JP2021511309A - 核酸を解析するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号CBS−2001−PVにより指定される、2018年1月12に出願した米国仮特許出願第62/617,055号の利益を主張するものである。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号CBS−2001−PV2により指定される、2018年1月17に出願した米国仮特許出願第62/618,382号の利益を主張するものでもある。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号CBS−2001−PV3により指定される、2018年11月20に出願した米国仮特許出願第62/769,787号の利益を主張するものでもある。上述の出願の全内容は、本文、表および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸を解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。方法は、核酸末端を修飾するステップおよび/または解析するステップを含み得る。核酸末端は、核酸断片の末端を指す。一般に、直鎖状核酸断片は、2つの末端(すなわち、最初の部分と最後の部分)を含有する。そのような末端は、5’末端および3’末端と呼ばれることが多い。非直鎖状断片は、2つより多くの末端を含有し得る(例えば、分岐型断片は、3つまたはそれより多くの末端を含み得る)。二本鎖断片の場合、核酸末端は、オーバーハングを含有することもあり、または平滑末端化されていることもある(すなわち、オーバーハングを含有しない)。用語オーバーハングまたはオーバーハング領域は、一般に、核酸末端の一本鎖部分を指す。例えば、核酸断片は、1つまたは複数の対合ヌクレオチド(塩基)を含む二本鎖または「二重鎖」領域、および1つまたは複数の不対合ヌクレオチド(塩基)を含む一本鎖または「オーバーハング」領域を含み得る。通常は、オーバーハングは、核酸分子の末端の一本鎖領域を指し、二本鎖領域が隣接している一本鎖領域を指さない。オーバーハングは、5’オーバーハングであることもあり、または3’オーバーハングであることもある。5’オーバーハングは、二重鎖部分が終わり、一本鎖部分が始まる、接合部で開始し、オーバーハングの末端(遊離末端)で終わる、3’から5’の方向に従来の核酸方向性に従って読み取られる、核酸分子の末端の一本鎖領域を一般に指す。3’オーバーハングは、二重鎖部分が終わり、一本鎖部分が始まる、接合部で開始し、オーバーハングの末端(遊離末端)で終わる、5’から3’の方向に従来の核酸方向性に従って読み取られる、核酸分子の末端の一本鎖領域を一般に指す。
一部の実施形態では、核酸(例えば、試料からの核酸;標的核酸)は、オリゴヌクレオチドと結合される。オリゴヌクレオチドは、標的核酸とは明確に異なる核酸(例えば、DNA、RNA)ポリマーを一般に指し、オリゴ、アダプター、オリゴヌクレオチドアダプター、およびオリゴアダプターと呼ばれることがある。オリゴヌクレオチドは、短い長さ(例えば、50bp未満、40bp未満、30bp未満、20bp未満、10bp未満、5bp未満)であり得、常にではないが標的核酸より短いことがある。オリゴヌクレオチドを人工的に合成することができる。一部の実施形態では、核酸(例えば、試料からの核酸;標的核酸)は、複数のオリゴヌクレオチド種とまたはオリゴヌクレオチド種のプールと結合される。オリゴヌクレオチド種のプールは、オリゴヌクレオチド種のセットと呼ばれることがあり、複数の異なるオリゴヌクレオチド種を含むことがある。本明細書における方法および組成物は、オリゴヌクレオチド種の1つより多くのプール(例えば、オリゴヌクレオチド種の第1のプールおよびオリゴヌクレオチド種の第2のプール)を含むことがある。そのような事例では、第1のプール内のオリゴヌクレオチドは、共通の特徴を共有することができ、第2のプール内のオリゴヌクレオチドは、異なる共通の特徴を共有することができる。プール内の共通の特徴としては、特定のドメインおよび/または特定の修飾を挙げることができる。一部の実施形態では、プール内の共通の特徴は、共通のプライマー結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングがあり、第2の末端に2本の非相補鎖がある。そのようなオリゴヌクレオチドは、Y−オリゴヌクレオチド、Y−アダプター、Y形オリゴヌクレオチド、Y形アダプターなどと呼ばれることがある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド(例えば、Y−アダプター)は、2本の鎖を含み、第1の末端に平滑末端またはオーバーハングのどちらかがあり、第2の末端に2本の非相補鎖がある。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖からなる。ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドは、一般に、二本鎖「ステム」領域および一本鎖「ループ」領域を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる1本の鎖(すなわち、1本の連続鎖)を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる1本の鎖(すなわち、1本の連続鎖)から本質的になる。1本の鎖から本質的になるとは、オリゴヌクレオチドが、連続鎖の一部でない、核酸の(例えば、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした)いかなるさらなる鎖も含まないことを意味する。したがって、ここでの「から本質的になる」は、オリゴヌクレオチド中の鎖の数を指し、オリゴヌクレオチドは、鎖の数に不可欠でない他の特徴を含むことができる(例えば、検出可能な標識を含むことができる;他の領域を含むことができる)。ヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含むまたはそのような1本の鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドは、本明細書では、ヘアピン、ヘアピンオリゴヌクレオチド、またはヘアピンアダプターと呼ばれることがある。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、修飾塩基と呼ぶことができ、例えば、結合対のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチド、遮断されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、架橋核酸(BNA)ヌクレオチド、グリコール核酸(GNA)ヌクレオチド、トレオース核酸(TNA)ヌクレオチドなど、およびこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、オリゴヌクレオチドの、二重鎖領域内に、オーバーハング領域内に、一方の末端に、または両方の末端に、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、1つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、オリゴヌクレオチドの一方の末端に1つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド種は、標的核酸とハイブリダイズする末端(例えば、オリゴヌクレオチドオーバーハングを含む末端)の反対側のオリゴヌクレオチドの末端に、1つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、3’末端を有する鎖の末端に存在することもあり、または5’末端を有する鎖の末端に存在することもある。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、オリゴヌクレオチドとホスファターゼ活性を有する薬剤とを、オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種、または脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種のプールを生成するステップを含む。一般に、標的核酸および/またはオリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に(すなわち、ハイブリダイゼーションの前に)、脱リン酸化される。標的核酸は、結合させるステップの前に(すなわち、ハイブリダイゼーションの前に)、脱リン酸化され、次いでその後にリン酸化されることがある。オリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に(すなわち、ハイブリダイゼーションの前に)、脱リン酸化され、次いでその後にリン酸化されることがある。オリゴヌクレオチドは、結合させるステップの前に(すなわち、ハイブリダイゼーションの前に)、脱リン酸化され、次いでリン酸化されないことがある。核酸の脱リン酸化を行うための試薬およびキットは、公知であり、入手可能である。例えば、標的核酸および/またはオリゴヌクレオチドをホスファターゼ(すなわち、水を使用してリン酸モノエステルを切断してリン酸イオンとアルコールにする酵素)で処理することができる。
核酸断片をオリゴヌクレオチドと結合させることができ、それによって結合産物が生成される。核酸断片とオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、オーバーハングハイブリダイゼーション、ライゲーション(例えば、ハイブリダイゼーション産物のライゲーション)および平滑末端ライゲーションのうちの1つまたは複数を含み得る。結合産物は、核酸断片の一方または両方の末端でオリゴヌクレオチドに接続された(例えば、ハイブリダイズおよび/またはライゲーションされた)核酸断片を含み得る。一部の実施形態では、標的核酸をオリゴヌクレオチドと結合させることができ、それによって結合産物が生成される。一部の実施形態では、切断ステップからの産物(すなわち、切断産物)をオリゴヌクレオチドと結合させることができ、それによって結合産物が生成される。本明細書におけるある特定の方法は、結合産物のセット(例えば、結合産物の第1のセットおよび結合産物の第2のセット)を生成するステップを含む。一部の実施形態では、結合産物の第1のセットは、オリゴヌクレオチドの第1のプールからのオリゴヌクレオチドに接続された(例えば、ハイブリダイズおよび/またはライゲーションされた)標的核酸を含む。一部の実施形態では、結合産物の第2のセットは、オリゴヌクレオチドの第2のプールからのオリゴヌクレオチドに接続された(例えば、ハイブリダイズおよび/またはライゲーションされた)切断産物を含む。
一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および/またはハイブリダイゼーション産物(例えば、標的核酸にハイブリダイズした本明細書におけるオリゴヌクレオチド)は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および/またはハイブリダイゼーション産物は、切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および/またはハイブリダイゼーション産物は、ヘアピンループ内の切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチド、および/またはハイブリダイゼーション産物は、オリゴヌクレオチドの内部位置の(例えば、オリゴヌクレオチドの二重鎖領域内の)切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、環状ハイブリダイゼーション産物は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、核酸、例えば、環状核酸および/または大きい断片(例えば、長さが500塩基対より長い)は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。大きい断片は、高分子量(HMW)核酸またはHMW DNAと呼ばれることがある。HMW核酸断片は、約500bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp、約1000bp、約2000bp、約3000bp、約4000bp、約5000bp、約10,000bpより長い、またはそれより長い断片を含み得る。用語「せん断すること」または「切断」は、核酸分子を2つの(またはそれより多くの)より小さい核酸分子に分断することができる手順または条件を一般に指す。そのようなせん断または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であり得、例えば、化学的、酵素的、および物理的(例えば、物理的断片化)を含む、様々な方法、試薬または条件により果たすことができる。せん断または切断された核酸は、約5〜約10,000塩基対、約100〜約1,000塩基対、約100〜約500塩基対、または約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000もしくは9000塩基対の長さの名目値、代表値または平均値を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ニックシール反応を行うステップ(例えば、DNAリガーゼまたは他の好適な酵素、およびある特定の事例では、核酸を5’リン酸化するように構成されたキナーゼ(例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)を使用する)を含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フィルイン反応を行うステップを含む。例えば、オリゴヌクレオチドが二重鎖として存在する場合、二重鎖の一部または全ては、核酸とハイブリダイズル末端の反対側のその二重鎖の末端にオーバーハングを含むことがある。そのような二重鎖オーバーハングが存在する場合、本明細書における方法は、結合させるステップの後に、二重鎖により形成されたオーバーハングをフィルインするステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、フィルイン反応は、平滑末端化ハイブリダイゼーション産物を生成するために行われる。フィルイン反応を行うために任意の好適な試薬を使用することができる。フィルイン反応を行うために好適なポリメラーゼとしては、例えば、DNAポリメラーゼI、大きい(クレノウ)断片、Bacillus stearothermophilus(Bst)DNAポリメラーゼなどが挙げられる。一部の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼが使用される(例えば、Bst DNAポリメラーゼ)。
