ES2881977T3 - Preparaciones liposomales para cribado no invasivo prenatal o de cáncer - Google Patents

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Abstract

Uso de liposomas para reducir la agregación de los ácidos nucleicos de un control para uso in vitro para identificar una pluralidad de genotipos, comprendiendo el control liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo de la pluralidad de genotipos, y la primera mezcla de ácidos nucleicos está incorporada en los liposomas.

Description

DESCRIPCIÓN
Preparaciones liposomales para cribado no invasivo prenatal o de cáncer
ANTECEDENTES
Los cribados de aneuploidía no invasivos prenatales consistentemente precisos para detectar trastornos genéticos tales como trisomía 21 del síndrome de Down, trisomía 18 del síndrome de Edwards y trisomía 13 del síndrome de Patau son de importancia crucial para las mujeres embarazadas y sus familias. Sin embargo, se han informado resultados incorrectos para muestras de control negativas. Por ejemplo, Takoudes y Hamar informaron resultados cuando un control negativo, por ejemplo, una muestra de plasma de una paciente hembra no embarazada, se envió a 5 laboratorios de ensayos clínicos para ensayos de aneuploidía (Ultrasound Obstetrics Gynecology 45: 112 (2015)). Dos laboratorios informaron los resultados correctos, sin suficiente ADN fetal, dos laboratorios informaron que no había aneuploidía normal XX y un laboratorio informó un feto normal con aneuploidía. Los resultados incorrectos sugieren que el ensayo no se validó correctamente o que el ensayo se realizó sin los controles de ejecución apropiados.
Para evaluar si un ensayo se ha realizado dentro de las especificaciones, generalmente se requieren controles. En ensayos clínicos, los controles son fundamentales para reducir el riesgo de proporcionar información de resultados incorrectos debido a fallos de ensayo no detectados de otro modo. En ensayos prenatales, los fetos con anomalías cromosómicas son raros - incluso en mujeres embarazadas de "alto riesgo" - y se están volviendo aún más raros a medida que más mujeres de riesgo medio y bajo se someten a cribado prenatal no invasivo (NIPS). En el ensayo NIPS, generalmente se analizan múltiples muestras en paralelo y, aun así, existe una alta probabilidad de que ninguna de las muestras contenga ADN sin células de origen fetal ("ADNcf') con anomalías cromosómicas. Al incluir un control que imita el ADNcf que contiene ADNcf de origen fetal con una o más anomalías cromosómicas, es posible evaluar si un ensayo es capaz de detectar tales anomalías en las otras muestras que se analizaron. Por lo tanto, los controles mejorados para los ensayos de ADNcf podrían mejorar la calidad de los ensayos de diagnóstico. El documento de patente US 2014/0287946 A1 se refiere a tecnología relacionada con la detección de ácidos nucleicos en una muestra. El documento WO 02/18635 A2 se refiere al uso de partículas no viables que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de control interno como control interno en análisis basados en ácidos nucleicos.
SUMARIO
Algunas realizaciones de la invención se presentan en las reivindicaciones. La reivindicación 1 menciona el uso de liposomas para reducir la agregación de los ácidos nucleicos de un control para uso in vitro para identificar una pluralidad de genotipos, comprendiendo el control liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo de la pluralidad de genotipos, y la primera mezcla de ácidos nucleicos está incorporada en los liposomas.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para identificar un genotipo, que comprende liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la pluralidad de genotipos. Al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos del control pueden estar asociados a los liposomas. El control puede comprender además una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo genotipo, en donde el genotipo y el segundo genotipo son genotipos alternativos que se encuentran en el mismo locus genético. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control. El genotipo puede estar asociado a una enfermedad, tal como una neoplasia, un provirus o una enfermedad hereditaria.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para identificar una pluralidad de genotipos, que comprende liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, y cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo de la pluralidad de genotipos. Al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos del control pueden estar asociados a los liposomas. El control puede comprender además una segunda mezcla de ácidos nucleicos, en donde la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, y cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad es un genotipo alternativo que se encuentra en el mismo locus genético que una secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para determinar la ploidía de un cromosoma en un feto. El control puede comprender una primera mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la primera secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma; la segunda secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con un cromosoma diferente; y la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos es mayor que 1:1.
En algunos casos, el control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos, en donde la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos es aproximadamente 1:1. Del mismo modo, en algunos casos, el control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos es aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla; la primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla y la primera secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla consisten en la misma secuencia de nucleótidos; y la segunda secuencia de nucleótidos de la primera mezcla y la segunda secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla consisten en la misma secuencia de nucleótidos. El control puede comprender liposomas, por ejemplo, en donde al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos en el control están asociados a los liposomas. El cromosoma puede ser, por ejemplo, un cromosoma humano 8, 9, 13, 18, 21, 22, o X, que puede presentar aneuploidía en un feto humano viable. El cromosoma diferente puede ser, por ejemplo, un cromosoma humano 1, 6, o 7, que a menudo se usan como cromosomas de referencia para determinar la ploidía de un genoma. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para determinar la ploidía de un cromosoma en un feto. El control puede comprender una primera mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos y una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma; la segunda pluralidad de la secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con al menos un autosoma, en donde el al menos un autosoma no comprende el cromosoma; y la proporción del número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la primera pluralidad con respecto al número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la segunda pluralidad es aproximadamente 3:2. En algunos casos, el control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos y la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la proporción del número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la primera pluralidad con respecto al número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la segunda pluralidad es aproximadamente 1:1. Del mismo modo, en algunos casos, el control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos y una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la proporción del número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la primera pluralidad con respecto al número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la segunda pluralidad es aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla; la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla y la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla consisten en las mismas secuencias de nucleótidos; y la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla y la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla consisten en las mismas secuencias de nucleótidos. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control. El control puede comprender liposomas, por ejemplo, en donde al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos en el control están asociados a los liposomas.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para determinar la ploidía de los cromosomas sexuales en un feto. El control puede comprender una primera mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la primera secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma Y; la segunda secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con un autosoma; y la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos es aproximadamente 1:1. El control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos, en donde la segunda mezcla de ácidos nucleicos no comprende una secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con el cromosoma Y. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control. El control puede comprender liposomas, por ejemplo, en donde al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos en el control están asociados a los liposomas.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para determinar la ploidía de los cromosomas sexuales en un feto. El control puede comprender una primera mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos, y una tercera secuencia de nucleótidos, en donde la primera secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma X; la segunda secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con un autosoma; una tercera secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma Y; y la proporción del número de copias de la primera, segunda, y tercera secuencias de nucleótidos es aproximadamente 2:2:1. En algunos casos, el control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos, en donde la proporción del número de copias de la primera y la segunda secuencias de nucleótidos es aproximadamente 1:1; y la segunda mezcla de ácidos nucleicos no comprende una secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con el cromosoma Y. Del mismo modo, en algunos casos, el control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la proporción del número de copias de la primera y la segunda secuencias de nucleótidos es aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla; la primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla y la primera secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla consisten en la misma secuencia de nucleótidos; la segunda secuencia de nucleótidos de la primera mezcla y la segunda secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla consisten en la misma secuencia de nucleótidos; y la segunda mezcla de ácidos nucleicos no comprende una secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con el cromosoma Y. El control puede comprender liposomas, por ejemplo, en donde al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos en el control están asociados a los liposomas. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para determinar el sexo de un feto. El control puede comprender una primera mezcla de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con un cromosoma humano Y. El control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos que no comprende una secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma humano Y. El control puede comprender liposomas, por ejemplo, en donde al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos en el control están asociados a los liposomas.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para identificar o caracterizar una enfermedad o afección, que comprende liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos de un microARN ("miARN" o "miR"). Al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos del control pueden estar asociados a los liposomas.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control para uso para identificar o caracterizar una enfermedad o afección, que comprende liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN. Al menos aproximadamente un 90 % de los ácidos nucleicos del control pueden estar asociados a los liposomas.
En algunos casos, la divulgación se refiere a un método para validar un ensayo de diagnóstico para el análisis de ADN libres de células circulantes, que comprende realizar el ensayo de diagnóstico en un control como se describe en el presente documento, en donde el ensayo de diagnóstico se valida si identifica correctamente el genotipo del control.
