオーバーハング識別配列がある。一部の実施形態では、オーバーハングの配列を問わず、特定の長さのオーバーハングを有するすべてのオリゴヌクレオチド種に対して、１つまたは２つのオーバーハング識別配列がある。一部の実施形態では、特定の長さのオーバーハングを有するオリゴヌクレオチド種に対してオーバーハング識別配列のサブセットがあり、サブセット中の異なるオーバーハング識別配列は、オリゴヌクレオチドの異なるオーバーハング配列に（例えば、オーバーハングの長さおよびタイプ（すなわち、５’または３’）に特異的であることに加えて）特異的である。一部の実施形態では、オーバーハング識別配列は、オーバーハングに特異的でない（すなわち、平滑末端化オリゴヌクレオチドに特異的である）。
一般に、オーバーハング識別配列は、オーバーハング識別配列のヌクレオチド配列によって、対応するオリゴヌクレオチドオーバーハングの長さおよび／またはタイプについての情報を提供する。オーバーハング識別配列のヌクレオチド配列をシーケンシングプロセスによりシーケンシングし、オリゴヌクレオチド－標的配列についての配列リードに含めることができる。したがって、ある特定の実施形態では、オーバーハング識別配列は、それらのヌクレオチド配列のリードを超えるさらなるシグナルを生成しない。例えば、オーバーハング識別配列は、シグナルを生成するために、標識すること（例えば、蛍光標識による）も、コンジュゲーション（例えば、固体支持体、抗体への）も、標識を有するまたは固体支持体、抗体などにコンジュゲートされたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも、必要としないことがある。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オーバーハングおよびオーバーハング識別配列以外に、１つまたは複数の部分またはドメインを含む。そのようなさらなる部分を、例えば、ハイブリダイゼーション産物またはそれらの誘導体を利用するまたはさらに処理する１つまたは複数の下流の用途、例えば、核酸増幅、シーケンシング（例えば、ハイスループットシーケンシング）、または両方を助長するために、含めることができる。ある特定の実施形態では、さらなる部分は、１つまたは複数の核酸結合ドメイン、例えば、プライマー結合ドメイン（プライミング配列とも呼ばれる）、および／またはシーケンシングアダプター、もしくはシーケンシングアダプターの１つもしくは複数の成分（例えば、本明細書に記載される１つもしくは複数の成分）などを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む。ＵＭＩは、一般に、固有の出発分子（例えば、増幅前の出発分子）の数の推定に、およびある特定の事例では、ライゲーション反応の感度の評価に使用される。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のプライマー結合ドメインを含む。プライマー結合ドメインは、プライマー（例えば、増幅プライマー）がアニールすることができるポリヌクレオチドである。プライマー結合ドメインは、プライマー（例えば、増幅プライマー）のヌクレオチド配列に相補的または実質的に相補的である、ヌクレオチド配列を通常は含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種の異なるプールは、プライマー結合ドメインを有するオリゴヌクレオチドを含むことができ、各プールが、独自のプライマー結合ドメインを有する。例えば、プールＡ内のオリゴヌクレオチドは、プライマー結合ドメインＡを含むことができ、プールＢ内のオリゴヌクレオチドは、プライマー結合ドメインＢを含むことができ、プライマー結合ドメインＡとプライマー結合ドメインＢは異なる。プライマー結合ドメインＡおよびプライマー結合ドメインＢは、異なるそれらのヌクレオチド配列に基づいて、異なると考えることができる。プライマー結合ドメインＡおよびプライマー結合ドメインＢは、プライマーＡが、プライマー結合ドメインＡにアニールし、プライマー結合ドメインＢにアニールしない、およびプライマーＢが、プライマー結合ドメインＢにアニールし、プライマー結合ドメインＡにアニールしないという特徴に基づいて、異なると考えることができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズするまたは平滑末端を含む１つのオーバーハングと、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズしない配列を含有する別のオーバーハングとを含む。標的核酸オーバーハングとハイブリダイズしないそのような配列は、標的核酸には一般に見られない配列を含有することがある。標的核酸オーバーハングとハイブリダイズしないそのような配列は、それ自体とハイブリダイズすることができる配列を含有することもある。例えば、配列は、パリンドローム配列を含み得る。パリンドローム配列を有するオーバーハングを含有するオリゴヌクレオチドは、例えば、オーバーハングハイブリダイゼーションによって標的核酸の各末端とハイブリダイズし、次いで、パリンドローム配列ハイブリダイゼーションにより互いにハイブリダイズすることができ、その結果、環状ハイブリダイゼーション産物が形成される。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、任意の好適なタイプのヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、天然ヌクレオチド）を含み、この例は、本明細書で提供される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、１つまたは複数のＤＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、ＤＮＡヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、ＲＮＡヌクレオチドからなる。例えば、ＲＮＡヌクレオチドを含むまたはＲＮＡヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドオーバーハングは、ＤＮＡヌクレオチドを含むまたはＤＮＡヌクレオチドからなる標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、それによってＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖が形成される。そのような事例では、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ）をライゲーションに使用することができる。ある特定の実施形態では、ライゲーションされていないオリゴダイマー産物（例えば、ＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を含有するもの）を、ＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を（例えば、例えばＲＮＡｓｅ ＩＩＩなどの、ＲＮＡｓｅを使用して）消化することにより除去することができる。
Ｙ－オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングがあり、第２の末端に２本の非相補鎖がある。そのようなオリゴヌクレオチドは、Ｙ－オリゴヌクレオチド、Ｙ－アダプター、Ｙ形オリゴヌクレオチド、Ｙ形アダプターなどと呼ばれることがある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、Ｙ－アダプター）は、２本の鎖を含み、第１の末端に平滑末端またはオーバーハングのどちらかがあり、第２の末端に２本の非相補鎖がある。
Ｙ形構造を有するオリゴヌクレオチドは、一般に、二本鎖二重鎖領域を含み、一方の末端に２つの一本鎖「アーム」を含み、他方の末端に平滑末端またはオーバーハングのどちらかを含む。
Ｙ－オリゴヌクレオチドは、複数のポリヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、Ｙ－オリゴヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（第１の鎖のもの）は、第２のポリヌクレオチド（第２の鎖のもの）に相補的である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（第１の鎖のもの）の一部分は、第２のポリヌクレオチド（第２の鎖のもの）の一部分に相補的である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第１の領域に相補的である第１の領域を含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第２の領域に相補的でない第２の領域を含む。相補的な領域は、Ｙ－オリゴヌクレオチドの二重鎖領域を形成することが多く、非相補的な領域は、Ｙ－オリゴヌクレオチドのアームまたはそれらの部分を形成することが多い。第１および第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターの成分、例えば、増幅プライミング部位など、および／または特異的シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）を含むことがある。一部の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターのある特定の成分、例えば、増幅プライミング部位など、および特異的シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）を含まない。
一部の実施形態では、Ｙ－オリゴヌクレオチドは、オーバーハング（例えば、５’オーバーハング、３’オーバーハング）を含む。Ｙ－オリゴヌクレオチドのオーバーハングは、二本鎖二重鎖部分に隣接して、非相補鎖（または「アーム」）部分の反対側の末端に、通常は位置する。Ｙ－オリゴヌクレオチドのオーバーハングは、通常は、標的核酸中のオーバーハングに相補的である。Ｙ－オリゴヌクレオチドは、オーバーハング識別配列を含むこともある。一部の実施形態では、Ｙ－オリゴヌクレオチドは、非相補鎖（または「アーム」）部分の反対側に平滑末端を含む。一部の実施形態では、複数のＹ－オリゴヌクレオチド種、またはＹ－オリゴヌクレオチド種のプールは、１）オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドと、２）平滑末端を含むオリゴヌクレオチドとの混合物を含む。
ヘアピン
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖からなる。ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドは、一般に、二本鎖「ステム」領域および一本鎖「ループ」領域を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる１本の鎖（すなわち、１本の連続鎖）を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる１本の鎖（すなわち、１本の連続鎖）から本質的になる。１本の鎖から本質的になるとは、オリゴヌクレオチドが、連続鎖の一部でない、核酸の（例えば、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした）いかなるさらなる鎖も含まないことを意味する。したがって、ここでの「から本質的になる」は、オリゴヌクレオチド中の鎖の数を指し、オリゴヌクレオチドは、鎖の数に不可欠でない他の特徴を含むことができる（例えば、検出可能な標識を含むことができる；他の領域を含むことができる）。ヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含むまたはそのような１本の鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドは、本明細書では、ヘアピン、ヘアピンオリゴヌクレオチド、またはヘアピンアダプターと呼ばれることがある。
ヘアピンオリゴヌクレオチドは、１本の鎖内に複数のポリヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、ヘアピンアダプターは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに相補的である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの一部分は、第２のポリヌクレオチド一部分に相補的である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第１の領域に相補的である第１の領域を含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第２の領域に相補的でない第２の領域を含む。相補的な領域は、ヘアピンアダプターのステムを形成することが多く、非相補的な領域は、ヘアピンアダプターのループまたはその一部を形成することが多い。第１および第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターの成分、例えば、増幅プライミング部位など、および特異的シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）を含むことがある。一部の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターのある特定の成分、例えば、増幅プライミング部位など、および特異的シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）を含まない。
ヘアピンオリゴヌクレオチドは、切断条件下で切断され得る１つまたは複数の切断部位を含むことができる。一部の実施形態では、切断部位は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの間に位置する。切断部位での切断は、ヘアピンオリゴヌクレオチドから２本の別々の鎖を生成することが多い。一部の実施形態では、切断部位での切断は、「Ｙ」構造を形成する２つの不対合鎖を有する部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドを生成する。切断部位は、例えば、本明細書に記載される切断部位などの、任意の好適な切断部位を含み得る。一部の実施形態では、切断部位は、ＲＮＡヌクレオチドを含み、例えばＲＮＡｓｅを使用して、切断部位を切断することができる。一部の実施形態では、切断部位は、ウラシルおよび／またはデオキシウリジンを含み、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅなど、およびこれらの組合せを使用して、切断部位を切断することができる。一部の実施形態では、切断部位は、ウラシルおよび／またはデオキシウリジンを含まない。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ヘアピンオリゴヌクレオチドと標的核酸とを結合させるステップの後、１つまたは複数の切断部位を切断条件に曝露するステップを含み、それによってオリゴヌクレオチドが切断される。
一部の実施形態では、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、オーバーハング（例えば、５’オーバーハング、３’オーバーハング）を含む。ヘアピンオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、二本鎖ステム部分に隣接して、ループ部分の反対側の末端に、通常は位置する。ヘアピンオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、通常は、標的核酸中のオーバーハングに相補的である。ヘアピンオリゴヌクレオチドは、オーバーハング識別配列を含むこともある。一部の実施形態では、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に、第１のオーバーハング識別配列、第１のポリヌクレオチド、１つまたは複数の切断部位、第２のポリヌクレオチド、第１のオーバーハング識別配列に相補的な第２のオーバーハング識別配列、およびオーバーハングを含む。一部の実施形態では、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に、オーバーハング、第１のオーバーハング識別配列、第１のポリヌクレオチド、１つまたは複数の切断部位、第２のポリヌクレオチド、および第１のオーバーハング識別配列に相補的なオーバーハング識別配列を含む。一部の実施形態では、複数のヘアピンリゴヌクレオチド種、またはヘアピンオリゴヌクレオチド種のプールは、１）５’から３’の方向に、第１のオーバーハング識別配列、第１のポリヌクレオチド、１つまたは複数の切断部位、第２のポリヌクレオチド、第１のオーバーハング識別配列に相補的な第２のオーバーハング識別配列、およびオーバーハングを含む、オリゴヌクレオチドと、２）５’から３’の方向に、オーバーハング、第１のオーバーハング識別配列、第１のポリヌクレオチド、１つまたは複数の切断部位、第２のポリヌクレオチド、および第１のオーバーハング識別配列に相補的なオーバーハング識別配列を含む、オリゴヌクレオチドとの混合物を含む。上記のある特定の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、第１のポリヌクレオチドの第１の部分、第１のポリヌクレオチドの第２の部分、切断部位、第２のポリヌクレオチドの第２の部分、そして第２のポリヌクレオチドの第１の部分の順に並べられ、各ポリヌクレオチドの第１の部分は、相補的であり、各ポリヌクレオチドの第２の部分は、相補的でない。一部の実施形態では、複数のヘアピンリゴヌクレオチド種、またはヘアピンオリゴヌクレオチド種のプールは、１）オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドと、２）平滑末端を含むオリゴヌクレオチドとの混合物を含む。
修飾ヌクレオチド
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、修飾塩基と呼ぶことができ、例えば、結合対のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチド、遮断されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）ヌクレオチドなど、およびこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、オリゴヌクレオチドの、二重鎖領域内に、オーバーハング領域内に、一方の末端に、または両方の末端に、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、１つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、オリゴヌクレオチドの一方の末端に１つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、標的核酸とハイブリダイズする末端（例えば、オリゴヌクレオチドオーバーハングを含む末端）の反対側のオリゴヌクレオチドの末端に、１つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、３’末端を有する鎖の末端に存在することもあり、または５’末端を有する鎖の末端に存在することもある。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、１つまたは複数の遮断されたヌクレオチドを含む。例えば、オリゴヌクレオチド種は、標的核酸中のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを遮断することができる１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことがある。一部の事例では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、標的核酸中のヌクレオチドへのライゲーションを遮断することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、天然ヌクレオチドに結合することができない１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－塩基、ジデオキシ－塩基、逆方向ジデオキシ－塩基、スペーサー、およびアミノリンカーのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－塩基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－グアニン（イソ－ｄＧ）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－シトシン（イソ－ｄＣ）を含む。イソ－ｄＣおよびイソ－ｄＧは、それぞれ、シトシンおよびグアニンの化学的バリアントである。イソ－ｄＣは、イソ－ｄＧと水素結合することができるが、未修飾グアニン（天然グアニン）とはできない。イソ－ｄＧは、イソ－ｄＣと塩基対合することができるが、未修飾シトシン（天然シトシン）とはできない。イソ－ｄＣを含有するオリゴヌクレオチドを、イソ－ｄＧを含有する相補的オリゴとハイブリダイズするが、天然に存在するいずれの核酸配列ともハイブリダイズすることができないように、設計することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ジデオキシ－塩基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ジデオキシ－シトシンを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、逆方向ジデオキシ－塩基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、逆方向ジデオキシ－チミンを含む。例えば、配列の５’末端に位置する逆方向ジデオキシ－チミンは、望ましくない５’ライゲーションを防止することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、スペーサーを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、Ｃ３スペーサーを含む。Ｃ３スペーサーホスホロアミダイトをオリゴヌクレオチドの内部にまたは５’末端に組み込むことができる。複数のＣ３スペーサーをオリゴヌクレオチドのどちらかの末端に付加させて、長い親水性スペーサーアームを（例えば、フルオロフォアまたは他のペンダント基の結合のために）導入することができる。他のスペーサーとしては、例えば、光切断性（ＰＣ）スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、１’，２’－ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）などが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、結合対のメンバーを含む。結合対は、例えば、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡもしくはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応性基／相補的化学反応性基、ジゴキシゲニン部分／抗ジゴキシゲニン抗体、フルオレセイン部分／抗フルオレセイン抗体、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、オペレーター／リプレッサー、ヌクレアーゼ／ヌクレオチド、レクチン／多糖、活性化合物／活性化合物受容体、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド／その対応する補体など、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ビオチンを含む。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）は、固体支持体または基板にコンジュゲートされている。固体支持体または基板は、マイクロアレイおよびウェルにより提供される表面、ならびに粒子、例えば、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ、磁気ビーズ、マイクロビーズ、ナノビーズ）、微小粒子およびナノ粒子を含むがこれらに限定されない、結合対のメンバーを直接または間接的に結合することができる任意の物理的に分離可能な固体であり得る。固体支持体は、例えば、チップ、カラム、光ファイバー、拭き取り繊維、フィルター（例えば、平面フィルター）、１つもしくは複数のキャピラリー、ガラスおよび改質もしくは機能化ガラス（例えば、細孔制御ガラス（ＣＰＧ））、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙もしくはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料、量子ドット、被覆ビーズもしくは粒子、他のクロマトグラフ材料、磁気粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンもしくは他の材料のコポリマー、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などを含む）、多糖、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカ、もしくはシリコン、シリカゲルおよび変性シリコンを含む、シリカに基づく材料、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、炭素、金属（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素および銅）、無機ガラス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールなどのポリマーを含む）；マイクロもしくはナノ構造化表面、例えば、核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤ、もしくはナノ粒子装飾表面；または多孔質表面、またはゲル、例えば、メタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケート、または他の繊維状もしくは鎖状ポリマーも含み得る。一部の実施形態では、固体支持体または基板は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチンまたはアガロースなどの、ポリマーを含む、任意の数の材料を用いた不動態または化学的誘導体化コーティングを使用して、被覆することができる。ビーズおよび／または粒子は、ばらばらの状態であることもあり、または互いにつながっている（例えば、焼結されている）こともある。一部の実施形態では、固体支持体は、粒子の集合体であることができる。一部の実施形態では、粒子は、シリカを含むことができ、シリカは、二酸化ケイ素を含み得る。一部の実施形態では、シリカは、多孔質であることができ、ある特定の実施形態では、シリカは、無孔質であることができる。一部の実施形態では、粒子は、粒子に常磁性特性を付与する薬剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、金属を含み、ある特定の実施形態では、薬剤は、酸化鉄（例えば、鉄または酸化鉄、ここでの酸化鉄は、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋の混合物を含有する）である。結合対のメンバーを共有結合によりまたは非共有結合性相互作用により固体支持体に連結させることができ、直接または間接的に（例えば、スペーサー分子もしくはビオチンなどの仲介物質によって）固体支持体に連結させることができる。
リン酸化および脱リン酸化
一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、オリゴヌクレオチドとホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種、または脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種のプールを生成するステップを含む。一般に、標的核酸および／またはオリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化される。標的核酸は、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、次いでその後にリン酸化されることがある。オリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、次いでその後にリン酸化されることがある。オリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、次いでリン酸化されないことがある。核酸の脱リン酸化を行うための試薬およびキットは、公知であり、入手可能である。例えば、標的核酸および／またはオリゴヌクレオチドをホスファターゼ（すなわち、水を使用してリン酸モノエステルを切断してリン酸イオンとアルコールにする酵素）で処理することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、脱リン酸化された標的核酸物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、オリゴヌクレオチドとホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチドとホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一般に、標的核酸および／またはオリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、リン酸化される。核酸の５’リン酸化を様々な手法で行うことができる。例えば、ＡＴＰのγ位からポリヌクレオチド（二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）の５’－ヒドロキシル末端およびヌクレオシド３’一リン酸へのパイの転移および交換を触媒するポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ ＰＮＫ）で、標的核酸および／またはオリゴヌクレオチドを処理することができる。好適な反応条件としては、例えば、１×ＰＮＫ反応緩衝剤（例えば、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ ７．６）中、３０分間、３７℃での核酸とＰＮＫのインキュベーション；およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ ７．５）中、３０分間、３７℃での核酸とＰＮＫのインキュベーションが挙げられる。必要に応じて、リン酸化反応後に、ＰＮＫを、例えば６５℃で２０分間、熱不活性化してもよい。一部の実施形態では、方法は、核酸試料からの核酸の５’末端をリン酸化することにより５’リン酸化された核酸を生成するステップを含まない。ある特定の事例では、核酸試料は、自然にリン酸化される５’末端を有する核酸を含む。一部の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化することにより５’リン酸化されたオリゴヌクレオチドを生成するステップを含まない。
ハイブリダイゼーションおよびライゲーション
核酸断片をオリゴヌクレオチドと結合させることができ、それによって結合産物が生成される。核酸断片とオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、オーバーハングハイブリダイゼーション、ライゲーション（例えば、ハイブリダイゼーション産物のライゲーション）および平滑末端ライゲーションのうちの１つまたは複数を含み得る。結合産物は、核酸断片の一方または両方の末端でオリゴヌクレオチドに接続された（例えば、ハイブリダイズおよび／またはライゲーションされた）核酸断片を含み得る。一部の実施形態では、標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることができ、それによって結合産物が生成される。一部の実施形態では、切断ステップからの産物（すなわち、切断産物）をオリゴヌクレオチドと結合させることができ、それによって結合産物が生成される。本明細書におけるある特定の方法は、結合産物のセット（例えば、結合産物の第１のセットおよび結合産物の第２のセット）を生成するステップを含む。一部の実施形態では、結合産物の第１のセットは、オリゴヌクレオチドの第１のプールからのオリゴヌクレオチドに接続された（例えば、ハイブリダイズおよび／またはライゲーションされた）標的核酸を含む。一部の実施形態では、結合産物の第２のセットは、オリゴヌクレオチドの第２のプールからのオリゴヌクレオチドに接続された（例えば、ハイブリダイズおよび／またはライゲーションされた）切断産物を含む。
標的核酸をオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション条件下で結合させることができ、それによってハイブリダイゼーション産物が生成される。結合ステップ中の条件は、オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドオーバーハング）が、オリゴヌクレオチドオーバーハングに対して配列が相補的であり、かつ対応する長さを有するオーバーハングまたはオーバーハング領域を有する標的核酸と、特異的にハイブリダイズする条件である。一部の実施形態では、対応する長さは、一般に、同じ長さ（すなわち、オリゴヌクレオチドオーバーハングおよび標的核酸オーバーハング中の同じ塩基数）を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドオーバーハングと標的核酸オーバーハングとの相補性度、それらの長さ、およびハイブリダイゼーションが起こる温度などの要因による影響を被るまたは影響を受ける可能性があり、ハイブリダイゼーションが起こる温度は、オーバーハングの融解温度（Ｔｍ）から情報を得ることができる。融解温度は、オリゴヌクレオチドオーバーハング／標的核酸オーバーハングの半分がハイブリダイズした状態のままであり、オリゴヌクレオチドオーバーハング／標的核酸オーバーハングの半分が解離して一本鎖になる、温度を一般に指す。二重鎖のＴｍは、実験により決定することができ、または以下の式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（分率Ｇ＋Ｃ）－（６０／Ｎ）（式中、Ｎは、連鎖長であり、［Ｎａ＋］は、１Ｍ未満である）を使用して予測することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド種の末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む。結合するステップは、標的核酸の、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドへの共有結合を可能にする、任意の好適なアプローチにより果たすことができる。標的核酸の一方の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合されるとき、通常は、２つの結合イベントが遂行される：１）標的核酸中の一方の鎖の３’末端とオリゴヌクレオチド中の一方の鎖の５’末端の結合イベント、および２）標的核酸中の他方の鎖の５’末端とオリゴヌクレオチド中の他方の鎖の３’末端の結合イベント。標的核酸の両方の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドに各々結合されるとき、通常は、４つの結合イベントが遂行される：１）標的核酸中の一方の鎖の３’末端とオリゴヌクレオチド中の一方の鎖の５’末端の結合イベント、２）標的核酸中の他方の鎖の５’末端とオリゴヌクレオチド中の他方の鎖の３’末端の結合イベント、ならびに３）および４）：別のオリゴヌクレオチドに結合される標的核酸の反対側の末端の（１）および（２）と同じ結合イベント。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド種の末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む。リガーゼ活性は、例えば、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、突出末端リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、付着末端リガーゼ活性、ＤＮＡリガーゼ活性、およびＲＮＡリガーゼ活性を含み得る。リガーゼ活性は、標的核酸の５’末端を、それとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端に、ライゲーション反応でライゲーションさせることを含む。ライゲーション反応を行うための好適な試薬（例えば、リガーゼ）およびキットは、公知であり、入手可能である。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｓｔｉｃｋｙ－ｅｎｄ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することができる。使用することができるリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｌｉｇａｓｅ（登録商標）、ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼなど、およびこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物を、第１のリガーゼ活性を有する第１の薬剤、および第１のリガーゼ活性とは異なる第２のリガーゼ活性を有する第２の薬剤と接触させる。例えば、第１のリガーゼ活性および第２のリガーゼ活性は、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、突出末端リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、および付着末端リガーゼ活性から独立して選択することができる。一部の実施形態では、ある特定のオリゴヌクレオチドは、オーバーハングを有さない。そのようなオリゴヌクレオチドを平滑末端化することができ、標的核酸の１つまたは複数の平滑末端に結合させる（例えば、ライゲーションする）ことができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、生体適合性結合によって標的核酸をオリゴヌクレオチドに結合させるステップを含む。方法は、例えば、生体分子を結合させるのに有用な生体適合性反応を含む、クリックケミストリーまたはタグ付けを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々についての末端は、第１の化学反応性部分を含み、標的核酸の各々についての末端は、第２の化学反応性部分を含む。そのような実施形態では、第１の化学反応性部分は、通常、第２の化学反応性部分と反応すること、そしてオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸との間に共有結合を形成することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、第２の化学反応性部分が、標的核酸の各々についての末端に組み込まれる条件下で、標的核酸と１つまたは複数の化学剤とを接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、第１の化学反応性部分が第２の化学反応性部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸との間に共有結合を形成する条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む。一部の実施形態では、第１の化学反応性部分は、第２の化学反応性部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸との間に１，２，３－トリアゾールを形成することができる。一部の実施形態では、第１の化学反応性部分は、銅を含む条件下で、第２の化学反応性部分と反応することができる。第１および第２の化学反応性部分は、任意の好適な対合を含み得る。例えば、第１の化学反応性部分は、アジド含有部分および５－オクタジイニルデオキシウラシルから選択することができ、第２の化学反応性部分は、独立して、アジド含有部分、ヘキシニルおよび５－オクタジイニルデオキシウラシルから選択することができる。一部の実施形態では、アジド含有部分は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル－アジドである。
切断
一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および／またはハイブリダイゼーション産物（例えば、標的核酸にハイブリダイズした本明細書におけるオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および／またはハイブリダイゼーション産物は、切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および／またはハイブリダイゼーション産物は、ヘアピンループ内の切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および／またはハイブリダイゼーション産物は、オリゴヌクレオチドの内部位置の（例えば、オリゴヌクレオチドの二重鎖領域内の）切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、環状ハイブリダイゼーション産物は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、核酸、例えば、環状核酸および／または大きい断片（例えば、長さが５００塩基対より長い）は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。大きい断片は、高分子量（ＨＭＷ）核酸またはＨＭＷ ＤＮＡと呼ばれることがある。ＨＭＷ核酸断片は、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約４０００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１０，０００ｂｐより長い、またはそれより長い断片を含み得る。用語「せん断すること」または「切断」は、核酸分子を２つの（またはそれより多くの）より小さい核酸分子に分断することができる手順または条件を一般に指す。そのようなせん断または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であり得、例えば、化学的、酵素的、および物理的（例えば、物理的断片化）を含む、様々な方法、試薬または条件により果たすことができる。せん断または切断された核酸は、約５～約１０，０００塩基対、約１００～約１，０００塩基対、約１００～約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００もしくは９０００塩基対の長さの名目値、代表値または平均値を有し得る。
せん断または切断された核酸を好適な方法により生成することができ、そのような方法の非限定的な例としては、物理的方法（例えば、せん断、例えば、音波処理、超音波処理、フレンチプレス、熱、ＵＶ照射など）、酵素的プロセス（例えば、酵素的切断作用因子（例えば、好適なヌクレアーゼ、好適な制限酵素）、化学的方法（例えば、アルキル化、ＤＭＳ、ピペリジン、酸加水分解、塩基加水分解、熱など、もしくはこれらの組合せ）、紫外（ＵＶ）線（例えば、光切断性部位（例えば、光切断性スペーサーを含む））など、またはこれらの組合せが挙げられる。結果として得られる核酸断片の長さ代表値、平均値または名目値は、適切な断片生成方法を選択することにより制御することができる。
用語「切断作用因子」は、一般に、核酸を１つまたは複数の特異的または非特異的部位で切断することができる薬剤、ときには、化学物質または酵素を指す。特異的切断作用因子は、特定のヌクレオチド配列に従って特定の部位で特異的に切断することが多く、特定の部位は、切断部位と呼ばれることがある。切断作用因子は、酵素的切断作用因子、化学的切断作用因子、および光（例えば、紫外（ＵＶ）線）を含み得る。
酵素的切断作用因子の例としては、限定ではないが、エンドヌクレアーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ；例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＩＩ）；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ；例えば、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖ）；エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ；ＣＬＥＡＶＡＳＥ酵素；ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ；真核生物の構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ；ニッキング酵素；Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）、例えば、Ａｃｃ Ｉ、ＡｃｉＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ａｌｕ
Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ａｓｎ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ． Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｌｎ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩ、ＢｓｔＥ ＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｏ Ｉ、ＣＩａ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃＩＸ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｋｓｐ Ｉ、ＭａｅＩＩ、ＭｃｒＢＣ、Ｍｌｕ Ｉ、ＭＩｕＮ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｎｃｉ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｎｄｅ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ
Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、ＳｃｒＦ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジンヒドレート－ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ－ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ－ＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ヒポキサンチン－ＤＮＡグリコシラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、５－ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５－ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６－エテノ－アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ）；５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）；３’→５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）；ポリ（Ａ）特異的３’→５’エキソヌクレアーゼ；リボザイム；ＤＮＡザイム；など、およびこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、切断部位（例えば、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分内の切断部位）は、ウラシルおよびデオキシウリジンから選択されるヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、ＤＮＡグリコシラーゼを含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼを含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を含む。
一部の実施形態では、切断部位は、制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、制限酵素を含む。一部の実施形態では、切断部位は、レアカッター制限酵素認識部位（例えば、ＮｏｔＩ認識配列）を含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、レアカッター酵素（例えば、レアカッター制限酵素）を含む。レアカッター酵素は、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）に極めてまれに存在する認識配列を有する制限酵素を一般に指す。一例は、５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣ－３’配列の最初のＧＣの後で切断するＮｏｔＩである。７および８塩基対認識配列を有する制限酵素は、多くの場合、レアカッター酵素と考えられる。
ＤＮＡを特異的部位で切断するための切断方法および制限酵素を選択するための手順は、当業者に周知である。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｒｏ－Ｍｅｇａ Ｂｉｏｃｈｅｍｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｍａｎｎｈｅｉｍなどを含む、多くの制限酵素供給業者は、特異的制限酵素により切断されるＤＮＡ配列の条件およびタイプに関する情報を提供している。酵素は、約９５％～１００％の効率で、好ましくは約９８％～１００％の効率で、ＤＮＡの切断を可能にすることになる条件下で使用されることが多い。
一部の実施形態では、切断部位は、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む一本鎖部分を含む。一部の実施形態では、一本鎖部分は、二重鎖部分と隣接している。一部の実施形態では、一本鎖部分は、ヘアピンループである。一部の実施形態では、切断部位は、１つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、２つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、３つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、４つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、５つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、５つより多くのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）から選択される１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）から選択される１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、ウラシル（Ｕ）を含まない。一部の実施形態では、切断部位は、グアニン（Ｇ）を含む１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、グアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、シトシン（Ｃ）を含む１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、シトシン（Ｃ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）を含む１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、を、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅは、エンドリボヌクレアーゼである。ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖのうちの１つまたは複数から選択することができる。
一部の実施形態では、切断部位は、光切断性スペーサーまたは光切断性修飾を含む。光切断性修飾は、例えば、特異的波長（例えば、３００～３５０ｎｍ）の紫外（ＵＶ）線により切断可能である光解離性官能基を含み得る。光切断性スペーサーの例（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能；製品番号１７０７）は、適切なスペクトル範囲内のＵＶ線に曝露されたときにのみ切断され得る、１０原子リンカーアームである。光切断性スペーサーを含むオリゴヌクレオチドは、後のリガーゼ反応に利用可能である５’リン酸基を有することができる。光切断性スペーサーを、ＤＮＡ塩基間に配置することができ、またはオリゴと末端修飾（例えばフルオロフォア）の間に配置することができる。そのような実施形態では、紫外（ＵＶ）線を切断作用因子と考えることができる。
一部の実施形態では、切断部位は、ジオールを含む。例えば、切断部位は、５’と５’の連結で組み込まれた隣接ジオールを含むことがある。ジオールを含む切断部位は、例えば過ヨウ素酸塩を使用して、化学的に切断することができる。一部の実施形態では、切断部位は、平滑末端制限酵素認識部位を含む。平滑末端制限酵素認識部位を含む切断部位は、平滑末端制限酵素により切断することができる。
ニックシールおよびフィルイン
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ニックシール反応を行うステップ（例えば、ＤＮＡリガーゼまたは他の好適な酵素、およびある特定の事例では、核酸を５’リン酸化するように構成されたキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用する）を含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フィルイン反応を行うステップを含む。例えば、オリゴヌクレオチドが二重鎖として存在する場合、二重鎖の一部または全ては、核酸とハイブリダイズする末端の反対側のその二重鎖の末端にオーバーハングを含むことがある。そのような二重鎖オーバーハングが存在する場合、本明細書における方法は、結合させるステップの後に、二重鎖により形成されたオーバーハングをフィルインするステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、フィルイン反応は、平滑末端化ハイブリダイゼーション産物を生成するために行われる。フィルイン反応を行うために任意の好適な試薬を使用することができる。フィルイン反応を行うために好適なポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きい（クレノウ）断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。一部の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼが使用される（例えば、Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ）。
エキソヌクレアーゼ処理
一部の実施形態では、核酸（例えば、ハイブリダイゼーション産物；環状化ハイブリダイゼーション産物）は、エキソヌクレアーゼで処理される。エキソヌクレアーゼは、３’または５’末端のどちらかにおいてホスホジエステル結合を切断する加水分解反応によってポリヌクレオチド鎖の末端から１つずつヌクレオチドを切断することにより作用する酵素である。エキソヌクレアーゼは、例えば、ＤＮＡｓｅｓ、ＲＮＡｓｅｓ（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）、３’→５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、およびポリ（Ａ）特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物は、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは核酸断片などの、夾雑核酸を除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。一部の実施形態では、環状化ハイブリダイゼーション産物は、一切の非環状化ハイブリダイゼーション産物、ハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチド、ハイブリダイズされていない標的核酸、オリゴヌクレオチドダイマーなど、およびこれらの組合せを除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。
オリゴヌクレオチドの第２のプール
本明細書に記載されるある特定の方法は、標的核酸とオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含むオリゴヌクレオチド）の第１のプールとを結合させるステップと、結合産物を切断して切断産物を生成するステップと、切断産物とオリゴヌクレオチドの第２プールとを結合させるステップとを含む。第２のプール内のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドについて本明細書に記載される任意の特徴を含むことができる。しかし、第２のプール内のオリゴヌクレオチドは、標的核酸中のネイティブオーバーハングと相補的であるオーバーハングを一般に含まず、オーバーハング識別配列を一般に含まない。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、第２のプールからのオリゴヌクレオチドを切断された標的核酸断片（切断産物）の少なくとも一方の末端に結合させる（例えば、アニールする、ハイブリダイズする、ライゲーションする）ステップを含む。一般に、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、切断された末端で切断された標的核酸断片に結合し、ネイティブ末端には結合しない。一部の実施形態では、切断された標的核酸断片は、第２のプールからのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に、平滑末端修復、３’→５’エキソヌクレアーゼ処理、５’フィルイン、Ａテーリング、および５’リン酸化のうちの１つまたは複数を含む末端修復に付される。一部の実施形態では、本明細書における方法は、切断産物の一方または両方の末端（すなわち、切断された末端（単数または複数））に１つまたは複数の不対合ヌクレオチド（Ａテール）を付加させるステップを含む。一部の実施形態では、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、切断産物に付加された１つまたは複数のヌクレオチドに相補的である１つまたは複数のヌクレオチドを（例えば、第１の末端に）含む。一部の実施形態では、第２のプールからのオリゴヌクレオチドの末端（例えば、第１の末端）は、オリゴヌクレオチドが結合される切断産物の末端に共有結合で連結され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、オリゴヌクレオチドが結合される切断産物中の鎖の５’末端（例えば、リン酸化された５’末端）に共有結合で連結され得る。
第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、プライマー結合ドメインを含むことがある。第２のプールからのオリゴヌクレオチド上のプライマー結合ドメインは、第１のプールからのオリゴヌクレオチド上のプライマー結合ドメインとは異なることがある。プライマー結合ドメインは、任意の好適なプライマー結合配列を含むことがある。一部の実施形態では、プライマー結合ドメインは、Ｐ５プライマー結合配列を含む。一部の実施形態では、プライマー結合ドメインは、Ｐ７プライマー結合配列を含む。
第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、平滑末端を（例えば、第１の末端に）含むことがあり、または短い（例えば、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ）オーバーハングを第１の末端に含むこともある。例えば、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、単一のＴ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵオーバーハングを第１の末端に含むことがある。一部の実施形態では、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、単一のＴオーバーハングを含む。通常は、オーバーハング（例えば、Ｔオーバーハング）は、鎖の３’末端の第１の末端にある。
第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格修飾（例えば、鎖上の最後の２ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合）を含むことがある。一部の実施形態では、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、オーバーハング（例えば、３’Ｔオーバーハング）の前に鎖に対するホスホロチオエート骨格修飾を含む。第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、例えば本明細書に記載される任意の修飾ヌクレオチドなどの、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、遮断されたヌクレオチドを含む。第２のプールからのオリゴヌクレオチドをリン酸化することができる。第２のプールからのオリゴヌクレオチドを第１の末端でリン酸化することができる。通常は、第２のプールからのオリゴヌクレオチドは、鎖の５’末端の第１の末端でリン酸化される。
本明細書に記載されるある特定の方法は、短縮化オリゴヌクレオチドの使用を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２のプールは、短縮化オリゴヌクレオチドを含む。短縮化オリゴヌクレオチドは、本明細書では、専用オリゴヌクレオチド、専用アダプター（例えば、専用Ｐ５アダプター）、ショーティオリゴヌクレオチド、ショーティアダプター（例えば、ショーティＰ５アダプター）、およびこれらの変形形態と呼ばれることがある。短縮化オリゴヌクレオチドは、一方の鎖が他方の鎖より短い２本の核酸鎖（すなわち、第１の鎖および第２の鎖）を一般に含む。一部の実施形態では、第１の鎖は、第２の鎖より短い。一部の実施形態では、第１の鎖および第２の鎖は、オリゴヌクレオチドの一方の末端（例えば、第１の末端）で相補的であり、第２の鎖は、オリゴヌクレオチドの他方の末端（例えば、第２の末端）における一本鎖を含む。長い鎖の相補配列が、アニールされた状態を継続するのに十分な長さであるが、増幅される（例えば、インデックスＰＣＲ中に）には短すぎるように、短縮化オリゴヌクレオチドを設計することができる。短縮化オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドについて本明細書に記載される任意の特徴を含むことができる。しかし、短縮化オリゴヌクレオチドは、標的核酸中のネイティブオーバーハングと相補的であるオーバーハングを一般に含まず、オーバーハング識別配列を一般に含まない。
短縮化オリゴヌクレオチドは、短縮化オリゴヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列（例えば、バーコード）を含むことがある。オリゴヌクレオチド識別配列を使用して、短縮化オリゴヌクレオチドにライゲーションされる核酸断片末端を識別することができる。一部の事例では、オリゴヌクレオチド識別配列を使用して、短縮化オリゴヌクレオチドにライゲーションされる核酸断片末端と、非短縮化オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるオーバーハングオリゴヌクレオチド）にライゲーションされる核酸断片末端とを区別することができる。一部の事例では、オリゴヌクレオチド識別配列を使用して、非ネイティブ核酸断片末端（例えば、せん断により生成された核酸断片末端）を識別することができる。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、長さ約５ｂｐ～約１０ｂｐであるオリゴヌクレオチド識別配列を含む。例えば、短縮化オリゴヌクレオチドは、長さ約５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐまたは１０ｂｐであるオリゴヌクレオチド識別配列を含むことがある。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、長さ８ｂｐであるオリゴヌクレオチド識別配列を含む。
短縮化オリゴヌクレオチドは、プライマー結合ドメインを含むことがある。一般に、プライマー結合ドメインは、長い方の鎖（例えば、第２の鎖）上にある。プライマー結合ドメインは、任意の好適なプライマー結合配列を含むことがある。一部の実施形態では、プライマー結合ドメインは、Ｐ５プライマー結合配列を含む。一部の実施形態では、プライマー結合ドメインは、Ｐ７プライマー結合配列を含む。通常は、短い方の鎖（例えば、第１の鎖）は、プライマー結合ドメインを含まない。
短縮化オリゴヌクレオチドは、平滑末端を（例えば、第１の末端に）含むことがあり、または短い（例えば、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ）オーバーハングを第１の末端に含むことがある。例えば、短縮化オリゴヌクレオチドは、単一のＴ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵオーバーハングを第１の末端に含むことがある。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、単一のＴオーバーハングを含む。通常は、オーバーハング（例えば、Ｔオーバーハング）は、第２の鎖の３’末端にある。