一部の実施形態では、核酸(例えば、ハイブリダイゼーション産物;環状化ハイブリダイゼーション産物)は、エキソヌクレアーゼで処理される。エキソヌクレアーゼは、3’または5’末端のどちらかにおいてホスホジエステル結合を切断する加水分解反応によってポリヌクレオチド鎖の末端から1つずつヌクレオチドを切断することにより作用する酵素である。エキソヌクレアーゼは、例えば、DNAses、RNAses(例えば、RNAseH)、5’→3’エキソヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼII)、3’→5’エキソヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼI)、およびポリ(A)特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物は、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは核酸断片などの、夾雑核酸を除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。一部の実施形態では、環状化ハイブリダイゼーション産物は、一切の非環状化ハイブリダイゼーション産物、ハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチド、ハイブリダイズされていない標的核酸、オリゴヌクレオチドダイマーなど、およびこれらの組合せを除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。
本明細書に記載されるある特定の方法は、標的核酸とオリゴヌクレオチド(例えば、本明細書に記載の標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含むオリゴヌクレオチド)の第1のプールとを結合させるステップと、結合産物を切断して切断産物を生成するステップと、切断産物とオリゴヌクレオチドの第2プールとを結合させるステップとを含む。第2のプール内のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドについて本明細書に記載される任意の特徴を含むことができる。しかし、第2のプール内のオリゴヌクレオチドは、標的核酸中のネイティブオーバーハングと相補的であるオーバーハングを一般に含まず、オーバーハング識別配列を一般に含まない。
核酸を処理および/または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法および組成物において利用される核酸または核酸混合物は、対象(例えば、被検対象)から得た試料から単離することができる。対象は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、原生生物または病原体を含むがこれらに限定されない、任意の生命体または非生命体であり得る。任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができ、任意のヒトまたは非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科の動物(例えば、ウシ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、ヤギ亜科の動物およびヒツジ属の動物(例えば、ヒツジ、ヤギ)、イノシシ属の動物(例えば、ブタ)、ラクダ科の動物(例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ)、サル、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー)、クマ科の蹠行性肉食動物(例えば、クマ)、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメを挙げることができる。対象は、雄であってもよく、または雌(例えば、女性、もしくは妊婦)であってもよい。対象は、いかなる年齢(例えば、胚、胎児、乳幼児、小児、成人)であってもよい。対象は、がん患者、がんの罹患が疑われる患者、寛解期の患者、がんの家族歴を有する患者、および/またはがんスクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、感染症もしくは感染性疾患に罹患しているまたは病原体(例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生動物など)に感染した患者、感染症もしくは感染性疾患の罹患または病原体による感染が疑われる患者、感染症、感染性疾患または病原体感染から回復した患者、感染症歴、感染性疾患歴、病原体感染歴がある患者、および/あるいは感染性疾患または病原体スクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、移植レシピエントであり得る。対象は、マイクロバイオーム解析を受けている患者であり得る。一部の実施形態では、被検対象は、雌である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雌である。一部の実施形態では、被検対象は、雄である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雄である。
核酸を処理および/または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸、核酸分子、核酸断片、標的核酸、核酸鋳型、鋳型核酸、核酸標的、標的核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド断片、標的ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド標的などの用語は、本開示を通して同義で使用され得る。これらの用語は、DNA(例えば、相補的DNA(cDNA;目的の任意のRNAまたはDNAから合成されたもの)、ゲノムDNA(gDNA)、ゲノムDNA断片、ミトコンドリアDNA(mtDNA)、組換えDNA(例えば、プラスミドDNA)など)、RNA(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、短鎖抑制性RNA(siRNA)、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)、マイクロRNA、トランス作用性低分子干渉RNA(ta−siRNA)、天然低分子干渉RNA(nat−siRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)、ノンコーディングRNA(ncRNA)、トランスファー・メッセンジャーRNA(tmRNA)、前駆体メッセンジャーRNA(pre−mRNA)、低分子カハール体特異的RNA(scaRNA)、piwi結合RNA(piRNA)、エンドリボヌクレアーゼ調製siRNA(esiRNA)、小分子RNA(stRNA)、シグナル認識RNA、テロメアRNA、胎児または胎盤により高度に発現されるRNAなど)、および/またはDNAもしくはRNAアナログ(例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび/または非ネイティブ骨格などを含む)、RNA/DNAハイブリッドならびにポリアミド核酸(PNA)であって、すべてが、一本鎖または二本鎖形態であることがあり、別段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含し得る、これらのものなどからの、任意の組成の核酸を指す。核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルス、細菌、自己複製配列(ARS)、ミトコンドリア、セントロメア、人工染色体、染色体であってもよく、またはこれらからのものであってもよく、あるいはある特定の実施形態ではin vitroでまたは宿主細胞、細胞、細胞の細胞核もしくは細胞質で複製し得るもしくは複製され得る他の核酸であってもよく、またはそのような他の核酸からのものであってもよい。一部の実施形態での鋳型核酸は、単一の染色体からのものであり得る(例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の1つの染色体からのものであることがある)。特に制限がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む、核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に修飾されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型(SNP)および相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの第3の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることにより果たすことができる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、遺伝子によりコードされているcDNAおよびmRNAと同義で使用される。この用語は、ヌクレオチドアナログ、一本鎖(「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム)および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたRNAまたはDNAの誘導体、バリアントおよびアナログも、同意義のものとして含み得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAの一区画を指し;遺伝子産物の転写/翻訳におよび転写/翻訳の調節に関与するコード領域(リーダーおよびトレーラー)に先行するおよび続く領域、ならびに個々のコード領域(エクソン)間の介在配列(イントロン)を一般に含む。ヌクレオチドまたは塩基は、核酸のプリンおよびピリミジン分子単位(例えば、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)およびシトシン(C))を一般に指す。RNAについては、塩基チミンが、ウラシルに置き換えられる。核酸長またはサイズを、塩基の数で表すことができる。
一部の実施形態では、核酸(例えば、細胞外核酸)は、核酸の部分集団または種について濃縮または相対的に濃縮される。核酸部分集団は、例えば、胎児核酸、母体核酸、がん核酸、腫瘍核酸、患者核酸、宿主核酸、病原体核酸、移植片核酸、マイクロバイオーム核酸、特定の長さもしくは長さの範囲の断片を含む核酸、または特定のゲノム領域(例えば、単一の染色体、染色体のセット、および/もしくはある特定の染色体領域)からの核酸を含むことができる。そのような濃縮された試料を、本明細書で提供される方法とともに使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本技術の方法は、試料中の核酸の部分集団について濃縮するさらなるステップを含む。ある特定の実施形態では、正常組織(例えば、非がん細胞、宿主細胞)からの核酸は、試料から選択的に(部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に)除去される。ある特定の実施形態では、母体核酸は、試料から選択的に(部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に)除去される。ある特定の実施形態では、特定の低コピー数種核酸(例えば、がん、腫瘍、胎児、病原体、移植片、マイクロバイオーム核酸)についての濃縮は、定量感度を改善することができる。試料を核酸の特定の種について濃縮する方法は、例えば、米国特許第6,927,028号、国際特許出願公開番号WO2007/140417、国際特許出願公開番号WO2007/147063、国際特許出願公開番号WO2009/032779、国際特許出願公開番号WO2009/032781、国際特許出願公開番号WO2010/033639、国際特許出願公開番号WO2011/034631、国際特許出願公開番号WO2006/056480、および国際特許出願公開番号WO2011/143659に記載されており、各々の全内容は、本文、表、式および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、断片長に従って標的核酸を分離するステップを含む。例えば、標的核酸を、1つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、特定の核酸断片長(単数)、長さの範囲、または長さ(複数)について濃縮することができる。核酸断片長は、通常は、断片中のヌクレオチドの数を指す。核酸断片長はまた、核酸断片サイズと呼ばれることもある。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを測定せずに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを決定する方法と併せて行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、分画されたプールのすべてまたは一部を単離(例えば、保持)および/または解析することができる、サイズ分画手順を指す。サイズ分画手順は、当技術分野において公知である(例えば、アレイでの分離、モレキュラーシーブによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除カラム)による分離、およびマイクロフルイディクスに基づくアプローチ)。一部の実施形態では、長さに基づく分離アプローチは、例えば、断片環状化、化学的処理(例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール(PEG))、質量分析および/またはサイズ特異的核酸増幅を含み得る。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、固相可逆的固定法(SPRI)ビーズを使用して行われる。