En el presente documento también se desvela un método para determinar si una muestra comprende un genotipo, que comprende realizar un ensayo de diagnóstico en la muestra y realizar el ensayo de diagnóstico en un control como se describe en el presente documento, en donde el control comprende el genotipo. En algunos casos, se encuentra que la muestra comprende el genotipo si el ensayo de diagnóstico indica que tanto la muestra como el control comprenden el genotipo; se encuentra que la muestra no comprende el genotipo si el ensayo de diagnóstico indica que la muestra no comprende el genotipo pero que el control comprende el genotipo; y se encuentra que el ensayo de diagnóstico no es concluyente si el ensayo indica que el control no comprende el genotipo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 presenta un flujo de trabajo de preparación para producir controles de acuerdo con algunas realizaciones de la invención.
La Figura 2 consta de tres paneles, etiquetados como panel (A), (B) y (C). El panel (A) representa el cariotipo para la línea celular T13 C3, que es un genotipo masculino con trisomía en el cromosoma 13. El panel (B) representa el cariotipo para la línea celular T18 C1, que es un genotipo masculino con trisomía en el cromosoma 18. El panel (C) representa el cariotipo para la línea celular T21 C2, que es un genotipo femenino con trisomía en el cromosoma 21.
La Figura 3 es una imagen de un gel de agarosa al 2 % que comprende ADN fragmentado a aproximadamente 170 pb usando un aparato de ultrasonidos Covaris.
La Figura 4 es una representación con el sistema Bioanalyzer 2100 de fluorescencia ("FU") con respecto a longitud de ácido nucleico ("pb") para ácidos nucleicos de la línea celular T13 C3 fragmentados a aproximadamente 150 pb (etiquetado como "1") y un segundo a aproximadamente 170 pb (etiquetado como "2") usando un aparato de ultrasonidos Covaris.
La Figura 5 representa trazas de cromatografía de intercambio aniónico apiladas para tres preparaciones de ADN (Muestras A, B, y C) cargadas en liposomas de DMPC y extruidas a través de un disco de extrusión de policarbonato de 100 nm, así como liposomas "fantasma", que no contienen ADN y una alícuota de ADN fragmentado, que no se incorporó en un liposoma. Los liposomas no interactúan con la fase estacionaria, mientras que el ADN desnudo se une a la fase estacionaria y eluye al aumentar la concentración de sal.
La Figura 6 es un informe de NTA, que mide el tamaño de las partículas, la polidispersidad y la concentración. Los datos son representativos de liposomas de DMPC cargados con ADN y extruidos a través de un disco de extrusión de policarbonato de 100 nm.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la distribución de tamaño de tres preparaciones de liposomas de DMPC cargados con ADN extruidos a través de un disco de extrusión de policarbonato de 100 nm, así como un liposoma "fantasma" correspondiente, que no contiene ADN.
La Figura 8 representa las concentraciones de ADN mediante análisis PicoGreen de siete preparaciones de liposomas de DMPC/DDAB al 2,5 % cargados con ADN extruidos a través de un disco de extrusión de policarbonato de 200 nm, así como una curva patrón, que se preparó usando una dilución en serie de ADN fragmentado a aproximadamente 170 pares de bases. También se muestran la concentración de LipoADN y las tasas de incorporación.
La Figura 9 es un gráfico del número de copias de cromosomas en diversas muestras de acuerdo con lo determinado por ddPCR (lector de gotas Bio-Rad QX200™). Cada muestra contenía ADN genómico purificado, que se había digerido con un cóctel de enzimas de restricción, obtenido a partir de las líneas celulares indicadas. La Figura 10 es un gráfico de los valores cromosómicos normalizados para muestras que comprenden diversas concentraciones de ADN aneuploide (es decir, ADN de trisomía 21).
La Figura 11 es un gráfico que representa la frecuencia de lectura observada con respecto a la esperada para cromosomas individuales. Los ácidos nucleicos extraídos en gel, que tienen un contenido de GC más alto que otras muestras, presentaron frecuencias observadas que variaban considerablemente de los valores esperados y de otras muestras.
La Figura 12 es un gráfico que representa las puntuaciones z para el número de veces que se calcula un cromosoma en una muestra con respecto a otros cromosomas de la muestra. La muestra fragmentada comprende ADN de trisomía 21.
La Figura 13 es un gráfico que representa las puntuaciones z para el número de veces que se calcula que se encuentra el cromosoma 21 en una muestra con respecto a otros cromosomas de la muestra. NIFTY 903 (muestras de 903 pacientes), STL001/2/3, NA12878, y NA24385 son puntos de datos de secuencias disponibles públicamente. La muestra de "Factor V" es la fuente de "ADN materno". La muestra "T21 al 100 %" comprende ADN genómico con trisomía 21. Las muestras "T21 al 25 %" y "T21 al 3 %" comprenden mezclas de ADN de T21 al 100 % y ADN de Factor V. La encapsulación de liposomas no dio como resultado un efecto notable en la detección de aneuploidía del cromosoma 21.
La Figura 14 es un gráfico que representa el uso de diversos controles de la invención en un ensayo de micromatriz usado para detectar trisomía 21.
La Figura 15 es una traza del sistema Bioanalyzer que representa la abundancia relativa de ADN en los tamaños observados en dos muestras después de almacenamiento durante 66 días a 42 °C (Ejemplo 12). La traza sugiere que un control de trisomía 21 sin liposomas agregados mientras que un control de trisomía 21 que comprende liposomas básicamente no mostró agregación.
La Figura 16 es un gráfico de NCV para los cromosomas 13, 18, y 21 obtenido mediante secuenciación de nueva generación para muestras que comprenden liposomas que se almacenaron a diversas temperaturas. El gráfico muestra que el cromosoma 13 presentaba poliploidía, pero los cromosomas 18 y 21 no la presentaban. La Figura 17 es un gráfico de la frecuencia alélica calculada para los controles que contienen nueve genotipos (siete están incluidos en el ensayo) asociados a neoplasias y ADN genómico a una concentración de ADN de genotipo con respecto a genómico de un 0,13 %, un 0,63 %, un 1,25 %, y un 5,0 %. Estos controles no comprenden liposomas.
La Figura 18 es una imagen de un gel de agarosa al 1 % que muestra el ADN de control antes ("no fragmentado") y después ("fragmentado") de fragmentar el ADN.
La Figura 19 es una traza del sistema Bioanalyzer que confirma que el ADN de control se fragmentó en tamaños que varían de 150 pares de bases a 170 pares de bases.
La Figura 20 es un gráfico de la frecuencia alélica real ("AF objetivo") con respecto a la frecuencia alélica observada ("AF media mediante secuenciación") para cuatro controles que contienen un 0,1 %, un 0,63 %, un 1.25 %, o un 5 % de ADN mutante con respecto al ADN total. El ADN total consistió en el ADN mutante y el ADN genómico. El ADN mutante constaba de partes de 9 genes y cada secuencia comprendía una mutación asociada a cáncer. Los valores de "AF media mediante secuenciación" son la media de las frecuencias alélicas de los 9 genes identificados durante un único análisis de NGS de cada uno de los cuatro controles.
La Figura 21 es un gráfico de la frecuencia alélica calculada (eje y) obtenida mediante secuenciación de nueva generación de las nueve mutaciones diferentes (eje x) en muestras de control, en donde las muestras de control comprenden una frecuencia alélica de un genotipo mutante con respecto al ADN genómico de un 5 %, un 1.25 %, un 0,63 %, un 0,1 %, o un 0 %.
La Figura 22 es una imagen de un gel de agarosa al 0,6 % que representa el ADN genómico de líneas celulares aneuploides antes y después de la fragmentación.
La Figura 23 es una traza del sistema Bioanalyzer para controles que comprenden ADN de trisomía 13 (T13), trisomía 18 (T18), o trisomía 21 (T21). La traza muestra que el pico máximo de los ácidos nucleicos en el control de trisomía 13 es de 131 pares de bases, el pico máximo en el control de trisomía 18 es de 145 pares de bases, y el pico máximo en el control de trisomía 21 es de 149 pares de bases.
La Figura 24 es un gráfico de barras que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido para los cromosomas 13, 18, y 21 en tres alícuotas de un control de trisomía 13.
La Figura 25 es un gráfico de barras que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido para los cromosomas 13, 18, y 21 en tres alícuotas de un control de trisomía 18.