短縮化オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格修飾（例えば、鎖上の最後の２ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合）を含むことがある。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、第２の鎖に対するホスホロチオエート骨格修飾を含む。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、オーバーハング（例えば、３’Ｔオーバーハング）の前に第２の鎖に対するホスホロチオエート骨格修飾を含む。
短縮化オリゴヌクレオチドは、例えば本明細書に記載される任意の修飾ヌクレオチドなどの、１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、遮断されたヌクレオチド（例えば、Ｃ３スペーサーを含むヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、短縮化オリゴヌクレオチドは、第２の鎖に遮断されたヌクレオチドを含む。通常は、遮断されたヌクレオチドは、第２の鎖の５’末端にある。短縮化オリゴヌクレオチドをリン酸化することができる。短縮化オリゴヌクレオチドを第１の末端でリン酸化することができる。通常は、短縮化オリゴヌクレオチドは、第１の鎖の５’末端でリン酸化される。
試料
核酸を処理および／または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法および組成物において利用される核酸または核酸混合物は、対象（例えば、被検対象）から得た試料から単離することができる。対象は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、原生生物または病原体を含むがこれらに限定されない、任意の生命体または非生命体であり得る。任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができ、任意のヒトまたは非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ヤギ亜科の動物およびヒツジ属の動物（例えば、ヒツジ、ヤギ）、イノシシ属の動物（例えば、ブタ）、ラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科の蹠行性肉食動物（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメを挙げることができる。対象は、雄であってもよく、または雌（例えば、女性、もしくは妊婦）であってもよい。対象は、いかなる年齢（例えば、胚、胎児、乳幼児、小児、成人）であってもよい。対象は、がん患者、がんの罹患が疑われる患者、寛解期の患者、がんの家族歴を有する患者、および／またはがんスクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、感染症もしくは感染性疾患に罹患しているまたは病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生動物など）に感染した患者、感染症もしくは感染性疾患の罹患または病原体による感染が疑われる患者、感染症、感染性疾患または病原体感染から回復した患者、感染症歴、感染性疾患歴、病原体感染歴がある患者、および／あるいは感染性疾患または病原体スクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、移植レシピエントであり得る。対象は、マイクロバイオーム解析を受けている患者であり得る。一部の実施形態では、被検対象は、雌である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雌である。一部の実施形態では、被検対象は、雄である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雄である。
核酸試料を、任意のタイプの好適な生物検体または試料（例えば、被検試料）から単離することまたは得ることができる。核酸試料を、単一細胞、複数の細胞（例えば、培養細胞）、細胞培養培地、馴化培地、組織、臓器、または生物（例えば、細菌、酵母など）から単離することまたは得ることができる。一部の実施形態では、核酸試料は、動物（例えば、動物対象）の細胞、組織、臓器および／またはこれらに類するものから単離されるかまたは得られる。一部の実施形態では、核酸試料は、細菌、酵母、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、哺乳動物、両生類（例えば、カエル（例えば、ツメガエル））、ウイルス、植物、または任意の他の哺乳動物もしくは非哺乳動物の核酸試料源などの、供給源から単離されるかまたは得られる。
核酸試料を、現存生物または動物から単離することまたは得ることができる。一部の事例では、核酸試料を、絶滅した（または「古代」）生物または動物（例えば、絶滅した哺乳動物；ヒト属からの絶滅した哺乳動物）から単離することまたは得ることができる。一部の事例では、核酸試料を、法医学分析の一部として得ることができる。一部の事例では、核酸試料を、診断分析の一部として得ることができる。
試料または被検試料は、対象またはその一部（例えば、ヒト対象、妊娠している雌、がん患者、感染症または感染性疾患に罹患している患者、移植レシピエント、胎児、腫瘍、感染臓器または組織、移植臓器または組織、マイクロバイオーム）から単離されるまたは得られ任意の検体であり得る。試料は、任意の妊娠期（例えば、ヒト対象については妊娠初期、妊娠中期または妊娠後期）の胎児を宿している妊娠している雌対象からのものであることもあり、出産後の対象からのものであることもある。試料は、すべての染色体が正倍数性である胎児を宿している妊娠している対象からのものであることもあり、染色体異数性（例えば、染色体の１、３（すなわち、トリソミー（例えば、Ｔ２１、Ｔ１８、Ｔ１３））もしくは４つのコピー）または他の遺伝的変異を有する胎児を宿している妊娠している対象からのものであることもある。検体の非限定的な例としては、血液もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿など）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡視下）、生検試料（例えば、着床前胚；がん生検からのもの）、体腔穿刺試料、細胞（血液細胞、胎盤細胞、胚もしくは胎児細胞、胎児有核細胞もしくは胎児細胞遺残物、正常細胞、異常細胞（例えば、がん細胞））またはそれらの部分（例えば、ミトコンドリアのもの、核、抽出物など）、雌生殖管の洗液、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁など、またはそれらの組合せを限定ではないが含む、対象からの体液または組織が挙げられる。一部の実施形態では、生体試料は、対象からの子宮頸部スワブである。核酸が抽出される体液または組織試料は、無細胞性（例えば、無細胞）であることがある。一部の実施形態では、体液または組織試料は、細胞要素または細胞遺残物を含有することがある。一部の実施形態では、胎児細胞またはがん細胞が試料に含まれていることがある。
試料は、液体試料であることがある。液体試料は、細胞外核酸（例えば、循環無細胞ＤＮＡ）を含むことがある。液体試料の非限定的な例としては、血液もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿など）、尿、生検試料（例えば、がんの検出のための液体生検）、上記の液体試料など、またはこれの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、試料は、液体生検であり、液体生検は、疾患の存在、非存在、悪化または寛解についての対象からの液体試料の評定を一般に指す。液体生検を、固体生検（例えば、腫瘍生検）とともに、または固体生検（例えば、腫瘍生検）の代替法として、使用することができる。ある特定の事例では、細胞外核酸は、液体生検で解析される。
一部の実施形態では、生体試料は、血液、血漿または血清であることがある。用語「血液」は、従来どおりの定義の、全血、血液製剤、または血液の任意の画分、例えば、血清、血漿、バフィーコートなどを包含する。血液またはその画分は、ヌクレオソームを含むことが多い。ヌクレオソームは、核酸を含み、無細胞であることもあり、または細胞内にあることもある。血液は、バフィーコートも含む。バフィーコートは、フィコール勾配を利用することにより単離されることもある。バフィーコートは、白血球（例えば、白血球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板など）を含むことができる。血漿は、抗凝固薬で処理された血液の遠心分離の結果として得られる、全血の画分を指す。血清は、血液試料が凝固した後に残存する流体の水様部分を指す。体液または組織試料は、病院または診療所が一般に準拠する標準プロトコールに従って採取されることが多い。血液の場合、末梢血の適切な量（例えば、３～４０ミリリットルの間、５～５０ミリリットルの間）が採取されることが多く、調製前または後に標準的な手順に従って保管され得る。
対象の血液中で見つかった核酸の解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、母体血中で見つかった胎児ＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、患者の血液中で見つかった腫瘍またはがんＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、患者の血液中で見つかった病原体ＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、移植レシピエントの血液中で見つかった移植ＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。対象（例えば、母体対象；患者；がん患者）から得た血液から血清または血漿を調製する方法は、公知である。例えば、対象の血液（例えば、妊婦の血液；患者の血液；がん患者の血液）を、ＥＤＴＡを含有するチューブまたは専用市販製品、例えば、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）に入れて、血液凝固を防止することができ、次いで、血漿を全血から遠心分離によって得ることができる。血清は、血液凝固後の遠心分離を行ってまたは行わずに得ることができる。遠心分離が使用される場合には、遠心分離は、排他的にではないが、通常は、適切な速度、例えば、１，５００～３，０００回ｇで行われる。血漿または血清は、核酸抽出のために未使用のチューブに移す前に追加の遠心分離ステップに付されることがある。全血の無細胞性部分に加えて、細胞画分から、対象からの全血試料の遠心分離および血漿の除去後に得ることができるバフィーコート部分に多く含まれている核酸を回収することもできる。
試料は、腫瘍核酸試料（すなわち、腫瘍から単離された核酸試料）であることがある。用語「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかを問わず、新生物細胞成長および増殖を一般に指し、前がん性およびがん性細胞および組織を含み得る。用語「がん」および「がん性（の）」は、非調節細胞成長／増殖によって通常は特徴付けられる哺乳動物の生理的状態を一般に指す。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、様々なタイプの頭頸部がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
試料は、不均一であることがある。例えば、試料は、１つより多くの細胞型および／または１つもしくは複数の核酸種を含むことがある。一部の事例では、試料は、（ｉ）胎児細胞と母体細胞、（ｉｉ）がん細胞と非がん細胞、および／または（ｉｉｉ）病原性細胞と宿主細胞を含むことがある。一部の事例では、試料は、（ｉ）がん核酸と非がん核酸、（ｉｉ）病原体核酸と宿主核酸、（ｉｉｉ）胎児由来核酸と母体由来核酸、および／またはより一般的には、（ｉｖ）突然変異した核酸と野生型核酸を含むことがある。一部の事例では、試料は、下でさらに詳細に説明されるような、少数派核酸種と多数派核酸種を含むことがある。一部の事例では、試料は、単一の対象からの細胞および／もしくは核酸を含むこともあり、または複数の対象からの細胞および／もしくは核酸を含むこともある。
核酸
核酸を処理および／または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸、核酸分子、核酸断片、標的核酸、核酸鋳型、鋳型核酸、核酸標的、標的核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド断片、標的ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド標的などの用語は、本開示を通して同義で使用され得る。これらの用語は、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ；目的の任意のＲＮＡまたはＤＮＡから合成されたもの）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ断片、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、組換えＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファー・メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、胎児または胎盤により高度に発現されるＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非ネイティブ骨格などを含む）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドならびにポリアミド核酸（ＰＮＡ）であって、すべてが、一本鎖または二本鎖形態であることがあり、別段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含し得る、これらのものなどからの、任意の組成の核酸を指す。核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルス、細菌、自己複製配列（ＡＲＳ）、ミトコンドリア、セントロメア、人工染色体、染色体であってもよく、またはこれらからのものであってもよく、あるいはある特定の実施形態ではｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは宿主細胞、細胞、細胞の細胞核もしくは細胞質で複製し得るもしくは複製され得る他の核酸であってもよく、またはそのような他の核酸からのものであってもよい。一部の実施形態での鋳型核酸は、単一の染色体からのものであり得る（例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の１つの染色体からのものであることがある）。特に制限がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む、核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることにより果たすことができる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、遺伝子によりコードされているｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと同義で使用される。この用語は、ヌクレオチドアナログ、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、バリアントおよびアナログも、同意義のものとして含み得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡの一区画を指し；遺伝子産物の転写／翻訳におよび転写／翻訳の調節に関与するコード領域（リーダーおよびトレーラー）に先行するおよび続く領域、ならびに個々のコード領域（エクソン）間の介在配列（イントロン）を一般に含む。ヌクレオチドまたは塩基は、核酸のプリンおよびピリミジン分子単位（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ））を一般に指す。ＲＮＡについては、塩基チミンが、ウラシルに置き換えられる。核酸長またはサイズを、塩基の数で表すことができる。
標的核酸は、目的の任意の核酸であり得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ塩基）、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ塩基）、またはこれらの組合せで構成されている任意の長さの、例えば、１０塩基のまたはそれより長い、２０塩基のまたはそれより長い、５０塩基のまたはそれより長い、１００塩基のまたはそれより長い、２００塩基のまたはそれより長い、３００塩基のまたはそれより長い、４００塩基のまたはそれより長い、５００塩基のまたはそれより長い、１０００塩基のまたはそれより長い、２０００塩基のまたはそれより長い、３０００塩基のまたはそれより長い、４０００塩基のまたはそれより長い、５０００塩基のまたはそれより長いポリマーであり得る。ある特定の態様では、核酸は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ塩基）、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ塩基）、またはこれらの組合せ、例えば、１０塩基もしくはそれ未満、２０塩基もしくはそれ未満、５０塩基もしくはそれ未満、１００塩基もしくはそれ未満、２００塩基もしくはそれ未満、３００塩基もしくはそれ未満、４００塩基もしくはそれ未満、５００塩基もしくはそれ未満、１０００塩基もしくはそれ未満、２０００塩基もしくはそれ未満、３０００塩基もしくはそれ未満、４０００塩基もしくはそれ未満、または５０００塩基もしくはそれ未満で構成されている、ポリマーである。
核酸は、一本鎖状であってもよく、または二本鎖状であってもよい。例えば、一本鎖ＤＮＡは、例えば、加熱によりまたはアルカリでの処理により二本鎖ＤＮＡを変性させることによって生成することができる。ある特定の実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ様分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、による二重鎖ＤＮＡ分子に対する鎖侵入によって形成される、Ｄ－ループ構造で存在する。例えば、当技術分野において公知の方法を使用する、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質の付加によりおよび／または塩濃度の変更により、Ｄループ形成を助長することができる。
核酸（例えば、核酸標的、オリゴヌクレオチド、オーバーハング）は、本明細書では、別の核酸に相補的であると、または相補的領域を有すると、記載されることがある。用語「相補的」または「相補性」は、本明細書で使用される場合、核酸（例えば、標的）の領域と非共有結合により塩基対合するヌクレオチド配列を指す。標準ワトソン・クリック塩基対合では、ＤＮＡの場合、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）は、シトシン（Ｃ）と対合する。ＲＮＡの場合、チミンは、ウラシル（Ｕ）により置き換えられる。しかるが故に、Ａは、Ｔと相補的であり、Ｇは、Ｃと相補的である。ＲＮＡの場合、Ａは、Ｕと相補的であり、逆もまた同様である。通常は、「相補的」または「相補性」は、少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。これらの用語は、完全に相補的であり、したがって、一方の鎖内のあらゆるヌクレオチドが、他方の鎖の対応する位置のあらゆるヌクレオチドと相補的である、二重鎖も包含し得る。
ある特定の事例では、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であることがあり、この場合、すべてのヌクレオチドが、標的核酸中のすべての対応する位置のあらゆるヌクレオチドと相補的であるとは限らない。例えば、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸オーバーハングに完璧に（すなわち、１００％）相補的であることもあり、または完璧とまではいかない（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％である）ある程度の相補性を共有することもある。
一部の実施形態では、核酸の混合物中の核酸が解析される。核酸の混合物は、同じもしくは異なるヌクレオチド配列、異なる長さ、異なる起源（例えば、ゲノム起源、胎児対母体起源、細胞もしくは組織起源、がん対非がん起源、腫瘍対非腫瘍起源、宿主対病原体、宿主対移植片、宿主対マイクロバイオーム、試料起源、対象起源など）、異なるオーバーハング長、異なるオーバーハングタイプ（例えば、５’オーバーハング、３’オーバーハング、オーバーハングなし）、またはこれらの組合せを有する、２つまたはそれより多くの核酸種を含むことができる。本明細書に記載されるプロセスに供される核酸は、１つの試料からの、または２つもしくはそれより多くの試料からの（例えば、１つもしくは複数、２つもしくはそれより多くの、３つもしくはそれより多くの、４つもしくはそれより多くの、５つもしくはそれより多くの、６つもしくはそれより多くの、７つもしくはそれより多くの、８つもしくはそれより多くの、９つもしくはそれより多くの、１０もしくはそれより多くの、１１もしくはそれより多くの、１２もしくはそれより多くの、１３もしくはそれより多くの、１４もしくはそれより多くの、１５もしくはそれより多くの、１６もしくはそれより多くの、１７もしくはそれより多くの、１８もしくはそれより多くの、１９もしくはそれより多くの、または２０もしくはそれより多くの試料からの）核酸を含有することがある。
一部の実施形態では、標的核酸は、分解されたＤＮＡを含む。分解されたＤＮＡは、低品質ＤＮＡまたは高度に分解されたＤＮＡと呼ばれることがある。分解されたＤＮＡは、高度に断片化されていることがあり、損傷部をミスコードしやすいおよび／または分子間架橋しやすい塩基アナログおよび脱塩基部位などの損傷を含むことがある。例えば、シトシン残基の脱アミノ化の結果として生じるシーケンシングの誤りは、分解されたＤＮＡから得られるある特定の配列中に存在することがある（例えば、ＣをＴとおよびＧをＡとミスコードすること）。
核酸を当技術分野において公知の方法により１つまたは複数の供給源（例えば、生体試料、血液、細胞、血清、血漿、バフィーコート、尿、リンパ液、皮膚、土壌など）から得ることができる。任意の好適な方法を、生体試料から（例えば、血液または血液製剤から）のＤＮＡの単離、抽出および／または精製に使用することができ、この方法の非限定的な例としては、ＤＮＡ調製方法（例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001に記載されている）、様々な市販の試薬も
しくはキット、例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍｄ）によるＤＮｅａｓｙ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）およびＱＩＡａｍｐ（登録商標）（例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）核酸単離／精製キット；ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）；ＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＤＮＡｚｏｌ（登録商標）、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）、ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（登録商標）核酸単離／精製キット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）およびＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）核酸単離／精製キット；など、またはこれらの組合せが挙げられる。ある特定の態様では、核酸は、固定された生体試料、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から、単離される。ＦＦＰＥ組織からのゲノムＤＮＡは、市販のキット－例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍｄ）によるＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＦＦＰＥ用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰＥキット－を使用して単離することができる。
一部の実施形態では、核酸は、細胞溶解手順を使用して細胞から抽出される。細胞溶解手順および試薬は、当技術分野において公知であり、一般に、化学的方法（例えば、界面活性剤、低張溶液、酵素的手順など、もしくはこれらの組合せ）、物理的方法（例えば、フレンチプレス、音波処理など）、または電解溶解法により行われ得る。任意の好適な溶解手順を利用することができる。例えば、化学的方法は、一般に、溶解剤を利用して細胞を破壊し、細胞から核酸を抽出し、その後、カオトロピック塩で処理する。物理的方法、例えば、凍結／解凍、続いての粉砕、細胞プレスの使用なども、有用である。一部の事例では、高塩および／またはアルカリ溶解手順が利用されることがある。一部の事例では、溶解手順は、ＥＤＴＡ／プロテイナーゼＫでの溶解ステップ、大量の塩（例えば、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、酢酸ナトリウム）およびイソプロパノールを用いる結合緩衝ステップ、およびこの溶液中のＤＮＡをシリカに基づくカラムに結合させるステップを含み得る。一部の事例では、溶解プロトコールは、Dabney et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 110, no. 39 (2013): 15758-15763に記載されている、ある特定の手順を含む。
核酸は、ある特定の実施形態では細胞外核酸を含むことができる。用語「細胞外核酸」は、本明細書で使用される場合、実質的に細胞を有さない供給源から単離された核酸を指すことができ、「無細胞」核酸（無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、または両方）、「循環無細胞核酸」（例えば、ＣＣＦ断片、ｃｃｆ ＤＮＡ）および／または「無細胞循環胞核酸」とも呼ばれる。細胞外核酸は、血液中に存在することができ、細胞外核酸を血液から（例えば、ヒト対象の血液から）得ることができる。細胞外核酸は、多くの場合、検出可能な細胞を含まず、細胞要素または細胞遺残物を含有し得る。細胞外核酸の無細胞性供給源の非限定的な例は、血液、血漿、血清および尿である。ある特定の態様では、無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸膜滲出液、気管支洗浄、気管支吸引物、母乳、初乳、涙、精液、腹水、胸膜滲出液、および便から選択される体液試料から得られる。本明細書で使用される場合、用語「無細胞循環試料核酸を得る」は、試料を直接得ること（例えば、試料、例えば被検試料、を採取すること）、または試料を採取した別の者から試料を得ることを含む。細胞外核酸は、細胞の分泌および／または核酸放出（例えば、ＤＮＡ放出）の産物であることがある。細胞外核酸は、例えば、任意の形態の死細胞の産物であることがある。一部の事例では、細胞外核酸は、有糸分裂性、膨化性、毒性、虚血性のものなど、およびこれらの組合せを含む、任意の形態のＩ型またはＩＩ型細胞死の産物である。理論により制限されるものではないが、細胞外核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞破壊の産物であることがあり、これは、スペクトル（例えば「ラダー」）にわたって一連の長さを有することが多い細胞外核酸の基礎を提供する。一部の事例では、細胞外核酸は、細胞壊死、ネクロプトーシス（necropoptosis）、膨化死、エントーシス、ピロト
ーシス（pyrotosis）など、およびこれらの組合せの産物である。一部の実施形態では、
被検対象からの試料核酸は、循環無細胞核酸である。一部の実施形態では、循環無細胞核酸は、被検対象からの血漿または血清からのものである。一部の態様では、無細胞核酸は、分解されている。一部の実施形態では、無細胞核酸は、無細胞胎児核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ）を含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、循環がん核酸（例えば、がんＤＮＡ）を含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、循環腫瘍核酸（例えば、腫瘍ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、感染性因子核酸（例えば、病原体ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、移植片からの核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、マイクロバイオーム（例えば、腸のマイクロバイオーム、血液のマイクロバイオーム、口腔のマイクロバイオーム、脊髄液のマイクロバイオーム、糞便のマイクロバイオーム）からの核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。
細胞外核酸は、異なる核酸種を含むことがあり、したがって、ある一定の実施形態では「不均一」と本明細書では呼ばれる。例えば、腫瘍またはがんに罹患している人物からの血清または血漿は、腫瘍細胞またはがん細胞（例えば、新生物）からの核酸と、非腫瘍細胞または非がん細胞からの核酸とを含み得る。別の例では、妊娠している雌からの血清または血漿は、母体核酸と胎児核酸を含み得る。別の例では、感染症または感染性疾患に罹患している患者からの血清または血漿は、宿主核酸と感染因子または病原体核酸とを含み得る。別の例では、移植を受けたことがある対象からの試料は、宿主核酸とドナー臓器または組織からの核酸とを含み得る。一部の事例では、がん核酸、腫瘍核酸、胎児核酸、病原体核酸、または移植片核酸は、全核酸の約５％～約５０％であることもある（例えば、全核酸の約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９％が、がん、腫瘍、胎児、病原体、移植片またはマイクロバイオーム核酸である）。別の例では、不均一核酸は、２またはそれより多くの対象（例えば、犯行現場からの試料）からの核酸を含み得る。
少なくとも２つの異なる核酸種が、細胞外核酸中に異なる量で存在することがあり、これらの核酸種は、少数派種および多数派種と呼ばれることがある。ある特定の事例では、核酸の少数派種は、罹患細胞型（例えば、がん細胞、消耗細胞、免疫系による攻撃を受けた細胞）からのものである。ある特定の実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変更（例えば、コピー数変更、コピー数変異、一塩基変更、一塩基変異、染色体変更、および／または転座）が、少数派核酸種について判定される。ある特定の実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変更が、多数派核酸種について判定される。一般に、用語「少数派」または「多数派」は、いかなる点についても厳格に定義されることを意図したものでない。一態様では、例えば、「少数派」と考えられる核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約０．１％から試料中の全核酸の５０％未満までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、少数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約１％から試料中の全核酸の約４０％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、少数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約２％から試料中の全核酸の約３０％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、少数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約３％から試料中の全核酸の約２５％までの存在量を有することができる。例えば、少数派核酸は、試料中の全核酸の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％の存在量を有することができる。一部の事例では、細胞外核酸の少数派種は、全核酸の約１％～約４０％であることもある（例えば、核酸の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％が、少数派種核酸である）。一部の実施形態では、少数派核酸は、細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、アポトーシス組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、内部の一部の細胞がアポトーシスを遂げた組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、壊死組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、内部の一部の細胞が壊死を遂げた組織からの細胞外ＤＮＡである。壊死は、ある特定の事例では、細胞死の後の死後プロセスを指すことがある。一部の実施形態では、少数派核酸は、細胞増殖性障害（例えば、がん）に罹患した組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、腫瘍細胞からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、細胞外胎児ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、病原体からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、移植片からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、マイクロバイオームからの細胞外ＤＮＡである。
別の態様では、例えば、「多数派」と考えられる核酸は、試料中の全核酸の５０％を超える存在量から試料中の全核酸の約９９．９％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約６０％から試料中の全核酸の約９９％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約７０％から試料中の全核酸の約９８％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約７５％から試料中の全核酸の約９７％までの存在量を有することができる。例えば、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、細胞外母体ＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、健康な組織からのＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、非腫瘍細胞からのＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、宿主細胞からのＤＮＡである。
一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約５００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約５００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約３００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約３００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約２５０塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約２５０塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約２００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約２００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約１５０塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約１５０塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約１００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約１００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約５０塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約５０塩基対またはそれ未満の長さのものである）。
核酸は、核酸を含有する試料の処理の有無にかかわらず、本明細書に記載される方法の実施に供することができる。一部の実施形態では、核酸は、核酸を含有する試料の処理後に、本明細書に記載される方法の実施に供される。例えば、核酸を試料から抽出、単離、精製、部分的に精製、または増幅することができる。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には天然環境、または外因的に発現される場合には宿主細胞）から除去された核酸を指し、したがって、その元の環境からヒトの介入により（例えば、「人間の手により」）変更されている。用語「単離された核酸」は、本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒト対象）から除去された核酸を指すことができる。供給源試料に存在する成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）を有する、単離された核酸を提供することができる。単離された核酸を含む組成物は、約５０％～９９％を超える％非核酸成分不含であり得る。単離された核酸を含む組成物は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える％非核酸成分不含であり得る。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、核酸を精製手順に付す前に存在する非核酸成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）を含有する、提供される核酸を指すことができる。精製された核酸を含む組成物は、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える％他の非核酸成分不含であり得る。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、核酸が由来する試料源中より少ない核酸種を含有する、提供される核酸を指すことができる。精製された核酸を含む組成物は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える％他の核酸種不含であり得る。例えば、胎児核酸を、母体核酸と胎児核酸とを含む混合物から精製することができる。ある特定の例では、核酸の小さい断片（例えば、３０～５００ｂｐ断片）を、異なる長さの核酸断片を含む混合物から精製または部分的に精製することができる。ある特定の例では、核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームを、核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。ある特定の例では、核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体を、核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームから精製することができる。ある特定の例では、胎児核酸の小さい断片（例えば、３０～５００ｂｐ断片）を、胎児核酸断片と母体核酸断片の両方を含む混合物から精製または部分的に精製することができる。ある特定の例では、胎児核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームを、母体核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。ある特定の例では、がん細胞核酸を、がん細胞核酸と非がん細胞核酸とを含む混合物から精製することができる。ある特定の例では、がん細胞核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームを、非がん核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。一部の実施形態では、核酸は、核酸を含有する試料の事前の処理なしで、本明細書に記載される方法の実施に供される。例えば、事前の抽出、精製、部分的精製、および／または増幅なしで、試料から直接核酸を解析することができる。
核酸を増幅条件下で増幅することができる。用語「増幅される」または「増幅」または「増幅条件」は、本明細書で使用される場合、標的核酸またはその一部と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的にまたは指数関数的に生成するプロセスに試料中の標的核酸を付すことを指す。ある特定の実施形態では、用語「増幅される」または「増幅」または「増幅条件」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を指す。ある特定の事例では、増幅産物は、核酸鋳型配列の増幅ヌクレオチド領域より１つまたは複数多いヌクレオチドを含有することができる（例えば、プライマーは、核酸鋳型遺伝子分子に相補的なヌクレオチドに加えて転写開始配列などの「余分な」ヌクレオチドを含有することができ、その結果、増幅産物は、核酸鋳型遺伝子分子の増幅ヌクレオチド領域に対応しない「余分な」ヌクレオチドまたはヌクレオチドを含有することになる）。
核酸は、本明細書に記載される方法に核酸を供する前に、核酸中のある特定のヌクレオチドを修飾するプロセスに曝露され得る。例えば、内部のヌクレオチドのメチル化状態に基づいて核酸を選択的に修飾するプロセスを核酸に適用することができる。加えて、高温、紫外線照射、Ｘ線照射などの条件は、核酸分子の配列の変化を誘導することができる。核酸を、配列解析を行うのに有用な任意の好適な形態で提供することができる。
一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない。この文脈での「修飾されない」は、標的核酸が試料から単離され、次いで、標的核酸の長さの修飾なしでオリゴヌクレオチドと結合されることを意味する。例えば、標的核酸は、長さが１ヌクレオチドも複数ヌクレオチドも短縮されず（例えば、それらは、制限酵素とも、ヌクレアーゼとも、長さを低減させる物理的条件（例えば、せん断条件、切断条件）とも接触されず）かつ増加されない（例えば、末端は、オーバーハングでフィルインされない；ヌクレオチドが末端に付加されない）。標的核酸の一方または両方の末端へのリン酸基または化学反応性基の付加は、一般に、核酸の長さの修飾と見なされない。
一部の実施形態では、標的核酸のネイティブ末端は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない。この文脈での「修飾されない」は、標的核酸が試料から単離され、次いで、標的核酸のネイティブ末端の長さの修飾なしでオリゴヌクレオチドと結合されることを意味する。例えば、標的核酸は、長さが１ヌクレオチドも複数ヌクレオチドも短縮されず（例えば、それらは、非ネイティブ末端を生成するために、制限酵素とも、ヌクレアーゼとも、長さを低減する物理的条件（例えば、せん断条件、切断条件）とも接触されず）かつ増加されない（例えば、ネイティブ末端は、オーバーハングでフィルインされない；ヌクレオチドがネイティブ末端に付加されない）。標的核酸のネイティブ末端の一方または両方へのリン酸基または化学反応性基の付加は、一般に、核酸の長さの修飾と見なされない。
一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に、切断作用因子（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素）および／またはポリメラーゼと接触されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に、機械的せん断（例えば、超音波処理（例えば、ＣｏｖａｒｉｓによるＡｄａｐｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ（商標）（ＡＦＡ）プロセス））に付されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前にエキソヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅ）と接触されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に増幅されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に固体支持体に結合されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に別の分子にコンジュゲートされない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前にベクターにクローニングされない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前に脱リン酸化に付されることがある。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書でのオリゴヌクレオチドと結合させるステップの前にリン酸化に付されることがある。
一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、および単離された標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることを含む。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることを含む。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、オリゴヌクレオチドを脱リン酸化すること、および単離された標的核酸を脱リン酸化されたオリゴヌクレオチドと結合させることを含む。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱離リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることを含む。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱離リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、オリゴヌクレオチドを脱リン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸を脱リン酸化されたオリゴヌクレオチドと結合させることを含む。
一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、および単離された標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることからなる。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることからなる。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、オリゴヌクレオチドを脱リン酸化すること、および単離された標的核酸を脱リン酸化されたオリゴヌクレオチドと結合させることからなる。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱離リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることからなる。一部の実施形態では、本明細書での標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させるステップは、本明細書では、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱離リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、オリゴヌクレオチドを脱リン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸を脱リン酸化されたオリゴヌクレオチドと結合させることからなる。
核酸の濃縮
一部の実施形態では、核酸（例えば、細胞外核酸）は、核酸の部分集団または種について濃縮または相対的に濃縮される。核酸部分集団は、例えば、胎児核酸、母体核酸、がん核酸、腫瘍核酸、患者核酸、宿主核酸、病原体核酸、移植片核酸、マイクロバイオーム核酸、特定の長さもしくは長さの範囲の断片を含む核酸、または特定のゲノム領域（例えば、単一の染色体、染色体のセット、および／もしくはある特定の染色体領域）からの核酸を含むことができる。そのような濃縮された試料を、本明細書で提供される方法とともに使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本技術の方法は、試料中の核酸の部分集団について濃縮するさらなるステップを含む。ある特定の実施形態では、正常組織（例えば、非がん細胞、宿主細胞）からの核酸は、試料から選択的に（部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に）除去される。ある特定の実施形態では、母体核酸は、試料から選択的に（部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に）除去される。ある特定の実施形態では、特定の低コピー数種核酸（例えば、がん、腫瘍、胎児、病原体、移植片、マイクロバイオーム核酸）についての濃縮は、定量感度を改善することができる。試料を核酸の特定の種について濃縮する方法は、例えば、米国特許第６，９２７，０２８号、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４０４１７、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４７０６３、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０３２７７９、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０３２７８１、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１０／０３３６３９、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０３４６３１、国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０５６４８０、および国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／１４３６５９に記載されており、各々の全内容は、本文、表、式および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸は、ある特定の標的断片種および／または参照断片種について濃縮される。ある特定の実施形態では、核酸は、下で説明される、１つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特異的核酸断片長または断片長範囲について濃縮される。ある特定の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知の、１つまたは複数の配列に基づく分離方法を使用して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）からの断片について濃縮される。
試料中の核酸部分集団について濃縮する方法の非限定的な例としては、核酸種間のエピジェネティックな差を利用する方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載されている、メチル化に基づく胎児核酸濃縮方法）；制限エンドヌクレアーゼにより多型配列を増強するアプローチ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０３１７８１８号に記載されている方法など）；選択的酵素的消化アプローチ；大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）アプローチ；増幅（例えば、ＰＣＲ）に基づくアプローチ（例えば、遺伝子座特異的増幅法、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲアプローチ；ユニバーサル増幅法）；プルダウンアプローチ（例えば、ビオチン化ウルトラマープルダウン法）；伸長およびライゲーションに基づく方法（例えば、分子反転プローブ（ＭＩＰ）伸長およびライゲーション）；およびこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載される１つまたは複数の配列に基づく分離方法を使用して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）からの断片について濃縮される。配列に基づく分離は、目的の断片（例えば、標的および／または参照断片）に存在するが、試料の他の断片には実質的に存在しないかまたは他の断片のごくわずかな量（例えば、５％またはそれ未満）に存在する、ヌクレオチド配列に一般に基づく。一部の実施形態では、配列に基づく分離は、分離された標的断片および／または分離された参照断片を生じさせることができる。分離された標的断片および／または分離された参照断片は、核酸試料中に残存する断片から単離されることが多い。ある特定の実施形態では、分離された標的断片および分離された参照断片はまた、互いから単離される（例えば、別々のアッセイ区画で単離される）。ある特定の実施形態では、分離された標的断片および分離された参照断片は、一緒に単離される（例えば、同じアッセイ区画で単離される）。一部の実施形態では、未結合断片を別個に除去または分解または消化することができる。
一部の実施形態では、標的および／または参照断片を核酸試料から分離するために、選択的核酸捕捉プロセスが使用される。市販の核酸捕捉システムとしては、例えば、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉システム（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢＥＡＤＡＲＲＡＹプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；および関連プラットフォームが挙げられる。そのような方法は、キャプチャーオリゴヌクレオチドと標的または参照断片のヌクレオチド配列の一部またはすべてとのハイブリダイゼーションを通常は含み、固相（例えば、固相アレイ）および／または溶液に基づくプラットフォームの使用を含み得る。キャプチャーオリゴヌクレオチド（「ベイト」と呼ばれることもある）を、それらが、選択されたゲノム領域もしくは遺伝子座からの核酸断片と、または核酸標的中の特定の配列と、優先的にハイブリダイズするように、選択または設計することができる。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションに基づく方法（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用するもの）を使用して、ある特定の核酸配列を含有する断片について濃縮することができる。したがって、一部の実施形態では、核酸試料は、例えば、試料核酸中の選択された配列に相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチドを使用して断片のサブセットを捕捉することにより、必要に応じて濃縮される。ある特定の事例では、捕捉された断片が増幅される。例えば、アダプターを含有する捕捉された断片を、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを使用して増幅して、アダプター配列に従ってインデックスが付加された、増幅された断片の一群を形成することができる。一部の実施形態では、核酸は、目的の領域を含有する断片の配列またはそれらの部分に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲプライマ－）を使用する目的の１つまたは複数の領域の増幅により、選択ゲノム領域（例えば、染色体、遺伝子）からの断片について濃縮される。
一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、特定の核酸断片長（単数）、長さの範囲、または長さ（複数）について濃縮される。核酸断片長は、通常は、断片中のヌクレオチドの数を指す。核酸断片長はまた、核酸断片サイズと呼ばれることもある。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを測定せずに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを決定する方法とともに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、分画されたプールのすべてまたは一部を単離（例えば、保持）および／または解析することができる、サイズ分画手順を指す。サイズ分画手順は、当技術分野において公知である（例えば、アレイでの分離、モレキュラーシーブによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除カラム）による分離、およびマイクロフルイディクスに基づくアプローチ）。ある特定の事例では、長さに基づく分離アプローチは、例えば、選択的配列タグ付けアプローチ、断片環状化、化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿）、質量分析および／またはサイズ特異的核酸増幅を含み得る。
一部の態様では、方法は、標的核酸の種について濃縮するステップを含む。例えば、本明細書における方法は、特定のオーバーハング特徴（例えば、長さ、タイプ（５’、３’）、配列）を有する標的核酸の種について濃縮するステップを含むことがある。特定のオーバーハング特徴を有する標的核酸の種についての濃縮は、特定のオーバーハング識別配列に従って果たすことができる。例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドと複合体化した、ある特定の標的核酸を、特定のオーバーハング識別配列に従って（例えば、オーバーハング識別配列の、配列に従って、または別の特徴（例えば、修飾）に従って）標的核酸の残部から分離することができる。一部の実施形態では、方法は、複合体（本明細書におけるオリゴヌクレオチドに結合された標的核酸）を、特定のオーバーハング識別配列と特異的にハイブリダイズする１つまたは複数の結合剤と会合させるステップを含み、それによって濃縮された複合体が生成される。用語「特異的にハイブリダイズする」について、特異的、または特異度は、一般に、ある分子と別の分子（例えば、ポリヌクレオチド鎖と相補鎖）の結合またはハイブリダイゼーションを指す。すなわち、特異的または特異度は、２分子間の、これらの２分子のうちのどちらかと他の分子との実質的により低い認識、接触または複合体形成と比較して、安定した複合体の認識、接触および形成を指す。ハイブリダイズするという用語は、一般に、２分子間の安定した複合体の形成を指す。
一部の態様では、特定のオーバーハング識別配列に相補的なポリヌクレオチドは、結合対のメンバーを含む。一部の態様では、特定のオーバーハング識別配列中の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド）は、結合対のメンバーを含む。結合対は、例えば、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡもしくはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応性基／相補的化学反応性基、ジゴキシゲニン部分／抗ジゴキシゲニン抗体、フルオレセイン部分／抗フルオレセイン抗体、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、オペレーター／リプレッサー、ヌクレアーゼ／ヌクレオチド、レクチン／多糖、活性化合物／活性化合物受容体、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド／その対応する補体など、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、特定のオーバーハング識別配列と特異的にハイブリダイズする１つまたは複数の結合剤を、固体支持体（例えば、ビーズ、または本明細書に記載されるもしくは当技術分野において公知の任意の好適な固体支持体）に結合させることができる。その後、オーバーハングの特定の種を有する標的核酸についての濃縮を、生体分子を分離するための任意の好適な方法（例えば、プルダウンアッセイ、固体支持体の使用など）に従って果たすことができる。
長さに基づく分離
一部の実施形態では、本明細書における方法は、断片長に従って標的核酸を分離するステップを含む。例えば、標的核酸を、１つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、特定の核酸断片長（単数）、長さの範囲、または長さ（複数）について濃縮することができる。核酸断片長は、通常は、断片中のヌクレオチドの数を指す。核酸断片長はまた、核酸断片サイズと呼ばれることもある。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを測定せずに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを決定する方法と併せて行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、分画されたプールのすべてまたは一部を単離（例えば、保持）および／または解析することができる、サイズ分画手順を指す。サイズ分画手順は、当技術分野において公知である（例えば、アレイでの分離、モレキュラーシーブによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除カラム）による分離、およびマイクロフルイディクスに基づくアプローチ）。一部の実施形態では、長さに基づく分離アプローチは、例えば、断片環状化、化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、質量分析および／またはサイズ特異的核酸増幅を含み得る。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）ビーズを使用して行われる。
一部の実施形態では、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、ある特定の長さ（単数）、長さ範囲、または長さ（複数）の核酸断片が、試料から分離される。一部の実施形態では、特定の閾値またはカットオフ（例えば、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ）未満の長さを有する断片は、「短い」断片と呼ばれ、特定の閾値またはカットオフ（例えば、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ）を超える長さを有する断片は、「長い」断片、大きい断片、および／または高分子量（ＨＭＷ）断片と呼ばれる。一部の実施形態では、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、ある特定の長さ（単数）、長さ範囲、または長さ（複数）の断片は、解析のために保持され、その一方で、閾値またはカットオフを超えるまたはそれ未満の、異なる長さ（単数）、または長さ範囲、または長さ（複数）の断片は、解析のために保持されない。一部の実施形態では、約５００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約４００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約３００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約２００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約１５０ｂｐ未満である断片は、保持される。例えば、約１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐ、１６０ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐまたは１００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約１００ｂｐ～約２００ｂｐである断片は、保持される。例えば、約１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐ、１６０ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、または１１０ｂｐである断片は、保持される。一部の実施形態では、約１００ｂｐ～約２００ｂｐの範囲内である断片は、保持される。例えば、約１１０ｂｐ～約１９０ｂｐ、１３０ｂｐ～約１８０ｂｐ、１４０ｂｐ～約１７０ｂｐ、１４０ｂｐ～約１５０ｂｐ、１５０ｂｐ～約１６０ｂｐ、または１４５ｂｐ～約１５５ｂｐの範囲内である断片は、保持される。
一部の実施形態では、約１０００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約４００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約３００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約２００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約１００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。