本明細書における方法は、核酸ライブラリーを調製するステップ、および/または核酸ライブラリーために核酸を修飾するステップを含み得る。一部の実施形態では、核酸断片の末端は、断片またはそれらの増幅産物を核酸ライブラリーに組み込むことができるように修飾される。一般に、核酸ライブラリーは、その非限定的な例が、固相(例えば、固体支持体、フローセル、ビーズ)上への固定化、濃縮、増幅、クローニング、検出を含む、特異的プロセスのために、および/または核酸シーケンシングのために、調製される、組み立てられる、および/または修飾される、複数のポリヌクレオチド分子(例えば、核酸の試料)を指す。ある特定の実施形態では、核酸ライブラリーは、シーケンシングプロセスの前にまたはシーケンシングプロセス中に調製される。核酸ライブラリー(例えば、シーケンシングライブラリー)は、当技術分野において公知であるような好適な方法により調製することができる。核酸ライブラリーは、標的化または非標的化調製プロセスにより調製することができる。
一部の実施形態では、核酸(例えば、核酸断片、試料核酸、無細胞核酸)がシーケンシングされる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした核酸標的(「ハイブリダイゼーション産物」)がシーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物が増幅プロセスにより増幅され、それらの増幅産物がシーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、配列リード(またはシーケンシングリード)を生成する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいて標的核酸のオーバーハングの配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいてオーバーハング識別配列または固有末端識別子(UEI)の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいてオーバーハング識別配列または固有末端識別子(UEI)と標的核酸のオーバーハングとを含むエレメントの配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいてオーバーハング識別配列または固有末端識別子(UEI)と標的核酸のオーバーハングとからなるエレメントの配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに従って標的核酸のオーバーハングの長さを決定するステップを含む。
配列リードをマッピングすることができ、指定核酸領域(例えば、染色体またはその一部分)にマッピングするリードの数は、カウントと呼ばれる。ある特定の実施形態では、オーバーハング配列情報を含む配列リードをマッピングすることができ、オーバーハング配列情報を含むリードの数が、指定核酸領域にマッピングすることになる。任意の好適なマッピング方法(例えば、プロセス、アルゴリズム、プログラム、ソフトウェア、モジュールなど、またはこれらの組合せ)を使用することができる。マッピングプロセスのある特定の態様が、以下に説明される。
選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割される配列リードを定量化して、1つまたは複数の部分(例えば、参照ゲノムの部分)にマッピングされるリードの量または数を決定することができる。一部の実施形態では、選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割されるオーバーハング情報を含む配列リードを定量化して、1つまたは複数の部分にマッピングされるオーバーハング情報を含むリードの量または数を決定することができる。ある特定の実施形態では、部分またはセグメントにマッピングされる配列リードの量は、カウントまたはリード密度と呼ばれる。
本開示の手法を使用して、様々なアッセイを行うことができる。一部の場合には、試料を、試料核酸中に存在するオーバーハングの一部、多数またはすべてについてアッセイすることができる。この情報を、存在するオーバーハングの数または出現頻度を示す、試料の全般的オーバーハングプロファイルを生成するために使用することができる。一部の場合には、試料を、試料中に存在する1つまたは複数の特定のオーバーハングの一団についてアッセイすることができる。一部の場合には、試料を、試料中に存在するオーバーハングの1つまたは複数の特徴についてアッセイすることができる。一部の場合には、試料を、平滑末端化断片(例えば、片側が平滑末端化されている、または両側が平滑末端化されている、標的核酸(例えばDNA))についてアッセイすることができる。
本明細書に記載される方法は、上記の試料または供給源の1つまたは複数の特性を示すアウトカムを提供することができる。本明細書に記載される方法は、被検試料(例えば、医学的状態の存在もしくは非存在および/または表現型を決定するアウトカムを提供するもの)についての表現型および/または医学的状態の存在もしくは非存在を示すアウトカムを提供することもある。アウトカムは、分類プロセスの一部であることが多く、分類(例えば、試料もしくは供給源の1つもしくは複数の特性、ならびに/または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の分類)は、アウトカムに基づくこともあり、および/またはアウトカムを含むこともある。アウトカムおよび/または分類は、分類プロセス(例えば、統計値)において試料および/もしくは供給源の1つもしくは複数の特性ならびに/または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の判定を容易にする、被検試料についてのデータ処理の結果に基づくこともあり、および/またはそのような結果を含むこともある。アウトカムおよび/または分類は、試料もしくは供給源の1つもしくは複数の特性、ならびに/または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を決定するスコアをあるいはそのような特性ならびに/または存在もしくは非存在のコールを含むこともあり、またはそのようなスコアもしくはコールに基づくこともある。ある特定の実施形態では、アウトカムおよび/または分類は、分類プロセスにおいて試料もしくは供給源の1つもしくは複数の特性をならびに/または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を予測および/または判定する、結論を含む。
本明細書に記載されるある特定のプロセスおよび方法(例えば、リードのサブセットを選択するプロセスおよび方法、オーバーハングプロファイルを生成するプロセスおよび方法、オーバーハングデータを処理するプロセスおよび方法、オーバーハング定量化を処理するプロセスおよび方法、オーバーハングデータまたはオーバーハングプロファイルに基づいて試料の1つまたは複数の特性を判定するプロセスおよび方法)は、コンピュータ、マイクロプロセッサー、ソフトウェア、モジュールまたは他の機械なしでは遂行することができないことが多い。本明細書に記載される方法は、コンピュータ実装方法であり得、方法の1つまたは複数の部分は、1つまたは複数のプロセッサー(例えば、マイクロプロセッサー)、コンピュータ、システム、装置または機械(例えば、マイクロプロセッサー制御型機械)により遂行されることもある。
ある特定の実施形態では、キットが提供される。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行うのに有用な、本明細書に記載される任意の成分および組成物(例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド成分/領域、標的核酸、酵素)を任意の好適な組合せで含むことができる。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行うのに有用な任意の試薬、緩衝剤または他の成分をさらに含むことができる。例えば、キットは、複数のオリゴヌクレオチド種、またはオリゴヌクレオチド種のプール、核酸試料の核酸を5’リン酸化するように構成されたキナーゼ(例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK))、DNAリガーゼ、切断作用因子、フィルインおよび/または鎖置換反応を行うのに好適な酵素(例えば、ポリメラーゼ)のうちの1つまたは複数、ならびにこれらの任意の組合せを含むことができる。
RNAse切断性ヘアピンアダプター
分解されたDNA分子(例えば、古代DNA)の損傷の1つの形態は、シトシン(C)からウラシルへ脱アミノ化である。ループにデオキシウリジンを含有するヘアピン構造の形態のDNAシーケンシングアダプターは、一本鎖を切断するためにウラシル−DNA−グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する必要がある。これらの酵素の使用の1つの起こり得る帰結は、目的のDNA断片内の損傷部位での切断であり、それによって断片はライブラリー変換に利用できなくなる。例えば循環無細胞DNAなどの古代DNAに類似したある特定の基質によって、身体からの放出およびクリアランスのプロセスの間に損傷した塩基が蓄積され得る。これは、循環無細胞DNAライブラリー調製のためのデオキシウリジンを含有するシーケンシングアダプターの使用を制限し得る。ライブラリー調製中にRNAseの使用と併せてヘアピンのループ内にRNA塩基を有するヘアピンアダプターを使用することにより、DNAライブラリー調製についてのそのような課題が取り除かれるはずである。ライブラリー調製中のRNAseの使用は、ある特性の夾雑物をシーケンシング前に低減させるのに有用でもあり得る。ヘアピンアダプター構成の例を図1A、図1Bおよび図1Cに示す。
シーケンシングライブラリーを、鋳型DNAをDNA/RNAアダプターにライゲーションすることにより調製し、DNA/RNAアダプターは、二本鎖ステムがIlluminaシーケンシングアダプターに普遍的ないくつかのDNA塩基の相補性により作出され、一本鎖ループが、P5およびP7(フォワードおよびリバース)プライマー部位の固有の非相補的DNA塩基を含有する、ステムループ構造を有した。3つのグアニンRNA塩基をループ内に配置し、これは、T1 RNAseの切断部位としての役割を果たした。切断後、二本鎖DNA分子が形成され、これを直接増幅およびシーケンシングすることができた。
表1の結果は、RNAse切断性ヘアピンアダプターが、市販のウラシルアダプターと全く同じように動作し、尿からの無細胞DNAおよび断片化したFFPE試料について最も大きな増加が観測されたことを示す。下記の8つの実験のうちの6つにおいて、RNAse切断性ヘアピンアダプターは、わずかにより低い複製率を示した。
固有末端識別子(UEI)および固有分子識別子(UMI)
DNA放出、様々な形態の細胞死、および死後の細胞プロセスなどの、イベントは、明確に異なる形態的特徴および分子経路によって特徴付けられる。二本鎖切断後のDNA末端に見られるシグナルは、固有のDNA分解パターンを反映することができ、原因となるプロセスおよび可能性のある病態形成プロセスについての情報を提供することができる。これを研究するために、RNAse切断性アダプターを、ネイティブDNA末端に存在するときに一本鎖オーバーハングを捕捉するように設計した(例えば、図1Bを参照されたい)。
DNA末端にタグを付けるための固有末端識別子(UEI)を有する両側オリゴ
固有末端識別子(UEI)は、DNA末端にタグを付けるために使用することもできる。他のシーケンシングプラットフォームまたは下流の解析のための柔軟な選択肢を与えるために、UEIは、独立型ライゲーション成分(すなわち、シーケンサー特異的アダプター配列を有さない)として機能することができる。このプロセスは、任意ライブラリータイプへの変換または解析のために、オーバーハングDNAのネイティブ末端をコードする/そのままの状態に保つ。そのようなライゲーションの産物は、平滑末端化された二本鎖分子であり得る。
このアプローチは、他の設計と比較してより多くのアダプターダイマーを生成し、これによりシーケンシング出力が低下した。ライブラリー当たり30,000〜150,000の間のリードが生成された。ヒトゲノムにマッピング可能であったDNAは、無細胞DNAの予想サイズ分布、およそ167bp、またはヌクレオソームに巻き付いたDNAの長さであった(図3および図4を参照されたい)。抽出物の「高」画分であるAPN307およびAPN310からの非常に少数のリードは、マージするのに十分な短さであり、ヌクレオソーム1個のサイズを優に上回っていた(図3、パネルCおよびF)。「高」画分ライブラリーは、データ数が少なすぎて目に見える表示が一切なかった(図4、パネルCおよびF)。ライブラリーの「低」または「全」(すなわち、サイズ分解されていない)部分は、ライブラリーを生成したが、所期のサイズの大半のDNA断片は、1つの両側UEIオリゴのみにライゲーションされたか、またはどの両側UEIオリゴヌクレオチドにもライゲーションされなかった(図4、パネルA、B、D、E)。
DNA末端にタグを付けるための固有末端識別子(UEI)を有する片側オリゴの遮断
UEIオリゴの両末端でのライゲーションを促す設計を使用するのではなく、特定の方向で確実にライゲーションするために単一の遮断性修飾塩基をUEIオリゴの3’末端に配置する。図5に示す1つの設計は、UEIオリゴを強制的に一方向にライゲーションさせるためにUEIオリゴの3’末端を遮断する。イソデオキシ−塩基を遮断剤として選択した。イソデオキシ−Gおよびイソデオキシ−Cは、天然塩基とは異なる水素結合パターンを有する。しかるが故に、それらは、いずれの天然塩基とも結合することができない。典型的に、isoGは、isoCとのみ対合することができる。これらの2つの修飾塩基のうちの1つ、isoGまたはisoCのどちらか、のみを使用することにより、UEIオリゴの「誤った」末端でライゲーションもハイブリダイゼーションも起こらないはずであり、したがって、ライゲーションイベントの正しい方向が余儀なくされる。