La Figura 26 es un gráfico de barras que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido para los cromosomas 13, 18, y 21 en tres alícuotas de un control de trisomía 21.
La Figura 27 es un gráfico que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido de los cromosomas 21 y 13 en controles que comprenden un 1 %, un 2 %, un 4 %, o un 8 % de ADN de trisomía 21 con respecto al NCV medido del cromosoma Y (eje x). El ADN genómico de trisomía 21 comprende un cromosoma Y, y el resto del ADN genómico (ADN "materno" simulado) no comprende un cromosoma Y.
La Figura 28 es un gráfico que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido de los cromosomas 21 y 18 en controles que comprenden un 1 %, un 2 %, un 4 %, o un 8 % de ADN de trisomía 21 con respecto al NCV medido del cromosoma Y (eje x). El ADN genómico de trisomía 21 comprende un cromosoma Y, y el resto del ADN genómico (ADN "materno" simulado) no comprende un cromosoma Y.
La Figura 29 es un gráfico que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido de los cromosomas 21 e Y en controles que comprenden un 1 %, un 2 %, un 4 %, o un 8 % de ADN de trisomía 21 con respecto a la concentración medida de ADN genómico de trisomía 21 ("% de Fracción Fetal mediante dPCR"; eje x). El ADN genómico de trisomía 21 comprende un cromosoma Y, y el resto del ADN genómico (ADN "materno" simulado) no comprende un cromosoma Y.
La Figura 30 es un gráfico de barras que representa el valor cromosómico normalizado (NCV) medido para los cromosomas 13, 18, y 21 en tres alícuotas de un control de trisomía de múltiples analitos, que comprende un 12 % de ADN genómico de trisomía 13, un 12 % de ADN genómico de trisomía 18, y un 12 % de ADN genómico de trisomía 21.
La Figura 31 consta de tres paneles, los paneles etiquetados como (A), (B), y (C). Cada panel es un gráfico que representa la estabilidad de los controles de trisomía 21 que comprenden liposomas o sin liposomas tal como se evalúa mediante PCR digital. Los controles se almacenaron a 2-8 °C ("Estabilidad con refrigeración; panel (A)), 22 °C ("Estabilidad a temperatura ambiente; panel (B)), o 42 °C ("Estabilidad a 42 °C; panel (A)). La Pc R digital no detectó ninguna diferencia entre controles que comprenden liposomas y controles que no comprenden liposomas. La PCR digital tampoco detectó un efecto de la temperatura en la estabilidad.
La Figura 32 es un gráfico que muestra los valores cromosómicos normalizados (NCV) de los cromosomas 13, 18, y 21 para controles de trisomía 21 que comprenden liposomas tal como se mide mediante secuenciación de nueva generación en una plataforma Illumina HiSeq ya sea inmediatamente después de la fabricación (Tiempo 0), después de almacenamiento durante 47 o 125 días a 2-8 °C, o después de almacenamiento durante 47 o 125 días a 42 °C.
La Figura 33 es un gráfico del porcentaje calculado de ADN de trisomía en nuestras que comprenden cualquiera de ADN de trisomía 13 masculino o ADN de trisomía 18 masculino y ADN libres de células circulantes femenino (eje x) frente al valor cromosómico normalizado medido (NCV; eje y).
La Figura 34 es un gráfico del porcentaje de ADN de trisomía en nuestras que comprenden ADN de trisomía 21 y ADN libres de células circulantes femenino (eje x) frente al valor cromosómico normalizado medido (NCV) para los cromosomas 13, 18, y 21 (eje y).
La Figura 35 es un diagrama de un control de trisomía 13. El control comprende liposomas (línea de puntos) y ácidos nucleicos asociados a los liposomas. Los ácidos nucleicos incluyen una primera mezcla de ácidos nucleicos y una segunda mezcla de ácidos nucleicos. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede codificar básicamente todo un genoma humano de trisomía 13, tal como un genoma citotrofoblástico humano. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar básicamente todo un genoma humano de euploidía, tal como un genoma femenino de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad tiene homología de secuencia con el cromosoma 13 (o con el cromosoma 18 o con el cromosoma 21). La primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar o no básicamente todo el cromosoma 13. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad tiene homología de secuencia con al menos un autosoma que no comprende el cromosoma 13, tal como el cromosoma 6. La segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar o no básicamente todo el al menos un autosoma; por ejemplo, la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todos los cromosomas 1, 6, y/o 7. La proporción del número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la primera pluralidad con respecto al número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la segunda pluralidad es aproximadamente 3:2 en la primera mezcla de ácidos nucleicos, es decir, porque un genoma de trisomía 13 humano comprende 3 copias del cromosoma 13 y 2 copias de cualquier otro autosoma. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, es decir, que tiene homología de secuencia con el cromosoma 13, y la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos. La proporción del número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la primera pluralidad con respecto al número de copias para cualquier secuencia de nucleótidos en la segunda pluralidad es aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos, es decir, porque un genoma humano de euploidía comprende 2 copias de cada autosoma. La composición puede comprender ácidos nucleicos a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. De aproximadamente un 2 % a un 32 % de los ácidos nucleicos del control pueden ser ácidos nucleicos de la primera mezcla y de aproximadamente un 68 % a un 98 % de los ácidos nucleicos del control pueden ser ácidos nucleicos de la segunda mezcla.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Visión de conjunto
En algunos aspectos, la invención que se describe en el presente documento es una metodología que se puede aplicar ampliamente para crear procesos completos, controles intercambiables y similares al paciente para cribado, ensayo y/o diagnóstico in vitro utilizando ADN libres de células circulantes (ADNcf) como un biomarcador de interés.
El ADNcf es un marcador directo de células normales o enfermas y, por lo tanto, es un biomarcador ideal para análisis genético fetal y para identificar tumores metastásicos. En este contexto, el ADNcf se define como el ADN que se encuentra en la sangre circulante, que es extracelular y puede estar asociado a cuerpos apoptóticos, nucleosomas, vesículas extracelulares o en otra forma extracelular. De manera característica, el ADNcf tiene un tamaño truncado, por ejemplo, como resultado de la escisión enzimática in vivo, que generalmente da como resultado fragmentos que tienen una longitud de 150-200 pares de bases. Además, el ADNcf es escaso en sangre, con concentraciones habituales de 5-50 ng/ml. Algunas aplicaciones para el análisis de ADNcf se están expandiendo e incluyen cribado/ensayo prenatal no invasivos (NIPS/NIPT) y el análisis del ADN tumoral circulante se relaciona con el diagnóstico y las terapias del cáncer.
Definiciones
La expresión "número de copias", como se usa en el presente documento, se refiere al número de veces que una secuencia de nucleótidos se encuentra en una composición, tal como un control o una mezcla de ácidos nucleicos. Una secuencia de nucleótidos se puede encontrar como una subsecuencia en diferentes ácidos nucleicos. Por ejemplo, diez copias de una secuencia de nucleótidos de 35 pares de bases se pueden encontrar en diez ácidos nucleicos diferentes en una mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, en donde cada uno de los diez ácidos nucleicos diferentes tiene diferentes longitudes. Del mismo modo, la expresión "número de copias" puede hacer referencia a la concentración de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, por unidad de volumen. Por ejemplo, se pueden encontrar diez copias de una secuencia de nucleótidos de 35 pares de bases, de media, por cada microlitro de volumen.
El término "control" puede hacer referencia a una muestra de control, control de proceso, control de ejecución, control positivo, control negativo, muestra de validación, muestra de aptitud, material de referencia, patrón o patrón analítico. Un control puede ser un control positivo, por ejemplo, para monitorizar el rendimiento de un ensayo de diagnóstico, tal como sensibilidad, exactitud y/o precisión. Un control puede ser un patrón analítico, por ejemplo, para calibrar un ensayo de diagnóstico o para evaluar su sensibilidad. Un control puede ser un control de proceso, por ejemplo, para monitorizar la sensibilidad, exactitud y/o precisión de un ensayo de diagnóstico durante un solo ensayo o para evaluar tendencias a lo largo del tiempo (por ejemplo, deriva). Se puede usar un control de proceso para monitorizar un proceso completo desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos o cualquier etapa intermedia. Un control puede ser un control de ejecución, tal como una muestra de control, por ejemplo, para monitorizar la sensibilidad, exactitud y/o precisión de un ensayo de diagnóstico en paralelo con una muestra de paciente. Un control puede ser un patrón, por ejemplo, para calibrar un ensayo de diagnóstico o para usar en la medición de la concentración de ácido nucleico en una muestra paralela (tal como ácido nucleico libres de células circulantes).