一部の実施形態では、約１００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約２００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約３００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約４００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。一部の実施形態では、約１０００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。
一部の実施形態では、任意の断片長または断片長の任意の組合せを有する標的核酸は、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。例えば、５００ｂｐ未満の断片長および５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸を、本明細書に記載される、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプールと結合させることができる。
本明細書に記載される方法とともに使用することができる、長さに基づくある特定の分離方法は、例えば、選択的配列タグ付けアプローチを利用する。そのような方法では、長い核酸と短い核酸とを含む試料中の核酸の断片サイズ種（例えば、短い断片）に、選択的にタグ付けすることができる。そのような方法は、内部プライマーと外部プライマーとを含む１セットのネステッドプライマーを使用して核酸増幅反応を行うステップを通常は含む。一部の実施形態では、内部のものの一方または両方にタグ付けして、それによって標的増幅産物上にタグを導入することができる。外部プライマーは、（内部）標的配列を有する短い断片に一般にアニールしない。内部プライマーは、短い断片にアニールし、タグと標的配列とを有する増幅産物を生成することができる。通常は、長い断片のタグ付けは、例えば、外部プライマーの事前のアニーリングおよび伸長による内部プライマーの伸長遮断を含む、機構の組合せによって阻害される。タグ付き断片の濃縮は、例えば、一本鎖核酸のエキソヌクレアーゼ消化、および少なくとも１つのタグに特異的な増幅プライマーを使用するタグ付き断片の増幅を含む、様々な方法のいずれかにより果たすことができる。
本明細書に記載される方法とともに使用することができる、長さに基づく別の分離方法は、核酸試料をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿に付すステップを含む。方法の例としては、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４０４１７およびＷＯ２０１０／１１５０１６に記載されているものが挙げられる。この方法は、小さい（例えば、３００ヌクレオチド未満の）核酸を実質的に沈殿させずに大きい核酸を実質的に沈殿させるのに十分な条件下、１つまたは複数の一価の塩の存在下で、核酸試料とＰＥＧを接触させるステップを一般に必要とする。
本明細書に記載される方法とともに使用することができる、長さに基づく別の濃縮方法は、例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅを使用する、ライゲーションによる環状化を含む。通常は、短い核酸断片を長い断片より高い効率で環状化することができる。環状化されていない配列を環状化された配列から分離することができ、濃縮された短い断片をさらなる解析に使用することができる。
核酸ライブラリー
本明細書における方法は、核酸ライブラリーを調製するステップ、および／または核酸ライブラリーために核酸を修飾するステップを含み得る。一部の実施形態では、核酸断片の末端は、断片またはそれらの増幅産物を核酸ライブラリーに組み込むことができるように修飾される。一般に、核酸ライブラリーは、その非限定的な例が、固相（例えば、固体支持体、フローセル、ビーズ）上への固定化、濃縮、増幅、クローニング、検出を含む、特異的プロセスのために、および／または核酸シーケンシングのために、調製される、組み立てられる、および／または修飾される、複数のポリヌクレオチド分子（例えば、核酸の試料）を指す。ある特定の実施形態では、核酸ライブラリーは、シーケンシングプロセスの前にまたはシーケンシングプロセス中に調製される。核酸ライブラリー（例えば、シーケンシングライブラリー）は、当技術分野において公知であるような好適な方法により調製することができる。核酸ライブラリーは、標的化または非標的化調製プロセスにより調製することができる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、固体支持体への核酸の固定化のために構成される化学的部分（例えば、官能基）を含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、固体支持体へのライブラリーの固定化のために構成される、生体分子（例えば、官能基）および／または結合対のメンバーを含むように修飾され、生体分子および結合対の非限定的な例としては、チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結合タンパク質、受容体、炭水化物、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、相補的核酸配列など、およびこれらの組合せが挙げられる。特異的結合対の一部の例としては、限定ではないが、アビジン部分とビオチン部分；抗原エピトープと抗体またはその免疫反応性断片；抗体とハプテン；ジゴキシゲニン部分と抗ジゴキシゲニン抗体；フルオレセイン部分と抗フルオレセイン抗体；オペレーターとリプレッサー；ヌクレアーゼとヌクレオチド；レクチンと多糖；ステロイドとステロイド結合タンパク質；活性化合物と活性化合物受容体；ホルモンとホルモン受容体；酵素と基質；免疫グロブリンとプロテインＡ；オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとその対応する補体；など、またはこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、既知組成の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように修飾され、ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、識別子（例えば、タグ、インデックス付加用タグ）、キャプチャー配列、標識、アダプター、制限酵素部位、プロモーター、エンハンサー、複製起点、ステムループ、相補配列（例えば、プライマー結合部位、アニーリング部位）、好適な組み込み部位（例えば、トランスポゾン、ウイルス組み込み部位）、修飾ヌクレオチド、本明細書に記載されるオーバーハング識別配列（すなわち、固有末端識別子（ＵＥＩ））、本明細書に記載される固有分子識別子（ＵＭＩ）、本明細書に記載されるパリンドローム配列など、またはこれらの組合せが挙げられる。既知配列のポリヌクレオチドを、好適な位置に、例えば、５’末端、３’末端にまたは核酸配列内に、付加させることができる。既知配列のポリヌクレオチドは、同じ配列であることもあり、または異なる配列であることもある。一部の実施形態では、既知配列のポリヌクレオチドは、表面（例えば、フローセルの表面）に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成される。例えば、５’既知配列を含む核酸分子は、第１の複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、その一方で、３’既知配列は、第２の複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、染色体特異的タグ、キャプチャー配列、標識および／またはアダプター（例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドアダプター）を含み得る。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、１つまたは複数の検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能な標識を、核酸ライブラリーの５’末端に、３’末端に、および／またはライブラリー内の核酸内の任意のヌクレオチド位置に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、標識されたプローブである。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを固相への固定化の前に含む。
一部の実施形態では、既知配列のポリヌクレオチドは、ユニバーサル配列を含む。ユニバーサル配列は、２つもしくはそれより多くの核酸分子にまたは核酸分子の２つもしくはそれより多くのサブセットに組み込まれる特異的ヌクレオチド配列であり、ユニバーサル配列は、それが組み込まれるすべての分子または分子のサブセットについて同じである。ユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列とハイブリダイズするように、および／または複数の異なる配列を増幅するように、設計されることが多い。一部の実施形態では、２つ（例えば、一対）またはそれより多くのユニバーサル配列および／またはユニバーサルプライマーが使用される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列を含むことが多い。一部の実施形態では、アダプター（例えば、ユニバーサルアダプター）は、ユニバーサル配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル配列が、核酸の複数の種またはサブセットを捕捉、識別および／または検出するために使用される。
核酸ライブラリーの調製についてのある特定の実施形態では、（例えば、ある特定の一塩基合成法手順では）、核酸は、数百塩基対またはそれ未満の長さに（例えば、ライブラリー生成のための調製において）サイズ選択および／または断片化される。一部の実施形態では、ライブラリー調製は、断片化なしで行われる（例えば、無細胞ＤＮＡを使用する場合）。
ある特定の実施形態では、ライゲーションに基づくライブラリー調製方法が使用される（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＴＲＵＳＥＱ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ライゲーションに基づくライブラリー調製方法は、インデックス配列（例えば、核酸配列についての試料起源を識別するための試料インデックス配列）を最初のライゲーションステップで組み込むことができ、多くの場合、シングルリードシーケンシング、ペアエンドシーケンシングおよび多重化シーケンシングのための試料の調製に使用され得る、アダプター（例えば、メチル化アダプター）設計を使用することが多い。例えば、核酸（例えば、断片化された核酸または無細胞ＤＮＡ）を、フィルイン反応、エキソヌクレアーゼ反応またはこれらの組合せにより、末端修復することができる。一部の実施形態では、次いで、結果として生じた平滑末端修復核酸を、アダプター／プライマーの３’末端の単一のヌクレオチドオーバーハングと相補的である単一のヌクレオチドにより伸長することができる。任意のヌクレオチドを伸長／オーバーハングヌクレオチドに使用することができる。一部の実施形態では、末端修復が省略され、アダプターオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド）は、核酸（例えば、断片化された核酸または無細胞ＤＮＡ）のネイティブ末端に直接ライゲーションされる。
一部の実施形態では、核酸ライブラリー調製は、本明細書に記載されるアダプターオリゴヌクレオチドなどの、アダプターオリゴヌクレオチドを（例えば、試料核酸に、試料核酸断片に、鋳型核酸に、標的核酸に）ライゲーションすることを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、フローセルアンカーに相補的であることが多く、例えばフローセルの内部表面などの、固体支持体に核酸ライブラリーを固定化するために利用されることもある。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、識別子、１つもしくは複数シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション部位（例えば、ユニバーサルシーケンシングプライマー、シングルエンドシーケンシングプライマー、ペアエンドシーケンシングプライマー、多重化シーケンシングプライマーなどに相補的な配列）、またはこれらの組合せ（例えば、アダプター／シーケンシング、アダプター／識別子、アダプター／識別子／シーケンシング）を含む。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、本明細書ではプライミング配列またはプライマー結合ドメインとも呼ばれる、プライマーアニーリングポリヌクレオチド（例えば、フローセル結合オリゴヌクレオチドへの、および／または遊離増幅プライマーへのアニーリングのためのもの）、インデックスポリヌクレオチド（例えば、異なる試料からの核酸を追跡するための試料インデックス配列；試料ＩＤとも呼ばれる）、オーバーハング識別配列（本明細書では固有末端識別子（ＵＥＩ）とも呼ばれる）およびバーコードポリヌクレオチド（例えば、シーケンシングの前に増幅される試料核酸の個々の分子を追跡するための単一分子バーコード（ＳＭＢ）；分子バーコードまたは固有分子識別子（ＵＭＩ）とも呼ばれる）のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング成分（またはプライミング配列またはプライマー結合ドメイン）は、１つまたは複数のユニバーサル配列（例えば、１つまたは複数のユニバーサル増幅プライマーに相補的な配列）を含む。一部の実施形態では、インデックスポリヌクレオチド（例えば、試料インデックス；試料ＩＤ）は、アダプターオリゴヌクレオチドの成分である。一部の実施形態では、インデックスポリヌクレオチド（例えば、試料インデックス；試料ＩＤ）は、ユニバーサル増幅プライマー配列の成分である。
一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅プライマー（例えば、ユニバーサル増幅プライマー）とともに使用されるとき、ユニバーサル配列、分子バーコード、試料ＩＤ配列、スペーサー配列、および試料核酸配列のうちの１つまたは複数を含むライブラリー構築物を生成するように設計される。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル増幅プライマーとともに使用されるとき、ユニバーサル配列、分子バーコード、試料ＩＤ配列、スペーサー配列、および試料核酸配列のうちの１つまたは複数の順序付けられた組合せを含むライブラリー構築物を生成するように設計される。例えば、ライブラリー構築物は、第１のユニバーサル配列、続いて第２のユニバーサル配列、続いて第１の分子バーコード、続いてスペーサー配列、続いて鋳型配列（例えば、試料核酸配列）、続いてスペーサー配列、続いて第２の分子バーコード、続いて第３のユニバーサル配列、続いて試料ＩＤ、続いて第４のユニバーサル配列を含み得る。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅プライマー（例えば、ユニバーサル増幅プライマー）とともに使用されるとき、鋳型分子（例えば、試料核酸分子）の鎖ごとにライブラリー構築物を生成するように設計される。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、二重鎖アダプターオリゴヌクレオチドである。
識別子は、識別子を含む核酸の検出および／または識別を可能にする、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に組み込まれたまたは結合された好適な検出可能な標識であり得る。一部の実施形態では、識別子は、シーケンシング方法の間に（例えば、ポリメラーゼにより）核酸に組み込まれるかまたは結合される。識別子の非限定的な例としては、核酸タグ、核酸インデックスもしくはバーコード、放射標識（例えば、同位体）、金属標識、蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、フルオロフォアクエンチャー、色素、タンパク質（例えば、酵素、抗体もしくはその一部、リンカー、結合対のメンバー）など、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、識別子（例えば、核酸インデックスまたはバーコード）は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の固有の、既知のおよび／または識別可能な配列である。一部の実施形態では、識別子は、連続する６またはそれを超えるヌクレオチドである。様々な異なる励起および発光スペクトルを有する多数のフルオロフォアが、利用可能である。任意の好適なタイプおよび／または数のフルオロフォアを、識別子として使用することができる。一部の実施形態では、１つもしくは複数、２つもしくはそれより多くの、３つもしくはそれより多くの、４つもしくはそれより多くの、５つもしくはそれより多くの、６つもしくはそれより多くの、７つもしくはそれより多くの、８つもしくはそれより多くの、９つもしくはそれより多くの、１０もしくはそれより多くの、２０もしくはそれより多くの、３０もしくはそれより多くの、または５０もしくはそれより多くの異なる識別子が、本明細書に記載される方法（例えば、核酸検出および／またはシーケンシング方法）において利用される。一部の実施形態では、１つまたは２つのタイプの識別子（例えば、蛍光標識）が、ライブラリー内の各核酸に連結される。識別子の検出および／または定量化は、好適な方法、装置または機械により行うことができ、そのような方法、装置または機械の非限定的な例としては、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、ルミノメーター、蛍光光度計、分光光度計、好適な遺伝子チップまたはマイクロアレイ解析、ウエスタンブロット、質量分析、クロマトグラフィー、細胞蛍光分析、蛍光顕微鏡法、好適な蛍光またはデジタルイメージング法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、レーザー走査型サイトメトリー、親和性クロマトグラフィー、マニュアルバッチモード分離、電界懸架、好適な核酸シーケンシング方法および／または核酸シーケンシング装置など、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸ライブラリーまたはその一部は、増幅条件下で増幅される（例えば、ＰＣＲに基づく方法により増幅される）。一部の実施形態では、シーケンシング方法は、核酸ライブラリーの増幅を含む。核酸ライブラリーを、固体支持体（例えば、フローセル内の固体支持体）への固定化の前または後に増幅することができる。核酸増幅は、（例えば、核酸ライブラリー内に）存在する核酸鋳型のおよび／またはその補体の数を、鋳型および／またはその補体の１つまたは複数のコピーを生成することにより、増幅するまたは増加させるプロセスを含む。増幅は、好適な方法により行うことができる。核酸ライブラリーを、サーモサイクリング法によりまたは等温増幅法により増幅することができる。一部の実施形態では、ローリングサークル増幅法が使用される。一部の実施形態では、増幅は、核酸ライブラリーまたはその一部分が固定化されている固体支持体（例えば、フローセル内のもの）上で行われる。ある特定のシーケンシング方法では、核酸ライブラリーは、フローセルに添加され、好適な条件下でのアンカーへのハイブリダイゼーションにより固定化される。このタイプの核酸増幅は、固相増幅と呼ばれることが多い。固相増幅の一部の実施形態では、増幅産物のすべてまたは一部分は、固定化されたプライマーから開始する伸長により合成される。固相増幅反応は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の少なくとも１つが固体支持体に固定化されることを除き、標準的な液相増幅に類似している。一部の実施形態では、修飾核酸（例えば、アダプターの付加により修飾された核酸）が増幅される。
一部の実施形態では、固相増幅は、表面に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの１つの種のみを含む核酸増幅反応を含む。ある特定の実施形態では、固相増幅は、複数の異なる固定化されたオリゴヌクレオチドプライマー種を含む。一部の実施形態では、固相増幅は、固体表面に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの１つの種と溶液中の第２の異なるオリゴヌクレオチドプライマー種とを含む核酸増幅反応を含み得る。固定化されたプライマーまたは溶液系プライマーの複数の異なる種を使用することができる。固相核酸増幅反応の非限定的な例としては、界面増幅、架橋増幅、エマルジョンＰＣＲ、ＷｉｌｄＦｉｒｅ増幅（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１２３９９号）などまたはこれらの組合せが挙げられる。
核酸シーケンシング
一部の実施形態では、核酸（例えば、核酸断片、試料核酸、無細胞核酸）がシーケンシングされる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした核酸標的（「ハイブリダイゼーション産物」）がシーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物が増幅プロセスにより増幅され、それらの増幅産物がシーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、配列リード（またはシーケンシングリード）を生成する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいて標的核酸のオーバーハングの配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいてオーバーハング識別配列または固有末端識別子（ＵＥＩ）の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいてオーバーハング識別配列または固有末端識別子（ＵＥＩ）と標的核酸のオーバーハングとを含むエレメントの配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいてオーバーハング識別配列または固有末端識別子（ＵＥＩ）と標的核酸のオーバーハングとからなるエレメントの配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに従って標的核酸のオーバーハングの長さを決定するステップを含む。
ある特定のシーケンシングプラットフォーム（例えば、ペアエンドシーケンシング）の場合、配列リードを生成するステップは、フォワード配列リードを生成すること、およびリバース配列リードを生成することを含み得る。例えば、ある特定のペアエンドシーケンシングプラットフォームを使用するシーケンシングは、各核酸断片を両方の方向からシーケンシングし、一般に、その結果、フォワード方向の第１のリード（フォワードリード）および逆相補的方向の第２のリード（リバースリード）を含む２つのリードが、核酸断片ごとに得られる。ある特定のプラットフォームの場合、フォワードリードは、シーケンシングアダプター内の特定のプライマー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター、Ｐ５プライマー）から生成され、リバースリードは、シーケンシングアダプター内の異なるプライマー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター、Ｐ７プライマー）から生成される。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードのサブセットを解析（例えば、定量化、処理）するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードのサブセットを解析（例えば、定量化、処理）するステップと、配列リードの別のサブセットを解析から削除するステップとを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードのサブセットについてオーバーハング情報を解析または処理するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、リバース配列リードを解析（例えば、定量化、処理）するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、リバース配列リードについてオーバーハング情報を解析または処理するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、リバース配列リードについてオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析または処理するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｐ７配列リードを解析（例えば、定量化、処理）するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｐ７配列リードから生成されたオーバーハング情報を解析（例えば、定量化、処理）するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｐ７配列リードから生成されたオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析（例えば、定量化、処理）するステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、フォワード配列リードを解析から削除するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フォワード配列リードから生成されたオーバーハング情報を解析から削除するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フォワード配列リードから生成されたオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｐ５配列リードを解析から削除するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｐ５配列リードから生成されたオーバーハング情報を解析から削除するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｐ５配列リードから生成されたオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップを含む。
一部の実施形態では、フォワードリード全体が、全て排除されるわけではない。例えば、フォワードリードのオーバーハング識別配列は無視され、その結果として、フォワードリードオーバーハング識別配列から推測されるオーバーハングは、オーバーハング解析から排除され、リバースリードからのオーバーハングのみが解析される。そのような事例では、フォワードリードの他の態様を解析に含めて、例えば、断片長を推測すること、ＧＣ含有量を決定すること、一塩基バリアントを識別すること、または平滑末端を識別することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、リバース配列リードについてオーバーハングなし（すなわち、平滑末端）を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析または処理するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フォワード配列リードについてオーバーハングなし（すなわち、平滑末端）を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析または処理するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フォワードおよびリバース配列リードについてオーバーハングなし（すなわち、平滑末端）を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析または処理するステップを含む。したがって、一部の実施形態では、オーバーハング識別配列がオーバーハングなし（すなわち、平滑末端）を示す場合、平滑末端についての情報は、解析から削除されない。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、フォワードおよびリバース配列リードについてオーバーハングなし（すなわち、平滑末端）を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析または処理するステップと、リバース配列リードについてオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析または処理するステップと、フォワード配列リードについてオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップとを含む。したがって、核酸末端（例えば、ネイティブ核酸末端）の解析は、フォワード配列リードとリバース配列リードの両方から生成された核酸末端平滑末端情報、およびリバースリードのみから生成された核酸オーバーハング情報の解析を含み得る。
核酸は、サンガーシーケンシングプラットフォーム、ハイスループットもしくは大規模並列シーケンシング（次世代シーケンシング（ＮＧＳ））プラットフォームなど、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）および／もしくはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シーケンシングシステム）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＭｉｎＩＯＮシーケンシングシステム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／もしくはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンシングシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシーケンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅにより提供されるシーケンシングプラットフォーム（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／もしくはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシーケンシングシステム）、または任意の他の好適なシーケンシングプラットフォームなどを含む、任意の好適なシーケンシングプラットフォームを使用してシーケンシングすることができる。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、高多重化シーケンシングプロセスである。ある特定の事例では、完全または実質的に完全な配列が得られ、部分的配列が得られることもある。核酸シーケンシングは、一般に、配列リードの一群を生成する。本明細書で使用される場合、「リード」（複数）（例えば、「リード」（単数）、「配列リード」（単数））は、本明細書に記載されるまたは当技術分野において公知の任意のシーケンシングプロセスにより生成されたオリゴヌクレオチドの短い配列である。リードは、核酸断片の一方の末端から生成され得（シングルエンドリード）、核酸断片の両方の末端から生成されることもある（例えば、ペアエンドリード、ダブルエンドリード）。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、短いシーケンシングリードまたは「短いリード」を生成する。一部の実施形態では、短いリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１０ヌクレオチドから、連続する約２５０またはそれを超えるヌクレオチドまでであることもある。一部の実施形態では、短いリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約５０ヌクレオチドから、連続する約１５０またはそれを超えるヌクレオチドまでである。
配列リードの長さは、利用される特定のシーケンシング技術に関連することが多い。例えば、ハイスループット法は、サイズに数十から数百塩基対（ｂｐ）までの幅があり得る、配列リードを生じさせる。例えば、ナノポアシーケンシングは、サイズに数十から数百そして数千塩基対までの幅があり得る、配列リードを生じさせ得る。一部の実施形態では、配列リードは、約１５ｂｐ～約９００ｂｐ長の長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。ある特定の実施形態では、配列リードは、約１０００ｂｐのまたはそれを超える、長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。一部の実施形態では、配列リードは、約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００もしくは５０００ｂｐのまたはそれを超える、長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。一部の実施形態では、配列リードは、約１００ｂｐ～約２００ｂｐの長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。
一部の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１０ヌクレオチドから連続する約２５０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約２００またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約１５０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約１２５またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約１００またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約７５またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約６０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する１５ヌクレオチドから連続する約５０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約４０またはそれを超えるヌクレオチドまでであることもあり、連続する約１５ヌクレオチド、または連続する約３６もしくはそれを超えるヌクレオチドであることもある。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約２０～約３０塩基、または約２４～約２８塩基である。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または約２９塩基もしくはそれを超える。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約２０～約２００塩基、約１００～約２００塩基、または約１４０～約１６０塩基である。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または約２００塩基もしくはそれを超える。ある特定の実施形態では、ペアエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１０ヌクレオチドから連続する約２５ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数まで（例えば、長さ約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチド数）、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約２０ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数までであることもあり、連続する約１７ヌクレオチドまたは連続する約１８ヌクレオチドであることもある。ある特定の実施形態では、ペアエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約２５ヌクレオチドから連続する約４００ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数まで（例えば、長さ約２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０もしくは４００ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチド数）、連続する約５０ヌクレオチドから連続する約３５０ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数まで、連続する約１００ヌクレオチドから連続する約３２５ヌクレオチドまで、連続する約１５０ヌクレオチドから連続する約３２５ヌクレオチドまで、連続する約２００ヌクレオチドから連続する約３２５ヌクレオチドまで、連続する約２７５ヌクレオチドから連続する約３１０ヌクレオチドまで、連続する約１００ヌクレオチドから連続する約２００ヌクレオチドまで、連続する約１００ヌクレオチドから連続する約１７５ヌクレオチドまで、連続する約１２５ヌクレオチドから連続する約１７５ヌクレオチドまでであることもあり、連続する約１４０ヌクレオチドから連続する約１６０ヌクレオチドまでであることもある。ある特定の実施形態では、ペアエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１５０ヌクレオチドであり、連続する１５０ヌクレオチドであることもある。
リードは、一般に、物理的核酸中のヌクレオチド配列の表現である。例えば、配列のＡＴＧＣ描写を含有するリードの場合、物理的核酸中の、「Ａ」は、アデニンヌクレオチドを表し、「Ｔ」は、チミンヌクレオチドを表し、「Ｇ」は、グアニンヌクレオチドを表し、「Ｃ」は、シトシンヌクレオチドを表す。対象からの試料から得られる配列リードは、少数派核酸と多数派核酸の混合物からのリードであることがある。例えば、がん患者の血液から得られる配列リードは、がん核酸と非がん核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、妊娠している雌の血液から得られる配列リードは、胎児核酸と母体核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、感染症または感染性疾患に罹患している患者の血液から得られる配列リードは、宿主核酸と病原体核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、移植レシピエントの血液から得られる配列リードは、宿主核酸と移植片核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、試料から得られる配列リードは、対象のマイクロバイオーム（例えば、腸のマイクロバイオーム、血液のマイクロバイオーム、口腔のマイクロバイオーム、脊髄液のマイクロバイオーム、糞便のマイクロバイオーム）を集団で構成する微生物からの核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、試料から得られる配列リードは、マイクロバイオーム（例えば、腸のマイクロバイオーム、血液のマイクロバイオーム、口腔のマイクロバイオーム、脊髄液のマイクロバイオーム、糞便のマイクロバイオーム）を集団で構成する微生物からの核酸と宿主対象からの核酸との混合物からのリードであることがある。比較的短いリードの混合物を、本明細書に記載されるプロセスにより、対象内に存在するゲノム核酸の表現に、および／または腫瘍、胎児、病原体、移植片もしくはマイクロバイオームに存在するゲノム核酸の表現に、変換することができる。
ある特定の実施形態では、対象から試料の核酸配列リードを「得ること」、および／または１名もしくは複数名の参照人物から生物検体の核酸配列リードを「得ること」は、配列情報を得るために核酸を直接シーケンシングすることを含むことができる。一部の実施形態では、「得ること」は、別の者により核酸から直接得られた配列情報を受け取ることを含むことができる。
一部の実施形態では、試料中の一部またはすべての核酸は、シーケンシング前または中に（例えば、非特異的に、例えば、ＰＣＲに基づく方法により）濃縮および／または増幅される。ある特定の実施形態では、試料中の特異的核酸種またはサブセットは、シーケンシング前または中に濃縮および／または増幅される。一部の実施形態では、核酸のあらかじめ選択されたプールの種またはサブセットは、ランダムにシーケンシングされる。一部の実施形態では、試料中の核酸は、シーケンシング前または中に濃縮および／または増幅されない。
一部の実施形態では、ゲノムの代表的画分は、シーケンシングされ、「カバレッジ」または「カバレッジ倍数」と呼ばれることもある。例えば、１倍のカバレッジは、ゲノムのヌクレオチド配列のおよそ１００％がリードにより表されることを示す。一部の事例では、カバレッジ倍数は、「シーケンシング深度」と呼ばれる（およびそれに正比例する）。一部の実施形態では、「カバレッジ倍数」は、参照として以前のシーケンシング実験を参照する相対的用語である。例えば、第２のシーケンシング実験は、第１のシーケンシング実験の２分の１のカバレッジを有することがある。一部の実施形態では、ゲノムは、ゲノムの所与の領域が、２つもしくはそれより多くのリードまたはオーバーラップしているリードによりカバーされ得る（例えば、１を超える「カバレッジ倍数」、例えば、２倍のカバレッジ）冗長性で、シーケンシングされる。一部の実施形態では、ゲノム（例えば、全ゲノム）は、約０．０１倍～約１００倍のカバレッジ、約０．１倍～約２０倍のカバレッジ、または約０．１倍～約１倍のカバレッジ（例えば、約０．０１５倍、０．０２倍、０．０３倍、０．０４倍、０．０５倍、０．０６倍、０．０７倍、０．０８倍、０．０９倍、０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれを超えるカバレッジ）で、シーケンシングされる。一部の実施形態では、ゲノムの特異的部分（例えば、標的化された方法からのゲノム部分）がシーケンシングされ、カバレッジ倍数値は、シーケンシングされる特異的ゲノム部分の画分を一般に指す（すなわち、カバレッジ倍数値は、全ゲノムを指さない）。一部の事例では、特異的ゲノム部分は、１０００倍のカバレッジまたはそれを超えるカバレッジでシーケンシングされる。例えば、特異的ゲノム部分を、２０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、３０，０００倍、４０，０００倍または５０，０００倍のカバレッジでシーケンシングすることができる。一部の実施形態では、シーケンシングは、約１，０００倍～約１００，０００倍のカバレッジでのものである。一部の実施形態では、シーケンシングは、約１０，０００倍～約７０，０００倍のカバレッジでのものである。一部の実施形態では、シーケンシングは、約２０，０００倍～約６０，０００倍のカバレッジでのものである。一部の実施形態では、シーケンシングは、約３０，０００倍～約５０，０００倍のカバレッジでのものである。
一部の実施形態では、１個体からの１つの核酸試料がシーケンシングされる。ある特定の実施形態では、２つまたはそれより多くの試料であって、１個体からのものであるかまたは異なる個体からのものである試料の各々からの核酸が、シーケンシングされる。ある特定の実施形態では、各生体試料が１個体または２もしくはそれより多くの個体からのものである、２つまたはそれより多くの生体試料からの核酸試料が、プールされ、そのプールがシーケンシングされる。後者の実施形態では、各生体試料からの核酸試料は、１つまたは複数の固有識別子により識別されることが多い。
一部の実施形態では、シーケンシング方法は、シーケンシングプロセスにおいて配列反応の多重化を可能にする識別を利用する。固有識別子の数が多いほど、例えば、シーケンシングプロセスで多重化することができる、検出用の試料および／または染色体の数が多い。シーケンシングプロセスは、任意の好適な数（例えば、４、８、１２、２４、４８、９６またはそれより多く）の固有識別子を使用して、行うことができる。
シーケンシングプロセスは、固相を使用することもあり、固相は、ライブラリーからの核酸を結合させることができるフローセスであって、試薬を流動させ、結合した核酸と接触させることができるフローセルを、含むこともある。フローセルは、フローセルレーンを含むこともあり、識別子の使用は、各レーンでのいくつかの試料の解析を容易にすることができる。フローセルは、結合された分析物を保持し、および／またはその上を試薬溶液が順序だって通過することを可能にするように、構成することができる固体支持体であることが多い。フローセルは、多くの場合、平面形状であり、光学的に透明であり、一般に、ミリメートルまたはミリメートル未満の規模であり、分析物／試薬相互作用が起こるチャネルまたはレーンを有することが多い。一部の実施形態では、所与のフローセルレーンで解析される試料の数は、ライブラリー調製および／またはプローブ設計中に利用される固有識別子の数に依存する。例えば、１２の識別子を使用する多重化により、８レーンフローセルで（例えば、９６ウェルマイクロウェルプレートにおけるウェルの数に等しい）９６の試料の同時解析が可能になる。同様に、例えば４８の識別子を使用する多重化により、８レーンフローセルで（例えば、３８４ウェルマイクロウェルプレートにおけるウェルの数に等しい）３８４の試料の同時解析が可能になる。市販のマルチプレックスシーケンシングキットの非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｔおよびｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｉｔ（例えば、それぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａのカタログ番号ＰＥ－４００－１００１およびＰＥ－４００－１００２）が挙げられる。
任意の好適な核酸シーケンシング方法を使用することができ、そのような方法の非限定的な例としては、マクサム・ギルバート法（Maxim & Gilbert）、連鎖停止法、一塩基
合成法、ライゲーションによるシーケンシング、質量分析によるシーケンシング、顕微鏡法に基づく手法など、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、例えば、マイクロ流体サンガーシーケンシングを含む、自動化サンガーシーケンシング法を含むサンガーシーケンシング法などの、第１世代技術を、本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の実施形態では、核酸イメージング技術（例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ））の使用を含むシーケンシング技術を使用することができる。一部の実施形態では、ハイスループットシーケンシング法が使用される。ハイスループットシーケンシング法は、大規模並列方式で、ときにはフローセル内で、シーケンシングされる、クローン増幅されたＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を一般に含む。大規模並列方式でＤＮＡをシーケンシングすることができる次世代（例えば、第２および第３世代）シーケンシング手法を本明細書に記載される方法に使用することができ、そのような手法は、本明細書では「大規模並列シーケンシング」（ＭＰＳ）と総称される。一部の実施形態では、ＭＰＳシーケンシング法は、目的の特異的染色体、遺伝子または領域がシーケンシングされる、標的化アプローチを利用する。ある特定の実施形態では、試料中の大半のまたはすべての核酸がランダムにシーケンシング、増幅および／または捕捉される、非標的化アプローチが、使用される。
一部の実施形態では、標的化された濃縮、増幅および／またはシーケンシングアプローチが使用される。標的化アプローチは、配列特異的オリゴヌクレオチドの使用によるさらなる処理のために試料中の核酸のサブセットを単離、選択および／または濃縮することが多い。一部の実施形態では、配列特異的オリゴヌクレオチドのライブラリーは、試料中の核酸の１つまたは複数のセットを標的とする（例えば、そのようなセットとハイブリダイズする）ために利用される。配列特異的オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーは、目的の１つまたは複数の染色体、遺伝子、エクソン、イントロンおよび／または調節領域に存在する特定の配列（例えば、固有核酸配列）に対して選択的であることが多い。任意の好適な方法または方法の組合せを、標的核酸の１つまたは複数のサブセットの濃縮、増幅および／またはシーケンシングに使用することができる。一部の実施形態では、標的配列は、１つまたは複数の配列特異的アンカーを使用する固相（例えば、フローセル、ビーズ）への捕捉により単離および／または濃縮される。一部の実施形態では、標的配列は、配列特異的プライマーおよび／またはプライマーセットを使用するポリメラーゼに基づく方法（例えば、任意の好適なポリメラーゼに基づく伸長による、ＰＣＲに基づく方法）により濃縮および／または増幅される。配列特異的アンカーを、多くの場合、配列特異的プライマーとして使用することができる。
ＭＰＳシーケンシングは、一塩基合成法およびある特定のイメージングプロセスを使用することもある。本明細書に記載される方法において使用することができる核酸シーケンシング技術は、一塩基合成法および可逆的ターミネーターに基づくシーケンシング（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））である。この技術を用いて、何百万もの核酸（例えば、ＤＮＡ）断片を並行してシーケンシングすることができる。このタイプのシーケンシング技術の一例では、光学的に透明なスライドであって、その表面の８つの個別のレーンにオリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）が結合されている、スライドを含有する、フローセルが使用される。
一塩基合成法は、一般に、鋳型により方向付けられる様式でプライマーまたは既存の核酸鎖にヌクレオチドを（共有結合性付加により）反復的に付加させることにより行われる。ヌクレオチドの反復的付加各々が検出され、核酸鎖の配列が得られるまでこのプロセスが何度も繰り返される。得られる配列の長さは、一部には、行われる付加および検出ステップの数に依存する。一塩基合成法の一部の実施形態では、ヌクレオチド付加の１ラウンドで、同じタイプの１つ、２つ、３つまたはそれより多くのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）が、付加され、検出される。ヌクレオチドを任意の好適な方法により（例えば、酵素的にまたは化学的に）付加させることができる。例えば、一部の実施形態では、ポリメラーゼまたはリガーゼは、ヌクレオチドをプライマーに、または既存の核酸鎖に、鋳型により方向付けられる様式で付加させる。一塩基合成法の一部の実施形態では、異なるタイプのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または識別子が使用される。一部の実施形態では、可逆的ターミネーターおよび／または除去可能な（例えば、切断可能な）識別子が使用される。一部の実施形態では、蛍光標識されたヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体が使用される。ある特定の実施形態では、一塩基合成法は、切断（例えば、識別子の切断および除去）および／または洗浄ステップを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの付加は、本明細書に記載されるまたは当技術分野において公知の好適な方法により検出され、そのような方法の非限定的な例としては、任意の好適なイメージング装置、好適なカメラ、デジタルカメラ、ＣＣＤ（電荷結合素子）に基づくイメージング装置（例えば、ＣＣＤカメラ）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化物シリコン）に基づくイメージング装置（例えば、ＣＭＯＳカメラ）、光ダイオード（例えば、光電子増倍チューブ）、電子顕微鏡法、電界効果トランジスタ（例えば、ＤＮＡ電界効果トランジスタ）、ＩＳＦＥＴイオンセンサー（例えば、ＣＨＥＭＦＥＴセンサー）など、またはこれらの組合せが挙げられる。
本明細書に記載される方法を行うための任意の好適なＭＰＳ法、システムまたは技術プラットフォームを使用して、核酸配列リードを得ることができる。ＭＰＳプラットフォームの非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘ／ＨｉＳｅｑ（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ）、ＳＯＬｉＤ、Ｒｏｃｈｅ／４５４、ＰＡＣＢＩＯおよび／もしくはＳＭＲＴ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔおよびＩｏｎ半導体に基づくシーケンシング（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発されたようなもの）、ＷｉｌｄＦｉｒｅ、５５００、５５００ｘｌ Ｗおよび／もしくは５５００ｘｌ Ｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒに基づく技術（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発され、販売されているようなもの；米国特許出願公開第２０１３／００１２３９９号）；Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、パイロシーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）シーケンシング、ＬａｓｅｒＧｅｎシステムおよび方法、ナノポアに基づくプラットフォーム、化学物質感受性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイ、電子顕微鏡法に基づくシーケンシング（例えば、ＺＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒにより開発されたようなもの）、ナノボールシーケンシングなど、またはこれらの組合せが挙げられる。本明細書における方法を行うために使用することができる他のシーケンシング方法としては、デジタルＰＣＲ、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、染色体特異的シーケンシング（例えば、ＤＡＮＳＲ（選択された領域のデジタル解析））技術が挙げられる。
一部の実施形態では、核酸は、シーケンシングされ、シーケンシング産物（例えば、配列リードの一群）は、シーケンシングされた核酸の解析前にまたは解析と同時に処理される。例えば、配列リードは、アライメント、マッピング、フィルタリング、計数、正規化、重み付け、プロファイルの生成などのうちの１つまたは複数、およびこれらの組合せに従って、処理され得る。ある特定の処理ステップをいずれの順序で行ってもよく、ある特定の処理ステップを繰り返してもよい。
リードのマッピング
配列リードをマッピングすることができ、指定核酸領域（例えば、染色体またはその一部分）にマッピングするリードの数は、カウントと呼ばれる。ある特定の実施形態では、オーバーハング配列情報を含む配列リードをマッピングすることができ、オーバーハング配列情報を含むリードの数が、指定核酸領域にマッピングすることになる。任意の好適なマッピング方法（例えば、プロセス、アルゴリズム、プログラム、ソフトウェア、モジュールなど、またはこれらの組合せ）を使用することができる。マッピングプロセスのある特定の態様が、以下に説明される。
ヌクレオチド配列リード（すなわち、物理的なゲノム位置が不明である断片からの配列情報）のマッピングは、いくつかの方法で行うことができ、多くの場合、得られた配列リードと参照ゲノム内のマッチする配列とのアライメントを含む。そのようなアライメントでは、配列リードは、一般に、参照配列とアライメントされ、アライメントしているものは、「マッピングされている」と、「マッピングされた配列リード」と、または「マッピングされたリード」と言われる。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列リードは、「ヒット」または「カウント」と呼ばれる。一部の実施形態では、マッピングされた配列リードは、様々なパラメーターに従ってまとめられ、下でさらに詳細に論じられる特定のゲノム部分に割り当てられる。
用語「アライメントされた」、「アライメント」または「アライメントすること」は、マッチ（例えば、同一性１００％）または部分的マッチとして識別され得る、２つまたはそれより多くの核酸配列を一般に指す。アライメントを手作業で行うことができ、またはコンピュータ（例えば、ソフトウェア、プログラム、モジュールもしくはアルゴリズム）により行うことができ、この非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅの一部として配給されているＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａ（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムが挙げられる。配列リードのアライメントは、１００％配列マッチであり得る。一部の場合には、アライメントは、１００％未満の配列マッチ（すなわち、非完璧マッチ、部分的マッチ、部分的アライメント）である。一部の実施形態では、アライメントは、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％マッチである。一部の実施形態では、アライメントは、ミスマッチを含む。一部の実施形態では、アライメントは、１、２、３、４または５つのミスマッチを含む。２つまたはそれより多くの配列を、どちらかの鎖（例えば、センスまたはアンチセンス鎖）を使用してアライメントすることができる。ある特定の実施形態では、核酸配列は、別の核酸配列の逆相補鎖とアライメントされる。
様々な計算論的方法を使用して、各配列リードを一部分にマッピングすることができる。配列をアライメントするために使用することができるコンピュータアルゴリズムの非限定的な例としては、限定ではないが、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＩＴＺ、ＦＡＳＴＡ、ＢＯＷＴＩＥ １、ＢＯＷＴＩＥ ２、ＥＬＡＮＤ、ＭＡＱ、ＰＲＯＢＥＭＡＴＣＨ、ＳＯＡＰ、ＢＷＡもしくはＳＥＱＭＡＰ、またはその変形形態、またはそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、配列リードを参照ゲノム内の配列とアライメントすることができる。一部の実施形態では、配列リードを、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴ、ｄｂＳＴＳ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）を含む、当技術分野において公知の核酸データベースにおいて見つけることができ、および／またはそのようなデータベース内の配列とアライメントすることができる。ＢＬＡＳＴまたは類似のツールを使用して、識別された配列を配列データベースに対して検索することができる。次いで、検索ヒットを使用して、例えば、識別された配列を適切な部分にソートすることができる（以下に説明される）。
一部の実施形態では、リードは、参照ゲノム内の部分に一意的にマッピングすることもあり、または非一意的にマッピングすることもある。リードは、それが参照ゲノム内の単一の配列とアライメントした場合、「一意的にマッピングされた」と考えられる。リードは、それが参照ゲノム内の２つまたはそれより多くの配列とアライメントした場合、「非一意的にマッピングされた」と考えられる。一部の実施形態では、非一意的にマッピングされたリードは、さらなる解析（例えば、定量化）から除外される。ある特定の実施形態では、参照ゲノムとマッピングされた個々の試料からのリードとの間に存在し得る一塩基多型を考慮するために、ある特定の少しのミスマッチ（０～１）が許可され得る。一部の実施形態では、いかなる程度のミスマッチも、参照配列へのリードのマッピングに許可されない。
本明細書で使用される場合、用語「参照ゲノム」は、対象からの識別された配列を参照するために使用することができる任意の生物またはウイルスについての任意の特定の既知のシーケンシングまたは特徴付けされたゲノムを指し、これは、部分的なものか完全なものかを問わない。例えば、ヒト対象にはもちろん多くの他の生物にも使用される参照ゲノムは、ワールドワイドウェブＵＲＬ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで見つけることができる。「ゲノム」は、核酸配列で表される、生物またはウイルスの完全遺伝情報を指す。本明細書で使用される場合、参照配列または参照ゲノムは、多くの場合、１個体または複数の個体からの組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。一部の実施形態では、参照ゲノムは、１名または複数名のヒト個体からの組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。一部の実施形態では、参照ゲノムは、染色体に割り当てられた配列を含む。
ある特定の実施形態では、マッピング能力は、ゲノム領域（例えば、部分、ゲノム部分）について評定される。マッピング能力は、ヌクレオチド配列リードを参照ゲノムの一部分と明確にアライメントする能力であり、通常は、例えば０、１、２またはそれより多くのミスマッチを含む、指定数までのミスマッチである。所与のゲノム領域についての予想マッピング能力は、あらかじめ設定されたリード長についてスライディングウインドウアプローチを使用すること、および結果として得られるリードレベルのマッピング能力の値を平均することにより、推定することができる。固有ヌクレオチド配列の伸長部を含むゲノム領域が高いマッピング能力値を有することもある。
ペアエンドシーケンシングの場合、好適なマッピングおよび／またはアライメントプログラムの使用によりリードを参照ゲノムにマッピングすることができ、そのようなプログラムの非限定的な例としては、ＢＷＡ（Li H. and Durbin R. (2009)Bioinformatics 25, 1754-60）、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ［Novocraft (2010)］、Ｂｏｗｔｉｅ（Langmead B, et al., (2009) Genome Biol. 10:R25）、ＳＯＡＰ２（Li R, et al.,
(2009) Bioinformatics 25, 1966-67）、ＢＦＡＳＴ（Homer N, et al., (2009) PLoS ONE 4, e7767）、ＧＡＳＳＳＴ（Rizk, G. and Lavenier, D. (2010) Bioinformatics 26, 2534-2540）、およびＭＰｓｃａｎ（Rivals E., et al. (2009) Lecture Notes in Computer Science 5724, 246-260）などが挙げられる。ペ
アエンドリードは、好適なショートリードアライメントプログラムを使用してマッピングおよび／またはアライメントすることができる。ショートリードアライメントプログラムの非限定的な例としては、ＢａｒｒａＣＵＤＡ、ＢＦＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＴ、Ｂｏｗｔｉｅ、ＢＷＡ、ＣＡＳＨＸ、ＣＵＤＡ－ＥＣ、ＣＵＳＨＡＷ、ＣＵＳＨＡＷ２、ｄｒＦＡＳＴ、ＥＬＡＮＤ、ＥＲＮＥ、ＧＮＵＭＡＰ、ＧＥＭ、ＧｅｎｓｅａｒｃｈＮＧＳ、ＧＭＡＰ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、ｉＳＡＡＣ、ＬＡＳＴ、ＭＡＱ、ｍｒＦＡＳＴ、ｍｒｓＦＡＳＴ、ＭＯＳＡＩＫ、ＭＰｓｃａｎ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、ＮｏｖｏａｌｉｇｎＣＳ、Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ、ＮｅｘｔＧＥＮｅ、Ｏｍｉｘｏｎ、ＰＡＬＭａｐｐｅｒ、Ｐａｒｔｅｋ、ＰＡＳＳ、ＰｅｒＭ、ＱＰａｌｍａ、ＲａｚｅｒＳ、ＲＥＡＬ、ｃＲＥＡＬ、ＲＭＡＰ、ｒＮＡ、ＲＴＧ、Ｓｅｇｅｍｅｈｌ、ＳｅｑＭａｐ、Ｓｈｒｅｃ、ＳＨＲｉＭＰ、ＳＬＩＤＥＲ、ＳＯＡＰ、ＳＯＡＰ２、ＳＯＡＰ３、ＳＯＣＳ、ＳＳＡＨＡ、ＳＳＡＨＡ２、Ｓｔａｍｐｙ、ＳＴｏＲＭ、Ｓｕｂｒｅａｄ、Ｓｕｂｊｕｎｃ、Ｔａｉｐａｎ、ＵＧＥＮＥ、ＶｅｌｏｃｉＭａｐｐｅｒ、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ、ＸｐｒｅｓｓＡｌｉｇｎ、ＺＯＯＭなど、またはこれらの組合せが挙げられる。ペアエンドリードは、参照ゲノムに従って、同じポリヌクレオチド断片の反対側の末端にマッピングされることが多い。一部の実施形態では、リードメイトが独立してマッピングされる。一部の実施形態では、両方の配列リードからの（すなわち、各末端からの）情報は、マッピングプロセスで因数分解される。参照ゲノムは、ペアエンドリードメイト間に位置する核酸の配列を決定および／または推測するために使用されることが多い。用語「不一致リードペア」は、本明細書で使用される場合、リードメイトの一方または両方が、一つには、連続するヌクレオチドのセグメントにより定義される、参照ゲノムの同じ領域に明確にマッピングすることができないリードメイトのペアを含む、ペアエンドリードを指す。一部の実施形態では、不一致リードペアは、参照ゲノムの予想外の位置にマッピングする、ペアエンドリードメイトである。参照ゲノムの予想外の位置の非限定的な例としては、（ｉ）２つの異なる染色体、（ｉｉ）所定の断片サイズより大きい（例えば、３００ｂｐより大きい、５００ｂｐより大きい、１０００ｂｐより大きい、５０００ｂｐより大きい、もしくは１０，０００ｂｐより大きい）断片サイズによって隔てられている位置、（ｉｉｉ）参照配列と合致しない方向（すなわち、反対方向）など、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、不一致リードメイトは、試料中の鋳型ポリヌクレオチド断片の長さ（例えば、長さ代表値、所定の断片サイズ）または予想長に従って識別される。例えば、試料中のポリヌクレオチド断片の長さ代表値または予想長を超える長さによって隔てられている位置にマッピングするリードメイトは、不一致リードペアとして識別されることもある。反対方向にマッピングするリードペアは、リードのうちの一方の逆相補鎖を使うこと、および参照配列の同じ鎖を使用して両方のリードのアライメントを比較することにより、決定されることもある。不一致リードペアは、当技術分野において公知のまたは本明細書に記載される任意の好適な方法および／またはアルゴリズム（例えば、ＳＶＤｅｔｅｃｔ、Ｌｕｍｐｙ、ＢｒｅａｋＤａｎｃｅｒ、ＢｒｅａｋＤａｎｃｅｒＭａｘ、ＣＲＥＳＴ、ＤＥＬＬＹなど、またはこれらの組合せ）により識別することができる。