合成および生物学的DNAの脱リン酸化
上記のある特定の実施例で説明したライブラリー調製では、一般に、3’オーバーハングをチューバックし、5’オーバーハングをフィルインし、Aテーリングまたは平滑末端ライゲーション用の鋳型を調製する、従来の末端修復ステップを省略する。上で説明した方法は、鋳型DNAを調製するためのヌクレアーゼの使用もポリメラーゼの使用も通常は含まず、その代わりにライゲーションの前に鋳型をT4 PNKでリン酸化する。
メイトペアライブラリー
ライブラリー変換の推奨断片長より長い、ゲノムDNAまたは他のDNAを、通常は、ライブラリー調製前に機械的せん断するか、または酵素的せん断する。せん断後、従来のライブラリー調製が、末端修復ステップから始まる。せん断も、末端修復も、ネイティブDNA末端の利用、したがって観測を妨げる。
さらなるアダプターの例
さらなるアダプターの例を図9Aおよび9B(パネルA)に示す。図9Aは、第1相で鎖置換ポリメラーゼを使用して固有末端識別子(UEI)配列を結合させ、第2相でシーケンサー特異的配列(例えば、シーケンシングアダプター)を結合させる方法の例を示す。したがって、図9A、パネルAに示すアダプターは、シーケンサー特異的アダプター配列(P5、P7)を含有しない。図9AのパネルAは、固有末端識別子(UEI)配列(灰色で示す)およびランダム配列(黒色で示す)で構成されている、Yアダプター(左側)およびヘアピンアダプター(右側)を示す。一部の事例では、Yアダプターは、ヘアピンアダプターの切断されたバージョンである。ヘアピンアダプターは、切断部位(「X」)を含み、この切断部位は、実施例1で説明したような1つまたは複数のRNAヌクレオチドを含み得る。図9AのパネルBは、標的核酸へのアダプターのライゲーションを示す。ヘアピンアダプターライゲーション産物を切断部位で切断することができる。切断後のライゲーション産物は、Y−アダプターライゲーション産物と同じである。図9AのパネルCは、完全相補的二本鎖の平滑末端化断片を作出するための鎖置換ポリメラーゼによるニックでのフィルインステップを示す。図9AのパネルDは、最適な任意のシーケンシングライブラリー調製のための準備が整った状態である核酸断片(第2相)を示す。
断片サイズ選択
ライブラリー調製後にビーズ、ゲル切り出し、またはPippen Prepマシンのような自動化法を使用してサイズ選択を行うのではなく、一部の事例では、サイズ分画をDNA抽出物で行うことで、ライブラリー分子に変換されることになるDNAのサイズを制御する。分画にはある特定の現実的および生物学的動機がある。現実的には、分画は、ある特定のシーケンシングプラットフォーム(例えば、Illuminaプラットフォーム)を使用して効率的にシーケンシングするには長すぎる断片の存在を低減せる。生物学的には、分画は、異なる生物学的プロセスの産物であり得る断片を分離し、保持する。無細胞DNA(cfDNA)断片長は、一般に、1、2または数ヌクレオチドのサイズ、約170、約340、約510bpぐらいであり、これらの断片は、一般に、細胞アポトーシスの産物と考えられる。より大きい断片は、ある一定の事例では、ゲノムDNA(gDNA)夾雑物を含む。より大きい断片は、cfDNA断片(例えば、ヌクレオソームより大きい断片、例えば、異なる分解段階の断片、またはアポトーシス以外のプロセス(例えば、壊死)に由来する断片)も含み得る。
RNAオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドアダプター
この実施例は、オリゴヌクレオチドアダプターにおける一本鎖オーバーハングの基質としてRNA塩基を使用する方法を記載するものである。RNAオーバーハングを有するアダプターを、ライブラリー調製のために、非常に多くの構成、例えば、Y、ヘアピン、二重鎖、遮断する修飾を加えた二重鎖(例えば、図10Aを参照されたい)で、構造化することができる。本明細書に記載する他のすべての反復と同様に、オーバーハングの長さおよびオーバーハングのタイプ(例えば、5’オーバーハングまたは3’オーバーハング)を示す固有末端識別子(UEI)をオリゴヌクレオチドの二重鎖部分に組み込む。一部の事例では、Illumina特異的アダプター配列(例えば、P5、P7)をUEI−アダプターに含める。一部の事例では、Illumina特異的アダプター配列(例えば、P5、P7)をUEI−アダプターに含めない。
高分子量(HMW)DNAのためのオリゴヌクレオチドアダプター
この実施例は、ショートリード次世代シーケンシング(NGS;例えば、ハイスループットシーケンシング)を利用して高分子量(HMW)DNAからオーバーハング情報を収集するためのオリゴヌクレオチドアダプターおよび方法を記載するものである。
断片化DNAのネイティブ末端を特徴付けるためのNGSライブラリー調製方法
この実施例では、断片状DNA末端のネイティブな状態についての包括的情報を提供する、ライゲーションに基づく次世代シーケンシング(NGS)ライブラリーアプローチを説明する。標準的なDNA末端修復ステップを省略することにより、この方法を使用して生成されるライブラリーは、カスタムシーケンシングアダプターを使用して各分子末端での切断のタイプをコードすることができる。このライブラリー調製方法の最終結果は、ゲノムワイドなヌクレオチド分解能のDNA断片化を提供する、ハイスループットNGSアッセイである。Illumina適合二本鎖DNA(dsDNA)シーケンシングライブラリーを生成するこの方法は、存在する場合には各々の元の鋳型分子上に存在する一本鎖オーバーハングのタイプ(3’、5’または平滑形)および長さならびに存在する場合には各DNA断片上の残存オーバーハングの長さおよび配列をコードする固有識別子を、シーケンシングアダプターに導入する。この方法の精度を、1)既知一本鎖オーバーハングを有する対照オリゴの集団、および2)特異的制限酵素からのDNA消化産物を使用して、実証する。Diagenode Bioruptor、NEB Fragmentase、DNaseI、およびミクロコッカスヌクレアーゼを使用する一般的な機械的および酵素的せん断方法により生成されたdsDNA断片のネイティブ末端の分布も記載する。最後に、この方法を使用して、ヒト血液を採取する一般的な手順が、循環無細胞DNA断片を血液中に存在するヌクレアーゼによる分解から保護するそれらの能力の点で異なることを示す。
核酸鋳型獲得および調製
ランダム配列生成装置を使用して50%GC含有量で合成対照オリゴ(表2)を設計し、公開データベースの任意の公知生物とマッチする配列を除去した。各対照分子(n=12)は、1つの平滑末端と、ランダム配列、長さ1〜6ヌクレオチド、の1つの3’または5’一本鎖オーバーハングとを有する、二本鎖DNAの固有の50bp配列である。各対照は、固有の配列であるため、オリゴの構造を示すそれ自体のバーコードとして役立つ。オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものであり、すべてのランダムヌクレオチドを、合成の偏りを低減させるために「手で混合」した。対照オリゴを等モル比で一緒にプールした。アダプターライゲーションの前に、37℃で30分間インキュベートされ、その後、10分間、65℃で熱不活性化される迅速エビアルカリホスファターゼ(New England Biolabs)を使用する20μl反応で、1pmol以下のプールした対照オリゴを脱リン酸化した。次いで、この熱不活性化される20μlのエビアルカリホスファターゼ反応を、ATPを補充したT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用して40μlにすることにより、対照オリゴを5’リン酸化した。このリン酸化反応を37℃で30分間行い、その後、65℃で30分間の熱不活性化ステップを行った。その結果、オリゴは、アダプターライゲーションのための準備が整った状態になった。オリゴ濃度は、40μlで割ったオリゴ投入量pmolを使って算出した。
各アダプターは、Illuminaシーケンサー特異的プライミング部位と、固有末端識別子(UEI)−存在する場合には元の分子に存在するオーバーハングの長さおよび正体(5’または3’)を示すバーコード配列−とを含有する(表4)。アダプターは、Integrated DNA Technologies(IDT)により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものである。この研究のための13のアダプターセットは、3’オーバーハング(長さ1〜6nt)を有する6つと、5’オーバーハング(長さ1〜6nt)を有する6つと、単一の平滑形アダプター(すなわち、オーバーハングなし)とを含む。アダプターをリン酸化せず、かくてアダプターによるダイマー形成を阻止した。13すべての二重鎖アダプターを等モル比でプールし、1pmolのプールアダプター、10単位の迅速エビアルカリホスファターゼ(New England Biolabs)、1×Cutsmart緩衝剤を37℃で30分間インキュベートし、その後、10分間、65℃で熱不活性化する、20μl反応を使用する末端脱リン酸化により、ライゲーション用に調製した。単一のQIAQUICK Nucleotide Removalカラム(Qiagen)で複数の脱リン酸化反応物を併せ、製造業者の使用説明書に従って精製した。DNA濃度(Qubit蛍光定量)および既知の長さを使用して、アダプターモル濃度を算出した。その結果、アダプターは、ライゲーションのための準備が整った状態であった。
UEIバーコード化リードペアのマッピングは、鋳型分子が、単一の7ntバーコードを加えたフォワードおよびリバースリードの長さの合計より短い場合、バイオインフォマティクス上の課題を提起する。この課題は、各リードが、そのメイトのバーコード配列にわたることがあり、ことによるとそれを超えてIlluminaアダプター配列へと及ぶこともあるため、存在する。古代DNAの分野におけるものなどの短い鋳型分子が期待される研究での1つのアプローチは、アダプター配列の除去とリードのマージを同時に行うことである。このプロセスは、配列類似性に基づいてフォワードリードとリバースリードを折り畳んで単一の配列にすること、その一方で、SEQPREP(github.com/jstjohn/SeqPrep)を使用して公知Illuminaアダプター配列とマッチするリードの末端をトリミングすることを含む。しかし、UEIが存在する場合、これらのマージされたリードは、両末端に7nt UEIを有することができ、末端の一方が逆補完されることになる。
1.オーバーハングのタイプおよび長さを示すかまたは平滑末端を示すUEIバーコード配列のリストを含有するデータ構造;
2.各リードの最初の7塩基(7=バーコードの長さ)を使う;
3.これらが公知バーコードとマッチするかどうかを確かめる;
4.Nが1つあった場合、それを塩基に変換することによって、それが公知バーコードとマッチするかどうかを確かめる;
5.それがバーコードとマッチした場合、バーコードにより示される塩基の数をリードから引くことによりそのバーコードのオーバーハングを調べる;および
6.バーコードが平滑形である場合を除き、フォワードリードを無視する。
対照オリゴは、一方の末端が一本鎖オーバーハングを有するように合成され、他方の末端が平滑形であるように意図された、合成二本鎖DNAの短い(50bp)配列であった。処理の際、すべての適正に形成された配列は、対照オリゴが共に連鎖している場合を除き、上記の基準を使用してマージすると予想された。一方が感度を測定するためのものであり、他方が特異度を測定するためのものである、対照オリゴ実験を評定する2つ方法を定義した。
フィルタリング後に残存するペアエンドリードを、必要に応じて短縮化し、UCSCゲノムブラウザからダウンロードしたhg19ヒト参照ゲノムとアライメントした。アライメントには、リードの最初のUEI配列をスキップして(−Bパラメーター)、デフォルトパラメーターでbwa alnおよびbwa sampeを使用した。次いで、samtools rmdupを使用して、重複リードを除去した。リードは、キメラアライメントの原因となる断片連鎖の可能性のため正しい対合の要件(samtools view−c−f64−q20)が外される制限酵素実験の場合を除いて、20の最小マップ品質(samtools view−c−f66−q20)で正しいペアの状態にあったときにマッピングされた場合にのみ計数した。
ライブラリー構築
この実施例での方法は、ライブラリー調製ワークフロー後の断片化され、分解されたdsDNA末端をアッセイするものであった。この方法のための各アダプターは、次の3つの部分を含んだ:P5/P7 Illuminaに基づくシーケンシングおよびインデクスプライミング部位、7塩基対(bp)固有末端識別子(UEI;末端のタイプをコードするバーコード)、および平滑末端、または存在する場合には、基質のオーバーハングとハイブリダイズし、ライゲーションする一本鎖オーバーハング。オーバーハングは、長さN(ここでは、6ヌクレオチド(nt)以下の長さ)のランダム配列の等しい比率を用いて合成した。アダプターを過剰に含めて、すべての鋳型dsDNAタイプが適合するアダプターを確実に利用できるようにした。このようにして、アダプターを、可能なすべての突出末端化鋳型分子とハイブリダイズするのに十分な適合配列を提供する競合反応で導入した。しかし、アダプターのオーバーハングは、自己ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの可能性を生じさせるため、アダプターダイマー形成を防止するためにアダプターのオーバーハングをリン酸化しなかった。
精度
この実施例で説明するアッセイの精度を判定するために、各々の一本鎖オーバーハングの長さおよびタイプ(3’または5’)が既知である12の合成二本鎖対照オリゴのプールを構築した。各対照オリゴは、固有の識別可能な50bpコアと、一方の側に平滑形末端、および他方の側に特定の長さ(1〜6nt)の5’または3’オーバーハングという一般的な構造とを含有した。ライブラリーをシーケンシングした後、リバースリード(P7)でのUEIを使用して、アダプターUEIにより示されるオーバーハングが、dsDNA対照鋳型上の操作されたオーバーハングと正しくマッチする頻度を比較することにより、アッセイの精度を定量化した。リバースアダプター上に存在するUEIは、正しいオーバーハングを予測することに関して、両方のアダプター上に存在するUEIが含まれる場合またはフォワードアダプターのみが含まれる場合よりも正確である(図18)ため、解析をリバースリードに限定した。この現象を説明するためのモデルを図19に提供する。