La expresión "ensayo de diagnóstico" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier prueba, cribado, ensayo o método que se pueda usar para caracterizar un genotipo, tal como aneuploidía, variante de número de copias, alelomorfismo, polimorfismo, variante de corte y empalme, variante reguladora, mutación, indel, repetición de trinucleótidos, codón de parada prematura, translocación, reordenamiento somático, fusión génica o la presencia de secuencias de nucleótidos extrañas o exógenas (por ejemplo, un provirus), mediante el análisis de una muestra de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ensayo de diagnóstico puede hacer referencia a secuenciación de nueva generación ("NGS") o un ensayo de diagnóstico puede comprender NGS, por ejemplo, y análisis posterior. Del mismo modo, un ensayo de diagnóstico puede hacer referencia a cualquier tipo de secuenciación de ácidos nucleicos, o un ensayo de diagnóstico puede comprender cualquier tipo de secuenciación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un ensayo de diagnóstico puede hacer referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, tal como análisis de micromatrices de ADN. Del mismo modo, un ensayo de diagnóstico puede comprender la hibridación de ácidos nucleicos, tal como análisis de micromatrices de ADN. En algunas realizaciones, un ensayo de diagnóstico puede hace referencia a PCR cuantitativa (qPCR) o PCR digital (dPCR), o un ensayo de diagnóstico puede comprender qPCR o dPCR.
El término "codificar" como se usa en el presente documento se refiere a una propiedad de una o más secuencias de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos puede codificar un genotipo si la secuencia de nucleótidos comprende información suficiente para identificar el genotipo. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos codifica el genotipo de la enfermedad de Huntington si la secuencia de nucleótidos comprende información suficiente para identificar (1) una secuencia del gen de Huntington y (2) un número perjudicial de repeticiones del trinucleótido CAG. Una secuencia de nucleótidos puede codificar un genotipo alterno que se encuentre en el mismo locus genético que el genotipo de la enfermedad de Huntington si la secuencia de nucleótidos comprende información suficiente para identificar (1) una secuencia del gen de Huntington y (2) que el gen de Huntington no comprenda un número perjudicial de repeticiones del trinucleótido CAG. Por lo tanto, muchas secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar ya sea el genotipo de la enfermedad de Huntington, un genotipo alterno que se encuentra en el mismo locus genético que el genotipo de la enfermedad de Huntington, o cualquier genotipo. Del mismo modo, uno o más ácidos nucleicos pueden codificar un genotipo porque los ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos. Por lo tanto, una pluralidad de ácidos nucleicos o una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden codificar una pluralidad de genotipos. Además, una mezcla de ácidos nucleicos puede codificar un genoma o básicamente todo un genoma, por ejemplo, una mezcla de ácidos nucleicos puede codificar una pluralidad de genotipos que comprenden básicamente todos los genotipos en un genoma. Como se usa en el presente documento, una mezcla de ácidos nucleicos codifica básicamente todo un genoma si la mezcla de ácidos nucleicos se obtuvo, por ejemplo, aislando ácidos nucleicos de una o mas células y fragmentando los ácidos nucleicos aislados, aunque algunas secuencias de nucleótidos se pueden empobrecer o perder durante el aislamiento, fragmentación, u otras etapas. Una mezcla de ácidos nucleicos puede codificar básicamente todo un genoma incluso si la mezcla no comprende, por ejemplo, secuencias de nucleótidos mitocondriales. Como se define en el presente documento, una mezcla de ácidos nucleicos puede codificar la ploidía de un cromosoma, tal como aneuploidía, si la mezcla de ácidos nucleicos comprende información suficiente para identificar la proporción entre el número de copias de una o más secuencias de nucleótidos que tienen homología de secuencia con el cromosoma con respecto al número de copias de una o más secuencias de nucleótidos que tienen homología de secuencia con al menos un cromosoma diferente. Del mismo modo, una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar la ploidía de un cromosoma, tal como aneuploidía, si la pluralidad comprende información suficiente para identificar la proporción entre el número de copias de una o más secuencias de nucleótidos que tienen homología de secuencia con el cromosoma con respecto al número de copias de una o más secuencias de nucleótidos que tienen homología de secuencia con al menos un cromosoma diferente.
El término "feto" como se usa en el presente documento se refiere a un mamífero en cualquier estadio de desarrollo entre la concepción y el nacimiento.
El término "genotipo" se refiere a un rasgo genético, tal como aneuploidía, variante de número de copias, alelomorfismo, polimorfismo, variante de corte y empalme, variante reguladora, mutación, indel, repetición de trinucleótidos, codón de parada prematura, translocación, reordenamiento somático, fusión génica o la presencia de una secuencia de nucleótidos extraña o exógena, tal como un virus, provirus o bacterias.
El término "liposoma" se refiere a una composición lamelar que comprende lípidos anfifílicos, que generalmente forman una bicapa lipídica que define un compartimento acuoso. Un liposoma puede ser artificial, de origen natural o derivado, al menos en parte, de lípidos de origen natural. Por ejemplo, el término liposoma, como se usa en el presente documento, puede hacer referencia a una vesícula de origen celular, tal como una microvesícula, un exosoma o un cuerpo apoptótico. Del mismo modo, un liposoma puede hacer referencia a una vesícula que comprende lípidos de origen celular. Tales liposomas pueden comprender componentes celulares, tales como proteínas transmembrana, o pueden estar sustancialmente libres de componentes celulares. Un liposoma puede ser una vesícula mutilamelar o una vesícula unilamelar, tal como una vesícula unilamelar pequeña o una vesícula unilamelar grande. En ciertas realizaciones, los liposomas comprenden vesículas unilamelares.
La expresión "mezcla de ácidos nucleicos" se refiere a una composición que comprende al menos dos ácidos nucleicos con diferentes secuencias de nucleótidos, es decir, un primer ácido nucleico puede comprender una primera secuencia de nucleótidos y un segundo ácido nucleico puede comprender una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la primera y la segunda secuencias de nucleótidos son diferentes. Sin embargo, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos pueden estar relacionadas. Por ejemplo, la primera secuencia de nucleótidos puede tener un 100 % de identidad de secuencia con una subsecuencia de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera y la segunda secuencias de nucleótidos puede variar solo en que la segunda secuencia de nucleótidos es más larga que la primera secuencia de nucleótidos. Del mismo modo, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos pueden comprender regiones con un 100 % de identidad de secuencia. La primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos pueden estar relacionadas porque se obtienen a partir del mismo genoma. En ciertas realizaciones, cada ácido nucleico en una mezcla de ácidos nucleicos se obtiene a partir de un solo genoma (por ejemplo, un solo genoma humano, que se puede obtener a partir de una línea celular humana) o se puede diseñar para replicar una característica de un solo genoma, tal como un genotipo (por ejemplo, aneuploidía, polimorfismo, mutación, alelomorfismo, etc.). Por lo tanto, en algunas realizaciones, una mezcla de ácidos nucleicos consiste en ácidos nucleicos que se aíslan de una línea celular humana, tal como una línea celular femenina o una línea celular que comprende un genotipo o una pluralidad de genotipos asociados a una enfermedad (por ejemplo, aneuploidía, una neoplasia o una enfermedad hereditaria), que se puede procesar además, por ejemplo, para ajustar el tamaño de los ácidos nucleicos a un rango deseado. Una mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos que se aíslan de un solo genoma y ácidos nucleicos adicionales, que se pueden añadir, por ejemplo, para introducir secuencias de nucleótidos que codifiquen un genotipo, por ejemplo, para permitir que la mezcla de ácidos nucleicos sirva como un control de genotipos adicionales, o para enmascarar un genotipo, por ejemplo, para someter a ensayo la solidez de un ensayo de diagnóstico. Una mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos que se aíslan a partir de un solo genoma pero sin una o más secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para retirar secuencias de nucleótidos mitocondriales o ribosómicos. Una mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener directamente a partir de un genoma, por ejemplo, mediante el aislamiento de los ácidos nucleicos del genoma, o una mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de un genoma indirectamente, por ejemplo, amplificando las secuencias de nucleótidos en un genoma y/o clonando las secuencias de nucleótidos de un genoma. Una mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos que no se obtienen a partir del mismo genoma; por ejemplo, la mezcla se puede diseñar para replicar una característica de un solo genoma. Por ejemplo, una mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera secuencia de nucleótidos con homología de secuencia con un primer cromosoma y una segunda secuencia de nucleótidos con homología de secuencia con un segundo cromosoma, en donde cada secuencia de nucleótidos se obtiene a partir del mismo genoma, la primera y la segunda secuencias de nucleótidos se obtienen a partir de diferentes genomas, o la primera y/o la segunda secuencias de nucleótidos se sintetizan y/o se clonan.