配列リード定量化
選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割される配列リードを定量化して、１つまたは複数の部分（例えば、参照ゲノムの部分）にマッピングされるリードの量または数を決定することができる。一部の実施形態では、選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割されるオーバーハング情報を含む配列リードを定量化して、１つまたは複数の部分にマッピングされるオーバーハング情報を含むリードの量または数を決定することができる。ある特定の実施形態では、部分またはセグメントにマッピングされる配列リードの量は、カウントまたはリード密度と呼ばれる。
カウントは、多くの場合、ゲノム部分と関連付けられる。一部の実施形態では、カウントは、部分にマッピングされた（すなわち、部分と関連付けられた）配列リードの一部またはすべてから決定される。ある特定の実施形態では、カウントは、部分の群（例えば、セグメントまたは領域内の部分）にマッピングされた配列リードの一部またはすべてから決定される。
カウントは、好適な方法、操作または数学的プロセスにより決定することができる。カウントは、セグメントに対応するゲノム部分もしくはゲノム部分の群にマッピングされた、ゲノムの小領域（例えば、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域）に対応する部分の群にマッピングされた、および／または、ときには、ゲノムに対応する部分の群にマッピングされた、すべての配列リードの直和であることもある。リード定量化は、比であることもあり、領域ａ内の部分についての定量化の領域ｂ内の部分についての定量化に対する比であることもある。領域ａは、１つの部分、セグメント領域、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域および／または性染色体領域であることもある。領域ｂは、独立して、１つの部分、セグメント領域、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域、すべての常染色体を含む領域、性染色体を含む領域、および／またはすべての染色体を含む領域であることもある。
一部の実施形態では、カウントは、生配列リードおよび／またはフィルタリングされた配列リードから導出される。ある特定の実施形態では、カウントは、ゲノム部分にまたはゲノム部分の群（例えば、領域内のゲノム部分）にマッピングされた配列リードの代表値、平均値または合計である。一部の実施形態では、カウントは、不確定値に関連付けられる。カウントは、調整されることもある。カウントは、重み付けされた、除去された、フィルタリングされた、正規化された、調整された、平均された、平均値として導出された、中央値として導出された、加算された、またはこれらの組合せが施された、ゲノム部分または部分の群に関連付けられた配列リードに従って、調整することができる。
配列リード定量化は、リード密度であることもある。リード密度を、ゲノムの１つまたは複数のセグメントについて決定および／または生成することができる。ある特定の事例では、リード密度を、１つまたは複数の染色体について決定および／または生成することができる。一部の実施形態では、リード密度は、参照ゲノムのセグメントまたは一部分にマッピングされた配列リードのカウントの定量的測度を含む。リード密度を、好適なプロセスにより決定することができる。一部の実施形態では、リード密度は、好適な分布および／または好適な分布関数により決定される。分布関数の非限定的な例としては、確率関数、確率分布関数、確率密度関数（ＰＤＦ）、カーネル密度関数（カーネル密度推定）、累積分布関数、確率質量関数、離散確率分布、絶対連続単変量分布など、任意の好適な分布、またはこれらの組合せが挙げられる。リード密度は、好適な確率密度関数から導出される密度推定であり得る。密度推定は、基礎をなす確率密度関数の推定値を実測データに基づいて構築することである。一部の実施形態では、リード密度は、密度推定（例えば、確率密度推定、カーネル密度推定）を含む。各々の部分が配列リードのカウントを構成する、ゲノムの１つまたは複数の部分の各々についての密度推定を生成することを含むプロセスに従って、リード密度を生成することができる。部分またはセグメントにマッピングされた、正規化および／または重み付けされたカウントについて、リード密度を生成することができる。一部の事例では、部分またはセグメントにマッピングされた各リードは、リード密度に寄与することができ、値（例えば、カウント）は、本明細書に記載される正規化プロセスから得られるその重みに等しくなる。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分またはセグメントについてのリード密度が調整される。リード密度を、好適な方法により調整することができる。例えば、１つまたは複数の部分についてのリード密度に重み付けすることができ、および／またはリード密度を正規化することができる。
所与の部分またはセグメントについて定量化されたリードは、１つの供給源からのものであることもあり、または異なる供給源からのものであることもある。一例では、がんに罹患しているまたはがんの罹患が疑われる対象からの核酸から、リードを得ることができる。そのような状況では、１つまたは複数の部分にマッピングされたリードは、健康な細胞（すなわち、非がん細胞）とがん細胞（例えば、腫瘍細胞）の両方を代表するリードであることが多い。ある特定の実施形態では、ある部分にマッピングされたリードの一部は、がん細胞核酸からのものであり、同じ部分にマッピングされたリードの一部は、非がん細胞核酸からのものである。別の例では、胎児を宿している妊娠している雌からの核酸試料から、リードを得ることができる。そのような状況では、１つまたは複数の部分にマッピングされたリードは、胎児と胎児の母（例えば、妊娠している雌対象）の両方を代表するリードであることが多い。ある特定の実施形態では、ある部分にマッピングされたリードの一部は、胎児ゲノムからのものであり、同じ部分にマッピングされたリードの一部は、母体ゲノムからのものである。
アッセイ
本開示の手法を使用して、様々なアッセイを行うことができる。一部の場合には、試料を、試料核酸中に存在するオーバーハングの一部、多数またはすべてについてアッセイすることができる。この情報を、存在するオーバーハングの数または出現頻度を示す、試料の全般的オーバーハングプロファイルを生成するために使用することができる。一部の場合には、試料を、試料中に存在する１つまたは複数の特定のオーバーハングの一団についてアッセイすることができる。一部の場合には、試料を、試料中に存在するオーバーハングの１つまたは複数の特徴についてアッセイすることができる。一部の場合には、試料を、平滑末端化断片（例えば、片側が平滑末端化されている、または両側が平滑末端化されている、標的核酸（例えばＤＮＡ））についてアッセイすることができる。
試料のオーバーハングプロファイルは、試料中に存在するオーバーハングのある特定の特徴を解析および／または定量化することにより生成することができる。ある特定の事例では、プロファイルは、標的／鋳型核酸自体の特徴を、さらにまたは代替的に（例えば、オーバーハング情報とともに、またはなしで）含むことができる。ある特定の事例では、オーバーハングプロファイルは、標的／鋳型核酸の特徴を含まない。したがって、ある特定の実施形態では、オーバーハングプロファイルは、オーバーハング特徴からなる。オーバーハング／鋳型特徴は、回帰（例えば、ロジスティック回帰、線形回帰、多変量回帰、最小二乗回帰）、階層的クラスタリング（例えば、ウォードの階層的クラスタリング）、教師あり学習アルゴリズム（例えば、サポートベクターマシン（ＳＶＭ））、多変量モデル（例えば、主成分分析（ＰＣＡ））、線形判別分析、二次判別分析、バギング、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシンモデル、ランダムフォレスト、分類木モデル、ｋ近傍法などを含むがこれらに限定されない、任意の好適な定量化方法、クラスタリング方法、統計的アルゴリズム、分類器もしくはモデル、ならびに／または任意の好適な数学的および／もしくは統計的操作を使用して、解析または定量化することができる。
解析または定量化することができるオーバーハング／鋳型特徴としては、ジヌクレオチドカウント（例えば、オーバーハングもしくはリード中の特定のジヌクレオチドの存在／非存在（例えば、特定のジヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングの数、特定のジヌクレオチドを有する試料中の鋳型＋オーバーハングの数、もしくは特定のジヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングなしの鋳型の数）および／またはオーバーハングもしくはリード内の特定のジヌクレオチドのインスタンスのカウント）；トリヌクレオチドカウント（例えば、オーバーハングもしくはリード中の特定のトリヌクレオチドの存在／非存在（例えば、特定のトリヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングの数、特定のトリヌクレオチドを有する試料中の鋳型＋オーバーハングの数、もしくは特定のトリヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングなしの鋳型の数）および／またはオーバーハングもしくはリード内の特定のトリヌクレオチドのインスタンスのカウント）；テトラヌクレオチドカウント（例えば、オーバーハングもしくはリード中の特定のテトラヌクレオチドの存在／非存在（例えば、特定のテトラヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングの数、特定のテトラヌクレオチドを有する試料中の鋳型＋オーバーハングの数、もしくは特定のテトラヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングなしの鋳型の数）および／またはオーバーハングもしくはリード内の特定のテトラヌクレオチドのインスタンスのカウント）；ジヌクレオチドパーセント（例えば、特定のジヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングのパーセント、特定のジヌクレオチドを有する試料中の鋳型＋オーバーハングのパーセント、または特定のジヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングなしの鋳型のパーセント；オーバーハング長により正規化されたオーバーハング中のジヌクレオチドの数；その特定のオーバーハングのものであるジヌクレオチドの比率；長さを問わず全オーバーハングにわたっての比較）；トリヌクレオチドパーセント（例えば、特定のトリヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングのパーセント、特定のトリヌクレオチドを有する試料中の鋳型＋オーバーハングのパーセント、または特定のトリヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングなしの鋳型のパーセント；オーバーハング長により正規化されたオーバーハング中のトリヌクレオチドの数；その特定のオーバーハングのものであるトリヌクレオチドの比率；長さを問わず全オーバーハングにわたっての比較）；テトラヌクレオチドパーセント（例えば、特定のテトラヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングのパーセント、特定のテトラヌクレオチドを有する試料中の鋳型＋オーバーハングのパーセント、または特定のテトラヌクレオチドを有する試料中のオーバーハングなしの鋳型のパーセント；オーバーハング長により正規化されたオーバーハング中のテトラヌクレオチドの数；その特定のオーバーハングのものであるテトラヌクレオチドの比率；長さを問わず全オーバーハングにわたっての比較）；鋳型の完全長；長さのカテゴリー（例えば、ｃｆＤＮＡの場合：サブヌクレオソーム、モノヌクレオソーム、マルチヌクレオソーム）；オーバーハング長（例えば、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、またはそれを超える塩基数）；オーバーハングタイプ（例えば、５’オーバーハング、３’オーバーハング、平滑形）；ＧＣ含有量（例えば、オーバーハングのＧＣ含有量、鋳型＋オーバーハングのＧＣ含有量、またはオーバーハングなしの鋳型のＧＣ含有量）；オーバーハングパーセント（例えば、オーバーハング配列／全オーバーハングのｌｏｇ２パーセント）；オーバーハングカウント（例えば、特定のオーバーハング配列のカウント）；長さパーセント（例えば、オーバーハングの長さ／鋳型の完全長）；鋳型分子の全配列中に対するオーバーハング中のジヌクレオチドカウント；鋳型分子の全配列中に対するオーバーハング中のトリヌクレオチドカウント；鋳型分子の全配列中に対するオーバーハング中のテトラヌクレオチドカウント；オーバーハングが、特定の領域（例えば、コード領域、ＣｐＧアイランド、転写因子結合部位（例えば、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）結合部位）、ＤＮＡｓｅ高感受性部位、オープンクロマチンを示す配列（例えば、ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク）；プロモーター領域、エンハンサー領域、高メチル化領域、目的の他の領域など）とオーバーラップするか、特定の領域に含有されるか、および／または特定の領域内で開始するかもしくは終了するかを含み得る、ブール変数；ゲノム座標；所与のオーバーハングタイプおよびオーバーハング長を有する分子の断片長または分布の平均値；所与のオーバーハング配列を有する分子の断片長または分布の平均値；ライブラリー間の差（例えば、変数間のデータの相関関係の識別（例えば、特徴Ｘと特徴Ｙの間の相関関係の検出、例えば、断片長分布の平均値対変数Ｘ（例えば、所与のオーバーハング配列を有する断片の長さまたは分布の平均値対そのＸ；ここで、Ｘ＝上記の任意の特徴／変数）））；など、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。ジヌクレオチドの例としては、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＴ、ＴＡ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＣ、ＣＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＧＣ、およびＧＴが挙げられる。トリヌクレオチドは、可能な４３のヌクレオチド組合せを含み、テトラヌクレオチドは、可能な４４のヌクレオチド組合せを含む。一部の実施形態では、試料中のオーバーハング中のジヌクレオチドの存在が解析される。一部の実施形態では、試料中のオーバーハング中のＣＧジヌクレオチドの存在が解析される。一部の実施形態では、試料中のオーバーハング中のＧＧジヌクレオチドの存在が解析される。一部の実施形態では、試料中のオーバーハング中のＧＣジヌクレオチドの存在が解析される。
全般的オーバーハングプロファイルを含むオーバーハングプロファイル、オーバーハングの一団、およびオーバーハング特徴は、試料、または試料が採取された供給源（例えば、生物）の様々な特性を示すことができる。これらの特性としては、ヌクレアーゼ活性および／または含有量、トポイソメラーゼ活性および／または含有量、疾患（例えば、がん型、がん病期、感染症、臓器疾患または不全、神経変性疾患、虚血、脳卒中、心血管疾患）、細胞死（例えば、全身性の細胞死率の上昇または低下、特定の臓器または細胞型における細胞死率の上昇または低下、細胞死のある特定の様式（例えば、アポトーシス、オートファジー、壊死、分裂期細胞死、アノイキス、角質化、興奮毒性、フェロトーシス、ウォラー変性、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）、虚血性細胞死、膨化死、免疫原性細胞死またはアポトーシス、パイロトーシス）の率の上昇または低下、アポトーシスまたは他の細胞死様式の調節異常）、マイクロバイオームプロファイル（例えば、腸マイクロバイオーム、血液マイクロバイオーム、口腔マイクロバイオーム、皮膚マイクロバイオーム、環境マイクロバイオーム（例えば、土壌マイクロバイオーム、水マイクロバイオーム））、ならびに放射線曝露のタイプおよび／または量（例えば、紫外線（ＡおよびＢ）、電離放射線（例えば、宇宙線、アルファ粒子、ベータ粒子、ガンマ線、Ｘ線）、中性子線）を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、全般的オーバーハングプロファイルを含むオーバーハングプロファイル、オーバーハングの一団、およびオーバーハング特徴は、がんを示す。一部の実施形態では、全般的オーバーハングプロファイルを含むオーバーハングプロファイル、オーバーハングの一団、およびオーバーハング特徴は、消化管がんを示す。
全般的オーバーハングプロファイルを含むオーバーハングプロファイル、オーバーハングの一団、およびオーバーハング特徴は、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）活性、例えば、内因性ヌクレアーゼ活性を示すことができる。ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）活性は、がんを含むがこれに限定されない、本明細書で論じられる試料または供給源の様々な特性を示すことができる。一部の場合には、試料中の天然に存在する核酸のオーバーハングをアッセイすることができる。一部の場合には、核酸（例えば、合成された核酸）を試料に導入することができ、するとそこでそれらの核酸は、試料中に存在するヌクレアーゼによる作用を受け得る。既知核酸集団の使用は、異なる試料からのものと比較される、オーバーハングプロファイルを生じさせることができる。既知核酸上に生成された異なるオーバーハングは、試料のヌクレアーゼプロファイルの情報を提供することができる。組織特異的ヌクレアーゼ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。例えば、異なる臓器、組織または細胞型からの細胞系を培養することができ、細胞死を誘導することができ、その後、オーバーハングプロファイルのアッセイを行うことができる。オーバーハングプロファイルを特定の酵素（ヌクレアーゼ）または酵素の群についてアッセイすることもできる。特定の酵素または酵素の群を使用して、核酸の集団を消化することができ、結果として生じたオーバーハングプロファイルをアッセイすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質または他の核酸誘導ヌクレアーゼをアッセイして、それらが生じさせる末端のタイプ（例えば、平滑末端、１ｂｐ付着末端、他のオーバーハング）を判定することができる。一部の応用では、オーバーハングプロファイルアッセイは、ＤＮＡｓｅ活性の活性を変更することを目的とする特定の処置および標的治療（例えば、ビタミンＣおよびＫ３；抗がん治療に使用されるトポイソメラーゼ阻害剤；など）の有効性をモニターするために使用され得る。
一部の場合には、対象におけるまたは試料中のヌクレアーゼを阻害して、特定のオーバーハングプロファイルを保存することができる。例えば、細胞プロセスは、１つのオーバーハングプロファイルを（例えば、溶解、細胞死、および／または死後細胞内プロセスから）生じさせ得るが、細胞外に（例えば、血液などの体液中に）存在するヌクレアーゼは、細胞の第１のオーバーハングプロファイルをさらに変更し得る。細胞外のものなどのヌクレアーゼを（例えば、一時的に）阻害または不活性化して、最初のオーバーハングプロファイルをアッセイするために保存することができる。ヌクレアーゼ活性を試料採取より前に（例えば、アクチンで）阻害することができる。一例では、オーバーハングの２つの集団、罹患細胞からのもの（Ｄ）と健康な細胞からのもの（Ｈ）、がアッセイされる。細胞からのＤＮＡの放出後、血液中のヌクレアーゼは、オーバーハングをさらに変更することができ、その結果、修飾されたオーバーハング集団Ｄ’およびＨ’が生じることになる。それ故、血液中に存在するヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）を阻害することにより、修飾されていないまたはあまり修飾されていないオーバーハング集団（例えば、ＤおよびＨ、または阻害なしで観察されると予想されるものよりＤおよびＨに近い）をアッセイすることが可能になり得る。オーバーハングプロファイルに影響を与える他の酵素も阻害することができる。例えば、トポイソメラーゼ切除は、核酸を切断することができ、その結果、特定のオーバーハングプロファイルが生じることになる。これらのプロファイルのアッセイを可能にするために、トポイソメラーゼ阻害剤を導入してこれらのオーバーハングを（例えば、再ライゲーションを防止することにより）保存することができる。
オーバーハングプロファイルは、様々な手法によりアッセイすることができる。オーバーハングを核酸シーケンシングによりアッセイすることができ、これは、本明細書で開示されるようにアッセイすることを含む。オーバーハングを、結合またはハイブリダイゼーションによりアッセイすることができる。例えば、オーバーハングを、特定のオーバーハングと特異的にハイブリダイズする結合剤に結合させることができる。結合剤は、アレイまたはビーズなどの基板上に位置することがある。結合イベントを検出することができ（例えば、蛍光または他の光シグナル、電気シグナル）、オーバーハングプロファイルを判定することができる。アッセイの前に、またはアッセイの一部として、核酸の特定の種（例えば、特定のオーバーハングを有するもの、またはオーバーハングの一団からの１つもしくは複数のオーバーハングを有するもの）を濃縮することができ、これは、本明細書で開示されるように濃縮することを含む。
分類およびそれらの使用
本明細書に記載される方法は、上記の試料または供給源の１つまたは複数の特性を示すアウトカムを提供することができる。本明細書に記載される方法は、被検試料（例えば、医学的状態の存在もしくは非存在および／または表現型を決定するアウトカムを提供するもの）についての表現型および／または医学的状態の存在もしくは非存在を示すアウトカムを提供することもある。アウトカムは、分類プロセスの一部であることが多く、分類（例えば、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性、ならびに／または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の分類）は、アウトカムに基づくこともあり、および／またはアウトカムを含むこともある。アウトカムおよび／または分類は、分類プロセス（例えば、統計値）において試料および／もしくは供給源の１つもしくは複数の特性ならびに／または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の判定を容易にする、被検試料についてのデータ処理の結果に基づくこともあり、および／またはそのような結果を含むこともある。アウトカムおよび／または分類は、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性、ならびに／または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を決定するスコアをあるいはそのような特性ならびに／または存在もしくは非存在のコールを含むこともあり、またはそのようなスコアもしくはコールに基づくこともある。ある特定の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、分類プロセスにおいて試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性をならびに／または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を予測および／または判定する、結論を含む。
アウトカムおよび／または分類の任意の好適な表現を提供することができる。アウトカムおよび／または分類は、確率の１つまたは複数の考察に関連して本明細書に記載される処理方法を使用して生成された１つまたは複数の数値に基づくこともあり、および／またはそのような数値を含むこともある。利用することができる値の非限定的な例としては、感度、特異度、標準偏差、中央絶対偏差（ＭＡＤ）、確実性の測度、信頼度の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある確実性または信頼度の測度、不確実性の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある不確実性の測度、変動係数（ＣＶ）、信頼レベル、信頼区間（例えば、約９５％信頼区間）、標準スコア（例えば、ｚスコア）、カイ値、パイ値、ｔ検定の結果、ｐ値、倍数性値、適合した少数派種の分率、面積比、中央値レベルなど、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、オーバーハングプロファイル、リード密度、リード密度プロファイルおよび／またはプロット（例えば、プロファイルプロット）を含む。ある特定の実施形態では、複数の値が、ときにはそのような値についてのプロファイル（例えば、ｚスコアプロファイル、ｐ値プロファイル、カイ値プロファイル、パイ値プロファイル、ｔ検定の結果、値のプロファイルなど、またはこれらの組合せ）に関して、一緒に解析される。確率の考察は、試料または供給源の１つもしくは複数の特性の判定、ならびに／または対象が、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態を有するリスクがあるか、もしくは有しているかの判定を容易にすることができ、前述のことを決定するアウトカムおよび／または分類が、そのような考察を含むこともある。
ある特定の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、被検試料について遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在のリスクもしくは確率を予測および／または判定する結論に基づく、ならびに／またはそのような結論を含む。結論は、本明細書に記載されるデータ解析方法から決定された値（例えば、確率、確実性および／または不確実性を示す統計値（例えば、標準偏差、中央絶対偏差（ＭＡＤ）、確実性の測度、信頼度の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある確実性または信頼度の測度、不確実性の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある不確実性の測度、変動係数（ＣＶ）、信頼レベル、信頼区間（例えば、約９５％信頼区間）、標準スコア（例えば、ｚスコア）、カイ値、パイ値、ｔ検定の結果、ｐ値、感度、特異度など、またはこれらの組合せ）に基づくこともある。アウトカムおよび／または分類は、特定の被検試料についての検査室検査レポートに、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在に関連する確率（例えば、オッズ比、ｐ値）、尤度またはリスク因子として表示されることもある。被検試料についてのアウトカムおよび／または分類は、特定の遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態に関して「陽性」または「陰性」として提供されることもある。例えば、アウトカムおよび／または分類は、特定の被検試料について、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在が判定された場合、検査室検査レポートに「陽性」と表示されることもあり、ときには、アウトカムおよび／または分類は、特定の被検試料について、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の非存在が判定された場合、検査室検査レポートに「陽性」と表示される。アウトカムおよび／または分類は、データ処理で判定されることもあり、データ処理で使用される仮説を含むこともある。
分類プロセスで生成される分類について、真陽性、偽陽性、真陰性および偽陰性という４つのタイプが概して存在する。用語「真陽性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について正しく判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の存在を指す。用語「偽陽性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について誤って判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の存在を指す。用語「真陰性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について正しく判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の非存在を指す。用語「偽陰性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について誤って判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の非存在を指す。分類プロセスについて性能の次の２つの測度：（ｉ）一般に、陽性であると正しく識別される予測陽性の分率である、感度値；および（ｉｉ）一般に、陰性であると正しく識別される予測陽性の分率である、特異度値を、これらの存在比に基づいて算出することができる。
ある特定の実施形態では、分類プロセスについて生成される検査室検査レポートは、検査性能の測度（例えば、感度および／または特異度）、および／または信頼度の測度（例えば、信頼レベル、信頼区間）を含む。検査性能および／または信頼度の測度は、被検試料についての検査室検査を行う前に行われる臨床検証研究から得られることもある。ある特定の実施形態では、感度、特異度および／または信頼度のうちの１つまたは複数は、パーセンテージとして表される。一部の実施形態では、感度、特異度または信頼レベルの各々について独立して表されるパーセンテージは、約９０％より高い（例えば、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％であるか、または９９％より高い（例えば、約９９．５％であるかそれより高い、約９９．９％であるかそれより高い、約９９．９５％であるかそれより高い、約９９．９９％であるかそれより高い））。特定の信頼レベル（例えば、約９０％～約９９．９％（例えば約９５％）の信頼レベル）について表される信頼区間を値の範囲として表すことができ、そのような信頼区間は、特定の信頼レベルについての感度および／または特異度の範囲として表されることもある。一部の実施形態での変動係数（ＣＶ）は、パーセンテージとして表され、パーセンテージは、約１０％またはそれ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１％、または１％未満（例えば、約０．５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満））であることもある。ある特定の実施形態での（例えば、特定のアウトカムおよび／または分類が偶然によるものでない）確率は、標準スコア（例えば、ｚスコア）、ｐ値、またはｔ検定の結果として表される。一部の実施形態では、アウトカムおよび／または分類についての測定分散、信頼レベル、信頼区間、感度、特異度など（例えば、信頼度パラメーターと総称される）は、本明細書に記載される１つまたは複数のデータ処理操作を使用して生成することができる。
被検試料についてのアウトカムおよび／または分類は、医療専門家または他の有資格者（例えば、医師もしくは助手）により発注されることが多く、彼らに提供されることが多く、彼らが、アウトカムおよび／または分類を、被検試料が採取される対象に伝送する。ある特定の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、好適な視覚媒体（例えば、機械の周辺機器またはコンポーネント、例えば、プリンターまたはディスプレイ）を使用して提供される。分類および／またはアウトカムは、医療専門家または有資格者にレポートの形態で提供されることが多い。レポートは、アウトカムおよび／または分類（例えば、値、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性、または遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の評定もしくは確率）の表示を通常は含み、関連信頼度パラメーターを含むこともあり、アウトカムおよび／または分類を生成するために使用された検査についての性能の測度を含むこともある。レポートは、追跡調査手順（例えば、アウトカムまたは分類を確認する手順）の助言を含むこともある。レポートは、染色体またはその一部分の視覚表示（例えば、染色体イディオグラムまたはカリオグラム）を含むこともあり、被検試料について識別された染色体の重複および／または欠失領域の視覚化（例えば、染色体欠失または重複についての全染色体の視覚化；欠失し領域または重複領域が示されている全染色体の視覚化；重複または欠失した染色体の部分の視覚化；染色体の部分の欠失イベントにおいて残存する染色体の部分の視覚化）を示すこともある。
レポートを、医療従事者または他の有資格者による遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在の判定を容易にする好適な形式で表示することができる。レポートの作成に使用するために好適な形式の非限定的な例としては、デジタルデータ、グラフ、２Ｄグラフ、３Ｄグラフおよび４Ｄグラフ、画像（例えば、ｊｐｇ、ビットマップ（例えば、ｂｍｐ）、ｐｄｆ、ｔｉｆｆ、ｇｉｆ、ｒａｗ、ｐｎｇなど、もしくは好適な形式）、統計図表、チャート、表、棒グラフ、円グラフ、図、フローチャート、散布図、マップ、ヒストグラム、密度チャート、関数グラフ、回路図、ブロック図、バブルマップ、信号空間ダイヤグラム、コンター図、統計地図、クモの巣グラフ、ベン図、計算図表など、または前述のものの組合せが挙げられる。
レポートを、コンピュータにより、および／またはヒトによるデータ入力により、作成してもよく、好適な電子媒体を使用して（例えば、インターネット経由で、コンピュータ経由で、ファクシミリ経由で、同じもしくは異なる物理的位置で１つのネットワークの場所から別の場所に）、またはデータを送信もしくは受信する別の方法（例えば、メールサービス、クーリエサービスなど）により、伝送および通信することができる。レポートを伝送するための通信媒体の非限定的な例としては、聴覚ファイル、コンピュータ可読ファイル（例えば、ｐｄｆファイル）、紙のファイル、検査室ファイル、診療記録ファイル、または前の段落に記載の任意の他の媒体が挙げられる。検査室ファイルまたは診療記録ファイルは、ある実施形態では、有形形態であってもよく、または電子形態（例えば、コンピュータ可読形態）であってもよい。レポートが作成され、伝送された後、アウトカムおよび／または分類を含む書面による表示および／またはグラフィック表示を好適な通信媒体経由で得ることによりレポートを受け取ることができ、これを見直すことによって、医療専門家または他の有資格者は、試料または供給源の１つもしくは複数の特性、または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在について判定することができる。
アウトカムおよび／または分類は、検査室により提供されることがあり、検査室から得られる（例えば、検査室ファイルから得られる）ことがある。検査室ファイルは、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性および／または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を判定するための１つまたは複数の検査を行う検査室により、作成され得る。検査室職員（例えば、主席研究員）は、アウトカムおよび／または分類の根拠となる被検試料に関連する情報（例えば、検査プロファイル、参照プロファイル、検査値、参照値、逸脱レベル、患者情報）を解析することができる。近いまたは疑わしい遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在に関するコールについては、検査室職員は、被検対象からの同じ（例えば、同じ試料のアリコート）または異なる被検試料を使用して同じ手順を再実行することができる。検査室は、検査室ファイルからの遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在を評定する職員と同じ場所にあってもよく、または異なる場所（例えば、別の国）にあってもよい。例えば、検査室ファイルをある場所で作成し、別の場所に伝送することができ、そこで、そのファイル内の被検試料についての情報が、医療専門家または他の有資格者により評定され、必要に応じて、被検試料が採取された対象に伝送される。検査室が、被検試料についてのゲノム不安定性、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在についての分類を含む検査室レポートを作成および／または伝送することもある。検査室検査レポートを作成する検査室は、認定された検査室であることもあり、臨床検査室改善法（ＣＬＩＡ）のもとで認定された検査室であることもある。
アウトカムおよび／または分類は、対象の診断の構成要素であることもあり、ときには、アウトカムおよび／または分類は、被検試料についての診断を下すことの一部として利用および／または評定される。例えば、医療専門家または他の有資格者は、アウトカムおよび／または分類を解析し、そのアウトカムおよび／もしくは分類に基づいて、または一部は基づいて、診断を下すことができる。一部の実施形態では、医学的状態、疾患、症状または異常の判定、検出または診断は、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在を決定するアウトカムおよび／または分類の使用を含む。したがって、本明細書に記載される方法により生成されたアウトカムまたは分類に従って、ならびに必要に応じて、被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在についての分類を含む検査室レポートの作成および伝送に従って、被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在を診断する方法が、本明細書で提供される。
機械、ソフトウェアおよびインターフェース
本明細書に記載されるある特定のプロセスおよび方法（例えば、リードのサブセットを選択するプロセスおよび方法、オーバーハングプロファイルを生成するプロセスおよび方法、オーバーハングデータを処理するプロセスおよび方法、オーバーハング定量化を処理するプロセスおよび方法、オーバーハングデータまたはオーバーハングプロファイルに基づいて試料の１つまたは複数の特性を判定するプロセスおよび方法）は、コンピュータ、マイクロプロセッサー、ソフトウェア、モジュールまたは他の機械なしでは遂行することができないことが多い。本明細書に記載される方法は、コンピュータ実装方法であり得、方法の１つまたは複数の部分は、１つまたは複数のプロセッサー（例えば、マイクロプロセッサー）、コンピュータ、システム、装置または機械（例えば、マイクロプロセッサー制御型機械）により遂行されることもある。
使用に好適なコンピュータ、システム、装置、機械およびコンピュータプログラム製品は、多くの場合、コンピュータ可読記憶媒体を含み、またはコンピュータ可読記憶媒体とともに利用される。コンピュータ可読記憶媒体の非限定的な例としては、メモリー、ハードディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、フラッシュメモリーデバイスなどが挙げられる。コンピュータ可読記憶媒体は、一般に、コンピュータハードウェアであり、多くの場合、非一過性コンピュータ可読記憶媒体である。コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータ可読伝送媒体ではなく、後者のコンピュータ可読伝送媒体は、それ自体が伝送信号である。
実行可能プログラムが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法を遂行するように命令する、コンピュータ可読記憶媒体が、本明細書で提供される。実行可能プログラムモジュールが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムモジュールが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法の一部を遂行するように命令する、コンピュータ可読記憶媒体も、提供される。実行可能プログラムが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体を含む、システム、機械、装置およびコンピュータプログラム製品であって、プログラムが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法を遂行するように命令する、システム、機械、装置およびコンピュータプログラム製品も、本明細書で提供される。実行可能プログラムモジュールが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体を含む、システム、機械および装置であって、プログラムモジュールが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法の一部を遂行するように命令する、システム、機械および装置も、提供される。
コンピュータプログラム製品も提供される。コンピュータプログラム製品は、内部で実施されるコンピュータ可読プログラムコードを含む、コンピュータ使用可能媒体であって、コンピュータ可読プログラムコードが、本明細書に記載される方法または方法の一部を実行するための命令を受けるように構成されている、コンピュータ使用可能媒体を、多くの場合、含む。コンピュータ使用可能媒体および可読プログラムコードは、伝送媒体（すなわち、それ自体が伝送信号）ではない。コンピュータ可読プログラムコードは、プロセッサー、コンピュータ、システム、装置または機械により実行されるように構成されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法（例えば、（例えば、リードのサブセットを選択する方法、オーバーハングプロファイルを生成する方法、オーバーハングデータを処理する方法、オーバーハング定量化を処理する方法、オーバーハングデータまたはオーバーハングプロファイルに基づいて試料の１つまたは複数の特性を判定する方法）は、自動化法により遂行される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法の１つまたは複数のステップは、マイクロプロセッサーおよび／もしくはコンピュータにより行われ、ならびに／またはメモリーと連動して行われる。一部の実施形態では、自動化法は、本明細書に記載される方法を遂行する、ソフトウェア、モジュール、マイクロプロセッサー、同様のものを含む周辺機器、および／または機械で、実施される。本明細書で使用される場合、ソフトウェアは、マイクロプロセッサーにより実行されたときに本明細書に記載のコンピュータ操作を遂行する、コンピュータ可読プログラム命令を指す。
機械、ソフトウェアおよびインターフェースを使用して、本明細書に記載される方法を行うことができる。機械、ソフトウェアおよびインターフェースを使用して、ユーザーは、特定の情報、プログラムまたはプロセスを使用する（例えば、オーバーハングデータを処理する、オーバーハング定量化を処理する、および／またはアウトカムを提供する）ための選択肢の入力、リクエスト、クエリまたは決定を行うことができ、これは、例えば、統計解析アルゴリズム、統計的有意性アルゴリズム、統計アルゴリズム、反復ステップ、検証アルゴリズム、およびグラフィック表示の実行を伴い得る。一部の実施形態では、データセットは、ユーザーにより入力情報として入力されることがあり、ユーザーは、好適なハードウェア媒体（例えば、フラッシュドライブ）により１つもしくは複数のデータセットをダウンロードすることができ、ならびに／またはユーザーは、アウトカムのその後の処理および／もしくは提供のためにデータセットをあるシステムから別のシステムに送信する（例えば、オーバーハング配列処理のためにシーケンサーからコンピュータシステムに配列リードデータを送信する；処理されたオーバーハングデータを、アウトカムおよび／もしくはレポートをさらに処理するおよび／もしくは生じさせるために、コンピュータシステムに送信する）ことができる。
システムは、通常は、１つまたは複数の機械を含む。各機械は、メモリー、１つまたは複数のマイクロプロセッサー、および命令のうちの１つまたは複数を含む。システムが、２つまたはそれより多くの機械を含む場合、機械の一部もしくはすべてが、同じ場所に位置してもよく、機械の一部もしくはすべてが、異なる場所に位置してもよく、機械のすべてが、一カ所に位置してもよく、および／または機械のすべてが、異なる場所に位置してもよい。システムが、２つまたはそれより多くの機械を含む場合、機械の一部もしくはすべてが、ユーザーと同じ場所に位置してもよく、機械の一部もしくはすべてが、ユーザーとは異なる場所に位置してもよく、機械のすべてが、ユーザーと同じ場所に位置してもよく、および／または機械のすべてが、ユーザーとは異なる１つもしくは複数の場所に位置してもよい。
システムは、計算機と、シーケンシング装置またはシーケンシング機とを含むことがあり、この場合、シーケンシング装置またはシーケンシング機は、物理的核酸を受け取り、配列リードを生成するように構成されており、計算装置は、シーケンシング装置またはシーケンシング機からのリードを処理するように構成されている。計算機は、配列リードからアウトカム（例えば、試料の特性）を判定するように構成されていることもある。
ユーザーは、例えば、ソフトウェアに対してクエリを行うことができ、その結果、インターネットアクセス経由でデータセットを獲得することができ、ある特定の実施形態では、プログラム可能マイクロプロセッサーを、所与のパラメーターに基づいて好適なデータセットを獲得するように促すことができる。プログラム可能マイクロプロセッサーにより、ユーザーが、所与のパラメーターに基づいてマイクロプロセッサーにより選択された１つまたは複数のデータセット選択肢を選択するように促されることもある。プログラム可能マイクロプロセッサーは、ユーザーに、インターネット経由で見つかった情報、他の内部または外部情報などに基づいてマイクロプロセッサーにより選択された１つまたは複数のデータセット選択肢を選択するように促すことができる。選択肢は、方法、機械、装置、コンピュータプログラム、または実行可能プログラムが記憶されている非一過性コンピュータ可読記憶媒体の、１つまたは複数のデータ特徴選択、１つまたは複数の統計アルゴリズム、１つまたは複数の統計解析アルゴリズム、１つまたは複数の統計的有意性アルゴリズム、反復ステップ、１つまたは複数の検証アルゴリズム、および１つまたは複数のグラフィック表示を選択するために、選択され得る。
本明細書で取り扱われるシステムは、例えば、ネットワークサービス、ラップトップシステム、デスクトップシステム、携帯型システム、携帯情報端末、コンピューティングキオスクなどのような、コンピュータシステムの一般的コンポーネントを含み得る。コンピュータシステムは、ユーザーによるシステムへのデータの入力を可能にする、キーボード、タッチスクリーン、マウス、音声認識または他の手段などの、１つまたは複数の入力手段を含み得る。システムは、ディスプレイスクリーン（例えば、ＣＲＴもしくはＬＣＤ）、スピーカー、ＦＡＸ機、プリンター（例えば、レーザー、インクジェット、インパクト、白黒もしくはカラープリンター）、または情報（例えば、アウトカムおよび／もしくはレポート）の視覚的、聴覚的および／もしくはハードコピー出力の提供に有用な他の出力要素を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の出力要素をさらに含み得る。
システム内で、入力および出力コンポーネントを中央処理ユニットに接続することができ、この中央処理ユニットは、数あるコンポーネントの中でも特に、プログラム命令を実行するためのマイクロプロセッサーと、プログラムコードおよびデータを記憶するためのメモリーとを含み得る。一部の実施形態では、プロセスを、単一の地理的位置に位置するシングルユーザーシステムとして実行することができる。ある特定の実施形態では、プロセスを、マルチユーザーシステムとして実行することができる。マルチユーザーインプリメンテーションの場合、複数の中央処理ユニットをネットワークによって接続することができる。ネットワークは、建物の一カ所にある単一の部署を包含する、ローカルなものであることもあり、建物全体であることもあり、複数の建物にわたることもあり、地域にわたることもあり、国全体にわたることもあり、または世界中であることもある。ネットワークは、プロバイダーにより所有され、制御される、プライベートなものであることもあり、またはユーザーがウェブページにアクセスして入り、情報を取り出す、インターネットに基づくサービスとして実行されることもある。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、ユーザーを基準にしてローカルであることもあり、または遠隔であることもある、１つまたは複数の機械を含む。１つの場所または複数の場所の１つより多くの機械にユーザーはアクセスすることができ、順次および／または並行してデータをマッピングおよび／または処理することができる。したがって、複数の機械を、例えば、ローカルネットワーク、遠隔ネットワーク、および／または「クラウド」コンピュータプラットフォームで使用して、データをマッピングおよび／または処理するために、好適な構成および制御を利用することができる。
システムは、一部の実施形態では、通信用インターフェースを含むことができる。通信用インターフェースは、コンピュータシステムと１つまたは複数の外部デバイスとの間のソフトウェアおよびデータの転送を可能にする。通信用インターフェースの非限定的な例としては、モデム、ネットワークインターフェース（例えば、イーサネット（登録商標）カード）、通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカードなどが挙げられる。通信用インターフェース経由で転送されるソフトウェアおよびデータは、一般に、通信用インターフェースによって受信され得る電子、電磁、光および／または他の信号であり得る、信号の形態である。信号は、チャネルを介して通信用インターフェースに提供されることが多い。チャネルは、多くの場合、信号を伝達し、ワイヤもしくはケーブル、光ファイバー、電話線、携帯電話リンク、ＲＦリンクおよび／または他の通信チャネルを使用して、チャネルを実装することができる。したがって、一例では、通信用インターフェースを使用して、信号検出モジュールにより検出され得る信号情報を受信することができる。
データは、手動入力デバイスまたは直接データ入力デバイス（ＤＤＥ）を含むがこれらに限定されない、好適なデバイスおよび／または方法により、入力することができる。手動デバイスの非限定的な例としては、キーボード、コンセプトキーボード、タッチ式スクリーン、ライトペン、マウス、トラッカーボール、ジョイスティック、グラフィックタブレット、スキャナー、デジタルカメラ、ビデオデジタイザーおよび音声認識デバイスが挙げられる。ＤＤＥの非限定的な例としては、バーコードリーダー、磁気ストライプコード、スマートカード、磁気インク文字認識、光学式文字認識、光学式マーク認識、およびターンアラウンドドキュメントが、挙げられる。
一部の実施形態では、シーケンシング装置またはシーケンシング機からの出力は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、オーバーハング情報（例えば、オーバーハング特徴、例えば、長さ、タイプ、配列）は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列リードは、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、核酸断片サイズ（例えば、長さ）は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、核酸捕捉プロセスからの出力（例えば、ゲノム領域由来のデータ）は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、核酸断片サイズ（例えば、長さ）と核酸捕捉プロセスからの出力（例えば、ゲノム領域由来のデータ）との組合せは、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、模擬データは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスにより生成され、模擬データは、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。用語「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」は、コンピュータを使用して遂行される研究および実験を指す。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスとしては、本明細書に記載されるプロセスに従って配列リードをマッピングすることおよびマッピングされた配列リードを処理することが挙げられるが、これらに限定されない。
システムは、本明細書に記載されるプロセスまたはプロセスの一部の遂行に有用なソフトウェアを含むことがあり、ソフトウェアは、そのようなプロセスを遂行するための１つまたは複数のモジュール（例えば、シーケンシングモジュール、論理処理モジュール、データ表示構成モジュール）を含むことができる。用語「ソフトウェア」は、コンピュータにより実行されたときにコンピュータ操作を遂行する、コンピュータ可読プログラム命令を指す。１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令が、実行コードとして提供されることもあり、実行コードは、実行されたとき、本明細書に記載される方法を１つまたは複数のマイクロプロセッサーに実行させることができる。本明細書に記載されるモジュールは、ソフトウェアとして存在することができ、ソフトウェアで実施される命令（例えば、プロセス、ルーチン、サブルーチン）がマイクロプロセッサーにより実行または遂行され得る。例えば、モジュール（例えば、ソフトウェアモジュール）は、特定のプロセスまたはタスクを遂行するプログラムの一部であり得る。用語「モジュール」は、より大型の機械またはソフトウェアシステムで使用され得る自己完結型機能ユニットを指す。モジュールは、モジュールの機能を行うための一連の命令を含むことができる。モジュールは、データおよび／または情報を変換することができる。データおよび／または情報は、適切な形態であり得る。例えば、データおよび／または情報は、デジタルまたはアナログであり得る。ある特定の実施形態では、データおよび／または情報は、ときにはパケット、バイト、文字またはビットであり得る。一部の実施形態では、データおよび／または情報は、任意の収集された、整理された、または使用可能なデータまたは情報であり得る。データおよび／または情報の非限定的な例としては、好適な媒体、画像、ビデオ、音（例えば、周波数、可聴のまたは非可聴の）、数、定数、値、オブジェクト、時間、関数、命令、マップ、参照、配列、リード、マッピングされたリード、レベル、範囲、閾値、シグナル、これらの表示、表現または変形が挙げられる。モジュールは、データおよび／または情報を受け入れ、または受信し、データおよび／または情報を二次形態に変換し、二次形態を機械、周辺機器、コンポーネントまたは別のモジュールに提供または転送することができる。マイクロプロセッサーは、ある特定の実施形態では、モジュールで命令を実行することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーは、モジュールまたはモジュール群で命令を実行するために必要とされる。モジュールは、データおよび／または情報を別のモジュール、機械または供給源に提供することができ、データおよび／または情報を別のモジュール、機械または供給源から受信することができる。
コンピュータプログラム製品は、有形コンピュータ可読媒体で実施されることもあり、非一過性コンピュータ可読媒体で明白に実施されることもある。モジュールは、コンピュータ可読媒体（例えば、ディスク、ドライブ）に記憶されていることもあり、またはメモリー（例えば、ランダムアクセスメモリー）に記憶されていることもある。モジュール、およびモジュールからの命令を実行することができるマイクロプロセッサーは、機械内または異なる機械内に位置することができる。モジュール、および／またはモジュールの命令を実行することができるマイクロプロセッサーは、ユーザーと同じ場所に位置することができ（例えば、ローカルネットワーク）、またはユーザーとは異なる場所に位置することができる（例えば、遠隔ネットワーク、クラウドシステム）。方法が２つまたはそれより多くのモジュールと連動して行われる実施形態では、モジュールは、同じ機械内に位置することができ、１つまたは複数のモジュールは、同じ物理的な場所の異なる機械内に位置することができ、１つまたは複数のモジュールは、異なる物理的な場所の異なる機械内に位置することができる。
機械は、一部の実施形態では、モジュールで命令を行うための少なくとも１つのマイクロプロセッサーを含む。配列リード定量化（例えば、カウント）および／またはオーバーハングデータは、本明細書に記載される方法を行うように構成された命令を実行するマイクロプロセッサーによりアクセスされることもある。マイクロプロセッサーによりアクセスされる配列リード定量化および／またはオーバーハングデータは、システムのメモリー内にあることができ、カウントおよび／またはオーバーハングデータにアクセスし、それらを得た後、それらをシステムのメモリーに入れることができる。一部の実施形態では、機械は、マイクロプロセッサー（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサー）を含み、このマイクロプロセッサーは、モジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を遂行および／または実行することができる。一部の実施形態では、機械は、複数のマイクロプロセッサー、例えば、連係しており、並行して働くマイクロプロセッサーを含む。一部の実施形態では、機械は、１つまたは複数の外部マイクロプロセッサー（例えば、内部または外部ネットワーク、サーバー、記憶デバイスおよび／または記憶ネットワーク（例えば、クラウド））で動作する。一部の実施形態では、機械は、モジュール（例えば、１つまたは複数のモジュール）を含む。モジュールを含む機械は、多くの場合、他のモジュールへ、および他のモジュールから、データおよび／または情報の１つまたは複数を受信および転送することができる。
ある特定の実施形態では、機械は、周辺機器および／またはコンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、機械は、他のモジュール、周辺機器および／またはコンポーネントへ、ならびに他のモジュール、周辺機器および／またはコンポーネントから、データおよび／または情報を転送することができる、１つまたは複数の周辺機器またはコンポーネントを含むことができる。ある特定の実施形態では、機械は、データおよび／または情報を提供する周辺機器および／またはコンポーネントと交信する。ある特定の実施形態では、周辺機器およびコンポーネントは、機械による機能の実行またはモジュールとの直接交信を支援する。周辺機器および／またはコンポーネントの非限定的な例としては、スキャナー、プリンター、ディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤ、ＬＣＴもしくはＣＲＴ）、カメラ、マイクロホン、パッド（例えば、ｉパッド、タブレット）、タッチスクリーン、スマートフォン、携帯電話、ＵＳＢ Ｉ／Ｏデバイス、ＵＳＢ大容量記憶デバイス、キーボード、コンピュータマウス、デジタルペン、モデム、ハードドライブ、ジャンプドライブ、フラッシュドライブ、マイクロプロセッサー、サーバー、ＣＤ、ＤＶＤ、グラフィックカード、専用Ｉ／Ｏデバイス（例えば、シーケンサー、光電池、光電子増倍チューブ、光学式読み取り装置、センサーなど）、１つまたは複数のフローセル、流体操作コンポーネント、ネットワークインターフェスコントローラー、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ワイヤレス転送法およびデバイス（ブルートゥース（登録商標）、ＷｉＦｉなど）、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）、インターネット、コンピュータおよび／または他のモジュールを含むがこれらに限定されない、好適なコンピュータ周辺機器、Ｉ／Ｏまたは記憶方法またはデバイスが挙げられる。
ソフトウェアは、コンピュータ可読媒体に記録されたプログラム命令を含むプログラム製品で提供されることが多く、コンピュータ可読媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクおよび磁気テープを含む、磁気媒体；ならびにＣＤ－ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスクを含む、光媒体；光磁気ディスク、フラッシュメモリ－デバイス（例えば、フラッシュドライブ）、ＲＡＭ、フロッピー（登録商標）ディスクなど、ならびにプログラム命令を記録することができる他のそのような媒体が挙げられるが、これらに限定されない。オンラインインプリメンテーションの場合、団体により維持されているサーバーおよびウェブサイトは、遠隔ユーザーにソフトウェアダウンロードを提供するように構成されていることがあり、または遠隔ユーザーは、団体により維持されている遠隔システムにアクセスして、ソフトウェアに遠隔アクセスすることができる。ソフトウェアは、入力情報を得るまたは受信することができる。ソフトウェアは、データを特異的に得るまたは受信するモジュール（例えば、配列リードデータおよび／またはマッピングされたリードデータを受信するデータ受信モジュール）を含むことができ、データを特異的に処理するモジュール（例えば、受信したデータを処理する（例えば、アウトカムおよび／またはレポートをフィルタリングする、正規化する、提供する）処理モジュール）を含むことができる。入力情報を「得ること」および「受信すること」という用語は、データ（例えば、配列リード、マッピングされたリード）を、ローカルもしくは遠隔サイトからコンピュータ通信手段により、人間によるデータ入力により、または任意の他のデータ受信方法により、受信することを指す。入力情報を、それを受信する場所と同じ場所で作成することができ、またはそれを異なる場所で作成し、受信場所に伝送することができる。一部の実施形態では、入力情報は、処理される前に修正される（例えば、処理に適用可能な形式にされる（例えば、表形式にされる））。
ソフトウェアは、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアルゴリズムを含むことができる。アルゴリズムは、命令の有限数列に従ってデータを処理するおよび／またはアウトカムもしくはレポートを提供するために、使用され得る。アルゴリズムは、多くの場合、タスクを完了するための定義済み命令のリストである。初期状態から開始して、命令は、定義された一連の連続状態を経て最終的に最終終了状態で終了する計算を記述することができる。ある状態から次の状態への移行は、必ずしも確定的ではない（例えば、一部のアルゴリズムは、乱数性を取り入れている）。例として、限定ではなく、アルゴリズムは、検索アルゴリズム、ソートアルゴリズム、マージアルゴリズム、数値アルゴリズム、グラフアルゴリズム、文字列アルゴリズム、モデリングアルゴリズム、計算幾何アルゴリズム、組合せアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、暗号学アルゴリズム、データ圧縮アルゴリズム、構文解析アルゴリズムなどであり得る。アルゴリズムは、１つのアルゴリズム、または組合せで働く２つもしくはそれより多くのアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、任意の好適な複雑性クラスおよび／またはパラメーター化された複雑性のものであり得る。アルゴリズムは、演算および／またはデータ処理に使用することができ、一部の実施形態では、決定論的または確率論的／予測アプローチで使用することができる。アルゴリズムを好適なプログラミング言語の使用によりコンピュータ環境で実行することができ、そのようなプログラミング言語の非限定的な例は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｆｏｒｔｒａｎなどである。一部の実施形態では、アルゴリズムを、許容誤差、統計解析、統計的有意性、および／または他の情報もしくはデータセットとの比較（例えば、ニューラルネットもしくはクラスタリングアルゴリズムを使用する場合に適用可能）を含むように、構成または修正することができる。
ある特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムをソフトウェアでの使用のために実装することができる。これらのアルゴリズムを、一部の実施形態では、生データで訓練することができる。新たな生データ試料ごとに、訓練されたアルゴリズムが、代表処理データセットまたはアウトカムを生成し得る。処理データセットは、処理された親データセットと比較して複雑性が低下したものであることもある。処理セットに基づいて訓練されたアルゴリズムの性能を、一部の実施形態では、感度および特異度に基づいて評定することができる。ある特定の実施形態では、感度および／または特異度が最も高いアルゴリズムを識別し、利用することができる。
ある特定の実施形態では、模擬（またはシミュレーション）データは、例えば、アルゴリズムを訓練することまたはアルゴリズムを検査することにより、データ処理を補助することができる。一部の実施形態では、模擬データは、配列リードの異なるグループ分けについての仮定的な様々な抽出試料を含む。模擬データは、現実の集団から予想され得るものに基づくこともあり、またはアルゴリズムを検査するおよび／もしくは正しい分類を割り当てるための偏ったものであることもある。模擬データは、本明細書では「仮想」データとも呼ばれる。ある特定の実施形態では、コンピュータプログラムによりシミュレーションを行うことができる。模擬データセットを使用する場合の可能性のある１つのステップは、識別された結果の信頼度、例えば、ランダム抽出試料が、どれ程、元データとよくマッチするか、または元データを最良に表すのかを、評価することである。１つのアプローチは、選択された試料より良好なスコアを有するランダム試料の確率を推定する、確率値（ｐ値）を算出することである。一部の実施形態では、少なくとも１つの試料が参照試料と（分解変動の有無にかかわらず）マッチすることが仮定される、経験的モデルを評定することができる。一部の実施形態では、例えばポアソン分布などの、別の分布を使用して、確率分布を定義することができる。