ライゲーション精度または効率が、オーバーハングの塩基組成による影響を受けるかどうかを判定するために、回収した一本鎖オーバーハング各々のヌクレオチド配列を、配列データおよびUEIデータを使用して決定した。ライブラリーの構造のため、5’オーバーハングに存在する塩基は、挿入鋳型分子に由来し、挿入鋳型分子は、この場合は対照オリゴであり、これに対して、3’オーバーハングは、アダプター自体のDNAオーバーハングに由来した。過剰なシトシンが観測された5’1ntオーバーハングを除いて、各オーバーハングタイプおよび長さについてヌクレオチドの均一な分布が観測された。このシトシンの偏りが、オリゴ合成プロセスの産物であるのかどうかを評価するために、標準的な末端修復ライブラリーを、合成対照オリゴを用いて調製した(NEB Ultra II)。末端修復ステップは、ポリメラーゼ活性によって、3’オーバーハングを除去し、5’オーバーハングをフィルインするものであり、これにより合成DNA 5’オーバーハングの塩基組成を特徴付けることができた。対照オリゴの標準的な末端修復ライブラリー内で、5’1ntシトシンのリードカウントの上昇が観測された。それ故、この観測は、カスタムオリゴ合成の偏りに由来する可能性が高く、ライゲーション中に導入される偏りに由来する可能性は低い。
外来DNA分子のバックグラウンドにおいて特異的な末端タイプの存在を検出する本明細書におけるアダプターの能力を評価するために、単一の既知オーバーハング配列を有するDNAを多様なオーバーハングのプールに混入する希釈系列を行った。多様な末端のプールを、NA12878ゲノムDNA(gDNA)の音波処理(Diagenode Bioruptor)およびサイズ選択により作出した。単一の既知オーバーハングを有するDNAを、NA12878 gDNAを制限エンドヌクレアーゼMluCIで消化することにより作出し、これにより配列AATTの5’4ntオーバーハングが作出され、その後、サイズ選択を行った。
高分子量DNAの断片化またはせん断は、通常は、ショートリード、例えばIllumina、シーケンシングライブラリーを作出する際に必要なステップである。評判のよりDNAせん断手段としては、音波処理および酵素的消化が挙げられる。音波処理による機械的せん断が、NGSライブラリーの品質を偏らせるまたは別様に影響を与えるのかどうかを詳しく調査するために、クローニングに基づくアプローチを使用して、DNA音波処理により作出された末端を調査した研究、および標準的な末端修復NGSライブラリー中の5’オーバーハングを解析して、DNA音波処理による非ランダムせん断の証拠を見つけた別の研究を含む、いくつかの研究により、せん断方法の帰結が比較されている。酵素的せん断の帰結を詳しく調査するために、いくつかの研究は、分子に基づく方法、マイクロアレイに基づく方法およびシーケンシングに基づく方法を使用して、DNaseIの消化の優先傾向、ならびに低分解能でだがミクロコッカスヌクレアーゼの切断の優先傾向を説明している。本明細書に記載するアダプターを使用して生成されるライブラリーは、すべての遊離DNA末端の微小構造を偏りのないハイスループットな方法で評定することができるため、この実施例で説明するアッセイを使用して、音波処理および酵素的せん断の両方によって断片化された裸のNA12878ゲノムDNAのDNA末端プロファイルを特徴付けた(表6)。
音波処理により生成されたオーバーハングをより詳細に照合するために、Diagenode Bioruptorでせん断したライブラリーから生成したデータを、上で紹介したように調査した(感度セクションを参照されたい)。音波処理試料についてのオーバーハング長および配列モチーフ分布は、DNAの音波処理が、平滑末端のより高い保有率、これに、5’末端と3’末端の両方に存在する1〜4ntオーバーハングが続くが、3’1ntおよび3’2ntオーバーハングに優先傾向がある保有率を生じさせることを示した。Bioruptorで音波処理したDNAの塩基組成プロファイルは、1ntオーバーハングが形成される場合を除いて、バランスのとれた範囲を示した。1nt DSBの存在は、ほとんどの場合、単一シトシンオーバーハングを残し、これは、5’1ntオーバーハングに関して以前に観測された現象である。
酵素的せん断により生成されるオーバーハングを照合するために、dsFragmentase(New England Biolabs、NEB)、DNaseIおよびミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)という3つのエンドヌクレアーゼを使用して、ライブラリーを生成した。NEB製品dsFragmentaseは、NGS DNA断片化用に特別に設計された2つの酵素のカクテルである。dsFragmentase消化試料からのオーバーハング長分布は、音波処理と比較して、オーバーハングを有する分子を多く生じさせ、平滑末端化された分子を少なく生じさせた。dsFragmentaseはまた、ライブラリー複製物間で観測されたオーバーハング長の変動に基づいて、Bioruptorよりランダムなせん断プロファイルを生じさせた。この研究で使用したアダプターは、6ntまでしか伸長しなかった。6ntオーバーハングを含有する分子のせん断数は、dsFragmentaseが、6ntより長いオーバーハングを生じさせることを示す。dsFragmentaseオーバーハングのモチーフ分布は、5’オーバーハングの生成と3’オーバーハングの生成間で等しい分布を示した。dsFragmentaseオーバーハングの塩基組成は、Bioruptorのものに類似していたが、長さ2nt〜6ntのオーバーハングにはより多くのシトシンがあった。
最近、循環無細胞DNA(cfDNA)プロファイリングは、非侵襲的出生前検査およびがん診断における使用に向けてかなりの注目を集めている。血漿からの高品質DNAの獲得は、採血自体から始まる。血液凝固または凝血は、ヌクレアーゼ活性増大に関連するプロセスであり、採血チューブ(BCT)のタイプは、cfDNA抽出物の量および品質に影響を与え得る。ここでは、一般的なBCTが、どの程度cfDNAの完全性を維持するのかを、公知の対照オリゴ(上記)をスパイクした様々なBCTから抽出したcfDNAのライブラリーを構築することによりアッセイした。一般に使用されている抗凝固薬を含有するBCTを含め(表3)、抗凝固薬のない対照チューブ(赤色キャップのチューブ;RTT)を含めた。
オーバーハングシーケンシングデータセットの解析
試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングを(例えば、バイオインフォマティクス解析を使用して)照合して、オーバーハングの1つまたは複数の特徴を含むオーバーハングプロファイルを生成することができる(例えば、ある特定のオーバーハングタイプ(例えば、5’、3’、平滑形)の定量化、ある特定のオーバーハング長の定量化、ある特定のオーバーハング配列特徴の定量化など)。ある特定の事例では、鋳型分子の特徴を考慮することができる。オーバーハングプロファイルおよび/またはある特定の鋳型特徴に基づいて、試料の1つまたは複数の特性を判定することができる。
**X=上記の任意の特徴
がんに罹患しているドナー(「がんドナー」)および健康なドナーからの無細胞DNAについてのライブラリーを、本明細書に記載されるY形オーバーハングアダプターを使用して生成した(例えば、図9Bに示すY形アダプターおよび方法を参照されたい)。ウォードの階層的クラスタリング法を使用して、各ライブラリーに存在するDNAオーバーハングのシーケンシングデータからヒートマップ(図20)を作成した。図20に示すヒートマップの各列は、がんドナー(黒色バー)または健康なドナー(バーなし)からの単一無細胞DNAライブラリーを表す。図20に示すヒートマップの各行は、長さ1〜6ヌクレオチドの固有オーバーハング(5’または3’)を表し、少なくとも1つのCGジヌクレオチド、すなわちCpG、を含有する行(オーバーハング)を灰色バーで示す。図20に示すヒートマップ行列内では、色が濃いほど、そのオーバーハングが占めるライブラリー内での(対数スケールで描かれた)比率が増す。より薄い色は、そのオーバーハングの枯渇を示す。
CGカウント、オーバーハング長、完全分子長、および図21に記載の他の変数を含む、変数を用いて、ロジスティック回帰および教師あり学習アルゴリズム(サポートベクターマシン(SVM))を実行して、がんおよび健康試料を分類した。SVMとロジスティック回帰の両方が、75%より高い適合率および再現率(適合率−真の陽性として試料を表示するモデルの能力;再現率−すべての陽性試料を見つけるモデルの能力)で、75%の正解率を有した。
被検セットに関するロジスティック回帰分類器の予測正解率は、真陽性、偽陽性、真陰性および偽陰性の間のよりよい分割で75%であった−正しい予測790+823および誤った予測308+230(図22)。
真陽性として試料を表示するモデルの能力(適合率)は73%であり、すべての陽性試料を見つけるモデルの能力(再現率)は78%であった。最終モデルは、データを30%被検セットと70%訓練セットに分割した。f1スコアは、適合率と再現率との調和平均であり、サポートは、被検セットからの考慮した試料の数である。分類の正解率は、75%であった。
がんに罹患している患者のオッズは、オーバーハングがCGジヌクレオチド配列を含有する場合、120%増加する。がんに罹患している患者のオッズは、オーバーハングがGGジヌクレオチド配列を含有する場合には105%増加し、オーバーハングがGCジヌクレオチド配列を含有する場合には50%増加する。すべての特徴変数は、最終モデルにおいて−カットオフを0.05として−有意なp値、P>|z|、を有した。
がんに罹患している患者のオッズは、オーバーハングがCGジヌクレオチド配列を含有する場合、94%増加する。すべての特徴変数は、最終モデルにおいて−カットオフを0.05として−有意なp値、P>|z|、を有した。
実施形態の例
下記の例は、ある特定の実施形態を説明するものであり、本技術を限定するものではない。
(a)標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
(i)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含み、ループが、1つまたは複数のリボ核酸(RNA)ヌクレオチドを含み、
(ii)標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
(iii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
(iv)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
(v)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと;
(b)ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物をヘアピンループ内のRNAヌクレオチドで切断することができる1つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップと
を含む方法。
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含み、ループが、1つまたは複数のリボ核酸(RNA)ヌクレオチドを含み;
(b)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸中のオーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
(c)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、組成物。
(a)標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
(i)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、切断条件下で切断され得る1つまたは複数の切断部位を含み、
(ii)標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
(iii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、2本の鎖および第1のオーバーハングおよび第2のオーバーハングを含み、各オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
(iv)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第1および第2のオリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的な少なくとも2つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
(v)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと;
(b)ハイブリダイゼーション産物と、ハイブリダイゼーション産物を1つまたは複数の切断部位で切断することができる1つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることによって、切断されたハイブリダイゼーション産物を形成するステップと;
(c)切断されたハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップと
を含む方法。
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、切断条件下で切断され得る1つまたは複数の切断部位を含み;
(b)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、2本の鎖および第1のオーバーハングおよび第2のオーバーハングを含み、各オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
(c)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第1および第2のオリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的な少なくとも2つのオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