El término "neoplasia" se refiere a tumores, tumores benignos, tumores precancerosos, tumores malignos, cánceres, cánceres metastásicos, tumores metastásicos, leucemia y linfomas, en donde una célula neoplásica tiene un genotipo asociado a la neoplasia.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a una molécula de ADN o ARN. Cada uno de los ácidos nucleicos monocatenarios comprende una secuencia de nucleótidos que abarca la longitud del ácido nucleico y múltiples secuencias de nucleótidos diferentes que son subsecuencias de la secuencia de un nucleótido. Del mismo modo, cada uno de los ácidos nucleicos bicatenarios comprende dos secuencias de nucleótidos que abarcan la longitud del ácido nucleico y múltiples secuencias de nucleótidos diferentes que son subsecuencias de las dos secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, un ácido nucleico bicatenario que tiene 10 pares de bases de longitud comprende dos secuencias de nucleótidos que tiene cada una 10 nucleótidos de longitud (y relacionado en que una secuencia es el complemento inverso de la otra secuencia); el mismo ácido nucleico bicatenario comprende cuatro secuencias de nucleótidos que tienen 9 nucleótidos de longitud y seis secuencias de nucleótidos que tienen 8 nucleótidos de longitud, etc.
La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos consecutivos, por ejemplo, en una molécula de ADN o ARN. Una secuencia de nucleótidos puede ser una subsecuencia de una secuencia de nucleótidos diferente y más larga. Una mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que es más larga que los ácidos nucleicos de la mezcla, por ejemplo, cuando la mezcla de ácidos nucleicos se genera a partir de ácidos nucleicos más largos (por ejemplo, fragmentando ADN genómico); tales secuencias de nucleótidos se pueden identificar, por ejemplo, mediante secuenciación de los ácidos nucleicos en la mezcla de ácidos nucleicos. Las secuencias de nucleótidos se leen de 5' a 3'.
La expresión "homología de secuencia" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con otra secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, "homología de secuencia" puede hacer referencia a una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con otra secuencia de nucleótidos. "Homología de secuencia" puede hacer referencia a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de un 100 % con otra secuencia de nucleótidos.
La expresión "homología de secuencia con un cromosoma" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con un cromosoma y menos de un 95 % de identidad de secuencia con todos los demás cromosomas del genoma a partir del que se obtuvo la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma Y si la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el cromosoma Y, y menos de un 95 % de identidad de secuencia con los cromosomas 1-23 y X. Del mismo modo, una secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con el cromosoma 1, si la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de las copias del cromosoma 1 en un genoma y menos de un 95 % de identidad de secuencia con todos los demás cromosomas del genoma.
La expresión "identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de nucleótidos en dos secuencias de nucleótidos que son idénticos al alinear las dos secuencias. Dos secuencias de nucleótidos se pueden alinear usando cualquier algoritmo de alineamiento conocido en la técnica, tales como los implementados en los conjuntos de programas BLAST o Clustal. Los algoritmos de alineamiento pueden introducir huecos en una o ambas secuencias de nucleótidos para mejorar una puntuación de alineamiento, aumentando de ese modo una identidad de secuencia calculada; para secuencias en las que los huecos mejoran una puntuación de alineamiento, "identidad de secuencia" se refiere a la identidad de secuencia calculada obtenida mediante un algoritmo de alineamiento que usa ponderaciones predeterminadas y funciones de puntuación predeterminadas para introducir y ampliar huecos (a menudo denominado penalizaciones de huecos, tales como penalizaciones por abertura de hueco y penalizaciones por extensión de hueco).
En el presente documento la expresión "proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma diferente" y expresiones similares se usan para describir el número de copias de un cromosoma con respecto al número de copias de un cromosoma diferente del mismo genoma o de la misma mezcla de ácidos nucleicos. Los cromosomas 1, 6, y 7 se usan frecuentemente como cromosomas de referencia, porque no se ha observado aneuploidía para estos cromosomas en seres humanos viables. Por lo tanto, por ejemplo, la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con el cromosoma 1 con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con el cromosoma 6 debería ser 1:1 en cualquier mezcla de ácidos nucleicos que comprenda un genoma, que comprenda básicamente todo un genoma, o que se diseñe para replicar la estequiometría del cromosoma 1 y del cromosoma 6 en un genoma. Sin embargo, un cromosoma puede comprender múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con el cromosoma, por ejemplo, el cromosoma puede comprender secuencias de nucleótidos parálogos, tales como copias de genes parálogos. La expresión "proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma diferente", y variantes de la misma, no incluye secuencias de nucleótidos que se encuentran más de una vez en un cromosoma en fase G0 o G1 o más de una vez en una cromátida. Por ejemplo, si una secuencia de nucleótidos se encuentra más de una vez en la misma cromátida, entonces la secuencia de nucleótidos no se usa para calcular una proporción del número de copias. Del mismo modo, un cromosoma puede comprender secuencias de nucleótidos que no se encuentran en la segunda copia del cromosoma, por ejemplo, para genomas que comprenden genotipos heterocigóticos. La expresión "proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma diferente", y variantes de la misma, solo incluye secuencias de nucleótidos que se encuentran en cada cromosoma de un par de cromosomas (por ejemplo, para autosomas disómicos) o en cada caso de un cromosoma particular (por ejemplo, para autosomas aneuploídicos). Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con un cromosoma no se usa para calcular una proporción del número de copias si la secuencia de nucleótidos carece de homología de secuencia con cada copia del cromosoma.
En algunas realizaciones, una proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma (es decir, un autosoma o cromosoma sexual) con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma no homólogo diferente (es decir, un autosoma o cromosoma sexual) no incluye (1) secuencias de nucleótidos que se encuentran más de una vez en un cromosoma humano en fase G0 o g 1, (2) secuencias de nucleótidos que se encuentran más de una vez en una cromátida humana, (3) secuencias de nucleótidos que se encuentran más de dos veces en un cromosoma humano en fase G2, (4) secuencias de nucleótidos que se encuentran exactamente una vez en un cromosoma humano en fase G2, (5) secuencias de nucleótidos que no se encuentran en cada cromátida hermana de un cromosoma humano en fase G2, (6) secuencias de nucleótidos que se encuentran en cromosomas no homólogos, y/o (7) secuencias de nucleótidos que no se encuentran en cada cromosoma homólogo a partir del que se obtuvieron los ácidos nucleicos de un control. Los cromosomas sexuales X e Y no son cromosomas homólogos. Cada secuencia de nucleótidos que satisface los criterios para calcular una proporción comprende subsecuencias que no satisfacen los criterios para su inclusión en un cálculo de una proporción porque cada secuencia de nucleótidos contiene subsecuencias cortas (por ejemplo, de 2-10 nucleótidos) que es probable que se encuentren muchas veces en un cromosoma y/o en cromosomas no homólogos.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con un cromosoma si la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el cromosoma y menos de un 95 % de identidad de secuencia con todos los otros cromosomas no homólogos en el control. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con un cromosoma si la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con el cromosoma y menos de un 99 % de identidad de secuencia con todos los otros cromosomas no homólogos en el control. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos tiene homología de secuencia con un cromosoma si la secuencia de nucleótidos tiene un 100 % de identidad de secuencia con el cromosoma y menos de un 100 % de identidad de secuencia con todos los otros cromosomas no homólogos en el control. En algunas realizaciones, una proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con un cromosoma diferente solo incluye secuencias de nucleótidos que se encuentran exactamente una vez en cada cromosoma homólogo en fase G0/G1 Y exactamente una vez en cada cromátida homóloga en los cromosomas a partir de los que se obtiene el control.