システムは、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーを含むことがある。マイクロプロセッサーを通信バスに接続することができる。コンピュータシステムは、メインメモリー、多くの場合、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含むことがあり、二次メモリーを含むこともできる。一部の実施形態でのメモリーは、非一過性コンピュータ可読記憶媒体を含む。二次メモリーは、例えば、ハードディスクドライブおよび／またはリムーバブル記憶ドライブを含むことができ、リムーバブル記憶ドライブは、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、メモリーカードなどを意味する。リムーバブル記憶ドライブは、多くの場合、リムーバブル記憶ユニットから読み取る、および／またはリムーバブル記憶ユニットに書き込む。リムーバブル記憶ユニットの非限定的な例としては、例えば、リムーバブル記憶ドライブによって読み取られ得る、かつリムーバブル記憶ドライブに書き込まれ得る、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、光ディスクなどが挙げられる。リムーバブル記憶ユニットは、コンピュータソフトウェアおよび／またはデータが内部に記憶されているコンピュータ使用可能記憶媒体を含むことができる。
マイクロプロセッサーは、システム内のソフトウェアを実行することができる。一部の実施形態では、マイクロプロセッサーを、ユーザーが行うことができる本明細書に記載されるタスクを自動的に遂行するようにプログラムすることができる。したがって、マイクロプロセッサー、またはそのようなマイクロプロセッサーにより実行されるアルゴリズムは、ユーザーによる監視も入力も殆どないしは全く必要とするはずがない（例えば、ソフトウェアを、自動的に機能を実行するようにプログラムすることができる）。一部の実施形態では、プロセスの複雑性が非常に高いので、１名の人物、または人物群が、試料の１つまたは複数の特性を判定するのに十分短い時間枠ではプロセスを遂行することができない。
一部の実施形態では、二次メモリーは、コンピュータシステムへのコンピュータプログラムまたは他の命令のローディングを可能にするための他の同様の手段を含むことがある。例えば、システムは、リムーバブル記憶ユニットおよびインターフェースデバイスを含むことができる。そのようなシステムの非限定的な例としては、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（例えば、ビデオゲームデバイスに見られるもの）、リムーバブルメモリーチップ（例えば、ＥＰＲＯＭまたはＰＲＯＭ）および付随するソケット、ならびにソフトウェアおよびでデータをリムーバブル記憶ユニットからコンピュータシステムに転送することを可能にする他のリムーバブル記憶ユニットおよびインターフェースが、挙げられる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーおよびメモリーを含む、システム、機械および装置であって、メモリーが、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令を含み、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令が、試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングのオーバーハングプロファイルを生成し、オーバーハングプロファイルに基づいて試料の１つまたは複数の特性を判定するように構成されている、システム、機械および装置が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーおよびメモリーを含む、システム、機械および装置であって、メモリーが、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令を含み、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令が、リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析するように構成されており、それによって、解析を生成し、フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除する、システム、機械および装置が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーおよびメモリーを含む機械であって、メモリーが、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令を含み、メモリーが、試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングについてのオーバーハングデータを含み、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令が、核酸オーバーハングのオーバーハングプロファイルを生成し、オーバーハングプロファイルに基づいて試料の１つまたは複数の特性を判定するように構成されている、機械が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーおよびメモリーを含む機械であって、メモリーが、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令を含み、メモリーが、シーケンシングプロセスにより生成されたフォワード配列リードおよびリバース配列リードを含み、１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令が、リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析するように構成されており、それによって、解析を生成し、フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除する、機械が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、実行可能プログラムが記憶されている非一過性コンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサーに、（ａ）試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングについてのオーバーハングデータにアクセスすることと、（ｂ）核酸オーバーハングのオーバーハングプロファイルを生成することと、（ｃ）オーバーハングプロファイルに基づいて、試料の１つまたは複数の特性を判定することとを遂行するように命令する、非一過性コンピュータ可読記憶媒体が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、実行可能プログラムが記憶されている非一過性コンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサーに、（ａ）シーケンシングプロセスにより生成されたフォワード配列リードおよびリバース配列リードにアクセスすることと、（ｂ）リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって、解析を生成し、フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除することとを遂行するように命令する、非一過性コンピュータ可読記憶媒体が、本明細書で提供される。
キット
ある特定の実施形態では、キットが提供される。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行うのに有用な、本明細書に記載される任意の成分および組成物（例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド成分／領域、標的核酸、酵素）を任意の好適な組合せで含むことができる。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行うのに有用な任意の試薬、緩衝剤または他の成分をさらに含むことができる。例えば、キットは、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプール、核酸試料の核酸を５’リン酸化するように構成されたキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ））、ＤＮＡリガーゼ、切断作用因子、フィルインおよび／または鎖置換反応を行うのに好適な酵素（例えば、ポリメラーゼ）のうちの１つまたは複数、ならびにこれらの任意の組合せを含むことができる。
キットの成分は、別々の容器内に存在することもあり、または複数の成分が、単一の容器内に存在することもある。好適な容器としては、単一のチューブ（例えば、バイアル）、プレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）の１つまたは複数ウェルなどが挙げられる。
キットは、本明細書に記載される１つもしくは複数の方法を行うための使用説明書、および／または本明細書に記載される１つもしくは複数の成分の説明書きも含むことがある。例えば、キットは、核酸断片の末端を修飾するために、および／または核酸ライブラリーを生成するために、本明細書に記載される組成物を使用するための使用説明書を含むことがある。使用説明書および／または説明書きは、印刷された形態であることもあり、キット添付文書に含まれることもある。一部の実施形態では、使用説明書および／または説明書きは、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、携帯フラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなど、に存在する電子記憶データファイルとして提供される。キットは、そのような使用説明書または説明書きを提供するインターネットの場所についての書面での説明書きを含むこともある。
下記の実施例は、ある特定の実施形態を例証するものであり、本技術を限定するものではない。
（実施例１）
ＲＮＡｓｅ切断性ヘアピンアダプター 分解されたＤＮＡ分子（例えば、古代ＤＮＡ）の損傷の１つの形態は、シトシン（Ｃ）からウラシルへ脱アミノ化である。ループにデオキシウリジンを含有するヘアピン構造の形態のＤＮＡシーケンシングアダプターは、一本鎖を切断するためにウラシル－ＤＮＡ－グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する必要がある。これらの酵素の使用の１つの起こり得る帰結は、目的のＤＮＡ断片内の損傷部位での切断であり、それによって断片はライブラリー変換に利用できなくなる。例えば循環無細胞ＤＮＡなどの古代ＤＮＡに類似したある特定の基質によって、身体からの放出およびクリアランスのプロセスの間に損傷した塩基が蓄積され得る。これは、循環無細胞ＤＮＡライブラリー調製のためのデオキシウリジンを含有するシーケンシングアダプターの使用を制限し得る。ライブラリー調製中にＲＮＡｓｅの使用と併せてヘアピンのループ内にＲＮＡ塩基を有するヘアピンアダプターを使用することにより、ＤＮＡライブラリー調製についてのそのような課題が取り除かれるはずである。ライブラリー調製中のＲＮＡｓｅの使用は、ある特性の夾雑物をシーケンシング前に低減させるのに有用でもあり得る。ヘアピンアダプター構成の例を図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す。
方法
シーケンシングライブラリーを、鋳型ＤＮＡをＤＮＡ／ＲＮＡアダプターにライゲーションすることにより調製し、ＤＮＡ／ＲＮＡアダプターは、二本鎖ステムがＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターに普遍的ないくつかのＤＮＡ塩基の相補性により作出され、一本鎖ループが、Ｐ５およびＰ７（フォワードおよびリバース）プライマー部位の固有の非相補的ＤＮＡ塩基を含有する、ステムループ構造を有した。３つのグアニンＲＮＡ塩基をループ内に配置し、これは、Ｔ１ ＲＮＡｓｅの切断部位としての役割を果たした。切断後、二本鎖ＤＮＡ分子が形成され、これを直接増幅およびシーケンシングすることができた。
末端修復中にＡテーリングを行う市販のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製キットを比較のために使用した。この実施例で検査したＲＮＡｓｅ切断性ヘアピンアダプターは、Ａテールを有する鋳型に対応する単一のＴオーバーハングを有するように設計したものであり、５’リン酸を有した。
ＲＮＡｓｅ切断性ヘアピンアダプターの性能を、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製を再現すること、およびＲＮＡｓｅ切断性ヘアピンアダプターを市販キットのウラシルアダプターの代わりに用いることによって、評価した。次の４つのＤＮＡ源を鋳型として使用した：１）血漿から単離した無細胞ＤＮＡ、２）尿から単離した無細胞ＤＮＡ、３）ヒトホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、および４）３０ｋｙａのバイソン骨から単離したＤＮＡ。ライブラリー調製は、マニュアルに記載の通りに行い、ペアエンドシーケンシングは、ｖ２ナノフローセルまたはｖ３試薬キットを使用してＭｉＳｅｑで行った。
結果
表１の結果は、ＲＮＡｓｅ切断性ヘアピンアダプターが、市販のウラシルアダプターと全く同じように動作し、尿からの無細胞ＤＮＡおよび断片化したＦＦＰＥ試料について最も大きな増加が観測されたことを示す。下記の８つの実験のうちの６つにおいて、ＲＮＡｓｅ切断性ヘアピンアダプターは、わずかにより低い複製率を示した。

（実施例２）
固有末端識別子（ＵＥＩ）および固有分子識別子（ＵＭＩ）
ＤＮＡ放出、様々な形態の細胞死、および死後の細胞プロセスなどの、イベントは、明確に異なる形態的特徴および分子経路によって特徴付けられる。二本鎖切断後のＤＮＡ末端に見られるシグナルは、固有のＤＮＡ分解パターンを反映することができ、原因となるプロセスおよび可能性のある病態形成プロセスについての情報を提供することができる。これを研究するために、ＲＮＡｓｅ切断性アダプターを、ネイティブＤＮＡ末端に存在するときに一本鎖オーバーハングを捕捉するように設計した（例えば、図１Ｂを参照されたい）。
そのようなアダプターを、１）長さＮの５’または３’一本鎖オーバーハング、および２）オーバーハングに隣接する固有末端識別子（ＵＥＩ）という、少なくとも２つの部分を含有する合成ＤＮＡのライゲーションにより生成した。ＵＥＩは、存在する場合にはそのオーバーハングのタイプおよび長さを伝達する、二本鎖バーコードである。一般に、ハイブリダイゼーションおよびダイマーの形成を回避するためにＵＥＩおよびＵＥＩアダプターをリン酸化しない。一部の事例では、ＵＥＩおよびＵＥＩアダプターをリン酸化する。
このヘアピン設計のある特定の反復、および他のアダプターの設計では、固有分子識別子（ＵＭＩ）も、ＵＥＩに隣接して含めるか、またはアダプター構造内の他の場所に含める（例えば、図１Ｃを参照されたい）。ＵＭＩは、それらによって固有の出発分子の数の推定が可能になり、ライゲーション反応の感度が評価されることから、ＵＥＩとは異なる目的に役立つ。
（実施例３）
ＤＮＡ末端にタグを付けるための固有末端識別子（ＵＥＩ）を有する両側オリゴ
固有末端識別子（ＵＥＩ）は、ＤＮＡ末端にタグを付けるために使用することもできる。他のシーケンシングプラットフォームまたは下流の解析のための柔軟な選択肢を与えるために、ＵＥＩは、独立型ライゲーション成分（すなわち、シーケンサー特異的アダプター配列を有さない）として機能することができる。このプロセスは、任意ライブラリータイプへの変換または解析のために、オーバーハングＤＮＡのネイティブ末端をコードする／そのままの状態に保つ。そのようなライゲーションの産物は、平滑末端化された二本鎖分子であり得る。
ＵＥＩの両側での対応するＤＮＡオーバーハングへのライゲーションを可能にする１つの設計を、図２Ａに示す。両側ＵＥＩオリゴと呼ばれることがあるこのオリゴは、フォワードおよびリバース鎖上に内部ウラシル（またはデオキシウリジン）を有し、これは、ウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ）酵素（すなわち、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物）の切断部位として役立つ。ある特定のオリゴ設計は、１個または２個のウラシルを含む、２～１２個のランダムな塩基をＵＥＩ間に含む。図２Ａは、オリゴヌクレオチドの例を示し、ワークフローの例を図２Ｂで説明する。手短に述べると、ライゲーション後、酵素カクテルが、両方の鎖のウラシルを切断し、その結果、あらゆるライゲーションされていない物質または隣接するライゲーション産物が分離される。切断後、鋳型ＤＮＡ分子には、依然としてＵＥＩが両側にライゲーションされている。フィルインを行って、分子内に残存するニックを修復する。フィルイン後、平滑末端化された二本鎖分子は、依然として、ライブラリー調製のための準備が整った状態である。
上記オリゴ設計の性能を検査するために、両側ＵＥＩオリゴを、２個体からの血漿から単離した５ｎｇの無細胞ＤＮＡにライゲーションした（２０×オリゴ：鋳型比）。多くの場合、血漿から単離した無細胞ＤＮＡ断片サイズについて２つの画分が観測された。これに対処するために、ＤＮＡ抽出物を分画して、５００ｂｐより大きい断片（「高」）を５００ｂｐより小さいもの（「低」）から分離した。ライブラリー調製を上で説明したように行い、鋳型をリン酸化し、両側ＵＥＩオリゴをライゲーションし、ウラシルを切断し、フィルインを行った。次いで、結果として得られたＤＮＡ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ＩＩライブラリー調製キットを使用するライブラリー調製に付した。ＭｉＳｅｑ ｖ２ナノフローセルを使用して、ペアエンドシーケンシング（２×１５０）を行った。
結果
このアプローチは、他の設計と比較してより多くのアダプターダイマーを生成し、これによりシーケンシング出力が低下した。ライブラリー当たり３０，０００～１５０，０００の間のリードが生成された。ヒトゲノムにマッピング可能であったＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの予想サイズ分布、およそ１６７ｂｐ、またはヌクレオソームに巻き付いたＤＮＡの長さであった（図３および図４を参照されたい）。抽出物の「高」画分であるＡＰＮ３０７およびＡＰＮ３１０からの非常に少数のリードは、マージするのに十分な短さであり、ヌクレオソーム１個のサイズを優に上回っていた（図３、パネルＣおよびＦ）。「高」画分ライブラリーは、データ数が少なすぎて目に見える表示が一切なかった（図４、パネルＣおよびＦ）。ライブラリーの「低」または「全」（すなわち、サイズ分解されていない）部分は、ライブラリーを生成したが、所期のサイズの大半のＤＮＡ断片は、１つの両側ＵＥＩオリゴのみにライゲーションされたか、またはどの両側ＵＥＩオリゴヌクレオチドにもライゲーションされなかった（図４、パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）。
ある特定の事例では、各鋳型ＤＮＡ分子は、２つのＵＥＩオリゴヌクレオチドを受け取ると有利である。多くの場合、ライゲーションされたＵＥＩオリゴを１つだけ有する、またはライゲーションされたＵＥＩオリゴを有さない分子は、それでもやはり、下流で標準的なライブラリー分子に変換されることになる。ＤＮＡのネイティブ末端を特徴付ける目的には、ＵＥＩオリゴヌクレオチドを有さない断片は、有用でなく、１つのＵＥＩオリゴを有する断片は、理想的でない。この課題に対処するために、ビオチン化ｄＮＴＰをフィルインステップ中に鎖に組み込む。フィルインに成功した（すなわち、ライゲーションに成功した）鋳型断片のみを固定化することにより、ＵＥＩオリゴライゲーションイベントが起こらなかったＤＮＡ分子を下流の処理から除外する。このアプローチは、シーケンシング調製前にＵＥＩオリゴ（すなわち、両側ＵＥＩオリゴ）を有するＤＮＡ断片を調製するあらゆる設計に適用可能である。
（実施例４）
ＤＮＡ末端にタグを付けるための固有末端識別子（ＵＥＩ）を有する片側オリゴの遮断
ＵＥＩオリゴの両末端でのライゲーションを促す設計を使用するのではなく、特定の方向で確実にライゲーションするために単一の遮断性修飾塩基をＵＥＩオリゴの３’末端に配置する。図５に示す１つの設計は、ＵＥＩオリゴを強制的に一方向にライゲーションさせるためにＵＥＩオリゴの３’末端を遮断する。イソデオキシ－塩基を遮断剤として選択した。イソデオキシ－Ｇおよびイソデオキシ－Ｃは、天然塩基とは異なる水素結合パターンを有する。しかるが故に、それらは、いずれの天然塩基とも結合することができない。典型的に、ｉｓｏＧは、ｉｓｏＣとのみ対合することができる。これらの２つの修飾塩基のうちの１つ、ｉｓｏＧまたはｉｓｏＣのどちらか、のみを使用することにより、ＵＥＩオリゴの「誤った」末端でライゲーションもハイブリダイゼーションも起こらないはずであり、したがって、ライゲーションイベントの正しい方向が余儀なくされる。
鋳型ＤＮＡのみがリン酸化される（オリゴはされない）ので、ニックは、ライゲーション後に分子のフォワード鎖上およびリバース鎖上の両方に残存する。鎖置換ポリメラーゼを使用するフィルインは、二本鎖分子を完成し、修飾塩基を有するＵＥＩオリゴの鎖を除去する（図６を参照されたい）。
（実施例５）
合成および生物学的ＤＮＡの脱リン酸化
上記のある特定の実施例で説明したライブラリー調製では、一般に、３’オーバーハングをチューバックし、５’オーバーハングをフィルインし、Ａテーリングまたは平滑末端ライゲーション用の鋳型を調製する、従来の末端修復ステップを省略する。上で説明した方法は、鋳型ＤＮＡを調製するためのヌクレアーゼの使用もポリメラーゼの使用も通常は含まず、その代わりにライゲーションの前に鋳型をＴ４ ＰＮＫでリン酸化する。
ある特定の事例では、アダプターおよび対照を含む、オリゴに対して、および／または鋳型ＤＮＡに対して前処理を行って、埋め込まれていようが、そうでなかろうが、すべての３’および５’末端のリン酸を除去した。ホスファターゼｒＳＡＰ（ＤＮＡの１ｐｍｏｌ当たり１単位）をこの前処理に使用した。
図７Ａ、図７Ｂおよび図７ＣのＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎデータは、ｒＳＡＰで無細胞ＤＮＡ鋳型（図７Ｂ）ならびに無細胞ＤＮＡおよびアダプター（図７Ｃ）を処理した後の、ライブラリー生成の改善を実証する。ｒＳＡＰ処理後の改善は、アダプターダイマーピークの低減およびＤＮＡサイズのピークの増加と考えられる。図７Ａは、ほぼ排他的にアダプターダイマーで構成されているライブラリー、鋳型をｒＳＡＰで処理しなかったときのＤＮＡのほぼ完全な喪失を示す。
Ｔ４ ＰＮＫでの第１のステップの前に合成５０ｂｐ二本鎖対照オリゴを脱リン酸化したときにも、有意な改善が観測された。これは、リン酸化されていないオリゴまたはアダプターを商事会社から購入した場合であっても、一部のＤＮＡ末端が、Ｔ４ ＰＮＫでのリン酸化を含む末端修飾に適応できず、それ故、ライゲーション中にうまく動作しないことを示す。
（実施例６）
メイトペアライブラリー
ライブラリー変換の推奨断片長より長い、ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡを、通常は、ライブラリー調製前に機械的せん断するか、または酵素的せん断する。せん断後、従来のライブラリー調製が、末端修復ステップから始まる。せん断も、末端修復も、ネイティブＤＮＡ末端の利用、したがって観測を妨げる。
無細胞ＤＮＡ断片の一部分は、使用可能なシーケンシングデータの生成に理想的であるものより大きい（例えば、５００ｂｐより上～７００ｂｐ）ことがある。大きい断片を含有する無細胞ＤＮＡの高分子量（ＨＭＷ）部分は、非アポトーシス細胞死または壊死後の放出の結果であり得、そのような断片の末端は、有用な情報源を提供し得る。ＨＭＷ ＤＮＡからの長いＤＮＡ断片のネイティブ末端を保持し、特徴付け、保存末端をシーケンシングライブラリーにうまく変換するための１つの設計は、メイトペアライブラリーの修飾またはＤＮＡ断片の環状化である。
メイトペア修飾は、まず、長い、例えば＞５００ｂｐの、５’リン酸化ＤＮＡ断片を、ビオチン化二本鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドのプールにライゲーションすることを含む。各ｄｓオリゴを、一方の側に長いパリンドローム一本鎖オーバーハング（５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのどちらかとして配置することができる；図８Ａには５’オーバーハングとして示されている）を含み、他方の側には、固有末端識別子（ＵＥＩ）と呼ばれる、オーバーハングの長さおよびタイプ（５’または３’）を識別する固有配列が先行する、長さＮまでの様々な長さのランダム配列で構成されている５’または３’一本鎖オーバーハングのすべての組合せを含むように、設計する。様々な５’および３’オーバーハング長を有するオリゴヌクレオチドの少数の例を、図８Ａで説明する。長いパリンドローム配列は、ヒトゲノムでは一般に見られも予測されもせず、ヒトマイクロバイオームに付随することが多い細菌では通常は観測されもしない。ヘアピン形成について推定される高いデルタＧ値は、ヘアピンではなく自己ダイマーが、所望通りに優先的に形成することになり、それによって環状化が促進されることを示唆する。ｄｓＤＮＡ鋳型上に存在するネイティブ３’および５’オーバーハングは、存在する場合、オリゴヌクレオチドセットの利用可能なオーバーハング末端にライゲーションすることになる。元々平滑形のｄｓＤＮＡ鋳型は、セット内の平滑末端化オリゴヌクレオチドにライゲーションすることができる。相補的オリゴヌクレオチドの長いパリンドローム配列により生成される自己ダイマーによって、リガーゼの存在下で長い断片の環状化が可能になる。一部の事例では、ポリヌクレオチドキナーゼをリガーゼとともにまたはリガーゼの前に使用して、ニックを修復し、二本鎖を完成する。一部の事例では、５’リン酸を有するオリゴヌクレオチドを調製する。
オリゴヌクレオチドと鋳型ＤＮＡがライゲーションされ、環状化されると、エキソヌクレアーゼが一切の非環状化ＤＮＡまたは過剰なオリゴヌクレオチドを除去する。次いで、環状化ＤＮＡを（例えば、超音波破砕装置（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用して、または酵素的断片化により）せん断して、ショートリードでハイスループットのシーケンサーに好適な分子を生成する。一般に、ビオチン化オリゴヌクレオチドにライゲーションされるすべてのＤＮＡ断片をストレプトアビジン被覆ビーズ上に固定化することにより、目的のＤＮＡ末端のみを捕捉する。これらのステップは、ネイティブ末端から生じたものでない高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡ片からのライブラリー分子の生成を低減させる。ＤＮＡ抽出後に低分子量（ＬＭＷ）核酸と高分子量（ＨＭＷ）核酸の両方を分画した後、長いＤＮＡ断片の環状化戦略を、より短いＤＮＡ断片についての、上で説明したもののような、アプローチと組み合わせることができる。これらの２つの戦略の結果として得られるデータセットを、バイオインフォマティクスによりマージして、または比較のために別々に解析して、ネイティブＤＮＡ末端が全ＤＮＡ断片長によってどのように異なるのかを詳しく調査することができる。
メイトペアまたは環状化法は、一般に次のように行う：１）鋳型ＤＮＡをホスファターゼで前処理する；２）鋳型ＤＮＡをリン酸化する；３）オーバーハングＵＥＩオリゴヌクレオチドプールを鋳型にライゲーションし、必要に応じてニックを修復する；４）エキソヌクレアーゼで処理する；５）せん断する；６）ビオチン化断片をビーズ上に固定化する；７）最適なライブラリー調製を開始する。
上で説明した方法について、特定のオーバーハング末端パターンが、生物学的（例えば、ヒト内因性もしくは組織特異的ヌクレアーゼ機能）、生物医学的（例えば、病理学的もしくは処置誘導細胞死、腫瘍形成）、または法医学的（例えば、生物学的分解対タフォノミック分解）発見にとって重要である場合、ＵＥＩ配列が組み込まれたオーバーハングオリゴ／アダプターを、ビオチンとともにまたはなしで、標的濃縮戦略として使用することができる。
（実施例７）
さらなるアダプターの例
さらなるアダプターの例を図９Ａおよび９Ｂ（パネルＡ）に示す。図９Ａは、第１相で鎖置換ポリメラーゼを使用して固有末端識別子（ＵＥＩ）配列を結合させ、第２相でシーケンサー特異的配列（例えば、シーケンシングアダプター）を結合させる方法の例を示す。したがって、図９Ａ、パネルＡに示すアダプターは、シーケンサー特異的アダプター配列（Ｐ５、Ｐ７）を含有しない。図９ＡのパネルＡは、固有末端識別子（ＵＥＩ）配列（灰色で示す）およびランダム配列（黒色で示す）で構成されている、Ｙアダプター（左側）およびヘアピンアダプター（右側）を示す。一部の事例では、Ｙアダプターは、ヘアピンアダプターの切断されたバージョンである。ヘアピンアダプターは、切断部位（「Ｘ」）を含み、この切断部位は、実施例１で説明したような１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含み得る。図９ＡのパネルＢは、標的核酸へのアダプターのライゲーションを示す。ヘアピンアダプターライゲーション産物を切断部位で切断することができる。切断後のライゲーション産物は、Ｙ－アダプターライゲーション産物と同じである。図９ＡのパネルＣは、完全相補的二本鎖の平滑末端化断片を作出するための鎖置換ポリメラーゼによるニックでのフィルインステップを示す。図９ＡのパネルＤは、最適な任意のシーケンシングライブラリー調製のための準備が整った状態である核酸断片（第２相）を示す。
図９Ｂは、ネイティブ核酸断片の末端にＹアダプターまたはヘアピンアダプターを結合させる方法の例を示す。パネルＡは、オーバーハングと、固有末端識別子（ＵＥＩ）配列（灰色で示す）と、プライミング配列（プライミング配列１（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｐ５プライミング配列）およびプライミング配列２（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７プライミング配列）；黒色で示すプライミング領域）とで構成されている、Ｙアダプター（左側）およびヘアピンアダプター（右側）を示す。パネルＢは、標的核酸へのアダプターのライゲーションを示す。アダプターがリン酸化されないので、ライゲーションは、鋳型の５’末端でのみ起こり、ニックが残る。パネルＣは、５’アダプター鎖がリン酸化され、アダプターの３’末端をライゲーションすると、ニックが修復されることを示す。ニック修復後、ヘアピンアダプターライゲーション産物を切断部位で切断することができる。切断後のライゲーション産物は、Ｙ－アダプターライゲーション産物と同じである。この方法は、最適な任意のシーケンシングライブラリー調製のための準備が整った状態である二本鎖核酸断片（第２相）、および／または最適なシーケンサーための準備が整った状態である二本鎖核酸断片を生成し、これは、使用されるプライミング配列に依存し得る。
（実施例８）
断片サイズ選択
ライブラリー調製後にビーズ、ゲル切り出し、またはＰｉｐｐｅｎ Ｐｒｅｐマシンのような自動化法を使用してサイズ選択を行うのではなく、一部の事例では、サイズ分画をＤＮＡ抽出物で行うことで、ライブラリー分子に変換されることになるＤＮＡのサイズを制御する。分画にはある特定の現実的および生物学的動機がある。現実的には、分画は、ある特定のシーケンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム）を使用して効率的にシーケンシングするには長すぎる断片の存在を低減せる。生物学的には、分画は、異なる生物学的プロセスの産物であり得る断片を分離し、保持する。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片長は、一般に、１、２または数ヌクレオチドのサイズ、約１７０、約３４０、約５１０ｂｐぐらいであり、これらの断片は、一般に、細胞アポトーシスの産物と考えられる。より大きい断片は、ある一定の事例では、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）夾雑物を含む。より大きい断片は、ｃｆＤＮＡ断片（例えば、ヌクレオソームより大きい断片、例えば、異なる分解段階の断片、またはアポトーシス以外のプロセス（例えば、壊死）に由来する断片）も含み得る。
固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）ビーズを使用して分画を行って、短いＤＮＡ断片と長いＤＮＡ断片の両方（それぞれ、＜５００ｂｐおよび＞５００ｂｐと定義する）を分離し、保持する。カルボキシル化ビーズを、様々なＰＥＧ－８０００濃度（１８％、２０％および３８％）およびＮａＣｌ濃度（０．５Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ）の溶液中で調製する。ＤＮＡ抽出物を溶液とともにインキュベートし、磁性粒子分離装置を使用してビーズを回収する。上清を、所望される効果に依存して、廃棄するかまたは保持する。ビーズをエタノールで洗浄した後、ＤＮＡを、ビーズから、水、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＴＥ緩衝液、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０を含有するＴＥ（ＴＥＴ）のような、中性ｐＨの溶出用緩衝液へ放出させる。
溶液中のＳＰＲＩビーズ上に固定化されることになるＤＮＡ断片の長さは、ＰＥＧの濃度に依存し、この濃度は、ビーズのＤＮＡに対する比と言い換えられる。一般に、この比が低いほど、長いＤＮＡ断片がビーズ上に捕捉されることになり、その結果、より短いＤＮＡが上清に残存することになる。短い断片を上清から得るには、より高いビーズのＤＮＡに対する比を使用する。一例では、二重サイズ選択を血漿ＤＮＡ抽出で行い、各ＤＮＡ抽出物を０．４～０．５×比のＳＰＲＩビーズ溶液（最終１８％ＰＥＧ、１Ｍ ＮａＣｌ）とともに（すなわち、２０ｕｌのＤＮＡ、８ｕｌのビーズ）、１５分間、室温でインキュベートした。１５分後、上清を回収し、取っておいた。ビーズを８０％エタノールで２回洗浄し、１５ｕｌのＴＥＴ緩衝液で溶出した。この画分は、一般に、短いＤＮＡ断片を含まない。
２×比のＳＰＲＩビーズを上清に添加した。インキュベーション、洗浄および溶出を、上で説明したように行った。溶出後、この画分は、一般に、短いＤＮＡ断片を含有した。次いで、短い断片を様々なＩｌｌｕｍｉｎａオーバーハングライブラリー調製方法に使用し、これらの方法の一部を、上記のある特定の実施例で説明している。
（実施例９）
ＲＮＡオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドアダプター
この実施例は、オリゴヌクレオチドアダプターにおける一本鎖オーバーハングの基質としてＲＮＡ塩基を使用する方法を記載するものである。ＲＮＡオーバーハングを有するアダプターを、ライブラリー調製のために、非常に多くの構成、例えば、Ｙ、ヘアピン、二重鎖、遮断する修飾を加えた二重鎖（例えば、図１０Ａを参照されたい）で、構造化することができる。本明細書に記載する他のすべての反復と同様に、オーバーハングの長さおよびオーバーハングのタイプ（例えば、５’オーバーハングまたは３’オーバーハング）を示す固有末端識別子（ＵＥＩ）をオリゴヌクレオチドの二重鎖部分に組み込む。一部の事例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ特異的アダプター配列（例えば、Ｐ５、Ｐ７）をＵＥＩ－アダプターに含める。一部の事例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ特異的アダプター配列（例えば、Ｐ５、Ｐ７）をＵＥＩ－アダプターに含めない。
Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼなどの、ある特定のリガーゼまたはリガーゼの組合せは、ある特定の条件下で、ＤＮＡがＲＮＡ鋳型にアニールされるとＲＮＡをＤＮＡにライゲーションすることができる。ＲＮＡ塩基の一本鎖オーバーハングを有するアダプターを作出することにより、ネイティブＤＮＡ鋳型とのハイブリダイゼーションは、ライゲーションされ得るＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖を生じさせる。
ダイマーを（例えば、ＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成するオーバーハングハイブリダイゼーションによって）形成するオリゴヌクレオチドアダプターの潜在的な問題に対処するために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造を標的とするリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を使用して、アダプターダイマーの消化を行う。ＲＮＡｓｅ ＩＩＩは、ｄｓＲＮＡ構造を標的とするＲＮＡｓｅの例である。大半のリボヌクレアーゼは、十分に機能するために長い基質を必要とする。しかし、より短いｄｓＲＮＡアダプターダイマーは、アダプター設計（例えば、最短長の基質および許容リーダー配列）の５’末端（「リーダー」）が、特定のリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ）の標準要件を満たすのであれば、消化または切断によって消失される。
ワークフローの例は、次の構成要素を含む：１）ＤＮＡ鋳型を脱リン酸化する；２）ＤＮＡ鋳型をリン酸化する；３）複数の（設計に依存して、完全または部分的）二本鎖ＤＮＡアダプターオリゴヌクレオチド種であって、ＵＥＩと長さ１～ＮのランダムＲＮＡ塩基を有する一本鎖オーバーハングとを各々が有し、平滑形アダプター（オーバーハングなし）も含まれる、二本鎖ＤＮＡアダプターオリゴヌクレオチド種と、鋳型をハイブリダイズする；４）リガーゼの１つまたは組合せとライゲーションする；５）必要に応じて、ヘアピン構造を切断する；６）二本鎖分子を完成する－アダプター構成に依存して、鎖置換ポリメラーゼを使用してニックをシールするまたはニックでフィルインする；７）ＳＰＲＩ精製して、サイズに基づいてアダプターダイマーを除去することで、過剰なアダプターおよび１００ｂｐ未満のダイマーを除去する；ある特定の事例では、酵素的消化も使用する；８）必要に応じて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ調製に進む。
（実施例１０）
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡのためのオリゴヌクレオチドアダプター
この実施例は、ショートリード次世代シーケンシング（ＮＧＳ；例えば、ハイスループットシーケンシング）を利用して高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡからオーバーハング情報を収集するためのオリゴヌクレオチドアダプターおよび方法を記載するものである。
上記実施例で説明した、ある特定のオリゴヌクレオチドアダプターおよび方法は、５００ｂｐ未満の長さを有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のためのオーバーハングの長さおよび方向に関する情報を（例えば、ショートリードＮＧＳシーケンサーを使用して）得るのに有用であり得る。上で論じた、ある特定の戦略は、５’末端または３’末端のどちらかにランダムな一本鎖Ｎ－ｍｅｒを含有するバーコード化Ｙ（またはヘアピン）オリゴヌクレオチドアダプターのプールをｄｓＤＮＡにライゲーションすることに依拠する。次世代シーケンシング後、各タイプのアダプター上に存在する固有のバーコードが、存在する場合には各ＤＮＡ分子上に存在するオーバーハングの正しい長さおよび方向を伝える。ある特定のプロトコールでは、１つの計算論的アプローチは、関与する分子生物学の細目のため、シーケンシングデータ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して得たもの）のリード２の最初にバーコードを使用する。
一般に、上で説明した方法では、ｄｓＤＮＡ末端は、不変である。ショートリードシーケンサーを使用するには、一般に、シーケンシング前に高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡ（例えば、５００ｂｐを超える長さのＤＮＡ）をより小さい断片サイズにせん断する必要がある。ＨＭＷ ＤＮＡのせん断は、通常は、ネイティブ末端を喪失する結果となる。裸のものであるか、クロマチンに結合されているかを問わず、任意のサイズのＤＮＡだが、元のＤＮＡ分子のオーバーハングに関する情報を保持しているＤＮＡを、ショートリードシーケンサーでシーケンシングするためのオリゴヌクレオチドアダプターおよび方法を、下で提供する。そのようなアダプターおよび方法は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのＤＮＡ（ＦＦＰＥ ＤＮＡ）、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ内因性手段（ＵＶ、メチル化、嵩高い付加物など）により損傷されたＤＮＡ、ならびに細胞培養抽出物からのＤＮＡを含むがこれらに限定されない、天然に約５００ｂｐより大きいＤＮＡのオーバーハング情報を解析するためのハイスループット法に有用であり得る。他の使用としては、細胞培養でｉｎ ｖｉｔｒｏでのまたはｉｎ ｖｉｖｏでの、医療用に設計されたＤＮＡ損傷剤および化学療法剤の照合；現行のＴＵＮＥＬアッセイの代替；新規ヌクレアーゼのスクリーニングなどを挙げることができる。
第１の方法を図１１に示す。それらのネイティブ断片長のＤＮＡ分子は、オーバーハング長情報を有する第１の非リン酸化縮重バーコード化アダプター（例えば、Ｐ７アダプタ－）がリン酸化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）にライゲーションされる、部分的シーケンシングライブラリー調製を経る。アダプターダイマーの発生を阻止するためのおよびアダプターの変化の防止するための任意の好適な修飾を使用して、第１のアダプター（例えば、Ｐ７アダプター）を修飾することができる（例えば、図１２を参照されたい）。
ライゲーションされていないアダプターを除去するための適切な固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）クリーンアップ後、ライゲーションされたアダプターは、上記のある特定の実施例で説明したようなリン酸化およびニック修復を経る。部分的な第１のアダプター（例えば、Ｐ７アダプター）戦略を使用する場合、アダプターを（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用して）フィルインする。アダプターダイマーを除去するための適切なＳＰＲＩクリーンアップ後、機械的または酵素的方法を使用してＤＮＡをショートリードシーケンサー用の適切なシーケンシング長にせん断する。次いで、ＤＮＡ分子は、好適な末端修復およびＡテーリング手法を使用する末端修復およびＡテーリングを経る。Ａテーリング後、正しい末端に５’リン酸化修飾および他方の遊離末端にライゲーションを遮断する修飾を有する、修飾された第２のアダプター（例えば、修飾Ｐ５アダプター）を、残存するＤＮＡ断片にライゲーションする。
次いで、第１および第２のアダプターに従って設計したプライマーを使用して、ライブラリーをＰＣＲ増幅する（例えば、Ｐ５／Ｐ７増幅戦略）。この戦略は、最終プール内の修飾された第１のアダプター（例えば、Ｐ７アダプター）を有する分子のみを増幅するので、ネイティブＤＮＡオーバーハングの濃縮を確実にする。第１のアダプター（例えば、Ｐ７アダプタ－）のみが修飾されるこの戦略は、アッセイにおいて仕様に従ってＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーのリード２で読み取られる正しいライゲーションイベントの濃縮も確実にする。
第２の方法を図１４に示す。高分子量ＤＮＡ分子の末端を捕捉するこの方法は、裸のＤＮＡを用いてまたはクロマチン結合ＤＮＡを用いて行うことができる。まず、オーバーハングＹ－アダプターのプールを遊離ｄｓＤＮＡ末端にライゲーションする。オーバーハングＹ－アダプターを遮断することができる（例えば、Ｃ３スペーサーを使用する；遮断修飾を図１４にＸにより示す）。次いで、ＤＮＡをせん断する（クロマチン結合ＤＮＡの場合、ＤＮＡをせん断前にプロテイナーゼＫで処理する）。ＤＮＡをシーケンシングに好適なサイズに断片化した後、末端修復ステップ（Ａテーリングを伴うまたは伴わない）を行い、専用アダプター（例えば、専用Ｐ５アダプター；図１４では特別なショーティＰ５＊と呼ばれる）を新たに遊離した末端にライゲーションして、正しく形成された分子を濃縮することにより、ライブラリーを完成する。せん断に適応できるものより短いＤＮＡは、それでもやはりライブラリー分子を構成することになる－しかし、通常の（すなわち、専用でない）アダプターおよび対応するバーコードを両側に有することになる。切断産物は、平滑末端修復およびＡテーリングを行う末端修復プロセスを経ることがある。このステップには、市販の酵素ミックスを使用することができる。そのような酵素ミックスは、５’リン酸化を行うポリヌクレオチドキナーゼ、５’フィルインを行うポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ポリメラーゼ）、３’→５’エキソヌクレアーゼを伴う酵素（例えば、Ｔ４ポリメラーゼ）、およびＡテーリングを行うポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を含み得る。
専用アダプター（例えば、専用Ｐ５アダプター）は、長い鎖の相補配列（例えば、Ｐ５）が、アニールされた状態を継続するのに十分な長さであるが、インデックスＰＣＲ中に増幅されるには短すぎ、したがって、１本の鎖のみが正しく形成され、コピーされることになるように、設計する。オーバーハングからの情報は、それがＰ７側にある場合、考慮される。したがって、その鎖は濃縮される。専用アダプター（例えば、専用Ｐ５アダプター）は、かつてＨＭＷであった分子を認識するための固有の８ｂｐバーコードを有する。専用アダプターを遮断すること（図１４にＸにより示す）で、間違った方向での相互作用を最小にすることができる。ある特定の事例では、専用アダプターをリン酸化し、Ｃ３スペーサーで遮断する。２本の鎖のうちの１本は、Ｔオーバーハングの前にホスホロチオエート骨格修飾を有することができる（図１４を参照されたい；ホスホロチオエート骨格修飾を、専用Ｐ５アダプターのプールにアスタリスク「＊」により示す）。
専用Ｐ５アダプターの例としては、以下のヌクレオチド配列が挙げられる：
この方法の予備検査を行い、結果は、この方法が高分子量ＤＮＡ分子の末端をうまく捕捉することを示した。
（実施例１１）
断片化ＤＮＡのネイティブ末端を特徴付けるためのＮＧＳライブラリー調製方法
この実施例では、断片状ＤＮＡ末端のネイティブな状態についての包括的情報を提供する、ライゲーションに基づく次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーアプローチを説明する。標準的なＤＮＡ末端修復ステップを省略することにより、この方法を使用して生成されるライブラリーは、カスタムシーケンシングアダプターを使用して各分子末端での切断のタイプをコードすることができる。このライブラリー調製方法の最終結果は、ゲノムワイドなヌクレオチド分解能のＤＮＡ断片化を提供する、ハイスループットＮＧＳアッセイである。Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）シーケンシングライブラリーを生成するこの方法は、存在する場合には各々の元の鋳型分子上に存在する一本鎖オーバーハングのタイプ（３’、５’または平滑形）および長さならびに存在する場合には各ＤＮＡ断片上の残存オーバーハングの長さおよび配列をコードする固有識別子を、シーケンシングアダプターに導入する。この方法の精度を、１）既知一本鎖オーバーハングを有する対照オリゴの集団、および２）特異的制限酵素からのＤＮＡ消化産物を使用して、実証する。Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、ＮＥＢ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ、ＤＮａｓｅＩ、およびミクロコッカスヌクレアーゼを使用する一般的な機械的および酵素的せん断方法により生成されたｄｓＤＮＡ断片のネイティブ末端の分布も記載する。最後に、この方法を使用して、ヒト血液を採取する一般的な手順が、循環無細胞ＤＮＡ断片を血液中に存在するヌクレアーゼによる分解から保護するそれらの能力の点で異なることを示す。
材料および方法
核酸鋳型獲得および調製
ランダム配列生成装置を使用して５０％ＧＣ含有量で合成対照オリゴ（表２）を設計し、公開データベースの任意の公知生物とマッチする配列を除去した。各対照分子（ｎ＝１２）は、１つの平滑末端と、ランダム配列、長さ１～６ヌクレオチド、の１つの３’または５’一本鎖オーバーハングとを有する、二本鎖ＤＮＡの固有の５０ｂｐ配列である。各対照は、固有の配列であるため、オリゴの構造を示すそれ自体のバーコードとして役立つ。オリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものであり、すべてのランダムヌクレオチドを、合成の偏りを低減させるために「手で混合」した。対照オリゴを等モル比で一緒にプールした。アダプターライゲーションの前に、３７℃で３０分間インキュベートされ、その後、１０分間、６５℃で熱不活性化される迅速エビアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用する２０μｌ反応で、１ｐｍｏｌ以下のプールした対照オリゴを脱リン酸化した。次いで、この熱不活性化される２０μｌのエビアルカリホスファターゼ反応を、ＡＴＰを補充したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して４０μｌにすることにより、対照オリゴを５’リン酸化した。このリン酸化反応を３７℃で３０分間行い、その後、６５℃で３０分間の熱不活性化ステップを行った。その結果、オリゴは、アダプターライゲーションのための準備が整った状態になった。オリゴ濃度は、４０μｌで割ったオリゴ投入量ｐｍｏｌを使って算出した。

ＮＡ１２８７８ ｇＤＮＡをコリエル医学研究所（Coriell Institute for Medical
Research）から購入し、いくつかの方法でアダプターライゲーション用に調製した。機械的せん断：Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）および製造業者の使用説明書を使用して、ＮＡ１２８７８を長さ代表値３５０ｂｐにせん断した。次いで、せん断されたＤＮＡを、Ｐｉｐｐｅｎ Ｐｒｅｐ用色素不含２％ゲル（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して２００～６００ｂｐからサイズ選択した。制限酵素消化：１μｇのＮＡ１２８７８を、１０単位のＭｌｕＣＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、３７℃で１時間、５０μｌ反応で消化した。消化されたＤＮＡを、２×ＡＭＰＵＲＥビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。精製後、ＤＮＡを、Ｐｉｐｐｅｎ Ｐｒｅｐ用色素不含２％ゲル（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および製造業者の使用説明書を使用して２００～６００ｂｐからサイズ選択した。酵素的せん断：ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、３７℃で２５分間、２０μｌ反応で１μｇのＮＡ１２８７８を消化し、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで停止させた。次いで、反応を５０μｌにし、上記のように精製した。ＤＮａｓｅ Ｉ：０．０１単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、３７℃で１０分間、５０μｌ反応で１μｇのＮＡ１２８７８を消化し、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで停止させ、ＤＮＡを上記のように精製した。ミクロコッカスヌクレアーゼ：２単位のミクロコッカスヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、３７℃で５分間、５０μｌ反応で１μｇのＮＡ１２８７８を消化し、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで停止させ、ＤＮＡを上記のように精製した。
すべてのＮＡ１２８７８反応：上記方法のいずれかを使用してＮＡ１２８７８ ｇＤＮＡを調製した後、それを、対照オリゴについて上で詳述したのと同じプロトコールを使用する脱リン酸化、続いての５’リン酸化によって、アダプターライゲーション用に末端調製した。
ヒト血漿および無細胞ＤＮＡ調製のために、匿名化されたドナーからの全血をｉｎ ｖｉｔｒｏ研究使用のためにＰａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡのスタンフォード献血センター（Stanford Blood Center）から入手した。血液をいくつかのチューブタイプのうちの１つ
に採取した（表３）。採血チューブを１８００ｇで１０分間、４℃で回転させることにより、全血から血漿を抽出した。細胞層を乱すことなく、上清の２ｍｌアリコートを無菌条件下で微量遠心チューブに移し、１６０００ｇで１０分間、４℃で再び回転させて、細胞デブリを除去し、１ｍｌアリコートとして－８０℃で保管した。循環無細胞ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、１ｍｌの血漿からｃｆＤＮＡを抽出した。精製されたｃｆＤＮＡを、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ高感度ｄｓＤＮＡアッセイキットおよびＱｕｂｉｔ蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）濃度について測定した。精製されたｃｆＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ４２００ならびに関連Ｄ１０００およびＤ５０００高感度製品を使用して、サイズ分布について解析した。無細胞ＤＮＡを、対照オリゴについて上で詳述したのと同じプロトコールを使用する脱リン酸化、続いての５’リン酸化によって、アダプターライゲーション用に末端調製した。
対照スパイク実験のために、おおよそ４０ｍｌの全血をドナーごとに５本の採血チューブ（表３）に採取した。各チューブからの血液を３つのアリコートに分けた。オーバーハングプロファイルに対する血中ヌクレアーゼの効果を正確に評価するために、対照オリゴのプール（全血１ｍｌ当たり合計１ｐｍｏｌ）を無菌条件下で添加した。血清チューブの場合、凝固が採血時から開始するため、血餅を実験開始時に分離し、対照オリゴプールを血清調製前に１ｍｌの上清に添加した。血漿－オリゴ混合物を０、４または２４時間インキュベートした。各時点の直後に、血漿抽出およびｃｆＤＮＡ調製を、上で説明したプロトコールに従って行った。水および１×ＰＢＳ ｐＨ７．４を、対照オリゴの代わりに用いる陰性対照として使用し、全血アリコートと同様にＤＮＡ抽出を行った。ビーズ結合緩衝剤、プロテイナーゼＫおよび磁気ビーズ体積を、投入する血漿の体積に従って増減させた。対照をスパイクしたｃｆＤＮＡのＤＮＡ末端調製を上で説明したように行い、その後、ライブラリー調製を行った。
アダプターライゲーションおよびシーケンシングライブラリー調製
各アダプターは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー特異的プライミング部位と、固有末端識別子（ＵＥＩ）－存在する場合には元の分子に存在するオーバーハングの長さおよび正体（５’または３’）を示すバーコード配列－とを含有する（表４）。アダプターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものである。この研究のための１３のアダプターセットは、３’オーバーハング（長さ１～６ｎｔ）を有する６つと、５’オーバーハング（長さ１～６ｎｔ）を有する６つと、単一の平滑形アダプター（すなわち、オーバーハングなし）とを含む。アダプターをリン酸化せず、かくてアダプターによるダイマー形成を阻止した。１３すべての二重鎖アダプターを等モル比でプールし、１ｐｍｏｌのプールアダプター、１０単位の迅速エビアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１×Ｃｕｔｓｍａｒｔ緩衝剤を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、１０分間、６５℃で熱不活性化する、２０μｌ反応を使用する末端脱リン酸化により、ライゲーション用に調製した。単一のＱＩＡＱＵＩＣＫ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で複数の脱リン酸化反応物を併せ、製造業者の使用説明書に従って精製した。ＤＮＡ濃度（Ｑｕｂｉｔ蛍光定量）および既知の長さを使用して、アダプターモル濃度を算出した。その結果、アダプターは、ライゲーションのための準備が整った状態であった。

アダプターライゲーションは、最初のライゲーションステップ、その後、インデックスＰＣＲの前に後続のニック修復ライゲーションステップを含む。０．０５ｐｍｏｌの基質ＤＮＡ（対照／ＮＡ１２８７８／ｃｆＤＮＡ）を、８００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて６０μｌのライゲーション反応で１ｐｍｏｌのアダプターと結合させ、２０℃で１時間インキュベートし、その後、対照オリゴについての２×ＡＭＰＵＲＥクリーンまたはＮＡ１２８７８もしくはｃｆＤＮＡについての１．２×ＡＭＰＵＲＥクリーンのどちらかを行った。ＤＮＡ精製後、ＤＮＡを、４８．８μｌの反応で、２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）および１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤でリン酸化し、３７℃でインキュベートした。３０分後、４８０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを反応に添加し、温度を１５分間、２０℃に低下させた。ニック修復の後、２×ＡＭＰＵＲＥビーズクリーン、および２０μｌの低ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）での溶出を行った。
インデックスＰＣＲのために、アダプターにライゲーションされ、精製された１０μｌのＤＮＡを、５０μｌ反応で、１×カッパＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）および最終濃度０．４ｍＭのＩＳ４および最終濃度０．４ｍＭのインデックスプライマー２と結合させ、次の熱サイクル条件を使用して増幅した：初期変性のために９８℃で３分間、続いて、９８℃で２０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を対照／ＮＡ１２８７８について１５サイクルまたはｃｆＤＮＡについて１８サイクル、最後に７２℃で１分の伸長ステップ。インデックスＰＣＲ後、ＤＮＡを、対照オリゴについての１．５×ＡＭＰＵＲＥクリーンまたはＮＡ１２８７８／ｃｆＤＮＡについての１．２×ＡＭＰＵＲＥクリーンのどちらかで精製した。各シーケンシングＤＮＡライブラリーについて、断片長分布およびｄｓＤＮＡ濃度（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ
４２００およびＱｕｂｉｔ蛍光定量ユニット）を使用して最終モル濃度推定値を算出した。次いで、試料をプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＩＳＥＱベンチトップシーケンサーで（製造業者の使用説明書に従って）２×１５０ｂｐサイクルを１試料当たり深度おおよそ１００，０００リードペアまで実行した。
インフォマティクス解析
ＵＥＩバーコード化リードペアのマッピングは、鋳型分子が、単一の７ｎｔバーコードを加えたフォワードおよびリバースリードの長さの合計より短い場合、バイオインフォマティクス上の課題を提起する。この課題は、各リードが、そのメイトのバーコード配列にわたることがあり、ことによるとそれを超えてＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列へと及ぶこともあるため、存在する。古代ＤＮＡの分野におけるものなどの短い鋳型分子が期待される研究での１つのアプローチは、アダプター配列の除去とリードのマージを同時に行うことである。このプロセスは、配列類似性に基づいてフォワードリードとリバースリードを折り畳んで単一の配列にすること、その一方で、ＳＥＱＰＲＥＰ（github.com/jstjohn/SeqPrep）を使用して公知Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列とマッチするリードの末端をトリミングすることを含む。しかし、ＵＥＩが存在する場合、これらのマージされたリードは、両末端に７ｎｔ ＵＥＩを有することができ、末端の一方が逆補完されることになる。
マッピングを単純にするために、アダプタートリミングおよびリードのマージは、ＵＥＩ配列の存在を条件とする。各リードについて、各ペアにおけるフォワードリードおよびリバースリード両方における既知ＵＥＩの存在をチェックした。ＵＥＩには、１個以下の「Ｎ」塩基を含有することを許可したが、他の塩基ミスマッチを許可しなかった。両方のリードが既知ＵＥＩ配列を有する場合、各配列をそのメイトのＵＥＩの逆相補鎖について検索することにより、リードがマージしたかどうかをチェックした。どちらのリードもこの基準を満たさなかった場合、両方のリードは、未変化状態で出力された。リードは、それがそのメイトのＵＥＩ配列にわたる場合、アダプター配列しか含むことができないからである。両方のリードが、それらのメイトの逆補完ＵＥＩ配列を含有し、メイトのＵＥＩと遭遇する位置がマッチした場合には、両方のリードを、それらのメイトのＵＥＩと遭遇する位置で短縮化した。位置がマッチしなかった場合、両方のリードを廃棄した。
メイトのＵＥＩ配列が参照ゲノムへのマッピングに干渉しないように、マージしたすべてのリードペアを折り畳んだ配列として保存するのではなく、それらを短縮型リードペアとして保持した。比較的短い配列が期待される対照オリゴ実験のために、上記基準を使用してマージしたリードペアについての折り畳んだ配列も保存した。そのような配列について、マージした領域内の塩基には、最大で１つのミスマッチを含有することを許可した（ミスマッチ位置に選択された塩基は、より高い品質を有する塩基であったか、または同点の場合はランダムな塩基であった）。
インデックスの誤った割り当てに起因する、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング対照ＤＮＡ－ｐｈｉＸ－によるシーケンシングデータの汚染リスクを低下させるために、まず、デフォルトパラメーターでｂｗａ ｍｅｍを使用してすべての生データをｐｈｉＸゲノムとアライメントした。マッピング（ｓａｍｔｏｏｌｓ ｆａｓｔｑ－ｆ １２）されなかたリードを抽出し、下流の解析に使用した。
オーバーハングアダプターは、リバース（Ｐ７）リードではなくフォワード（Ｐ５）リードで遭遇した場合、信頼性が低いことが判明したため、解析は、オーバーハングアダプターで始まるフォワードリードを無視した。平滑形アダプターをフォワードリードでもリバースリードでも許可した。すべての場合、このフィルタリングステップを、結果を計算するときにのみ適用した（処理、マージおよびアライメントの際にすべてのリードを含めたが、フォワードリードでのオーバーハングアダプターが結果に影響を与えることを許可しなかった）。
「固有末端識別－ＵＥＩ」バーコードを使用してオーバーハングを識別するコードを使用した。アルゴリズムは、以下の特徴を含んだ：
１．オーバーハングのタイプおよび長さを示すかまたは平滑末端を示すＵＥＩバーコード配列のリストを含有するデータ構造；
２．各リードの最初の７塩基（７＝バーコードの長さ）を使う；
３．これらが公知バーコードとマッチするかどうかを確かめる；
４．Ｎが１つあった場合、それを塩基に変換することによって、それが公知バーコードとマッチするかどうかを確かめる；
５．それがバーコードとマッチした場合、バーコードにより示される塩基の数をリードから引くことによりそのバーコードのオーバーハングを調べる；および
６．バーコードが平滑形である場合を除き、フォワードリードを無視する。
対照オリゴ実験
対照オリゴは、一方の末端が一本鎖オーバーハングを有するように合成され、他方の末端が平滑形であるように意図された、合成二本鎖ＤＮＡの短い（５０ｂｐ）配列であった。処理の際、すべての適正に形成された配列は、対照オリゴが共に連鎖している場合を除き、上記の基準を使用してマージすると予想された。一方が感度を測定するためのものであり、他方が特異度を測定するためのものである、対照オリゴ実験を評定する２つ方法を定義した。
感度を測定するためにアダプターを使用して正しく識別される妥当な（非連鎖）対照オリゴ末端のパーセントを計算した。最初に、上記の基準を使用してマージしたすべてのリードを考慮した。リードペアをマージしているときにミスマッチ塩基に遭遇した場合、より高い品質スコアを有する塩基を選択し、品質スコアが同点であった場合、塩基をランダムに選択した。次に、すべての対照オリゴ配列およびそれらの逆相補鎖を含む、参照配列を構築し、最長対照オリゴオーバーハングと長さが等しい「Ｎ」塩基の実行により分離した。マージしたリード各々の対照オリゴタイプを決定するために、マージしたリードとこの参照配列とを、Ｅｄｌｉｂ Ｃ＋＋配列アライメントライブラリーを使用して、アライメントにおけるリードの最初と最後にギャップを許可し、かつ１塩基以下のミスマッチを許可することで、「Ｎ」をペナルティーなしで任意の塩基にマッチさせて、アライメントした。最良のアライメントが、単一の対照オリゴ配列（非キメラアライメント）の座標内に入った場合、その対照オリゴを正しい配列として選択した。対照オリゴは、正しいオーバーハングのバーコードがそのオリゴのオーバーハング末端にライゲーションされ、平滑形アダプターのバーコードが反対側の末端にライゲーションされた場合、正しいと考えた。
特異度を測定するために、マッチするオーバーハングを有する対照オリゴの正しい末端にライゲーションされたＵＥＩ配列のパーセントを計算した。この場合、対照オリゴが連鎖を形成するかどうかを評定せず、したがって、ライゲーションに利用可能なあらゆるＤＮＡ末端を評定した。すべてのペアエンドリード（上で説明したように短縮されているが、マージしていない）について、ＵＥＩに続く配列を、最長オーバーハングと長さが等しい「Ｎ」塩基の実行により分離したすべての対照オリゴ配列を含有する参照配列と、アライメントした。アライメントが非キメラである（単一対照オリゴ配列の座標内にある）場合、１つ以下のミスマッチ許可し、任意の塩基とマッチする「Ｎ」を用いる、最良のアライメントを使用して、正しい対照オリゴ配列を決定した。その際、特異度を、リードの最初にあるＵＥＩの後に正しいタイプの対照オリゴ末端が正しい方向で続くリードのパーセントと定義した。
オーバーハング配列のヌクレオチド組成を決定するために、ＵＥＩ配列の末端と対照オリゴ配列の始点の間のすべての塩基を、オーバーハングの真の配列であると見なした。オーバーハング配列の塩基組成を評定するとき、すべてのアダプターを正しいタイプの対照オリゴにライゲーションする必要があった。
ヒトＤＮＡ