(a)標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
(i)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第2の末端に1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
(ii)標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
(iii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
(iv)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと;
(b)ハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップと
を含む方法。
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第2の末端に1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
(b)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
(a)標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
(i)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第1の末端のオーバーハングが、パリンドローム配列を含み、
(ii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第2の末端にオーバーハングを含み、第2の末端のオーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有の第2の末端のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
(iii)標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
(iv)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第2の末端のオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
(v)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、
(vi)第1の末端のオーバーハングが、他の第1の末端のオーバーハングとハイブリダイズし、第2の末端のオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによって環状ハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと;
(b)ハイブリダイゼーション産物とエキソヌクレアーゼとを接触させることによって、エキソヌクレアーゼ処理されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと;
(c)エキソヌクレアーゼ処理されたハイブリダイゼーション産物をせん断することによって、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと;
(d)オリゴヌクレオチド種における配列を含む断片を、オリゴヌクレオチド種における配列を含まない断片から分離することによって、エキソヌクレアーゼ処理され、せん断され、分離されたハイブリダイゼーション産物を生成するステップと
を含む方法。
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第1の末端のオーバーハングが、パリンドローム配列を含み;
(b)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第2の末端にオーバーハングを含み、第2の末端のオーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有の第2の末端のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
(c)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、第2の末端のオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み;
(d)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、
組成物。
(a)標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
(i)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、(1)2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第2の末端に2本の非相補鎖を含むか、または(2)一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
(ii)標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
(iii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
(iv)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと;
(b)ハイブリダイゼーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップと
を含む方法。
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、(i)2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第2の末端に2本の非相補鎖を含むか、または(ii)一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
(b)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
試料中の核酸の集団の核酸オーバーハングをアッセイするステップであって、それによって集団のオーバーハングプロファイルを生成するステップと;
オーバーハングプロファイルに基づいて、試料の1つまたは複数の特性を判定するステップと
を含む方法。
標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、RNAヌクレオチドを含む少なくとも1つのオーバーハングを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
(b)標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含み、
(c)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
(d)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、
方法。
(a)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、RNAヌクレオチドを含む少なくとも1つのオーバーハングを含み、オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
(b)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、
組成物。
組成物を使用して核酸末端を修飾するための使用説明書と
を含む、キット。
a)標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第1のプールとを結合させるステップであって、
i)標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
iii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iv)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1のプライマー結合ドメインを含み、
v)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第1のプールが結合し、それによって結合産物の第1のセットが形成される、ステップと;
b)結合産物の第1のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと;
c)切断産物とオリゴヌクレオチド種の第2のプールとを結合させるステップであって、
i)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1の末端および第2の末端を含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第2のプライマー結合ドメインを含み、第1のプライマー結合ドメインと第2のプライマー結合ドメインが異なり、
iii)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、第1の末端において、切断産物の少なくとも1つの末端に結合する条件下で、切断産物とオリゴヌクレオチド種の第2のプールが結合し、それによって結合産物の第2のセットが形成される、ステップと
を含む方法。
をさらに含む、実施形態T1の方法。
i)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1のプライマー結合ドメインを含む、第1のプールと;
b)オリゴヌクレオチド種の第2のプールであって、
i)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1の末端および第2の末端を含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第2のプライマー結合ドメインを含む、第2のプールと
を含み;第1のプライマー結合ドメインと第2のプライマー結合ドメインが異なる、組成物。
組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
a)標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第1のプールとを結合させるステップであって、
i)前記標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを第1の末端に含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
iii)オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iv)オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1のプライマー結合ドメインを含み、
v)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、前記核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の前記第1のプールが結合し、それによって結合産物の第1のセットが形成される、ステップと;
b)結合産物の前記第1のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと;
c)前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の第2のプールとを結合させるステップであって、
i)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1の鎖および第2の鎖を含み、前記第1の鎖が、前記第2の鎖より短く、前記第1の鎖と前記第2の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第1の末端において相補的であり、前記第2の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第2の末端における一本鎖を含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の前記第2のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、
iii)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記第2の鎖上に第2のプライマー結合ドメインを含み、前記第1のプライマー結合ドメインと前記第2のプライマー結合ドメインが異なり、
iv)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物の少なくとも一方の末端に結合する条件下で、前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の前記第2のプールが結合し、それによって結合産物の第2のセットが形成される、ステップと
を含む方法。
をさらに含む、実施形態W1の方法。
i)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1のプライマー結合ドメインを含む、第1のプールと;
b)オリゴヌクレオチド種の第2のプールであって、
i)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1の鎖および第2の鎖を含み、第1の鎖が、第2の鎖より短く、第1の鎖と第2の鎖が、オリゴヌクレオチドの第1の末端において相補的であり、第2の鎖が、オリゴヌクレオチドの第2の末端における一本鎖を含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の第2のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、