I. ÁCIDOS NUCLEICOS
En algunos aspectos, la invención se refiere al uso de liposomas para reducir la agregación de los ácidos nucleicos de un control que comprende ácidos nucleicos, tal como un control que comprende una mezcla de ácidos nucleicos, como se presenta además en las reivindicaciones. El control puede ser un control para uso para determinar la ploidía de un cromosoma en un feto, por ejemplo, para uso en la calibración de una prueba o ensayo de diagnóstico o para uso como un control de ejecución en una prueba o ensayo de diagnóstico. El cromosoma puede ser un cromosoma humano 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, o Y. En algunas realizaciones, el cromosoma es un cromosoma humano 8, 9, 13, 18, 21, 22, o X. El cromosoma puede ser un autosoma o un cromosoma sexual. En algunas realizaciones, el control es un control para uso para identificar un genotipo. El genotipo puede ser una enfermedad genética o el genotipo puede estar asociado a cáncer. El genotipo puede estar asociado a una neoplasia, provirus, o enfermedad hereditaria. El genotipo puede estar asociado a un virus o bacterias, tal como un patógeno humano. En algunas realizaciones, el genotipo no está asociado a una enfermedad genética, por ejemplo, cuando el control es para uso para evaluar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico. El genotipo puede ser un polimorfismo de un solo nucleótido, mutación puntual, codón de parada prematura, repetición de trinucleótidos, translocación, reordenamiento somático, alelomorfismo, variante de un solo nucleótido, inserción o deleción de codificación ("indel"), variante de corte y empalme, variante reguladora, Variante de número de copias, o fusión génica. El control puede ser para uso para identificar o caracterizar una enfermedad o afección.
Los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias de nucleótidos de cualquier origen, tal como de origen viral, bacteriano, protista, fúngico, vegetal o animal. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos humanas. Los ácidos nucleicos también pueden comprender secuencias de nucleótidos de patógenos humanos, por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias de nucleótidos virales, bacterianas, protistas o fúngicas, en donde el virus, bacteria, protista u hongo es un patógeno humano.
En ciertas realizaciones, los controles están básicamente libres de cromatina. Por ejemplo, los controles pueden comprender ácidos nucleicos que codifican secuencias de nucleótidos humanos, en donde los ácidos nucleicos no están asociados a histonas y/o nucleosomas. En ciertas realizaciones, los controles están básicamente libres de histonas y/o nucleosomas.
Los controles pueden comprender ADN y/o ARN. En algunas realizaciones, los controles están básicamente libres de ARN.
El control comprende una primera mezcla de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el control comprende una primera mezcla de ácidos nucleicos y una segunda mezcla de ácidos nucleicos.
Primera mezcla de ácidos nucleicos
Como se describe en el presente documento, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender un primer genotipo (un genotipo de interés), tal como aneuploidía, un genotipo asociado a una enfermedad hereditaria, un genotipo asociado a una enfermedad transmisible (por ejemplo, un virus, provirus, o bacterias), y/o un genotipo asociado a una neoplasia (por ejemplo, cáncer). En otras realizaciones, el primer genotipo no está asociado a enfermedad.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica el genotipo. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con un cromosoma, por ejemplo, para uso para detectar aneuploidía del cromosoma. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen que comprende un codón de parada prematura, polimorfismo, o repetición de trinucleótidos, por ejemplo, para uso para detectar una enfermedad hereditaria. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos bacteriana, viral, o protista, por ejemplo, para uso para detectar una enfermedad transmisible. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación genética o un reordenamiento genético asociado a una neoplasia, por ejemplo, para uso para detectar cáncer, tal como cáncer metastásico.
La primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una o más pluralidades de secuencias de nucleótidos, que codifican más de un genotipo, por ejemplo, una pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica más de un genotipo.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende secuencias de nucleótidos que codifican básicamente todo el genoma de una célula, pluralidad de células, línea celular, o sujeto. Por ejemplo, la línea celular puede ser un genoma de una línea celular de linfocitos inmortalizados, un genoma de una línea celular de fibroblastos, o un genoma de una línea celular de citotrofoblastos. En ciertas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende secuencias de nucleótidos que codifican básicamente todo el genoma de una célula humana, línea celular humana, o sujeto humano. La primera mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de una célula, pluralidad de células, línea celular, o donante, por ejemplo, una célula, pluralidad de células, línea celular, o donante que porta una aneuploidía, enfermedad hereditaria, provirus, y/o mutación de cáncer. Sin embargo no es necesario que la primera mezcla de ácidos nucleicos comprenda secuencias de nucleótidos que codifiquen un genoma completo. Por ejemplo, una mezcla de ácidos nucleicos obtenida a partir de una célula puede codificar básicamente todo el genoma de la célula aunque puede que algunas secuencias de nucleótidos se hayan perdido durante las etapas de procesamiento, tal como durante las etapas de aislamiento y/o fragmentación. Del mismo modo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede presentar enriquecimiento o empobrecimiento de diversas secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para uso para someter a ensayo la solidez de una prueba o ensayo de diagnóstico. Alternativamente, la primera mezcla de ácidos nucleicos se puede originar a partir de una o más fuentes no humanas, tal como una célula hospedadora que comprende una o más secuencias de nucleótidos suficientes para calibrar una prueba o ensayo de diagnóstico o para evaluar su rendimiento. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos codifica básicamente todo el genoma de una célula, línea celular, o sujeto, por ejemplo, una célula humana, una pluralidad de células humanas, línea celular humana, o sujeto humano. La línea celular puede ser, por ejemplo, GM24385. En otras realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos no codifica el genoma de una célula, línea celular, o sujeto. La primera mezcla de ácidos nucleicos también puede comprender secuencias de nucleótidos de patógenos humanos, por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos virales, bacterianas, protistas o fúngicas, en donde el virus, bacteria, protista u hongo es un patógeno humano. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos no codifica un genoma o básicamente todo un genoma, por ejemplo, en donde la primera mezcla comprende genotipos que están asociados a una enfermedad, tal como cáncer, o la primera mezcla comprende miARN.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos se obtiene a partir de un donante humano, por ejemplo, a partir de células o un fluido corporal del donante humano. La primera mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos, fibroblastos, placenta, y/o adipocitos de un donante humano. La primera mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de ADN sin células circulantes (ADNcf) de un donante humano, tal como una donante femenina. En ciertas realizaciones preferentes, la primera mezcla de ácidos nucleicos se obtiene a partir de las PBMC. La primera mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de la placenta de un donante humano. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ADN sin células obtenido a partir de un donante (por ejemplo, donante humano). El donante puede ser un donante humano sano (por ejemplo, que no tiene cáncer). El ADN sin células se puede obtener a partir de plasma sanguíneo o suero sanguíneo. El control puede comprender además plasma sanguíneo o suero sanguíneo tal como plasma sanguíneo humano o suero sanguíneo humano. De aproximadamente un 50 % a un 100 % del control puede ser plasma sanguíneo o suero sanguíneo, tal como de aproximadamente un 90 % a un 100 %, de aproximadamente 90 % a un 99,999 %, o de aproximadamente un 95 % a un 99,99 % (por ejemplo, en donde el plasma sanguíneo o suero sanguíneo comprende ADN sin células). El ADN sin células se puede obtener a partir de orina. En ciertas realizaciones, el donante humano puede ser masculino o femenino. En ciertas realizaciones, el donante es femenino.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de cromatina, nucleosomas, y/o histonas, por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos humanas que están básicamente libres de cromatina, nucleosomas, e histonas. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede carecer de cromatina, nucleosomas, y/o histonas. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende cromatina, nucleosomas, y/o histonas. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos metilados o la primera mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de ácidos nucleicos metilados.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos bicatenarios que comprenden extremos "pegajosos", por ejemplo, en donde un ácido nucleico bicatenario comprende uno o dos salientes en 3', uno o dos salientes en 5', o un saliente en 3' y un saliente en 5'. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de salientes en 3' y/o en 5'. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede consistir básicamente en ácidos nucleicos de extremos romos. Básicamente, todos los extremos en 5' de los ácidos nucleicos en la primera mezcla pueden estar fosforilados. En algunas realizaciones, básicamente todos los extremos en 5' de los ácidos nucleicos en la primera mezcla no están fosforilados. Básicamente, todos los extremos 3' de los ácidos nucleicos en la primera mezcla pueden estar desfosforilados. En algunas realizaciones, básicamente todos los extremos 3' de los ácidos nucleicos en la primera mezcla están fosforilados. La desfosforilación de los extremos 5' de los ácidos nucleicos (y/o los extremos 3') de un control puede inhibir el ligamiento involuntario. La desfosforilación se puede lograr mediante una fosfatasa, tal como una fosfatasa alcalina (por ejemplo, fosfatasa alcalina intestinal de ternera, fosfatasa alcalina bacteriana, fosfatasa alcalina de gamba, fosfatasa alcalina de placenta). La terminación roma de los ácidos nucleicos de un control puede inhibir el emparejamiento y/o la agregación involuntarios de ácidos nucleicos. Un ácido nucleico que comprende uno o dos extremos pegajosos puede tener extremos romos, por ejemplo, con una polimerasa o un fragmento de Klenow. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos mitocondriales, o la primera mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de secuencias de nucleótidos mitocondriales. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ADN y/o ARN. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos carece básicamente de ARN. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende ARN (por ejemplo, microARN).