フィルタリング後に残存するペアエンドリードを、必要に応じて短縮化し、ＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードしたｈｇ１９ヒト参照ゲノムとアライメントした。アライメントには、リードの最初のＵＥＩ配列をスキップして（－Ｂパラメーター）、デフォルトパラメーターでｂｗａ ａｌｎおよびｂｗａ ｓａｍｐｅを使用した。次いで、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｒｍｄｕｐを使用して、重複リードを除去した。リードは、キメラアライメントの原因となる断片連鎖の可能性のため正しい対合の要件（ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ－ｃ－ｆ６４－ｑ２０）が外される制限酵素実験の場合を除いて、２０の最小マップ品質（ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ－ｃ－ｆ６６－ｑ２０）で正しいペアの状態にあったときにマッピングされた場合にのみ計数した。
マッピングされたリードにおけるＵＥＩタイプを計数するために、ＨＴＳＬｉｂのＢＡＭパーサーを使用してＢＡＭファイルをスキャンし、ＢＣタグからＵＥＩ配列を得た。オーバーハング配列は、ＵＥＩにより示されるオーバーハング長と等しい各リードの最初の部分からの塩基の数を使うことによって得た。
一部のシーケンシングライブラリーは、対照オリゴをスパイクしたヒトＤＮＡを含有した。これらのライブラリーを解析するために、すべてのシーケンシングリードを、最初は、ライブライーがヒトＤＮＡのみを含有するかのごとく処理した。次いで、非ヒト配列を、ヒト参照ゲノムとのアライメントから、マッピングされなかったリードおよびマップ品質が１０未満であるリードを（ｓａｍｔｏｏｌｓ ｆａｓｔｑとは異なり、抽出されたリード配列にバーコードを再び付加することができるカスタム手法を使用して）選択することにより抽出した。次いで、大部分が対照オリゴであったこれらのリードを、他の対照オリゴライブラリーと同様に処理した。
結果
ライブラリー構築
この実施例での方法は、ライブラリー調製ワークフロー後の断片化され、分解されたｄｓＤＮＡ末端をアッセイするものであった。この方法のための各アダプターは、次の３つの部分を含んだ：Ｐ５／Ｐ７ Ｉｌｌｕｍｉｎａに基づくシーケンシングおよびインデクスプライミング部位、７塩基対（ｂｐ）固有末端識別子（ＵＥＩ；末端のタイプをコードするバーコード）、および平滑末端、または存在する場合には、基質のオーバーハングとハイブリダイズし、ライゲーションする一本鎖オーバーハング。オーバーハングは、長さＮ（ここでは、６ヌクレオチド（ｎｔ）以下の長さ）のランダム配列の等しい比率を用いて合成した。アダプターを過剰に含めて、すべての鋳型ｄｓＤＮＡタイプが適合するアダプターを確実に利用できるようにした。このようにして、アダプターを、可能なすべての突出末端化鋳型分子とハイブリダイズするのに十分な適合配列を提供する競合反応で導入した。しかし、アダプターのオーバーハングは、自己ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの可能性を生じさせるため、アダプターダイマー形成を防止するためにアダプターのオーバーハングをリン酸化しなかった。
この方法の最初のステップの間に、鋳型ＤＮＡをポリヌクレオチドキナーゼで処理して、５’末端をリン酸化した。リン酸化を除いて、鋳型ＤＮＡ末端を変化させない。次に、２ステップライゲーションを行った。まず、５’リン酸化された鋳型ＤＮＡを、リン酸化されていないＵＥＩ含有アダプターのプールにライゲーションした。この第１のライゲーションを、両方の鋳型鎖のフォワード（Ｐ５）アダプター末端でのみ行った。次に、精製を行って、過剰な、ライゲーションされていないアダプターを除去した。最後に、アダプターの５’末端をリン酸化し、第２のライゲーションを－今度はリバース（Ｐ７）アダプター末端で－行って、ｄｓＤＮＡライブラリー分子を完成した。次いで、完全に形成された分子にインデックスを付加し、ユニバーサルＰ５プライマーおよび固有のインデックスが付加されたＰ７プライマーを使用して増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーでのペアエンドシーケンシング後、ＵＥＩを使用して、オーバーハングのタイプ、長さおよび配列により配列リードを分類した。
ＤＮＡ末端識別の精度の評定
精度
この実施例で説明するアッセイの精度を判定するために、各々の一本鎖オーバーハングの長さおよびタイプ（３’または５’）が既知である１２の合成二本鎖対照オリゴのプールを構築した。各対照オリゴは、固有の識別可能な５０ｂｐコアと、一方の側に平滑形末端、および他方の側に特定の長さ（１～６ｎｔ）の５’または３’オーバーハングという一般的な構造とを含有した。ライブラリーをシーケンシングした後、リバースリード（Ｐ７）でのＵＥＩを使用して、アダプターＵＥＩにより示されるオーバーハングが、ｄｓＤＮＡ対照鋳型上の操作されたオーバーハングと正しくマッチする頻度を比較することにより、アッセイの精度を定量化した。リバースアダプター上に存在するＵＥＩは、正しいオーバーハングを予測することに関して、両方のアダプター上に存在するＵＥＩが含まれる場合またはフォワードアダプターのみが含まれる場合よりも正確である（図１８）ため、解析をリバースリードに限定した。この現象を説明するためのモデルを図１９に提供する。
この実施例でのアッセイの特異度は、対照オリゴプールを使用して２つの方法で測定した。まず、データセットを正しく形成されたライブラリー分子（すなわち、真の対照オリゴ配列の編集距離１以内の配列を有するモノマー対照オリゴ）に限定し、正しいオーバーハングタイプおよび長さが捕捉される頻度を算出した。各対照オリゴについて、最も多く認められたアダプターＵＥＩが、検査したすべてのオーバーハングタイプ（３’および５’）および長さ（１～６ｎｔ）に関して正しいアダプターであった。しかし、ライブラリー分子のほんのわずかな画分は、それらのＵＥＩが、これらの対照オリゴの既知オーバーハング長またはタイプに対応しないことが認められた。オーバーハングのタイプおよび長さ各々に関しての全般的なＵＥＩ精度は、８４．９４％＋／－０．７２％（９５％Ｃ．Ｉ．）であった。次に、各ＵＥＩの特異度を、合成オリゴの各タイプへの各ＵＥＩアダプターのライゲーションが観測された回数を計数することにより測定した。すべての３’ＵＥＩおよび平滑形ＵＥＩについて、最もよく見られたライゲーションイベントは、正しいものであった。５’１ｎｔオーバーハング以外のすべての５’ＵＥＩについて、最もよく見られたライゲーションイベントは、正しいものであった。しかし、群としてまとめると、５’オーバーハングは、３’オーバーハングの精度より低い精度を有する。正しい長さから±１ｎｔの距離で、特に、５’１ｎｔ、５’３ｎｔおよび５’５ｎｔ対照において、誤りが最も多く発生した。
塩基組成
ライゲーション精度または効率が、オーバーハングの塩基組成による影響を受けるかどうかを判定するために、回収した一本鎖オーバーハング各々のヌクレオチド配列を、配列データおよびＵＥＩデータを使用して決定した。ライブラリーの構造のため、５’オーバーハングに存在する塩基は、挿入鋳型分子に由来し、挿入鋳型分子は、この場合は対照オリゴであり、これに対して、３’オーバーハングは、アダプター自体のＤＮＡオーバーハングに由来した。過剰なシトシンが観測された５’１ｎｔオーバーハングを除いて、各オーバーハングタイプおよび長さについてヌクレオチドの均一な分布が観測された。このシトシンの偏りが、オリゴ合成プロセスの産物であるのかどうかを評価するために、標準的な末端修復ライブラリーを、合成対照オリゴを用いて調製した（ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ＩＩ）。末端修復ステップは、ポリメラーゼ活性によって、３’オーバーハングを除去し、５’オーバーハングをフィルインするものであり、これにより合成ＤＮＡ ５’オーバーハングの塩基組成を特徴付けることができた。対照オリゴの標準的な末端修復ライブラリー内で、５’１ｎｔシトシンのリードカウントの上昇が観測された。それ故、この観測は、カスタムオリゴ合成の偏りに由来する可能性が高く、ライゲーション中に導入される偏りに由来する可能性は低い。
感度
外来ＤＮＡ分子のバックグラウンドにおいて特異的な末端タイプの存在を検出する本明細書におけるアダプターの能力を評価するために、単一の既知オーバーハング配列を有するＤＮＡを多様なオーバーハングのプールに混入する希釈系列を行った。多様な末端のプールを、ＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の音波処理（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）およびサイズ選択により作出した。単一の既知オーバーハングを有するＤＮＡを、ＮＡ１２８７８ ｇＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＣＩで消化することにより作出し、これにより配列ＡＡＴＴの５’４ｎｔオーバーハングが作出され、その後、サイズ選択を行った。
まず、音波処理鋳型からおよびＭｌｕＣＩ消化鋳型ＤＮＡから生成したライブラリーをシーケンシングして、両方の試料の末端を特徴付けた。音波処理試料についてのオーバーハング長分布（図１５、パネルＡ）は、ＤＮＡの音波処理せん断が、平滑末端の保有率、これに続く、３’１ｎｔおよび３’２ｎｔオーバーハングが過度である５’末端と３’末端の両方に存在する１～４ｎｔオーバーハングの保有率を特徴とする、非ランダムプロファイルを生じさせることを示した。ＭｌｕＣＩについては予想通り、ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡの長さ分布が、５’４ｎｔオーバーハングの圧倒的過剰を示した（図１５、パネルＢ）。
希釈系列を行うために、ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡの規定量を、音波処理ＤＮＡ試料と混合し、次いで、プールした混合物からライブラリーを生成した。プールは、ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡを１％から５０％まで含有した。５’ＡＡＴＴオーバーハングに起因する配列リードの各ライブラリー中のパーセント（図１５、パネルＣ；表５）を算出した。全体的に見れば、ライブラリープール中の既知ＭｌｕＣＩの分率と、シーケンシングしたデータ中の正しいＡＡＴＴオーバーハングを有する正しい５’４ヌクレオチドオーバーハングとして観測されたものとの間には、一致があった。ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡの分率（１００％～１０％）がより高いライブラリーは、予想されたものより少ない５’ＡＡＴＴオーバーハングを示し、これは、適合する突出鋳型末端の過多に起因する可能性が高かったが、より低い希釈ライブラリーは、既知ＭｌｕＣＩの分率のより正確な推定値を生じさせた。
次に、ＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡのいかなる濃度で５’ＡＡＴＴシグナルが喪失されるのかを推定するために、滴定量のＭｌｕＣＩ消化ＤＮＡを含有する音波処理ライブラリーを、スパイクされた５’ＡＡＴＴオーバーハングを含有しない対照音波処理ライブラリーと比較した。系列中の最低希釈度（１％ＭｌｕＣＩ）であっても、５’ＡＡＴＴオーバーハングの存在が、他のすべてのオーバーハングより多く検出された、ｐ＜０．００１（図１５、パネルＤ）。この観測は、適切な対照ライブラリーと比較したとき、この実施例でのアッセイには、ライブラリーの１％未満を構成するオーバーハングモチーフを発見するのに十分な感度があることを示す。音波処理によりせん断されたＤＮＡ末端およびＭｌｕＣＩにより消化されたＤＮＡ末端の正確なゲノム位置のマッピングは、オーバーハングのランダムな分布、および予想された５’４ｎｔオーバーハングの過多を、それぞれ示した。
一般的ＤＮＡせん断機構のオーバーハングプロファイル
高分子量ＤＮＡの断片化またはせん断は、通常は、ショートリード、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ、シーケンシングライブラリーを作出する際に必要なステップである。評判のよりＤＮＡせん断手段としては、音波処理および酵素的消化が挙げられる。音波処理による機械的せん断が、ＮＧＳライブラリーの品質を偏らせるまたは別様に影響を与えるのかどうかを詳しく調査するために、クローニングに基づくアプローチを使用して、ＤＮＡ音波処理により作出された末端を調査した研究、および標準的な末端修復ＮＧＳライブラリー中の５’オーバーハングを解析して、ＤＮＡ音波処理による非ランダムせん断の証拠を見つけた別の研究を含む、いくつかの研究により、せん断方法の帰結が比較されている。酵素的せん断の帰結を詳しく調査するために、いくつかの研究は、分子に基づく方法、マイクロアレイに基づく方法およびシーケンシングに基づく方法を使用して、ＤＮａｓｅＩの消化の優先傾向、ならびに低分解能でだがミクロコッカスヌクレアーゼの切断の優先傾向を説明している。本明細書に記載するアダプターを使用して生成されるライブラリーは、すべての遊離ＤＮＡ末端の微小構造を偏りのないハイスループットな方法で評定することができるため、この実施例で説明するアッセイを使用して、音波処理および酵素的せん断の両方によって断片化された裸のＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡのＤＮＡ末端プロファイルを特徴付けた（表６）。
音波処理
音波処理により生成されたオーバーハングをより詳細に照合するために、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒでせん断したライブラリーから生成したデータを、上で紹介したように調査した（感度セクションを参照されたい）。音波処理試料についてのオーバーハング長および配列モチーフ分布は、ＤＮＡの音波処理が、平滑末端のより高い保有率、これに、５’末端と３’末端の両方に存在する１～４ｎｔオーバーハングが続くが、３’１ｎｔおよび３’２ｎｔオーバーハングに優先傾向がある保有率を生じさせることを示した。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで音波処理したＤＮＡの塩基組成プロファイルは、１ｎｔオーバーハングが形成される場合を除いて、バランスのとれた範囲を示した。１ｎｔ ＤＳＢの存在は、ほとんどの場合、単一シトシンオーバーハングを残し、これは、５’１ｎｔオーバーハングに関して以前に観測された現象である。
酵素的せん断
酵素的せん断により生成されるオーバーハングを照合するために、ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）、ＤＮａｓｅＩおよびミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）という３つのエンドヌクレアーゼを使用して、ライブラリーを生成した。ＮＥＢ製品ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅは、ＮＧＳ ＤＮＡ断片化用に特別に設計された２つの酵素のカクテルである。ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅ消化試料からのオーバーハング長分布は、音波処理と比較して、オーバーハングを有する分子を多く生じさせ、平滑末端化された分子を少なく生じさせた。ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅはまた、ライブラリー複製物間で観測されたオーバーハング長の変動に基づいて、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒよりランダムなせん断プロファイルを生じさせた。この研究で使用したアダプターは、６ｎｔまでしか伸長しなかった。６ｎｔオーバーハングを含有する分子のせん断数は、ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅが、６ｎｔより長いオーバーハングを生じさせることを示す。ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅオーバーハングのモチーフ分布は、５’オーバーハングの生成と３’オーバーハングの生成間で等しい分布を示した。ｄｓＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅオーバーハングの塩基組成は、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒのものに類似していたが、長さ２ｎｔ～６ｎｔのオーバーハングにはより多くのシトシンがあった。
次に、エンドヌクレアーゼＤＮａｓｅＩおよびミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）により生成されたオーバーハングを照合した。ＤＮａｓｅＩで消化された裸のＤＮＡについてのオーバーハング長プロットは、３’２ｎｔオーバーハングはもちろん、５’２ｎｔ～４ｎｔオーバーハングの保有率も示した。後者のうち、ヌクレオチドが３つまたはそれより多いオーバーハングは、ＧＣリッチであった。オーバーハング長分布プロットにおける６ｎｔオーバーハングの相対存在量に基づいて、ＤＮａｓｅＩは、６ｎｔを超える長さのオーバーハングを生じさせる可能性が高い。ＤＮａｓｅＩ消化ＤＮＡのオーバーハング塩基組成プロファイルは、オーバーハングの長さが増加するにつれて５’オーバーハング中のシトシンの優先傾向の低下を示し、３’１ｎｔチミンのわずかな優先傾向を示した。ＤＮａｓｅＩ切断部位の上流のヌクレオチドの塩基組成は、５’オーバーハングの－１位にあるＡ／Ｔ部位でのＤＮＡ切断の優先傾向を示した。
ＭＮａｓｅ消化ＤＮＡについてのオーバーハング長プロット（図１６、上のパネル）は、ＭＮａｓｅには平滑形ＤＮＡ末端の作出の強い優先傾向（オーバーハングデータの３９．５％）があり、オーバーハングが長くなるとそれが徐々に低下する可能性が高いことを示した。オーバーハングが生成された場合、ＭＮａｓｅは、Ａ／Ｔリッチ５’オーバーハングの全般的優先傾向を（１ｎｔオーバーハングを除いて）示した（図１６、下のパネル）。ＭＮａｓｅ切断部位の上流のヌクレオチドの塩基組成は、ＭＮａｓｅにより生成される実際の３’オーバーハングが５’オーバーハングほどＡ／Ｔリッチではないが、３’オーバーハングの－１位が圧倒的にＡ／Ｔリッチであることを示す。
これらの結果は、この実施例で説明する方法が、様々なＤＮＡせん断方法の優先傾向および偏りを特徴付けた以前の研究のアウトカムを再現し得ることを示す。これらの結果はまた、新規ヌクレアーゼの特徴付けにこの方法を利用することの潜在的利益を強調する。
全血におけるｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ活性により生成される末端の回収
最近、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）プロファイリングは、非侵襲的出生前検査およびがん診断における使用に向けてかなりの注目を集めている。血漿からの高品質ＤＮＡの獲得は、採血自体から始まる。血液凝固または凝血は、ヌクレアーゼ活性増大に関連するプロセスであり、採血チューブ（ＢＣＴ）のタイプは、ｃｆＤＮＡ抽出物の量および品質に影響を与え得る。ここでは、一般的なＢＣＴが、どの程度ｃｆＤＮＡの完全性を維持するのかを、公知の対照オリゴ（上記）をスパイクした様々なＢＣＴから抽出したｃｆＤＮＡのライブラリーを構築することによりアッセイした。一般に使用されている抗凝固薬を含有するＢＣＴを含め（表３）、抗凝固薬のない対照チューブ（赤色キャップのチューブ；ＲＴＴ）を含めた。
上で説明したように血漿（または血清）を抽出し、ｃｆＤＮＡを単離する前に、対照オリゴを４つのチューブタイプの各々にスパイクした。対照オリゴとｃｆＤＮＡの混合物を、オリゴスパイクイン後０、４および２４時間の時点で抽出し、本明細書に記載されるアダプターを使用してライブラリーに変換した。ヌクレアーゼ活性および細胞溶解を阻害する添加剤を含有するＳｔｒｅｃｋ（登録商標）ＢＣＴ（ＳＢＣＴ）内では、ヒトｃｆＤＮＡ断片長プロファイルまたは存在量は、経時的に変化しなかった。逆に言うと、複数のヌクレオソーム断片がＹＴＴ（抗凝固薬－クエン酸塩）およびＰＴＴ（抗凝固薬－ＥＤＴＡカリウム塩）では２４時間の時点で出現し、これは、アポトーシス性細胞ｇＤＮＡを想起させた。ＲＴＴでは、複数のヌクレオソーム断片が０時間ほども早期に見られた。これは、アポトーシスプロセスが、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの放出に関連する血液凝固中に開始され得ることを示唆する。
ｃｆＤＮＡ抽出前の対照オリゴを含有する全血のインキュベーションによって、採血後に依然として活性であるヌクレアーゼに起因する既知ＤＮＡ末端の喪失または変化の量を定量化することができた。ＳＢＣＴにおいても、ＰＴＴにおいても、陰性対照においても、対照ＤＮＡ末端プロファイルの有意な喪失も変化も観測されなかった（図１７）。いずれの公知ヌクレアーゼ阻害剤も含有しないＹＴＴでは、３’オーバーハングプロファイルと５’オーバーハングプロファイル両方の変化が観測された。これらの変化は、１つまたは複数の活性な循環エキソヌクレアーゼの存在を示した（図１７）。２４時間までに、ＹＴＴでは対照オリゴの３’オーバーハングシグナルが有意に低下した。これは、３’→５’エキソヌクレアーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼよりプロセシング性が高い可能性があることを示唆する。ＲＴＴでは、３’オーバーハングカウントの完全喪失が４時間以内に観測され、かつて平滑形であった分子における新たなオーバーハングの生成により識別される、真の平滑末端の枯渇も観測された。２４時間までに、ＲＴＴでは、高活性ヌクレアーゼ環境に関して予想された通り、対照オリゴがもはや目視できなくなった。要するに、これらの観測は、この実施例で説明した方法が、ｃｆＤＮＡのオーバーハングパターンの変化を判別することおよび血液中の循環ヌクレアーゼの効果を調査するために使用することができることを示す。
（実施例１２）
オーバーハングシーケンシングデータセットの解析
試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングを（例えば、バイオインフォマティクス解析を使用して）照合して、オーバーハングの１つまたは複数の特徴を含むオーバーハングプロファイルを生成することができる（例えば、ある特定のオーバーハングタイプ（例えば、５’、３’、平滑形）の定量化、ある特定のオーバーハング長の定量化、ある特定のオーバーハング配列特徴の定量化など）。ある特定の事例では、鋳型分子の特徴を考慮することができる。オーバーハングプロファイルおよび／またはある特定の鋳型特徴に基づいて、試料の１つまたは複数の特性を判定することができる。
試料の１つまたは複数の特性を判定するために使用することができる特徴変数（例えば、オーバーハング特徴；鋳型特徴）の例を、表７に提供する。


*ジヌクレオチドの例としては、AA、AT、AC、AG、TT、TA、TC、TG、CC、CG、CA、CT、GG
、GA、GC、GTが挙げられる;トリヌクレオチドの可能な組合せ 43;テトラヌクレオチドの可能な組合せ 44
**X=上記の任意の特徴
オーバーハングデータおよび試料特性との関係についてのある特定のバイオインフォマティクス解析の例を下で説明する。
オーバーハングデータのヒートマップ
がんに罹患しているドナー（「がんドナー」）および健康なドナーからの無細胞ＤＮＡについてのライブラリーを、本明細書に記載されるＹ形オーバーハングアダプターを使用して生成した（例えば、図９Ｂに示すＹ形アダプターおよび方法を参照されたい）。ウォードの階層的クラスタリング法を使用して、各ライブラリーに存在するＤＮＡオーバーハングのシーケンシングデータからヒートマップ（図２０）を作成した。図２０に示すヒートマップの各列は、がんドナー（黒色バー）または健康なドナー（バーなし）からの単一無細胞ＤＮＡライブラリーを表す。図２０に示すヒートマップの各行は、長さ１～６ヌクレオチドの固有オーバーハング（５’または３’）を表し、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド、すなわちＣｐＧ、を含有する行（オーバーハング）を灰色バーで示す。図２０に示すヒートマップ行列内では、色が濃いほど、そのオーバーハングが占めるライブラリー内での（対数スケールで描かれた）比率が増す。より薄い色は、そのオーバーハングの枯渇を示す。
図２０に示すように、ＣｐＧ含有オーバーハングの大半は、木の一端に向かってクラスター化しており、少数のより小さいクラスターが全体にわたって存在する。がんドナーの１つの一次クラスターが観測され（図２０、左の上から２番目のクレード）、その大半（１３のうちの１２）がＧＩがんに罹患していた。これらの試料は、ＣＧ含有オーバーハングを有するライブラリーのより低いパーセント（枯渇）を示し、その一方で、健康なドナーには、ＣＧ含有オーバーハングを有するライブラリーのより高いパーセンテージ（濃縮）を有する傾向があった。このように、ＣＧ含有オーバーハングに関して、枯渇のパターンが、がん無細胞ＤＮＡライブラリーのある特定のクラスターにおいて観測された。
オーバーハング配列データを使用する機械学習アプローチ
ＣＧカウント、オーバーハング長、完全分子長、および図２１に記載の他の変数を含む、変数を用いて、ロジスティック回帰および教師あり学習アルゴリズム（サポートベクターマシン（ＳＶＭ））を実行して、がんおよび健康試料を分類した。ＳＶＭとロジスティック回帰の両方が、７５％より高い適合率および再現率（適合率－真の陽性として試料を表示するモデルの能力；再現率－すべての陽性試料を見つけるモデルの能力）で、７５％の正解率を有した。
モデルに使用した変数を図２１に提供する。再帰的特徴量削減後、異なるサブセットを用いて－これらに対して、用いる特徴セットを徐々に小さくして再帰的処理を行って－モデル作成プロセスを繰り返した後、すべての変数を最もよく動作する特徴と見なした。
ロジスティック回帰分類器（がん対健康－混同行列）
被検セットに関するロジスティック回帰分類器の予測正解率は、真陽性、偽陽性、真陰性および偽陰性の間のよりよい分割で７５％であった－正しい予測７９０＋８２３および誤った予測３０８＋２３０（図２２）。
ＳＶＭ分類器（がん対健康－分類レポートおよびＲＯＣ）
真陽性として試料を表示するモデルの能力（適合率）は７３％であり、すべての陽性試料を見つけるモデルの能力（再現率）は７８％であった。最終モデルは、データを３０％被検セットと７０％訓練セットに分割した。ｆ１スコアは、適合率と再現率との調和平均であり、サポートは、被検セットからの考慮した試料の数である。分類の正解率は、７５％であった。
ＧＩがん対健康－モデル要約
がんに罹患している患者のオッズは、オーバーハングがＣＧジヌクレオチド配列を含有する場合、１２０％増加する。がんに罹患している患者のオッズは、オーバーハングがＧＧジヌクレオチド配列を含有する場合には１０５％増加し、オーバーハングがＧＣジヌクレオチド配列を含有する場合には５０％増加する。すべての特徴変数は、最終モデルにおいて－カットオフを０．０５として－有意なｐ値、Ｐ＞｜ｚ｜、を有した。
ＧＩがん対その他（健康および他のがんを含む）－モデル要約
がんに罹患している患者のオッズは、オーバーハングがＣＧジヌクレオチド配列を含有する場合、９４％増加する。すべての特徴変数は、最終モデルにおいて－カットオフを０．０５として－有意なｐ値、Ｐ＞｜ｚ｜、を有した。
分類器の例
がん対健康





（実施例１３）
実施形態の例
下記の例は、ある特定の実施形態を説明するものであり、本技術を限定するものではない。
Ａ１．核酸ライブラリーを生成する方法であって、
（ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、ループが、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含み、
（ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
（ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
（ｉｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
（ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内のＲＮＡヌクレオチドで切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップと
を含む方法。
Ａ２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖からなる、実施形態Ａ１の方法。
Ａ３．ループが、２つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２の方法。
Ａ４．ループが、３つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２の方法。
Ａ５．ループが、４つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２の方法。
Ａ６．ループが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）から選択される１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１つの方法。
Ａ７．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ８．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ９．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１０．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１１．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１２．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１３．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１４．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１５．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１６．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ１７．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つの方法。
Ａ１８．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ１７のいずれか１つの方法。
Ａ１９．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループ、二重鎖部分、および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ａ１～Ａ１８のいずれか１つの方法。
Ａ２０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ１９のいずれか１つの方法。
Ａ２１．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つの方法。
Ａ２２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ａ２１の方法。
Ａ２３．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ａ２２の方法。
Ａ２４．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ａ２１、Ａ２２またはＡ２３の方法。
Ａ２５．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループおよび二重鎖部分を含む、実施形態Ａ１～Ａ１８のいずれか１つの方法。
Ａ２６．オリゴヌクレオチドの末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つの方法。
Ａ２７．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ａ２６の方法。
Ａ２８．ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域および少なくとも１つの一本鎖ループを含む、実施形態Ａ１～Ａ２７のいずれか１つの方法。
Ａ２９．ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域を含み、各末端に一本鎖ループを含む、実施形態Ａ１～Ａ２８のいずれか１つの方法。
Ａ３０．１つまたは複数の切断作用因子が、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内のＲＮＡヌクレオチドで切断することができ、ハイブリダイゼーション産物を二重鎖領域内で切断することができない、実施形態Ａ２８またはＡ２９の方法。
Ａ３１．１つまたは複数の切断作用因子が、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つの方法。
Ａ３２．ＲＮＡｓｅが、エンドリボヌクレアーゼである、実施形態Ａ３１の方法。
Ａ３３．ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ａ３１またはＡ３２の方法。
Ａ３４．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ａ１～Ａ３３のいずれか１つの方法。
Ａ３５．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ａ１～Ａ３４のいずれか１つの方法。
Ａ３６．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ａ１～Ａ３５のいずれか１つの方法。
Ａ３７．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ａ１～Ａ３６のいずれか１つの方法。
Ａ３８．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ａ１～Ａ３７のいずれか１つの方法。
Ａ３９．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ａ１～Ａ３８のいずれか１つの方法。
Ａ４０．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ａ１～Ａ３９のいずれか１つの方法。
Ａ４１．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ａ１～Ａ４０のいずれか１つの方法。
Ａ４２．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ａ４１の方法。
Ａ４３．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ａ４１またはＡ４２の方法。
Ａ４４．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ａ１～Ａ４０のいずれか１つの方法。
Ａ４５．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ａ４４の方法。
Ａ４６．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ａ１～Ａ４５のいずれか１つの方法。
Ａ４７．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ａ１～Ａ４６のいずれか１つの方法。
Ａ４８．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ａ１～Ａ４７のいずれか１つの方法。
Ａ４９．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ａ１～Ａ４８のいずれか１つの方法。
Ａ５０．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ａ１～Ａ４９のいずれか１つの方法。
Ａ５１．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ａ１～Ａ５０のいずれか１つの方法。
Ａ５２．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ５１のいずれか１つの方法。
Ａ５３．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を含む薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ａ５２の方法。
Ａ５４．（ａ）の前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ５３のいずれか１つの方法。
Ａ５５．（ａ）の前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ５４の方法。
Ａ５６．（ａ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ５５のいずれか１つの方法。
Ａ５７．（ａ）の前に、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ５６の方法。
Ａ５８．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ａ１～Ａ５７のいずれか１つの方法。
Ａ５９．対象がヒトである、実施形態Ａ５８の方法。
Ａ６０．（ａ）の前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ５９のいずれか１つの方法。
Ａ６１．約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ａ６０の方法。
Ａ６２．約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ａ６０の方法。
Ａ６３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ６２のいずれか１つの方法。
Ａ６４．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ａ１～Ａ６２のいずれか１つの方法。
Ａ６５．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ６２のいずれか１つの方法。
Ａ６６．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ａ１～Ａ６２のいずれか１つの方法。
Ａ６７．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ａ６５またはＡ６６の方法。
Ａ６８．ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを、二本鎖ＲＮＡ二重鎖が消化される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ６５～Ａ６７のいずれか１つの方法。
Ｂ１．複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、ループが、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含み；
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸中のオーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
（ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物。
Ｂ２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖からなる、実施形態Ｂ１の組成物。
Ｂ３．ループが、２つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１またはＢ２の組成物。
Ｂ４．ループが、３つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１またはＢ２の組成物。
Ｂ５．ループが、４つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１またはＢ２の組成物。
Ｂ６．ループが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）から選択される１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つの組成物。
Ｂ７．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ８．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ９．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１０．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１１．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１２．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１３．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１４．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１５．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１６．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１７．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１６のいずれか１つの組成物。
Ｂ１８．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つの組成物。
Ｂ１９．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループ、二重鎖部分、および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１８のいずれか１つの組成物。
Ｂ２０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１９のいずれか１つの組成物。
Ｂ２１．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２０のいずれか１つの組成物。
Ｂ２２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｂ２１の組成物。
Ｂ２３．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｂ２２の組成物。
Ｂ２４．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｂ２１、Ｂ２２またはＢ２３の組成物。
Ｂ２５．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループおよび二重鎖部分を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１８のいずれか１つの組成物。
Ｂ２６．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｂ１～Ｂ２５のいずれか１つの組成物。
Ｂ２７．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つの組成物。
Ｂ２８．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２７のいずれか１つの組成物。
Ｂ２９．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２８のいずれか１つの組成物。
Ｂ３０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｂ１～Ｂ２８のいずれか１つの組成物。
Ｂ３１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２８のいずれか１つの組成物。
Ｂ３２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｂ１～Ｂ２８のいずれか１つの組成物。
Ｃ１．核酸末端を修飾する方法であって、
（ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、切断条件下で切断され得る１つまたは複数の切断部位を含み、
（ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
（ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖および第１のオーバーハングおよび第２のオーバーハングを含み、各オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
（ｉｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第１および第２のオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
（ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物を１つまたは複数の切断部位で切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップと；
（ｃ）切断されたハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップと
を含む方法。
Ｃ２．（ｃ）が、切断されたハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼおよび修飾ヌクレオチドとを接触させることによって、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む平滑末端化された核酸断片を形成することを含む、実施形態Ｃ１の方法。
Ｃ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、結合対のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ２の方法。
Ｃ４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ビオチンにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ２の方法。
Ｃ５．１つまたは複数の切断部位が、ウラシルおよびデオキシウリジンから選択されるヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つの方法。
Ｃ６．１つまたは複数の切断作用因子が、エンドヌクレアーゼを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５のいずれか１つの方法。
Ｃ７．１つまたは複数の切断作用因子が、ＤＮＡグリコシラーゼを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５のいずれか１つの方法。
Ｃ８．１つまたは複数の切断作用因子が、エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ７のいずれか１つの方法。
Ｃ９．１つまたは複数の切断作用因子が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を含む、実施形態Ｃ８の方法。
Ｃ１０．１つまたは複数の切断部位が、制限酵素認識部位を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つの方法。
Ｃ１１．１つまたは複数の切断作用因子が、制限酵素を含む、実施形態Ｃ１０の方法。
Ｃ１２．１つまたは複数の切断作用因子が、レアカッター制限酵素を含む、実施形態Ｃ１０の方法。
Ｃ１３．保留。
Ｃ１４．保留。
Ｃ１５．１つまたは複数の切断部位が、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つの方法。
Ｃ１６．１つまたは複数の切断部位が、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む一本鎖部分を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つの方法。
Ｃ１７．１つまたは複数の切断作用因子が、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む、実施形態Ｃ１５またはＣ１６の方法。
Ｃ１８．ＲＮＡｓｅが、エンドリボヌクレアーゼである、実施形態Ｃ１７の方法。
Ｃ１９．ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ｃ１７またはＣ１８の方法。
Ｃ２０．１つまたは複数の切断部位が、光切断性スペーサーを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つの方法。
Ｃ２１．１つまたは複数の切断作用因子が、紫外（ＵＶ）線を含む、実施形態Ｃ２０の方法。
Ｃ２２．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２１のいずれか１つの方法。
Ｃ２３．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２２のいずれか１つの方法。
Ｃ２４．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分を含み、各末端に一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２３のいずれか１つの方法。
Ｃ２５．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分を含み、各末端に一本鎖オーバーハングを含み、第１の末端の一本鎖オーバーハングが、第２の末端のオーバーハングと、長さの点で同一であり、かつ配列の点で同一である、実施形態Ｃ１～Ｃ２４のいずれか１つの方法。
Ｃ２６．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２５のいずれか１つの方法。
Ｃ２７．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２６のいずれか１つの方法。
Ｃ２８．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｃ２７の方法。
Ｃ２９．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｃ２８の方法。
Ｃ３０．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｃ２７、Ｃ２８またはＣ２９の方法。
Ｃ３１．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、平滑末端化された二重鎖部分を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３０のいずれか１つの方法。
Ｃ３２．オリゴヌクレオチドの末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｃ１～Ｃ３１のいずれか１つの方法。
Ｃ３３．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｃ３２の方法。
Ｃ３４．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｃ１～Ｃ３３のいずれか１つの方法。
Ｃ３５．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｃ１～Ｃ３４のいずれか１つの方法。
Ｃ３６．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ３５のいずれか１つの方法。
Ｃ３７．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３６のいずれか１つの方法。
Ｃ３８．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３７のいずれか１つの方法。
Ｃ３９．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３８のいずれか１つの方法。
Ｃ４０．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３９のいずれか１つの方法。
Ｃ４１．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４０のいずれか１つの方法。
Ｃ４２．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｃ４１の方法。
Ｃ４３．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｃ４１またはＣ４２の方法。
Ｃ４４．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４０のいずれか１つの方法。
Ｃ４５．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｃ４４の方法。
Ｃ４６．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４５のいずれか１つの方法。
Ｃ４７．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４６のいずれか１つの方法。
Ｃ４８．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｃ１～Ｃ４７のいずれか１つの方法。
Ｃ４９．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ｃ１～Ｃ４８のいずれか１つの方法。
Ｃ５０．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ｃ１～Ｃ４９のいずれか１つの方法。
Ｃ５１．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５０のいずれか１つの方法。
Ｃ５２．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５１のいずれか１つの方法。
Ｃ５３．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｃ５２の方法。
Ｃ５４．（ａ）の前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５３のいずれか１つの方法。
Ｃ５５．（ａ）の前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｃ５４の方法。
Ｃ５６．（ａ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５５のいずれか１つの方法。
Ｃ５７．（ａ）の前に、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｃ５６の方法。
Ｃ５８．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｃ１～Ｃ５７のいずれか１つの方法。
Ｃ５９．対象がヒトである、実施形態Ｃ５８の方法。
Ｃ６０．（ａ）の前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５９のいずれか１つの方法。
Ｃ６１．約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｃ６０の方法。
Ｃ６２．約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｃ６０の方法。
Ｃ６３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ６２のいずれか１つの方法。
Ｃ６４．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｃ１～Ｃ６２のいずれか１つの方法。
Ｃ６５．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ６２のいずれか１つの方法。
Ｃ６６．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｃ１～Ｃ６２のいずれか１つの方法。
Ｃ６７．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｃ６５またはＣ６６の方法。
Ｃ６８．ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを、二本鎖ＲＮＡ二重鎖が消化される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｃ６５～Ｃ６７のいずれか１つの方法。
Ｄ１．複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、切断条件下で切断され得る１つまたは複数の切断部位を含み；
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖および第１のオーバーハングおよび第２のオーバーハングを含み、各オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
（ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第１および第２のオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
Ｄ２．１つまたは複数の切断部位が、ウラシルおよびデオキシウリジンから選択されるヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１の組成物。
Ｄ３．１つまたは複数の切断部位が、制限酵素認識部位を含む、実施形態Ｄ１の組成物。
Ｄ４．１つまたは複数の切断部位が、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１の組成物。
Ｄ５．１つまたは複数の切断部位が、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む一本鎖部分を含む、実施形態Ｄ４の組成物。
Ｄ６．１つまたは複数の切断部位が、光切断性スペーサーを含む、実施形態Ｄ１の組成物。
Ｄ７．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ６のいずれか１つの組成物。
Ｄ８．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ７のいずれか１つの組成物。
Ｄ９．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分を含み、各末端に一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ８のいずれか１つの組成物。
Ｄ１０．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分を含み、各末端に一本鎖オーバーハングを含み、第１の末端の一本鎖オーバーハングが、第２の末端のオーバーハングと、長さの点で同一であり、かつ配列の点で同一である、実施形態Ｄ１～Ｄ９のいずれか１つの組成物。
Ｄ１１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１０のいずれか１つの組成物。
Ｄ１２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１１のいずれか１つの組成物。
Ｄ１３．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｄ１２の組成物。
Ｄ１４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｄ１３の組成物。
Ｄ１５．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｄ１２、Ｄ１３またはＤ１４の組成物。
Ｄ１６．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、平滑末端化された二重鎖部分を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１５のいずれか１つの組成物。
Ｄ１７．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｄ１～Ｄ１６のいずれか１つの組成物。
Ｄ１８．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｄ１～Ｄ１７のいずれか１つの組成物。
Ｄ１９．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１８のいずれか１つの組成物。
Ｄ２０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つの組成物。
Ｄ２１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つの組成物。
Ｄ２２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つの組成物。
Ｄ２３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つの組成物。
Ｅ１．核酸末端を修飾する方法であって、
（ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
（ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
（ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップと
を含む方法。
Ｅ２．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを第２の末端に有するオリゴヌクレオチドが、不対合修飾ヌクレオチドを第２の末端に含む、実施形態Ｅ１の方法。
Ｅ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（one or modified nucleotides）を第２の末端に有するオリゴヌクレオチドが、３’末端を有する鎖の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１またはＥ２の方法。
Ｅ４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを第２の末端に有するオリゴヌクレオチドが、５’末端を有する鎖の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１またはＥ２の方法。
Ｅ５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸中のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを遮断することができる、実施形態Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つの方法。
Ｅ６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸中のヌクレオチドへのライゲーションを遮断することができる、実施形態Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つの方法。
Ｅ７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、天然ヌクレオチドに結合することができない修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つの方法。
Ｅ８．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－塩基、ジデオキシ－塩基、逆方向ジデオキシ－塩基、スペーサー、およびアミノリンカーから選択される１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つの方法。
Ｅ９．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－塩基を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つの方法。
Ｅ１０．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－グアニン（イソ－ｄＧ）を含む、実施形態Ｅ９の方法。
Ｅ１１．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－シトシン（イソ－ｄＣ）を含む、実施形態Ｅ１０の方法。
Ｅ１２．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ジデオキシ－塩基を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つの方法。
Ｅ１３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ジデオキシ－シトシンを含む、実施形態Ｅ１２の方法。
Ｅ１４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、逆方向ジデオキシ－塩基を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つの方法。
Ｅ１５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、逆方向ジデオキシ－チミンを含む、実施形態Ｅ１４の方法。
Ｅ１６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、スペーサーを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つの方法。
Ｅ１７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、Ｃ３スペーサーを含む、実施形態Ｅ１６の方法。
Ｅ１８．（ｂ）で形成される平滑末端化された核酸断片が、修飾ヌクレオチドを含まない、実施形態Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つの方法。
Ｅ１９．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つの方法。
Ｅ２０．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１９のいずれか１つの方法。