(iii)オリゴヌクレオチド種の第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第2の鎖上に第2のプライマー結合ドメインを含む、第2のプールと
を含み;第1のプライマー結合ドメインと第2のプライマー結合ドメインが異なる、組成物。
組成物を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
a)標的核酸を含む核酸組成物とホスファターゼ活性を有する薬剤とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸を生成するステップであって、標的核酸の一部またはすべてが、オーバーハングを含む、ステップと;
b)脱リン酸化された標的核酸と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
i)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
ii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iii)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと
を含む方法。
a)標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップであって、
i)標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
iii)複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iv)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、ステップと;
b)ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成するステップであって、配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含む、ステップと;
c)リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成し、フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析から削除するステップと
を含む方法。
Claims (99)
- 核酸ライブラリーを生成する方法であって、
標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
a)前記標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み;
b)前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第2の末端に2本の非相補鎖を含み、前記オーバーハングが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し;
c)前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちの各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み;
d)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、前記核酸組成物と前記複数のオリゴヌクレオチド種が結合し、それによってハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。 - 前記複数のオリゴヌクレオチド種が、5’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび3’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチド種が、5’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、3’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、第1の末端にオーバーハングを含み、二重鎖部分を含み、第2の末端に2本の非相補鎖を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドオーバーハングが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチド種のうちのオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、請求項6、7または8に記載の方法。
- オーバーハングを含まない前記オリゴヌクレオチドが、平滑末端化された第1の末端を含み、二重鎖部分を含み、第2の末端に2本の非相補鎖を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの末端が、前記ハイブリダイゼーション産物において前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド鎖の3’末端が、ハイブリダイゼーション産物において前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる前記標的核酸の鎖の5’末端に共有結合で連結され得る、請求項11に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域と、2本の非相補鎖を含む少なくとも1つの末端とを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション産物が、二重鎖領域を含み、各末端に2本の非相補鎖を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、(i)5’オーバーハング、(ii)3’オーバーハング、(iii)特定の配列、(iv)(i)と(iii)の組合せ、または(v)(ii)と(iii)の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む前記標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、5’オーバーハングまたは3’オーバーハングを独立して含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸中の前記オーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸中の前記オーバーハングが、未修飾オーバーハングである、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、前記複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされる前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、前記ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸の末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、前記ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、請求項27に記載の方法。
- 標的核酸の5’末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの3’末端に共有結合で連結される条件下で、前記ハイブリダイゼーション産物とリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させることによって、ライゲーション産物を形成するステップを含む、請求項28に記載の方法。
- 標的核酸の3’末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの5’末端に共有結合で連結される条件下で、前記ライゲーション産物とニックシーリングリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させることによって、ニックがシールされたライゲーション産物を形成するステップを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記ライゲーション産物と鎖置換ポリメラーゼとを接触させることによって、平滑末端化された核酸断片を形成するステップを含む、請求項29に記載の方法。
- 標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップの前に、前記標的核酸とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸を生成するステップを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱リン酸化された標的核酸とホスホリル転移活性を有する作用因子とを、5’リン酸が標的核酸の5’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、請求項32に記載の方法。
- 標的核酸を含む核酸組成物と複数のオリゴヌクレオチド種とを結合させるステップの前に、前記複数のオリゴヌクレオチド種とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、前記オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、複数の脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種を生成するステップを含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド種の前記第2の末端の前記2本の非相補鎖のうちの少なくとも一方が、プライマー結合ドメインを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド種の前記第2の末端の前記2本の非相補鎖の各々が、プライマー結合ドメインを含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非相補鎖の一方が、第1のプライマー結合ドメインを含み、他方の非相補鎖が、第2のプライマー結合ドメインを含み、前記第1のプライマー結合ドメインと第2のプライマー結合ドメインが異なる、請求項36に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション産物またはそれらの増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングすることによって、配列リードを生成するステップであって、前記配列リードが、フォワード配列リードおよびリバース配列リードを含む、ステップを含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リバース配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を解析することによって解析を生成し、前記フォワード配列リードについてのオーバーハングの存在を示すオーバーハング識別配列に関連するオーバーハング情報を前記解析から削除するステップを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記標的核酸が、対象からの試料から得られる、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項40に記載の方法。
- 核酸ライブラリーを生成する方法であって、
a)標的核酸を含む核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の第1のプールとを結合させるステップであって、
i)前記標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを第1の末端に含み、各オリゴヌクレオチド種が、固有のオーバーハング配列およびオーバーハング長を有し、
iii)オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含み、
iv)オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1のプライマー結合ドメインを含み、
v)オリゴヌクレオチドオーバーハングが、対応する長さを有する標的核酸オーバーハングとハイブリダイズする条件下で、前記核酸組成物とオリゴヌクレオチド種の前記第1のプールが結合し、それによって結合産物の第1のセットが形成される、ステップと;
b)結合産物の前記第1のセットを切断することによって、切断産物を形成するステップと;
c)前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の第2のプールとを結合させるステップであって、
i)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、第1の鎖および第2の鎖を含み、前記第1の鎖が、前記第2の鎖より短く、前記第1の鎖と前記第2の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第1の末端において相補的であり、前記第2の鎖が、前記オリゴヌクレオチドの第2の末端における一本鎖を含み、
ii)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド種の前記第2のプールに特異的なオリゴヌクレオチド識別配列を含み、
iii)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内の各オリゴヌクレオチドが、前記第2の鎖上に第2のプライマー結合ドメインを含み、前記第1のプライマー結合ドメインと前記第2のプライマー結合ドメインが異なり、
iv)オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物の少なくとも一方の末端に結合する条件下で、前記切断産物とオリゴヌクレオチド種の前記第2のプールが結合し、それによって結合産物の第2のセットが形成される、ステップと