Una primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos puede codificar un genotipo de interés, tal como un cromosoma asociado a aneuploidía, un genotipo asociado a una enfermedad hereditaria, un genotipo asociado a una enfermedad transmisible, y/o un genotipo asociado a una neoplasia. Una segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos diferente a la primera secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un primer cromosoma, la segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un segundo cromosoma, y la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos en la primera mezcla puede ser aproximadamente 3:2, por ejemplo, para uso con ensayos de diagnóstico que tienen como objetivo determinar si el primer cromosoma está presente en una muestra como una trisomía. Por lo tanto, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 8, 9, 13, 18, 21, 22, o X, de los cuales la trisomía puede dar como resultado un feto viable, y la segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un cromosoma diferente, por ejemplo, un cromosoma diferente que es un autosoma, tal como los cromosomas 1, 6, o 7, que se usan comúnmente como cromosomas de referencia. Sin embargo, aunque no se sabe que otros cromosomas trisómicos den como resultado una descendencia viable, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, o Y, por ejemplo, para calibrar un ensayo de diagnóstico o para cribar una trisomía en un feto antes de que la trisomía presente un fenotipo letal.
La proporción del número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos puede variar de aproximadamente 3:2, por ejemplo, para diagnosticar una aneuploidía distinta a una trisomía o para calibrar una prueba o ensayo de diagnóstico. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos puede ser aproximadamente 1:1 o mayor que 1:1, tal como mayor que aproximadamente 11:10, mayor que aproximadamente 10:9, mayor que aproximadamente 9:8, mayor que aproximadamente 8:7, mayor que aproximadamente 7:6, mayor que aproximadamente 6:5, mayor que aproximadamente 5:4, mayor que aproximadamente 4:3, mayor que aproximadamente 3:2, o mayor que aproximadamente 2:1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma Y, la segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un autosoma, y la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos puede ser aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos es aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1, tal como de aproximadamente 11:10 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 10:9 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 9:8 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 8:7 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 7:6 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 6:5 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 5:4 a aproximadamente 2:1, o de aproximadamente 4:3 a aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos es aproximadamente 3:2.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una tercera secuencia de nucleótidos, por ejemplo, para uso para determinar si un feto tiene el síndrome de Klinefelter. En esta realización, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un cromosoma humano X; una segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un autosoma; una tercera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con el cromosoma Y; y la proporción del número de copias de la primera, la segunda, y la tercera secuencias de nucleótidos puede ser aproximadamente 2:2:1.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos y una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos. Cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con un genotipo de interés, tal como un cromosoma asociado a aneuploidía, un genotipo asociado a una enfermedad hereditaria, un genotipo asociado a una enfermedad transmisible, y/o un genotipo asociado a una neoplasia. Cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con secuencias de nucleótidos que son diferentes a la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con un primer cromosoma, cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un segundo cromosoma, y la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad en la primera mezcla puede ser aproximadamente 3:2, por ejemplo, , para uso con ensayos de diagnóstico que tienen como objetivo determinar si el primer cromosoma está presente en una muestra como una trisomía. Por lo tanto, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 8, 9, 13, 18, 21, 22, o X, de los cuales la trisomía puede dar como resultado un feto viable, y cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un cromosoma diferente, por ejemplo, un cromosoma diferente que es un autosoma. Sin embargo, aunque no se sabe que otros cromosomas trisómicos den como resultado una descendencia viable, las secuencias de nucleótidos de la primera pluralidad pueden tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, o Y, por ejemplo, para calibrar un ensayo de diagnóstico o para cribar una trisomía en un feto antes de que la trisomía presente un fenotipo letal. La primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo de los cromosomas humanos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, o Y. La segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo de los cromosomas humanos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, y/o Y, por ejemplo, la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo de los cromosomas humanos 1, 6, y 7.
La proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede variar de aproximadamente 3:2, por ejemplo, para diagnosticar una aneuploidía distinta a una trisomía o para calibrar una prueba de ensayo de diagnóstico. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede ser aproximadamente 1:1 o mayor que 1:1, tal como mayor que aproximadamente 11:10, mayor que aproximadamente 10:9, mayor que aproximadamente 9:8, mayor que aproximadamente 8:7, mayor que aproximadamente 7:6, mayor que aproximadamente 6:5, mayor que aproximadamente 5:4, mayor que aproximadamente 4:3, mayor que aproximadamente 3:2, o mayor que aproximaban 2:1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia para el cromosoma Y, cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un autosoma, y la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede ser aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede ser de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1, tal como de aproximadamente 11:10 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 10:9 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 9:8 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 8:7 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 7:6 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 6:5 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 5:4 a aproximadamente 2:1, o de aproximadamente 4:3 a aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad es aproximadamente 3:2. La primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo el cromosoma Y.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos que tengan homología de secuencia con el primer cromosoma que no estén incluidas en la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos. Del mismo modo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos que tengan homología de secuencia con el segundo cromosoma que no estén incluidas en la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para uso para determinar si un feto tiene el síndrome de Klinefelter. En esta realización, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con un cromosoma humano X; cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un autosoma; cada secuencia de nucleótidos de la tercera pluralidad puede tener homología de secuencia con el cromosoma Y; y la proporción del número de copias de cualesquiera tres secuencias de nucleótidos seleccionadas entre la primera, la segunda, y la tercera pluralidades puede ser aproximadamente 2:2:1. La primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo el cromosoma X, y/o la tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo el cromosoma Y.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos, y una cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos. Cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma 13, cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma 18, y cada secuencia de nucleótidos de la tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma 21. Cada secuencia de nucleótidos de la cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, o 22, preferentemente los cromosomas 1, 6, o 7. La proporción de los números de copias de cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada entre la primera, la segunda, y la tercera pluralidades con respecto a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada entre la cuarta pluralidad puede ser aproximadamente 7:6. Tal mezcla se puede preparar, por ejemplo, combinando un genoma de trisomía 13, un genoma de trisomía 18, y un genoma de trisomía 21 a concentraciones aproximadamente iguales. La primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo el cromosoma 13, la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo el cromosoma 18, y la tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo el cromosoma 21.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación o genotipo que están asociados al cáncer. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica un genotipo (o mutación) que está asociado al cáncer, por ejemplo, la pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar una pluralidad de genotipos en donde cada genotipo está asociado al cáncer. Cada ácido nucleico de la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender exactamente una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende al menos un ácido nucleico que comprende más de una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender múltiples copias de un ácido nucleico que comprende cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para un control multiplexado.
Un control puede comprender cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos a una concentración de aproximadamente 1 copia por ml a aproximadamente 109 copias por ml, tal como de aproximadamente 1 aproximadamente 108 copias por ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 107 copias por ml, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 106 copias por ml. Un control puede comprender cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 copias por ml, de aproximadamente 10 a aproximadamente 103 copias por ml, de aproximadamente 100 a aproximadamente 104 copias por ml, de aproximadamente 103 a aproximadamente 105 copias por ml, de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 copias por ml, de aproximadamente 105 a aproximadamente 107 copias por ml, de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 copias por ml, o de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 copias por ml. Un control puede comprender cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos a la misma concentración (por ejemplo, copias por ml) o a concentraciones diferentes.