Ｅ２１．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に少なくとも１つの不対合修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つの方法。
Ｅ２２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つの方法。
Ｅ２３．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つの方法。
Ｅ２４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｅ２３の方法。
Ｅ２５．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｅ２４の方法。
Ｅ２６．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｅ２３、Ｅ２４またはＥ２５の方法。
Ｅ２７．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、第１の末端に平滑末端を有する二重鎖部分を含み、第２の末端に少なくとも１つの不対合修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つの方法。
Ｅ２８．オリゴヌクレオチドの末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｅ１～Ｅ２７のいずれか１つの方法。
Ｅ２９．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｅ２８の方法。
Ｅ３０．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つの方法。
Ｅ３１．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つの方法。
Ｅ３２．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つの方法。
Ｅ３３．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３２のいずれか１つの方法。
Ｅ３４．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３３のいずれか１つの方法。
Ｅ３５．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３４のいずれか１つの方法。
Ｅ３６．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３５のいずれか１つの方法。
Ｅ３７．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３６のいずれか１つの方法。
Ｅ３８．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｅ３７の方法。
Ｅ３９．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｅ３７またはＥ３８の方法。
Ｅ４０．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３６のいずれか１つの方法。
Ｅ４１．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｅ４０の方法。
Ｅ４２．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４１のいずれか１つの方法。
Ｅ４３．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４２のいずれか１つの方法。
Ｅ４４．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つの方法。
Ｅ４５．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ｅ１～Ｅ４４のいずれか１つの方法。
Ｅ４６．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ｅ１～Ｅ４５のいずれか１つの方法。
Ｅ４７．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４６のいずれか１つの方法。
Ｅ４８．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４７のいずれか１つの方法。
Ｅ４９．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｅ４８の方法。
Ｅ５０．（ａ）の前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４９のいずれか１つの方法。
Ｅ５１．（ａ）の前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｅ５０の方法。
Ｅ５２．（ａ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５１のいずれか１つの方法。
Ｅ５３．（ａ）の前に、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｅ５２の方法。
Ｅ５４．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つの方法。
Ｅ５５．対象がヒトである、実施形態Ｅ５４の方法。
Ｅ５６．（ａ）の前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５５のいずれか１つの方法。
Ｅ５７．約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｅ５６の方法。
Ｅ５８．約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｅ５６の方法。
Ｅ５９．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５８のいずれか１つの方法。
Ｅ６０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ５８のいずれか１つの方法。
Ｅ６１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５８のいずれか１つの方法。
Ｅ６２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｅ１～Ｅ５８のいずれか１つの方法。
Ｅ６３．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｅ６１またはＥ６２の方法。
Ｅ６４．ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを、二本鎖ＲＮＡ二重鎖が消化される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｅ６１～Ｅ６３のいずれか１つの方法。
Ｆ１．複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
Ｆ２．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを第２の末端に有するオリゴヌクレオチドが、不対合修飾ヌクレオチドを第２の末端に含む、実施形態Ｆ１の組成物。
Ｆ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを第２の末端に有するオリゴヌクレオチドが、３’末端を有する鎖の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１またはＦ２の組成物。
Ｆ４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを第２の末端に有するオリゴヌクレオチドが、５’末端を有する鎖の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１またはＦ２の組成物。
Ｆ５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸中のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを遮断することができる、実施形態Ｆ１～Ｆ４のいずれか１つの組成物。
Ｆ６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸中のヌクレオチドへのライゲーションを遮断することができる、実施形態Ｆ１～Ｆ５のいずれか１つの組成物。
Ｆ７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、天然ヌクレオチドに結合することができない修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ６のいずれか１つの組成物。
Ｆ８．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－塩基、ジデオキシ－塩基、逆方向ジデオキシ－塩基、スペーサー、およびアミノリンカーから選択される１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ７のいずれか１つの組成物。
Ｆ９．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－塩基を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８のいずれか１つの組成物。
Ｆ１０．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－グアニン（イソ－ｄＧ）を含む、実施形態Ｆ９の組成物。
Ｆ１１．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、イソデオキシ－シトシン（イソ－ｄＣ）を含む、実施形態Ｆ９の組成物。
Ｆ１２．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ジデオキシ－塩基を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８のいずれか１つの組成物。
Ｆ１３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ジデオキシ－シトシンを含む、実施形態Ｆ１２の組成物。
Ｆ１４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、逆方向ジデオキシ－塩基を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８のいずれか１つの組成物。
Ｆ１５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、逆方向ジデオキシ－チミンを含む、実施形態Ｆ１４の組成物。
Ｆ１６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、スペーサーを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８のいずれか１つの組成物。
Ｆ１７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、Ｃ３スペーサーを含む、実施形態Ｆ１６の組成物。
Ｆ１８．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１７のいずれか１つの組成物。
Ｆ１９．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１８のいずれか１つの組成物。
Ｆ２０．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に少なくとも１つの不対合修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１９のいずれか１つの組成物。
Ｆ２１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２０のいずれか１つの組成物。
Ｆ２２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つの組成物。
Ｆ２３．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｆ２２の組成物。
Ｆ２４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｆ２３の組成物。
Ｆ２５．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｆ２２、Ｆ２３またはＦ２４の組成物。
Ｆ２６．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、第１の末端に平滑末端を有する二重鎖部分を含み、第２の末端に少なくとも１つの不対合修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２５のいずれか１つの組成物。
Ｆ２７．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｆ１～Ｆ２６のいずれか１つの組成物。
Ｆ２８．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｆ１～Ｆ２７のいずれか１つの組成物。
Ｆ２９．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２８のいずれか１つの組成物。
Ｆ３０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２９のいずれか１つの組成物。
Ｆ３１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｆ１～Ｆ２９のいずれか１つの組成物。
Ｆ３２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２９のいずれか１つの組成物。
Ｆ３３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｆ１～Ｆ２９のいずれか１つの組成物。
Ｇ１．核酸末端を修飾する方法であって、
（ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第１の末端のオーバーハングが、パリンドローム配列を含み、
（ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端にオーバーハングを含み、第２の末端のオーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有の第２の末端のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
（ｉｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
（ｉｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第２の末端のオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
（ｖ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、
（ｖｉ）第１の末端のオーバーハングが、他の第１の末端のオーバーハングとハイブリダイズし、第２の末端のオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによって環状ハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション産物とエキソヌクレアーゼとを接触させることによって、エキソヌクレアーゼ処理されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと；
（ｃ）エキソヌクレアーゼ処理されたハイブリダイゼーション産物をせん断することによって、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと；
（ｄ）オリゴヌクレオチド種における配列を含む断片を、オリゴヌクレオチド種における配列を含まない断片から分離することによって、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断され、分離されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと
を含む方法。
Ｇ２．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、結合対の第１のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１の方法。
Ｇ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ビオチンにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１またはＧ２の方法。
Ｇ４．第１の末端のオーバーハングが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ３のいずれか１つの方法。
Ｇ５．（ｄ）での分離が、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断されたハイブリダイゼーション産物と、結合対の第２のメンバーとを接触させることを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ４のいずれか１つの方法。
Ｇ６．結合対の第２のメンバーが、固体支持体にコンジュゲートされたストレプトアビジンである、実施形態Ｇ５の方法。
Ｇ７．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、ならびにこれらの組合せを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ６のいずれか１つの方法。
Ｇ８．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを第１の末端に有する、実施形態Ｇ１～Ｇ７のいずれか１つの方法。
Ｇ９．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、３’オーバーハングを第１の末端に有する、実施形態Ｇ１～Ｇ８のいずれか１つの方法。
Ｇ１０．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを第２の末端に有する、実施形態Ｇ１～Ｇ９のいずれか１つの方法。
Ｇ１１．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、３’オーバーハングを第２の末端に有する、実施形態Ｇ１～Ｇ１０のいずれか１つの方法。
Ｇ１２．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、第２の末端にオーバーハングを有さない、実施形態Ｇ１～Ｇ１１のいずれか１つの方法。
Ｇ１３．複数のオリゴヌクレオチド種が、第１の末端５’オーバーハングまたは第１の末端３’オーバーハングと、第２の末端５’オーバーハング、第２の末端３’オーバーハング、またはオーバーハングを含まない第２の末端とを独立して有する、オリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ１２のいずれか１つの方法。
Ｇ１４．第２の末端のオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ１３のいずれか１つの方法。
Ｇ１５．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有する第２の末端のオーバーハングを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ１４のいずれか１つの方法。
Ｇ１６．複数のオリゴヌクレオチド種における第２の末端のオーバーハングが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｇ１５の方法。
Ｇ１７．複数のオリゴヌクレオチド種における第２の末端のオーバーハングが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｇ１６の方法。
Ｇ１８．第２の末端のオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｇ１５、Ｇ１６またはＧ１７の方法。
Ｇ１９．オリゴヌクレオチドの末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｇ１～Ｇ１８のいずれか１つの方法。
Ｇ２０．第１の末端のオーバーハングの末端が、ハイブリダイゼーション産物において第１の末端のオーバーハングがハイブリダイズされる第１の末端を含むオリゴヌクレオチド種の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｇ１～Ｇ１９のいずれか１つの方法。
Ｇ２１．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｇ２０の方法。
Ｇ２２．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、第２の末端のオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｇ１～Ｇ２１のいずれか１つの方法。
Ｇ２３．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、第２の末端のオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択される第２の末端のオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｇ１～Ｇ２２のいずれか１つの方法。
Ｇ２４．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｇ１～Ｇ２３のいずれか１つの方法。
Ｇ２５．オリゴヌクレオチド種が、第２の末端のオーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｇ１～Ｇ２４のいずれか１つの方法。
Ｇ２６．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ２５のいずれか１つの方法。
Ｇ２７．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ２６のいずれか１つの方法。
Ｇ２８．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｇ１～Ｇ２７のいずれか１つの方法。
Ｇ２９．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｇ１～Ｇ２８のいずれか１つの方法。
Ｇ３０．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｇ２９の方法。
Ｇ３１．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｇ２９またはＧ３０の方法。
Ｇ３２．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｇ１～Ｇ２８のいずれか１つの方法。
Ｇ３３．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｇ３２の方法。
Ｇ３４．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｇ１～Ｇ３３のいずれか１つの方法。
Ｇ３５．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｇ１～Ｇ３４のいずれか１つの方法。
Ｇ３６．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｇ１～Ｇ３５のいずれか１つの方法。
Ｇ３７．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ｇ１～Ｇ３６のいずれか１つの方法。
Ｇ３８．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ｇ１～Ｇ３７のいずれか１つの方法。
Ｇ３９．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｇ１～Ｇ３８のいずれか１つの方法。
Ｇ４０．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ３９のいずれか１つの方法。
Ｇ４１．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｇ４０の方法。
Ｇ４２．（ａ）の前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ４１のいずれか１つの方法。
Ｇ４３．（ａ）の前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｇ４２の方法。
Ｇ４４．（ａ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ４３のいずれか１つの方法。
Ｇ４５．（ａ）の前に、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｇ４４の方法。
Ｇ４６．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｇ１～Ｇ４５のいずれか１つの方法。
Ｇ４７．対象がヒトである、実施形態Ｇ４６の方法。
Ｇ４８．（ａ）の前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ４７のいずれか１つの方法。
Ｇ４９．約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｇ４８の方法。
Ｇ５０．約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｇ４８の方法。
Ｇ５１．第２の末端のオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ５０のいずれか１つの方法。
Ｇ５２．第２の末端のオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｇ１～Ｇ５０のいずれか１つの方法。
Ｇ５３．第２の末端のオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１～Ｇ５０のいずれか１つの方法。
Ｇ５４．第２の末端のオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｇ１～Ｇ５０のいずれか１つの方法。
Ｇ５５．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｇ５３またはＧ５４の方法。
Ｇ５６．ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを、二本鎖ＲＮＡ二重鎖が消化される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｇ５３～Ｇ５５のいずれか１つの方法。
Ｈ１．複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第１の末端のオーバーハングが、パリンドローム配列を含み；
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端にオーバーハングを含み、第２の末端のオーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有の第２の末端のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
（ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第２の末端のオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み；
（ｄ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、
組成物。
Ｈ２．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、結合対の第１のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１の組成物。
Ｈ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ビオチンにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１またはＨ２の組成物。
Ｈ４．第１の末端のオーバーハングが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ３のいずれか１つの組成物。
Ｈ５．（ｄ）での分離が、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断されたハイブリダイゼーション産物と、結合対の第２のメンバーとを接触させることを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ４のいずれか１つの組成物。
Ｈ６．結合対の第２のメンバーが、固体支持体にコンジュゲートされたストレプトアビジンである、実施形態Ｈ５の組成物。
Ｈ７．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、ならびにこれらの組合せを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ６のいずれか１つの組成物。
Ｈ８．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを第１の末端に有する、実施形態Ｈ１～Ｈ７のいずれか１つの組成物。
Ｈ９．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、３’オーバーハングを第１の末端に有する、実施形態Ｈ１～Ｈ８のいずれか１つの組成物。
Ｈ１０．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを第２の末端に有する、実施形態Ｈ１～Ｈ９のいずれか１つの組成物。
Ｈ１１．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、３’オーバーハングを第２の末端に有する、実施形態Ｈ１～Ｈ１０のいずれか１つの組成物。
Ｈ１２．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド種が、第２の末端にオーバーハングを有さない、実施形態Ｈ１～Ｈ１１のいずれか１つの組成物。
Ｈ１３．複数のオリゴヌクレオチド種が、第１の末端５’オーバーハングまたは第１の末端３’オーバーハングと、第２の末端５’オーバーハング、第２の末端３’オーバーハング、またはオーバーハングを含まない第２の末端とを独立して有する、オリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ１２のいずれか１つの組成物。
Ｈ１４．第２の末端のオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ１３のいずれか１つの組成物。
Ｈ１５．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有する第２の末端のオーバーハングを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ１４のいずれか１つの組成物。
Ｈ１６．複数のオリゴヌクレオチド種における第２の末端のオーバーハングが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｈ１５の組成物。
Ｈ１７．複数のオリゴヌクレオチド種における第２の末端のオーバーハングが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｈ１６の組成物。
Ｈ１８．第２の末端のオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｈ１５、Ｈ１６またはＨ１７の組成物。
Ｈ１９．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、第２の末端のオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｈ１～Ｈ１８のいずれか１つの組成物。
Ｈ２０．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、第２の末端のオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択される第２の末端のオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｈ１～Ｈ１９のいずれか１つの組成物。
Ｈ２１．オリゴヌクレオチド種が、第２の末端のオーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｈ１～Ｈ２０のいずれか１つの組成物。
Ｈ２２．第２の末端のオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ２１のいずれか１つの組成物。
Ｈ２３．第２の末端のオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｈ１～Ｈ２１のいずれか１つの組成物。
Ｈ２４．第２の末端のオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１～Ｈ２１のいずれか１つの組成物。
Ｈ２５．第２の末端のオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｈ１～Ｈ２１のいずれか１つの組成物。
Ｉ１．核酸末端を修飾する方法であって、
（ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（１）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
（ｉｉ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
（ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップと
を含む方法。
Ｉ２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖からなる、実施形態Ｉ１の方法。
Ｉ３．一本鎖ループが、切断部位を含む、実施形態Ｉ１またはＩ２の方法。
Ｉ４．切断部位が、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ３の方法。
Ｉ５．ループが、２つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ４の方法。
Ｉ６．ループが、３つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ４の方法。
Ｉ７．ループが、４つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ４の方法。
Ｉ８．ループが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）から選択される１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ４～Ｉ７のいずれか１つの方法。
Ｉ９．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）を含む、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１０．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１１．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）を含む、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１２．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１３．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）を含む、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１４．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１５．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１６．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１７．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１８．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｉ４～Ｉ８のいずれか１つの方法。
Ｉ１９．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ１８のいずれか１つの方法。
Ｉ２０．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ１９のいずれか１つの方法。
Ｉ２１．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループ、二重鎖部分、および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ２０のいずれか１つの方法。
Ｉ２２．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、第１の末端にオーバーハングを含み、二重鎖部分を含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ２０のいずれか１つの方法。
Ｉ２３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ２２のいずれか１つの方法。
Ｉ２４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ２３のいずれか１つの方法。
Ｉ２５．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｉ２４の方法。
Ｉ２６．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｉ２５の方法。
Ｉ２７．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｉ２４、Ｉ２５またはＩ２６の方法。
Ｉ２８．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループおよび二重鎖部分を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ２７のいずれか１つの方法。
Ｉ２９．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、平滑末端化された第１の末端を含み、二重鎖部分を含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ２７のいずれか１つの方法。
Ｉ３０．オリゴヌクレオチドの末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｉ１～Ｉ２９のいずれか１つの方法。
Ｉ３１．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｉ３０の方法。
Ｉ３２．ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域および少なくとも１つの一本鎖ループを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ３１のいずれか１つの方法。
Ｉ３３．ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域を含み、各末端に一本鎖ループを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ３２のいずれか１つの方法。
Ｉ３４．ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域と、２本の非相補鎖を含む少なくとも１つの末端とを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ３１のいずれか１つの方法。
Ｉ３５．ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域を含み、各末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ３１およびＩ１３４のいずれか１つの方法。
Ｉ３６．ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内の切断部位おいて切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップを含む、実施形態Ｉ３～Ｉ３５のいずれか１つの方法。
Ｉ３７．ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内のＲＮＡヌクレオチドで切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップを含む、実施形態Ｉ４～Ｉ３６のいずれか１つの方法。
Ｉ３８．１つまたは複数の切断作用因子が、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内のＲＮＡヌクレオチドで切断することができ、ハイブリダイゼーション産物を二重鎖領域内で切断することができない、実施形態Ｉ３７の方法。
Ｉ３９．１つまたは複数の切断作用因子が、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む、実施形態Ｉ３６～Ｉ３８のいずれか１つの方法。
Ｉ４０．ＲＮＡｓｅが、エンドリボヌクレアーゼである、実施形態Ｉ３９の方法。
Ｉ４１．ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ｉ３９またはＩ４０の方法。
Ｉ４２．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｉ１～Ｉ４１のいずれか１つの方法。
Ｉ４３．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｉ１～Ｉ４２のいずれか１つの方法。
Ｉ４４．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｉ１～Ｉ４３のいずれか１つの方法。
Ｉ４５．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ４４のいずれか１つの方法。
Ｉ４６．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ４５のいずれか１つの方法。
Ｉ４７．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ４６のいずれか１つの方法。
Ｉ４８．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｉ１～Ｉ４７のいずれか１つの方法。
Ｉ４９．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ４８のいずれか１つの方法。
Ｉ５０．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｉ４９の方法。
Ｉ５１．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｉ４９またはＩ５０の方法。
Ｉ５２．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ４８のいずれか１つの方法。
Ｉ５３．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｉ５２の方法。
Ｉ５４．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ５３のいずれか１つの方法。
Ｉ５５．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｉ１～Ｉ５４のいずれか１つの方法。
Ｉ５６．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｉ１～Ｉ５５のいずれか１つの方法。
Ｉ５７．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ｉ１～Ｉ５６のいずれか１つの方法。
Ｉ５８．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ｉ１～Ｉ５７のいずれか１つの方法。
Ｉ５９．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｉ１～Ｉ５８のいずれか１つの方法。
Ｉ６０．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ５９のいずれか１つの方法。
Ｉ６１．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｉ６０の方法。
Ｉ６２．（ａ）の前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ６１のいずれか１つの方法。
Ｉ６３．（ａ）の前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｉ６２の方法。
Ｉ６４．（ａ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ６３のいずれか１つの方法。
Ｉ６５．（ａ）の前に、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｉ６４の方法。
Ｉ６６．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｉ１～Ｉ６５のいずれか１つの方法。
Ｉ６７．対象がヒトである、実施形態Ｉ６６の方法。
Ｉ６８．（ａ）の前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ６７のいずれか１つの方法。
Ｉ６９．約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｉ６８の方法。
Ｉ７０．約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｉ６８の方法。
Ｉ７１．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ７０のいずれか１つの方法。
Ｉ７２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｉ１～Ｉ７０のいずれか１つの方法。
Ｉ７３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｉ１～Ｉ７０のいずれか１つの方法。
Ｉ７４．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｉ１～Ｉ７０のいずれか１つの方法。
Ｉ７５．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｉ７３またはＩ７４の方法。
Ｉ７６．ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを、二本鎖ＲＮＡ二重鎖が消化される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｉ７３～Ｉ７５のいずれか１つの方法。
Ｊ１．複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（ｉ）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、または（ｉｉ）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
Ｊ２．複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖からなる、実施形態Ｊ１の組成物。
Ｊ３．一本鎖ループが、切断部位を含む、実施形態Ｊ１またはＪ２の組成物。
Ｊ４．切断部位が、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ３の組成物。
Ｊ５．ループが、２つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ４の組成物。
Ｊ６．ループが、３つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ４の組成物。
Ｊ７．ループが、４つのＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ４の組成物。
Ｊ８．ループが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）から選択される１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ４～Ｊ７のいずれか１つの組成物。
Ｊ９．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）を含む、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１０．ＲＮＡヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１１．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）を含む、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１２．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１３．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）を含む、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１４．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１５．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１６．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１７．ＲＮＡヌクレオチドが、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１８．ＲＮＡヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる、実施形態Ｊ４～Ｊ８のいずれか１つの組成物。
Ｊ１９．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ１８のいずれか１つの組成物。
Ｊ２０．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ１９のいずれか１つの組成物。
Ｊ２１．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループ、二重鎖部分、および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ２０のいずれか１つの組成物。
Ｊ２２．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、第１の末端にオーバーハングを含み、二重鎖部分を含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｊ１～Ｊ２１のいずれか１つの組成物。
Ｊ２３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ２２のいずれか１つの組成物。
Ｊ２４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ２３のいずれか１つの組成物。
Ｊ２５．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｊ２４の組成物。
Ｊ２６．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｊ２５の組成物。
Ｊ２７．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｊ２４、Ｊ２５またはＪ２６の組成物。
Ｊ２８．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、一本鎖ループおよび二重鎖部分を含む、実施形態Ｊ１～Ｊ２７のいずれか１つの組成物。
Ｊ２９．オーバーハングを含まないオリゴヌクレオチドが、平滑末端化された第１の末端を含み、二重鎖部分を含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｊ１～Ｊ２７のいずれか１つの組成物。
Ｊ３０．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｊ１～Ｊ２９のいずれか１つの組成物。
Ｊ３１．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｊ１～Ｊ３０のいずれか１つの組成物。
Ｊ３２．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｊ１～Ｊ３１のいずれか１つの組成物。
Ｊ３３．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ３２のいずれか１つの組成物。
Ｊ３４．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｊ１～Ｊ３２のいずれか１つの組成物。
Ｊ３５．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態Ｊ１～Ｊ３２のいずれか１つの組成物。
Ｊ３６．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｊ１～Ｊ３２のいずれか１つの組成物。
Ｋ１．実施形態Ｂ１～Ｂ３２のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｋ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｋ１のキット。
Ｋ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｋ１またはＫ２のキット。
Ｋ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｋ１～Ｋ３のいずれか１つのキット。
Ｋ５．１つまたは複数の切断作用因子をさらに含む、実施形態Ｋ１～Ｋ４のいずれか１つのキット。
Ｋ６．１つまたは複数の切断作用因子が、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む、実施形態Ｋ５のキット。
Ｋ７．ＲＮＡｓｅが、エンドリボヌクレアーゼである、実施形態Ｋ６のキット。
Ｌ１．実施形態Ｄ１～Ｄ２３のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｌ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｌ１のキット。
Ｌ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｌ１またはＬ２のキット。
Ｌ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｌ１～Ｌ３のいずれか１つのキット。
Ｌ５．１つまたは複数の切断作用因子をさらに含む、実施形態Ｌ１～Ｌ４のいずれか１つのキット。
Ｌ６．１つまたは複数の切断作用因子が、エンドヌクレアーゼを含む、実施形態Ｌ１～Ｌ５のいずれか１つのキット。
Ｌ７．１つまたは複数の切断作用因子が、ＤＮＡグリコシラーゼを含む、実施形態Ｌ１～Ｌ５のいずれか１つのキット。
Ｌ８．１つまたは複数の切断作用因子が、エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼを含む、実施形態Ｌ１～Ｌ７のいずれか１つのキット。
Ｌ９．１つまたは複数の切断作用因子が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を含む、実施形態Ｌ８のキット。
Ｌ１０．鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、実施形態Ｌ１～Ｌ９のいずれか１つのキット。
Ｌ１１．修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｌ１～Ｌ１０のいずれか１つのキット。
Ｌ１２．修飾ヌクレオチドが、結合対の第１のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｌ１１のキット。
Ｌ１３．修飾ヌクレオチドが、ビオチンにコンジュゲートされたヌクレオチドを含む、実施形態Ｌ１１またはＬ１２のキット。
Ｌ１４．固体支持体にコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーをさらに含む、実施形態Ｌ１２またはＬ１３のキット。
Ｌ１５．結合対の第２のメンバーが、ストレプトアビジンである、実施形態Ｌ１４のキット。
Ｍ１．実施形態Ｆ１～Ｆ３３のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｍ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｍ１のキット。
Ｍ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｍ１またはＭ２のキット。
Ｍ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｍ１～Ｍ３のいずれか１つのキット。
Ｍ５．鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、実施形態Ｍ１～Ｍ４のいずれか１つのキット。
Ｎ１．実施形態Ｈ１～Ｈ２５のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｎ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｎ１のキット。
Ｎ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｎ１またはＮ２のキット。
Ｎ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｎ１～Ｎ３のいずれか１つのキット。
Ｎ５．エキソヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｎ１～Ｎ４のいずれか１つのキット。
Ｎ６．せん断剤をさらに含む、実施形態Ｎ１～Ｎ５のいずれか１つのキット。
Ｎ７．固体支持体にコンジュゲートされた結合対のメンバーをさらに含む、実施形態Ｎ１～Ｎ６のいずれか１つのキット。
Ｎ８．結合対のメンバーが、ストレプトアビジンである、実施形態Ｎ７のキット。
Ｏ１．実施形態Ｊ１～Ｊ３６のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｏ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｏ１のキット。
Ｏ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｏ１またはＯ２のキット。
Ｏ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｏ１～Ｏ３のいずれか１つのキット。
Ｏ５．鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、実施形態Ｏ１～Ｏ４のいずれか１つのキット。
Ｏ６．１つまたは複数の切断作用因子をさらに含む、実施形態Ｏ１～Ｏ５のいずれか１つのキット。
Ｏ７．１つまたは複数の切断作用因子が、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む、実施形態Ｏ６のキット。
Ｏ８．ＲＮＡｓｅが、エンドリボヌクレアーゼである、実施形態Ｏ７のキット。
Ｐ１．核酸の集団をアッセイする方法であって、
試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングをアッセイするステップであって、それによって集団のオーバーハングプロファイルを生成するステップと；
オーバーハングプロファイルに基づいて、試料の１つまたは複数の特性を判定するステップと
を含む方法。
Ｐ２．アッセイするステップが、オリゴヌクレオチドを核酸の集団に接触させることを含む、実施形態Ｐ１の方法。
Ｐ２．１ オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有する、実施形態Ｐ２の方法。
Ｐ３．オリゴヌクレオチドが、オーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｐ２またはＰ２．１の方法。
Ｐ３．１ 各オーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｐ３の方法。
Ｐ３．２ オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｐ２～Ｐ３．１のいずれか１つの方法。
Ｐ３．３．オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｐ２～Ｐ３．１のいずれか１つの方法。
Ｐ４．試料の１つまたは複数の特性が、病状を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３．３のいずれか１つの方法。
Ｐ５．病状が、がん型またはがんの病期を含む、実施形態Ｐ４の方法。
Ｐ５．１ がん型が、消化管がんである、実施形態Ｐ５の方法。
Ｐ６．病状が、細胞死の率または様式の変化を含む、実施形態Ｐ４の方法。
Ｐ７．変化が、特定の細胞型または臓器の種類に関連する、実施形態Ｐ６の方法。
Ｐ８．試料の１つまたは複数の特性が、マイクロバイオームプロファイルを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３．３のいずれか１つの方法。
Ｐ９．試料の１つまたは複数の特性が、放射線曝露を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３．３のいずれか１つの方法。
Ｐ１０．試料の１つまたは複数の特性が、ヌクレアーゼ活性を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３．３のいずれか１つの方法。
Ｐ１１．ヌクレアーゼ活性が、核酸誘導ヌクレアーゼ活性を含む、実施形態Ｐ１０の方法。
Ｐ１２．核酸誘導ヌクレアーゼ活性が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質活性を含む、実施形態Ｐ１１の方法。
Ｐ１３．試料の１つまたは複数の特性が、トポイソメラーゼ活性を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３．３のいずれか１つの方法。
Ｐ１４．アッセイするステップの前に、酵素活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つの方法。
Ｐ１５．酵素活性が、ヌクレアーゼ活性を含む、実施形態Ｐ１４の方法。
Ｐ１６．アッセイするステップが、ハイブリダイゼーションを含み、それによってハイブリダイゼーション産物を生成する、実施形態Ｐ１～Ｐ１５のいずれか１つの方法。
Ｐ１７．アッセイするステップが、ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成することを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１６のいずれか１つの方法。
Ｐ１８．配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含む、実施形態Ｐ１７の方法。
Ｐ１９．配列リードを定量化することによって配列リード定量化をもたらすステップであって、リバース配列リードが定量化され、フォワード配列リードが定量化から除外される、ステップを含む、実施形態Ｐ１８の方法。
Ｐ２０．オーバーハングプロファイルが、リバース配列リードに従って生成される、実施形態Ｐ１８またはＰ１９の方法。
Ｐ２１．リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成するステップを含む、実施形態Ｐ１８の方法。
Ｐ２２．フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップを含む、実施形態Ｐ２１の方法。
Ｐ２３．フォワード配列リードおよびリバース配列リードについてのオーバーハングがないことを示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析するステップを含む、実施形態Ｐ２１またはＰ２２の方法。
Ｐ２４．オーバーハングプロファイルが、１つまたは複数のオーバーハング特徴を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２３のいずれか１つの方法。
Ｐ２５．１つまたは複数のオーバーハング特徴が、オーバーハング長、オーバーハングのタイプ、ジヌクレオチドカウント、トリヌクレオチドカウント、テトラヌクレオチドカウント、ジヌクレオチドパーセント、トリヌクレオチドパーセント、テトラヌクレオチドパーセント、ＧＣ含有量、オーバーハングパーセント、オーバーハングカウント、オーバーハング長パーセント、およびゲノム座標のうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ｐ２４の方法。
Ｐ２６．１つまたは複数のオーバーハング特徴が、特定のジヌクレオチドの存在を含む、実施形態Ｐ２４の方法。
Ｐ２７．１つまたは複数のオーバーハング特徴が、ＣＧジヌクレオチドの存在を含む、実施形態Ｐ２６の方法。
Ｐ２８．オーバーハングプロファイルを参照オーバーハングプロファイルと比較するステップをさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２７のいずれか１つの方法。