を含む方法。 - d)増幅条件下で、結合産物の前記第2のセットと2つまたはそれより多くの増幅プライマー種とを接触させることによって、増幅産物を生成するステップであって、第1のプライマー種が、前記第1のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第2のプライマー種が、前記第2のプライマー結合ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む、ステップ
をさらに含む、請求項42に記載の方法。 - 前記標的核酸が、500bpより大きい核酸断片を含む、請求項42または43に記載の方法。
- 前記標的核酸が、1000bpより大きい核酸断片を含む、請求項42または43に記載の方法。
- (b)が、結合産物の前記第1のセットと、前記結合産物を切断することができる1つまたは複数の切断作用因子とを、切断条件下で接触させることを含む、請求項42〜45のいずれか一項に記載の方法。
- (b)が、機械的せん断を含む、請求項42〜45のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、第2の末端に1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項42〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドの前記第2の末端の結合を遮断することができる、請求項48に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、前記第2の末端に1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項42〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、前記切断産物への前記オリゴヌクレオチドの前記第2の末端の結合を遮断することができる、請求項50に記載の方法。
- 前記増幅産物をシーケンシングプロセスによりシーケンシングするステップをさらに含む、請求項43〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シーケンシングプロセスが、短い配列リードを生成する、請求項52に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプールが、5’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドおよび3’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項42〜53のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプールが、5’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、3’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、およびオーバーハングを有さないオリゴヌクレオチドを含む、請求項42〜54のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、二重鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、請求項54または55に記載の方法。
- オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、(1)2本の鎖を含み、第1の末端にオーバーハングを含み、第2の末端に2本の非相補鎖を含むか、または(2)一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含む、請求項54〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドオーバーハングが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドを含む、請求項54〜57のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について異なる配列を有するオリゴヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項42〜58のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドが、特定のオーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、請求項59に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドが、各オーバーハング長について可能なすべてのオーバーハング配列の組合せを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドオーバーハング配列が、ランダムである、請求項59、60または61に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の前記第1のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる標的核酸の末端に共有結合で連結され得る、請求項42〜62のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端が、結合産物の前記第1のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる前記標的核酸の鎖の5’末端に共有結合で連結され得る、請求項63に記載の方法。
- (b)の後に前記切断産物の末端を修復するステップを含む、請求項42〜64のいずれか一項に記載の方法。
- (b)の後に前記切断産物の前記末端に1つまたは複数の不対合ヌクレオチドを付加させるステップを含む、請求項42〜65のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記切断産物に付加された前記1つまたは複数のヌクレオチドに相補的である1つまたは複数のヌクレオチドを前記第1の末端に含む、請求項66に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、前記第1の末端において、前記切断産物の少なくとも一方の末端とハイブリダイズする、請求項67に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドの末端が、結合産物の前記第2のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドが結合される切断産物の末端に共有結合で連結され得る、請求項42〜68のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端が、結合産物の前記第2のセットにおいて前記オリゴヌクレオチドが結合される前記切断産物の鎖の5’末端に共有結合で連結され得る、請求項69に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、ネイティブ標的核酸オーバーハングとハイブリダイズすることができるオーバーハングを含まない、請求項42〜70のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第2のプール内のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含まない、請求項42〜71のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内の各オリゴヌクレオチド上の前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的である、請求項42〜72のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内の各オリゴヌクレオチド上の前記オリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列が、前記オリゴヌクレオチドオーバーハングの長さに特異的であり、(i)5’オーバーハング、(ii)3’オーバーハング、(iii)特定の配列、(iv)(i)と(iii)の組合せ、または(v)(ii)と(iii)の組合せから選択されるオリゴヌクレオチドオーバーハングの1つまたは複数の特徴に特異的である、請求項42〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸の一部が、オーバーハングを含まない、請求項42〜74のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド種の前記第1のプール内のオリゴヌクレオチド種が、オーバーハングを含まず、オーバーハングを有さないことに特異的なオリゴヌクレオチドオーバーハング識別配列を含む、請求項42〜75のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む前記標的核酸が、二重鎖領域および一本鎖オーバーハングを含む、請求項42〜76のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングを含むか、または両方の末端にオーバーハングを含む、請求項42〜77のいずれか一項に記載の方法。
- オーバーハングを含む各標的核酸の末端または両方の末端が、5’オーバーハングまたは3’オーバーハングを独立して含む、請求項42〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、デオキシリボ核酸(DNA)断片を含む、請求項42〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA断片が、細胞から得られる、請求項80に記載の方法。
- 前記DNA断片が、ゲノムDNA断片を含む、請求項80または81に記載の方法。
- 前記標的核酸が、無細胞核酸断片を含む、請求項42〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、循環無細胞核酸断片を含む、請求項42〜83のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸の前記オーバーハングが、ネイティブオーバーハングである、請求項42〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸中の前記オーバーハングが、未修飾オーバーハングである、請求項42〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、前記複数のオリゴヌクレオチド種と結合させるステップの前に、長さについて修飾されない、請求項42〜86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸の末端が、それがハイブリダイズされる前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の前記第1のセットを曝露するステップを含む、請求項42〜87のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸の末端が、前記標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の前記第1のセットとリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、請求項88に記載の方法。
- 前記切断産物の末端が、それが結合される前記オリゴヌクレオチドの末端に結合される条件に、結合産物の前記第2のセットを曝露するステップを含む、請求項42〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 切断産物の末端が、前記標的核酸が結合される前記オリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、結合産物の前記第2のセットとリガーゼ活性を有する作用因子とを接触させるステップを含む、請求項90に記載の方法。
- (a)の前に、前記標的核酸組成物とホスファターゼ活性を有する作用因子とを、標的核酸が脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化された標的核酸組成物を生成するステップを含む、請求項42〜91のいずれか一項に記載の方法。
- (a)の前に、前記脱リン酸化された標的核酸組成物とホスホリル転移活性を有する作用因子とを、5’リン酸が標的核酸の5’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、請求項92に記載の方法。
- (a)の前に、オリゴヌクレオチド種の前記第1のプールとホスファターゼ活性を有する作用因子とを、前記オリゴヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させることによって、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド種の第1のプールを生成するステップを含む、請求項42〜93のいずれか一項に記載の方法。
- (c)の前に、オリゴヌクレオチド種の前記第2のプールとホスホリル転移活性を有する作用因子とを、5’リン酸が前記第1の鎖の5’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、請求項42〜94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、対象からの試料から得られる、請求項42〜95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項96に記載の方法。
- (a)の前に、前記標的核酸を断片長に従って分離するステップを含む、請求項42〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、(a)の前に長さによって分離されない、請求項42〜97のいずれか一項に記載の方法。
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