Ｐ２９．オーバーハングプロファイルを第２の試料の第２のオーバーハングプロファイルと比較するステップであって、第２の試料が、異なる時点での試料と同じ供給元からのものである、ステップをさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２７のいずれか１つの方法。
Ｐ３０．１つまたは複数のステップが、マイクロプロセッサーにより行われる、実施形態Ｐ１～Ｐ２９のいずれか１つの方法。
Ｐ３１．実施形態Ａ１～Ａ６８、Ｃ１～Ｃ６８、Ｅ１～Ｅ６４、Ｇ１～Ｇ５６、Ｉ１～Ｉ７６、Ｑ１～Ｑ４２、Ｔ１～Ｔ５８、およびＷ１～Ｗ５９のいずれか１つについての１つまたは複数の特徴を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２９のいずれか１つの方法。
Ｑ１．核酸末端を修飾する方法であって、
標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、ＲＮＡヌクレオチドを含む少なくとも１つのオーバーハングを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
（ｂ）標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
（ｃ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
（ｄ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、
方法。
Ｑ２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ３．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｑ１またはＱ２の方法。
Ｑ４．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ３のいずれか１つの方法。
Ｑ５．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ４のいずれか１つの方法。
Ｑ６．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ５のいずれか１つの方法。
Ｑ７．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｑ６の方法。
Ｑ８．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｑ７の方法。
Ｑ９．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｑ６、Ｑ７またはＱ８の方法。
Ｑ１０．オリゴヌクレオチドの末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｑ１～Ｑ９のいずれか１つの方法。
Ｑ１１．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、ハイブリダイゼーション産物においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｑ１０の方法。
Ｑ１２．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｑ１～Ｑ１１のいずれか１つの方法。
Ｑ１３．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｑ１～Ｑ１２のいずれか１つの方法。
Ｑ１４．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｑ１～Ｑ１３のいずれか１つの方法。
Ｑ１５．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１４のいずれか１つの方法。
Ｑ１６．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１５のいずれか１つの方法。
Ｑ１７．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１６のいずれか１つの方法。
Ｑ１８．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１７のいずれか１つの方法。
Ｑ１９．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１８のいずれか１つの方法。
Ｑ２０．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｑ１９の方法。
Ｑ２１．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｑ１９またはＱ２０の方法。
Ｑ２２．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１８のいずれか１つの方法。
Ｑ２３．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｑ２２の方法。
Ｑ２４．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ２３のいずれか１つの方法。
Ｑ２５．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ２４のいずれか１つの方法。
Ｑ２６．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｑ１～Ｑ２５のいずれか１つの方法。
Ｑ２７．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ｑ１～Ｑ２６のいずれか１つの方法。
Ｑ２８．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ｑ１～Ｑ２７のいずれか１つの方法。
Ｑ２９．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｑ１～Ｑ２８のいずれか１つの方法。
Ｑ３０．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ２９のいずれか１つの方法。
Ｑ３１．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｑ３０の方法。
Ｑ３２．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｑ３０の方法。
Ｑ３３．結合させるステップの前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ３２のいずれか１つの方法。
Ｑ３４．結合させるステップの前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｑ３３の方法。
Ｑ３５．結合させるステップの前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ３４のいずれか１つの方法。
Ｑ３６．結合させるステップの前に、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｑ３５の方法。
Ｑ３７．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｑ１～Ｑ３６のいずれか１つの方法。
Ｑ３８．対象がヒトである、実施形態Ｑ３７の方法。
Ｑ３９．結合させるステップの前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ３８のいずれか１つの方法。
Ｑ４０．約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｑ３９の方法。
Ｑ４１．約５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合される、実施形態Ｑ３９の方法。
Ｑ４２．ハイブリダイゼーション産物とＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを、二本鎖ＲＮＡ二重鎖が消化される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ４１のいずれか１つの方法。
Ｒ１．複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、ＲＮＡヌクレオチドを含む少なくとも１つのオーバーハングを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
（ｂ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
Ｒ２．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、ＲＮＡヌクレオチドからなる、実施形態Ｒ１の組成物。
Ｒ３．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｒ１またはＲ２の組成物。
Ｒ４．複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｒ１～Ｒ３のいずれか１つの組成物。
Ｒ５．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｒ１～Ｒ４のいずれか１つの組成物。
Ｒ６．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｒ１～Ｒ５のいずれか１つの組成物。
Ｒ７．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｒ６の組成物。
Ｒ８．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｒ７の組成物。
Ｒ９．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の組成物。
Ｒ１０．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｒ１～Ｒ９のいずれか１つの組成物。
Ｒ１１．オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｒ１～Ｒ１０のいずれか１つの組成物。
Ｒ１２．オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｒ１～Ｒ１１のいずれか１つの組成物。
Ｓ１．実施形態Ｒ１～Ｒ１２のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｓ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｓ１のキット。
Ｓ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｓ１またはＳ２のキット。
Ｓ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｓ１～Ｓ３のいずれか１つのキット。
Ｓ５．ＲＮＡリガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｓ１～Ｓ４のいずれか１つのキット。
Ｓ６．鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、実施形態Ｓ１～Ｓ５のいずれか１つのキット。
Ｓ７．１つまたは複数の切断作用因子をさらに含む、実施形態Ｓ１～Ｓ６のいずれか１つのキット。
Ｓ８．１つまたは複数の切断作用因子が、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む、実施形態Ｓ７のキット。
Ｓ９．ＲＮＡｓｅが、エンドリボヌクレアーゼである、実施形態Ｓ８のキット。
Ｓ１０．ＲＮＡｓｅが、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩである、実施形態Ｓ８またはＳ９のキット。
Ｔ１．核酸ライブラリーを生成する方法であって、
ａ）標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールとを結合させるステップであって、
ｉ）標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含み、
ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールが結合し、それによって結合産物の第１のセットが形成される、ステップと；
ｂ）結合産物の第１のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと；
ｃ）切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールとを結合させるステップであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の末端および第２の末端を含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含み、第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なり、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、第１の末端において、切断産物の少なくとも１つの末端に結合する条件下で、切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールが結合し、それによって結合産物の第２のセットが形成される、ステップと
を含む方法。
Ｔ１．１ ｄ）増幅条件下で、結合産物の第２のセットと２つまたはそれより多くの増幅プライマー種とを接触させることによって、増幅産物を生成するステップであって、第１のプライマー種が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のプライマー結合ドメインが、第２のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む、ステップ
をさらに含む、実施形態Ｔ１の方法。
Ｔ２．標的核酸が、５００ｂｐより大きい核酸断片を含む、実施形態Ｔ１またはＴ１．１の方法。
Ｔ３．標的核酸が、１０００ｂｐより大きい核酸断片を含む、実施形態Ｔ１またはＴ１．１の方法。
Ｔ４．（ｂ）が、結合産物の第１のセットと、結合産物を切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３のいずれか１つの方法。
Ｔ５．（ｂ）が、機械的せん断を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３のいずれか１つの方法。
Ｔ６．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ５のいずれか１つの方法。
Ｔ７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、プール内の他のオリゴヌクレオチドへの結合を遮断することができる、実施形態Ｔ６の方法。
Ｔ８．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ７のいずれか１つの方法。
Ｔ９．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、切断産物へのオリゴヌクレオチドの第２の末端の結合を遮断することができる、実施形態Ｔ８の方法。
Ｔ１０．増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ｔ１～Ｔ９のいずれか１つの方法。
Ｔ１１．シーケンシングプロセスが、短い配列リードを生成する、実施形態Ｔ１０の方法。
Ｔ１２．オリゴヌクレオチド種の第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ１１のいずれか１つの方法。
Ｔ１３．オリゴヌクレオチド種の第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ１２のいずれか１つの方法。
Ｔ１４．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｔ１２またはＴ１３の方法。
Ｔ１５．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｔ１２～Ｔ１４のいずれか１つの方法。
Ｔ１６．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ１５のいずれか１つの方法。
Ｔ１７．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｔ１６の方法。
Ｔ１８．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｔ１７の方法。
Ｔ１９．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｔ１６、Ｔ１７またはＴ１８の方法。
Ｔ２０．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の第１のセットにおいてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｔ１～Ｔ１９のいずれか１つの方法。
Ｔ２１．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、結合産物の第１のセットにおいてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｔ２０の方法。
Ｔ２２．（ｂ）の後に切断産物の末端を修復するステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ２１のいずれか１つの方法。
Ｔ２３．（ｂ）の後に切断産物の末端に１つまたは複数の不対合ヌクレオチドを付加させるステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ２２のいずれか１つの方法。
Ｔ２４．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、切断産物に付加された１つまたは複数のヌクレオチドに相補的である１つまたは複数のヌクレオチドを第１の末端に含む、実施形態Ｔ２３の方法。
Ｔ２５．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、第１の末端において、切断産物の少なくとも１つの末端とハイブリダイズする、実施形態Ｔ２４の方法。
Ｔ２６．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の第２のセットにおいてオリゴヌクレオチドが結合される切断産物の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｔ１～Ｔ２５のいずれか１つの方法。
Ｔ２７．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、結合産物の第２のセットにおいてオリゴヌクレオチドが結合される切断産物の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｔ２６の方法。
Ｔ２８．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、ネイティブ標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含まない、実施形態Ｔ１～Ｔ２７のいずれか１つの方法。
Ｔ２８．１ オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含まない、実施形態Ｔ１～Ｔ２８のいずれか１つの方法。
Ｔ２９．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｔ１～Ｔ２８．１のいずれか１つの方法。
Ｔ３０．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｔ１～Ｔ２９のいずれか１つの方法。
Ｔ３１．標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｔ１～Ｔ３０のいずれか１つの方法。
Ｔ３２．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３１のいずれか１つの方法。
Ｔ３３．オーバーハングを含む標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３２のいずれか１つの方法。
Ｔ３４．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３３のいずれか１つの方法。
Ｔ３５．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３４のいずれか１つの方法。
Ｔ３６．標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３５のいずれか１つの方法。
Ｔ３７．ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｔ３６の方法。
Ｔ３８．ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｔ３６またはＴ３７の方法。
Ｔ３９．標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３５のいずれか１つの方法。
Ｔ４０．ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｔ３９の方法。
Ｔ４１．標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ４０のいずれか１つの方法。
Ｔ４２．標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ４１のいずれか１つの方法。
Ｔ４３．標的核酸中のオーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｔ１～Ｔ４２のいずれか１つの方法。
Ｔ４４．標的核酸中のオーバーハングが、非修飾オーバーハングである、実施形態Ｔ１～Ｔ４３のいずれか１つの方法。
Ｔ４５．標的核酸が、複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、実施形態Ｔ１～Ｔ４４のいずれか１つの方法。
Ｔ４６．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｔ１～Ｔ４５のいずれか１つの方法。
Ｔ４７．標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の第１のセットを曝露するステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ４６のいずれか１つの方法。
Ｔ４８．標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の第１のセットとリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｔ４７の方法。
Ｔ４９．切断産物の末端が、それが結合されるオリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の第２のセットを曝露するステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ４８のいずれか１つの方法。
Ｔ５０．切断産物の末端が、標的核酸が結合されるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の第２のセットとリガーゼ活性を有する薬剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｔ４９の方法。
Ｔ５１．（ａ）の前に、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ５０のいずれか１つの方法。
Ｔ５２．（ａ）の前に、脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｔ５１の方法。
Ｔ５３．（ａ）の前に、オリゴヌクレオチド種の第１のプールとホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種の第１のプールを生成するステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ５２のいずれか１つの方法。
Ｔ５４．（ｃ）の前に、オリゴヌクレオチド種の第２のプールとホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第１の末端におけるオリゴヌクレオチド種の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ５３のいずれか１つの方法。
Ｔ５５．標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｔ１～Ｔ５４のいずれか１つの方法。
Ｔ５６．対象がヒトである、実施形態Ｔ５５の方法。
Ｔ５７．（ａ）の前に、標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｔ１～Ｔ５６のいずれか１つの方法。
Ｔ５８．標的核酸が、（ａ）の前に長さによって分離されない、実施形態Ｔ１～Ｔ５６のいずれか１つの方法。
Ｕ１．ａ）オリゴヌクレオチド種の第１のプールであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、第１のプールと；
ｂ）オリゴヌクレオチド種の第２のプールであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の末端および第２の末端を含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、第２のプールと
を含み；第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なる、組成物。
Ｕ２．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｕ１の組成物。
Ｕ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、プール内の他のオリゴヌクレオチドへの結合を遮断することができる、実施形態Ｕ２の組成物。
Ｕ４．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｕ１～Ｕ３のいずれか１つの組成物。
Ｕ５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、切断された標的核酸へのオリゴヌクレオチドの第２の末端の結合を遮断することができる、実施形態Ｕ４の組成物。
Ｕ６．オリゴヌクレオチド種の第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｕ１～Ｕ５のいずれか１つの組成物。
Ｕ７．オリゴヌクレオチド種の第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｕ１～Ｕ６のいずれか１つの組成物。
Ｕ８．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｔ１２またはＴ１３の組成物。
Ｕ９．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｕ６～Ｕ８のいずれか１つの組成物。
Ｕ１０．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｕ１～Ｕ９のいずれか１つの組成物。
Ｕ１１．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｕ１０の組成物。
Ｕ１２．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｕ１１の組成物。
Ｕ１３．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｕ１０、Ｕ１１またはＵ１２の組成物。
Ｕ１４．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、第１の末端に１つまたは複数の不対合ヌクレオチドを含む、実施形態Ｕ１～Ｕ１３のいずれか１つの組成物。
Ｕ１５．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、ネイティブ標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含まない、実施形態Ｕ１～Ｕ１４のいずれか１つの組成物。
Ｕ１５．１ オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含まない、実施形態Ｕ１～Ｕ１５のいずれか１つの組成物。
Ｕ１６．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｕ１～Ｕ１５．１のいずれか１つの組成物。
Ｕ１７．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｕ１～Ｕ１６のいずれか１つの組成物。
Ｕ１８．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｕ１～Ｕ１７のいずれか１つの組成物。
Ｖ１．実施形態Ｕ１～Ｕ１８のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｖ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｖ１のキット。
Ｖ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｖ１またはＶ２のキット。
Ｖ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｖ１～Ｖ３のいずれか１つのキット。
Ｖ５．切断活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｖ１～Ｖ４のいずれか１つのキット。
Ｖ６．ポリメラーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｖ１～Ｖ５のいずれか１つのキット。
Ｖ７．第１の増幅プライマー種および第２の増幅プライマー種をさらに含み、第１のプライマー種が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のプライマー種が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｖ１～Ｖ６のいずれか１つのキット。
Ｖ８．核酸増幅を行うための１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｖ１～Ｖ７のいずれか１つのキット。
Ｗ１．核酸ライブラリーを生成する方法であって、
ａ）標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第１のプールとを結合させるステップであって、
ｉ）前記標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを第１の末端に含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含み、
ｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、前記核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の前記第１のプールが結合し、それによって結合産物の第１のセットが形成される、ステップと；
ｂ）結合産物の前記第１のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと；
ｃ）前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の第２のプールとを結合させるステップであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の鎖および第２の鎖を含み、前記第１の鎖が、前記第２の鎖より短く、前記第１の鎖と前記第２の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第１の末端において相補的であり、前記第２の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第２の末端における一本鎖を含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の前記第２のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖上に第２のプライマー結合ドメインを含み、前記第１のプライマー結合ドメインと前記第２のプライマー結合ドメインが異なり、
ｉｖ）オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物の少なくとも一方の末端に結合する条件下で、前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の前記第２のプールが結合し、それによって結合産物の第２のセットが形成される、ステップと
を含む方法。
Ｗ１．１．ｄ）増幅条件下で、結合産物の前記第２のセットと２つまたはそれより多くの増幅プライマー種とを接触させることによって、増幅産物を生成するステップであって、第１のプライマー種が、前記第１のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のプライマー種が、前記第２のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む、ステップ
をさらに含む、実施形態Ｗ１の方法。
Ｗ２．前記標的核酸が、５００ｂｐより大きい核酸断片を含む、実施形態Ｗ１またはＷ１．１の方法。
Ｗ３．前記標的核酸が、１０００ｂｐより大きい核酸断片を含む、実施形態Ｗ１またはＷ１．１の方法。
Ｗ４．（ｂ）が、結合産物の前記第１のセットと、前記結合産物を切断することができる１つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３のいずれか１つの方法。
Ｗ５．（ｂ）が、機械的せん断を含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３のいずれか１つの方法。
Ｗ６．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ５のいずれか１つの方法。
Ｗ７．前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドの前記第２の末端の結合を遮断することができる、実施形態Ｗ６の方法。
Ｗ８．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、前記第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ７のいずれか１つの方法。
Ｗ９．前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、前記切断産物への前記オリゴヌクレオチドの前記第２の末端の結合を遮断することができる、実施形態Ｗ８の方法。
Ｗ１０．前記増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ｗ１～Ｗ９のいずれか１つの方法。
Ｗ１１．前記シーケンシングプロセスが、短い配列リードを生成する、実施形態Ｗ１０の方法。
Ｗ１２．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ１１のいずれか１つの方法。
Ｗ１３．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ１２のいずれか１つの方法。
Ｗ１４．オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、二重鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｗ１２またはＷ１３の方法。
Ｗ１５．オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、（１）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｗ１２～Ｗ１４のいずれか１つの方法。
Ｗ１６．前記オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｗ１２～Ｗ１５のいずれか１つの方法。
Ｗ１７．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ１６のいずれか１つの方法。
Ｗ１８．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｗ１７の方法。
Ｗ１９．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｗ１８の方法。
Ｗ２０．前記オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｗ１７、Ｗ１８またはＷ１９の方法。
Ｗ２１．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の前記第１のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｗ１～Ｗ２０のいずれか１つの方法。
Ｗ２２．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、結合産物の前記第１のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる前記標的核酸の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｗ２１の方法。
Ｗ２３．（ｂ）の後に前記切断産物の末端を修復するステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ２２のいずれか１つの方法。
Ｗ２４．（ｂ）の後に前記切断産物の前記末端に１つまたは複数の不対合ヌクレオチドを付加させるステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ２３のいずれか１つの方法。
Ｗ２５．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物に付加された前記１つまたは複数のヌクレオチドに相補的である１つまたは複数のヌクレオチドを前記第１の末端に含む、実施形態Ｗ２４の方法。
Ｗ２６．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記第１の末端において、前記切断産物の少なくとも一方の末端とハイブリダイズする、実施形態Ｗ２５の方法。
Ｗ２７．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の前記第２のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドが結合される切断産物の末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｗ１～Ｗ２６のいずれか１つの方法。
Ｗ２８．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、結合産物の前記第２のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドが結合される前記切断産物の鎖の５’末端に共有結合で連結され得る、実施形態Ｗ２７の方法。
Ｗ２９．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、ネイティブ標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含まない、実施形態Ｗ１～Ｗ２８のいずれか１つの方法。
Ｗ２９．１．オリゴヌクレオチド種の前記第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含まない、実施形態Ｗ１～Ｗ２９のいずれか１つの方法。
Ｗ３０．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上の前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｗ１～Ｗ２９．１のいずれか１つの方法。
Ｗ３１．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上の前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｗ１～Ｗ３０のいずれか１つの方法。
Ｗ３２．前記標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、実施形態Ｗ１～Ｗ３１のいずれか１つの方法。
Ｗ３３．オリゴヌクレオチド種の前記第１のプール内のオリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３２のいずれか１つの方法。
Ｗ３４．オーバーハングを含む前記標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３３のいずれか１つの方法。
Ｗ３５．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３４のいずれか１つの方法。
Ｗ３６．オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを独立して含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３５のいずれか１つの方法。
Ｗ３７．前記標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片を含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３６のいずれか１つの方法。
Ｗ３８．前記ＤＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｗ３７の方法。
Ｗ３９．前記ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ断片を含む、実施形態Ｗ３７またはＷ３８の方法。
Ｗ４０．前記標的標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）断片を含む、実施形態Ｗ１～Ｗ３６のいずれか１つの方法。
Ｗ４１．前記ＲＮＡ断片が、細胞から得られる、実施形態Ｗ４０の方法。
Ｗ４２．前記標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｗ１～Ｗ４１のいずれか１つの方法。
Ｗ４３．前記標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、実施形態Ｗ１～Ｗ４２のいずれか１つの方法。
Ｗ４４．標的核酸の前記オーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、実施形態Ｗ１～Ｗ４３のいずれか１つの方法。
Ｗ４５．標的核酸中の前記オーバーハングが、未修飾オーバーハングである、実施形態Ｗ１～Ｗ４４のいずれか１つ方法。
Ｗ４６．前記標的核酸が、前記複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さについて修飾されない、実施形態Ｗ１～Ｗ４５のいずれか１つの方法。
Ｗ４７．試料から核酸を単離することによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスにより核酸組成物を調製するステップを（ａ）の前に含む、実施形態Ｗ１～Ｗ４６のいずれか１つの方法。
Ｗ４８．前記標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされる前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の前記第１のセットを曝露するステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ４７のいずれか１つの方法。
Ｗ４９．標的核酸の末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の前記第１のセットとリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、実施形態Ｗ４８の方法。
Ｗ５０．前記切断産物の末端が、それが結合される前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の前記第２のセットを曝露するステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ４９のいずれか１つの方法。
Ｗ５１．切断産物の末端が、前記標的核酸が結合される前記オリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の前記第２のセットとリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、実施形態Ｗ５０の方法。
Ｗ５２．（ａ）の前に、前記標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ５１のいずれか１つの方法。
Ｗ５３．（ａ）の前に、前記脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する作用因子とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｗ５２の方法。
Ｗ５４．（ａ）の前に、オリゴヌクレオチド種の前記第１のプールとホスファターゼ活性を有する作用因子とを、前記オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種の第１のプールを生成するステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ５３のいずれか１つの方法。
Ｗ５５．（ｃ）の前に、オリゴヌクレオチド種の前記第２のプールとホスホリル転移活性を有する作用因子とを、５’リン酸が前記第１の鎖の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ５４のいずれか１つの方法。
Ｗ５６．前記標的核酸が、対象からの試料から得られる、実施形態Ｗ１～Ｗ５５のいずれか１つの方法。
Ｗ５７．前記対象がヒトである、実施形態Ｗ５６の方法。
Ｗ５８．（ａ）の前に、前記標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、実施形態Ｗ１～Ｗ５７のいずれか１つの方法。
Ｗ５９．前記標的核酸が、（ａ）の前に長さによって分離されない、実施形態Ｗ１～Ｗ５７のいずれか１つの方法。
Ｘ１．ａ）オリゴヌクレオチド種の第１のプールであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、第１のプールと；
ｂ）オリゴヌクレオチド種の第２のプールであって、
ｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖より短く、第１の鎖と第２の鎖が、オリゴヌクレオチドの第１の末端において相補的であり、第２の鎖が、オリゴヌクレオチドの第２の末端における一本鎖を含み、
ｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の第２のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、
（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド種の第２のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第２の鎖上に第２のプライマー結合ドメインを含む、第２のプールと
を含み；第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なる、組成物。
Ｘ２．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ１の組成物。
Ｘ３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの第２の末端の結合を遮断することができる、実施形態Ｘ２の組成物。
Ｘ４．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第２の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ１～Ｘ３のいずれか１つの組成物。
Ｘ５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、切断された標的核酸へのオリゴヌクレオチドの第２の末端の結合を遮断することができる、実施形態Ｘ４の組成物。
Ｘ６．オリゴヌクレオチド種の第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ１～Ｘ５のいずれか１つの組成物。
Ｘ７．オリゴヌクレオチド種の第１のプールが、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ１～Ｘ６のいずれか１つの組成物。
Ｘ８．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、二重鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｘ６またはＸ７の組成物。
Ｘ９．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドが、（１）２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｘ６～Ｘ８のいずれか１つの組成物。
Ｘ１０．オリゴヌクレオチドオーバーハングが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ６～Ｘ９のいずれか１つの組成物。
Ｘ１１．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、実施形態Ｘ１～Ｘ１０のいずれか１つの組成物。
Ｘ１２．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｘ１１の組成物。
Ｘ１３．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、実施形態Ｘ１２の組成物。
Ｘ１４．オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、実施形態Ｘ１１、Ｘ１２またはＸ１３の組成物。
Ｘ１５．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、第１の末端に１つまたは複数の不対合ヌクレオチドを含む、実施形態Ｘ１～Ｘ１４のいずれか１つの組成物。
Ｘ１６．オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、ネイティブ標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含まない、実施形態Ｘ１～Ｘ１５のいずれか１つの組成物。
Ｘ１６．１ オリゴヌクレオチド種の第２のプール内のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含まない、実施形態Ｘ１～Ｘ１６のいずれか１つの組成物。
Ｘ１７．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、実施形態Ｘ１～Ｘ１６．１のいずれか１つの組成物。
Ｘ１８．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内の各オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、実施形態Ｘ１～Ｘ１７のいずれか１つの組成物。
Ｘ１９．オリゴヌクレオチド種の第１のプール内のオリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、実施形態Ｘ１～Ｘ１８のいずれか１つの組成物。
Ｙ１．実施形態Ｘ１～Ｘ１９のいずれか１つの組成物と、
組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｙ２．ホスファターゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｙ１のキット。
Ｙ３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｙ１またはＹ２のキット。
Ｙ４．リガーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｙ１～Ｙ３のいずれか１つのキット。
Ｙ５．切断活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｙ１～Ｙ４のいずれか１つのキット。
Ｙ６．ポリメラーゼ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｙ１～Ｙ５のいずれか１つのキット。
Ｙ７．第１の増幅プライマー種および第２の増幅プライマー種をさらに含み、第１のプライマー種が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のプライマー種が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｙ１～Ｙ６のいずれか１つのキット。
Ｙ８．核酸増幅を行うための１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｙ１～Ｙ７のいずれか１つのキット。
Ｚ１．核酸ライブラリーを生成する方法であって、
ａ）標的核酸を含む核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸を生成するステップであって、標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含む、ステップと；
ｂ）脱リン酸化された標的核酸と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
ｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと
を含む方法。
Ｚ２．（ｂ）の前に、脱リン酸化された標的核酸物とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｚ１の方法。
Ｚ３．（ｂ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ｚ１またはＺ２の方法。
Ｚ４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ｚ１～Ｚ３のいずれか１つの方法。
Ｚ５．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｚ１～Ｚ３のいずれか１つの方法。
Ｚ６．ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成するステップであって、配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含むステップを含む、実施形態Ｚ１～Ｚ５のいずれか１つの方法。
Ｚ７．配列リードを定量化することによって配列リード定量化をもたらすステップであって、リバース配列リードが定量化され、フォワード配列リードが定量化から除外される、ステップを含む、実施形態Ｚ６の方法。
Ｚ８．リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成するステップを含む、実施形態Ｚ６の方法。
Ｚ９．フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップを含む、実施形態Ｚ８の方法。
Ｚ１０．フォワード配列リードおよびリバース配列リードについてのオーバーハングがないことを示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析するステップを含む、実施形態Ｚ８またはＺ９の方法。
Ｚ１１．実施形態Ａ１～Ａ６８、Ｃ１～Ｃ６８、Ｅ１～Ｅ６４、Ｇ１～Ｇ５６、Ｉ１～Ｉ７６、Ｑ１～Ｑ４２、Ｔ１～Ｔ５８、およびＷ１～Ｗ５９のいずれか１つについての１つまたは複数の特徴を含む、実施形態Ｚ１～Ｚ１０のいずれか１つの方法。
Ａ’１．核酸を解析する方法であって、
ａ）標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
ｉ）標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと；
ｂ）ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成するステップであって、配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含む、ステップと；
ｃ）リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成し、フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップと
を含む方法。
Ａ’２．（ｃ）が、フォワード配列リードおよびリバース配列リードについてのオーバーハングがないことを示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することを含む、実施形態Ａ’１の方法。
Ａ’３．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、２本の鎖を含み、第１の末端にオーバーハングを含み、第２の末端に２本の非相補鎖を含む、実施形態Ａ’１またはＡ’２の方法。
Ａ’４．複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ａ’１またはＡ’２の方法。
Ａ’５．（ａ）の前に、標的核酸とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸を生成するステップを含む、実施形態Ａ’１～Ａ’４のいずれか１つの方法。
Ａ’６．脱リン酸化された標的核酸とホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ’５の方法。
Ａ’７．（ａ）の前に、複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、実施形態Ａ’１～Ａ’６のいずれか１つの方法。
Ａ’８．（ｃ）が、マイクロプロセッサーを使用して行われる、実施形態Ａ’１～Ａ’７のいずれか１つの方法。
Ａ’９．実施形態Ａ１～Ａ６８、Ｃ１～Ｃ６８、Ｅ１～Ｅ６４、Ｇ１～Ｇ５６、Ｉ１～Ｉ７６、Ｑ１～Ｑ４２、Ｔ１～Ｔ５８、およびＷ１～Ｗ５９のいずれか１つについての１つまたは複数の特徴を含む、実施形態Ａ’１～Ａ’８のいずれか１つの方法。
本明細書で参照される各特許、特許出願、公報および文献の全体が、参照により組み込まれる。上記特許、特許出願、公報および文献の引用は、上述のもののいずれかが関連先行技術であることの承認ではなく、これらの公報および文献の内容または日付についてのいかなる承認にも相当しない。それらの引用は、関連する開示の検索の指示ではない。これらの文献の日付または内容に関するすべての記載は、入手可能な情報に基づくものであり、それらの正確さについて承認するものでも、それらの正当性について承認するものでもない。
本技術の基本態様から逸脱することなく、上述の事物に修飾を加えることができる。本技術を１つまたは複数の特定の実施形態に関してかなり詳細に説明したが、当業者には、本願で具体的に開示される実施形態に変更を加えることができ、それでもこれらの修飾形態および改善形態が、本技術の範囲および趣旨の範囲内であることは、認識されると予想される。
本明細書で例証して説明した本技術は、本明細書で具体的に開示していない、いずれかの要素の非存在下で好適に実施されることがある。したがって、例えば、本明細書での各事例では、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかを、他の２つの用語のどちらかで置き換えることができる。用いた用語および表現は、説明用語として使用しており、限定用語として使用しておらず、そのような用語および表現の使用は、示されているおよび説明されている特徴またはそれらの部分のいかなる均等物も除外せず、様々な修飾形態が請求項記載の本技術の範囲内で可能である。用語「ａ」または「ａｎ」は、この用語が修飾する要素の１つまたは複数の要素を、要素の１つが記載されているのか、または要素の１つより多くが記載されているのかが、文脈上明白である場合を除き、指すことができる（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つまたは複数の試薬を意味することができる）。用語「約」は、本明細書で使用される場合、基礎をなすパラメーターの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）を指し、一連の値の始めに用語「約」を使用することにより、値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム～１１０グラムの間の重量を含み得る。さらに、値のリスト（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）が本明細書に記載されている場合、このリストは、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本技術を代表実施形態および必要に応じた特徴により具体的に開示したが、本明細書で開示した概念の修飾形態および変形形態を当業者は用いることができること、ならびにそのような修飾形態および変形形態が本技術の範囲内で考えられることは、理解されるはずである。
本技術のある特定の実施形態を後続の特許請求の範囲で示す。

Claims (17)

  1. 複数のオリゴヌクレオチド種を含む組成物であって、
    ａ）前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、２本の鎖を含み；
    ｂ）前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第１の末端にオーバーハングを含むか、または前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部が、第１の末端にオーバーハングを含み、前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部が、第１の末端にオーバーハングを含まず、前記オーバーハングが、存在する場合、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、オーバーハングを有する各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し；
    ｃ）前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第２の末端に２本の非相補鎖を含み；
    ｄ）前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的なあるいはオーバーハング有さないオリゴヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
    組成物。
  2. 前記複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記複数のオリゴヌクレオチド種が、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. オーバーハングを有する前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、
    ｉ）特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む；
    ｉｉ）特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む；または
    ｉｉｉ）各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの１つまたは複数の特徴に特異的である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記オリゴヌクレオチド種の前記第２の末端の前記２本の非相補鎖の各々が、プライマー結合ドメインを含み、前記非相補鎖の一方が、第１のプライマー結合ドメインを含み、他方の非相補鎖が、第２のプライマー結合ドメインを含み、前記第１のプライマー結合ドメインと第２のプライマー結合ドメインが異なる、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 各オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、特定の長さのオーバーハングを含むか、またはオーバーハングを含まない各オリゴヌクレオチドに固有である核酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 各オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、特定の長さのオーバーハングを含むか、またはオーバーハングを含まず、オーバーハングが存在する場合、特定の５’または３’オーバーハングの方向性を含む各オリゴヌクレオチドに固有である核酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、前記第２の末端に１つまたは複数の遮断されたヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物；および
    前記組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための説明書
    を含むキット。
  13. ホスファターゼ活性を有する作用因子をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
  14. ホスホリル転移活性を有する作用因子をさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。
  15. リガーゼ活性を有する作用因子をさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキット。
  16. ニックシーリングリガーゼ活性を有する作用因子をさらに含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のキット。
  17. 鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のキット。
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