Un control puede comprender un genotipo o mutación codificados por una secuencia de nucleótidos a una concentración de aproximadamente 1 copia por ml a aproximadamente 109 copias por ml, tal como de aproximadamente 1 aproximadamente 108 copias por ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 107 copias por ml, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 106 copias por ml. Un control puede comprender un genotipo o mutación codificados por una secuencia de nucleótidos a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 copias por ml, de aproximadamente 10 a aproximadamente 103 copias por ml, de aproximadamente 100 a aproximadamente 104 copias por ml, de aproximadamente 103 a aproximadamente 105 copias por ml, de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 copias por ml, de aproximadamente 105 a aproximadamente 107 copias por ml, de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 copias por ml, o de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 copias por ml. En algunas realizaciones, el control está diseñado para replicar los números de copias de mutaciones observadas en ADN libres de células circulantes en la sangre de pacientes con cáncer (por ejemplo, ADN tumoral circulante; ADNct), que puede variar de menos de 1 copia por ml a aproximadamente 106 copias por ml de plasma de sangre completa o sanguíneo (véase, por ejemplo, Dawson et al., New England J. Medicine, 368 (13): 1199 (2013)).
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo enumerada en el catálogo de la base de datos de mutaciones somáticas en el cáncer ("COSMIC") (véase http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic), y/o la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende un genotipo de tipo silvestre que corresponde a uno cualquiera de los genotipos en la base de datos COSMIC. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica un genotipo enumerado en la base de datos COSMIC. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,
45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,
76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500,
600, 700, 800, 900, o 1000 genotipos enumerados en la base de datos COSMIC (por ejemplo, una pluralidad de genotipos enumerados en la base de datos COSMIC). La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica al menos
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 genotipos enumerados en la base de datos COSMIC.
En la Tabla 1 se muestran sesenta y seis mutaciones (es decir, genotipos) enumeradas en la base de datos COSMIC. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo enumerado en la Tabla 1. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica un genotipo enumerado en la Tabla 1. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, o 66 enumerados en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, en donde el gen se selecciona entre MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMt 3a , MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen
(y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación; las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, o 44 genes diferentes; y los genes se seleccionan entre MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS.
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En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen y/o una región reguladora del mismo que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre ABI1, ABL1, ABL2, ACSL3, ACUR1, AF15Q14, AF1Q, AF3P21, AF5Q31, AKAP9, AKT1, AKT2, AKT3, AL017, ALDH2, ALK, AMER1, APC, APEX1, AR, AR1D1A, ARAF, ARHGAP5, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATP11B, ATP1A1, ATP2B3, ATR, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL2L1, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC2, BIRC3, BLM, BMPR1A, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIP1, BTG1, BUB1B, C12ORF9, C15ORF21, C15ORF55, C16ORF75, C2ORF44, CACNA1D, CALR, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CASP8, CBFA2T1, CBFA2T3, CBFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD44, CD74, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2A(PL4), CDKN2B, CDKN2C, CDX2, CEBPA, CEP1, CEP89, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHN1, CIC, CIITA, CLIP1, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1A1, COL2A1, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CSF1R, CSF3R, CSNK2A1, CTNNB1, CUX1, CYLD, D10S170, DAXX, DCTN1, DDB2, DDIT3, DDR2, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, DICERL, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFL, ECT2L, EGFR, EIF3E, EIF4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERBB2 ("HER2"), ERBB3, ERBB4 ("HER4"), ERC1, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ESR1, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EXT1, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FAS, FBXOI1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFR10P, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FH, FHIT, FIP1L1, FLJ27352, FLT3, FLU, FNBP1, FOX03A, FOX04, FOXA1, FOXL2, FOXOIA, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GABRA6, GABRG2, GAS6, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, H3F3B, HCMOGT-1, HEAB, HERPUD1, HEY1, HIP1, HIST1H3B, HIST1H4L, HLA-A, HLF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNF1A, HNRNPA2B1, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HPAS, HRAS, HSPCA, HSPCB, IDH1, IDH2, IGF1R, IGH, IGK, IGL, IHD2, IKZF1, IL2, IL21R, IL6, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIAA1598, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KMT2A, KMT2D, KRAS, KTN1, LAF4, LASP1, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LM02, LMNA, LMOL, LPP, LRIG3, LSM14A, LYL1, MAF, MAFB, MALAT1, MALT1, MAML2, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAX, MCL1, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECOM, MECT1, MED 12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLH1, MLL, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MTOR, MUC1, MUTYH, MY018A, MY05A, MYB, MYC, MYC1, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NAB2, NACA, NBSL, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFATC2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2- 1, NKX2-1, NKX2-8, NONO, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NR4A3, NRAS, NRAS/CSDE1, NRG1, NSD1, NT5C2, NTRK1, NTRK3, NUMA1, NUP214, NUP98, NUTM2A, NUTM2B, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB2, PARP1, PARP2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDCD1LG2, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PHF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG1, PLCG1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNP, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPFIBP1, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1A, PSIP1, PTCH1, PTEN, PTPN11, PTPRB, PTPRC, PTPRK, PWWP2A, RAB5EP, RAC1, RAD21, RAD51, RAD51L1, RAF1, RAFT, RALGDS, RANBP17, RAP1GDS1, RARA, RB1, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RHEB, RHOA, RIT1, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RPS6KB1, RSP02, RSP03, RUNDC2A, RUNX1, RUNX1T1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRC, SRGAP3, SRSF2, SS18, SS18L1, SSX1, SSX2, SSX4, STAG2, STAT3, STAT5B, STAT6, STK11, STL, SUFU, SUZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TALI, TBL1XR1, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIAF1, TIF1, TLX1, TLX3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TRRAP, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, UBR5, USP6, VHL, VT11A, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WWTR1, XPA, XPC, XPO1, YWHAE, ZCCHC8, ZNF145, ZNF198, ZNF217, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2, y ZRSR2. En algunas realizaciones, cada genotipo de una pluralidad de genotipos consiste en una mutación para un gen y/o una región reguladora del mismo seleccionado entre los genes mencionados anteriormente.
Una mutación o genotipo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en mutación c.145G>A para el gen AKT1, mutación c.49G>A para el gen AKT1, mutación c.268G>T para el gen AKT2, mutación c.371A>T para el gen AKT3, mutación c.4248delC para el gen APC, mutación c.4348C>T para el gen APC, mutación c.4666_4667insA para el gen APC, mutación c.1864G>A para el gen ARHGAP5, mutación c,1058_1059delGT para el gen ATM, mutación c.5557G>A para el gen ATM, mutación c.3790_3796delATAAAAG para el gen ATR, mutación c.1799T>A para el gen BRAF, mutación c.121A>G para el gen CTNNB1, mutación c.2644C>T para el gen DNMT3A, mutación c.2236_2250del15 para el gen EGFR, mutación c.2310231linsGGT para el gen EGFR, mutación c.2369C>T para el gen EGFR, mutación c.2573T>G para el gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 para el gen ERBB2, mutación c.287C>A para el gen ERCC1, mutación c,1937A>T para el gen EZH2, mutación c.1394G>A para el gen FBXW7, mutación c.746C>G para el gen FGFR3, mutación c.2503G>T para el gen FLT3, mutación c.763G>C para el gen GABRA6, mutación c.1355A>G para el gen GABRG2, mutación c.626A>C para el gen GNAQ, mutación c.601C>T para el gen GNAS, mutación c.394C>T para el gen IDH1, mutación c.515G>A para el gen IDH2, mutación c.419G>A para el gen IDH2, mutación c.1849G>T para el gen JAK2, mutación c.2447A>T para el gen KIT, mutación c.1679T>A para el gen KIT, mutación c.35G>A para el gen KRAS, mutación c.3757T>G para el gen MET, mutación c.1151T>A para el gen MLH1, mutación c.1544G>T para el gen MPL, mutación c.2250delG para el gen MSH2, mutación c.2359_2360delCT para el gen MSH2, mutación c.2664A>T para el gen MTOR, mutación c.794T>C para el gen MYD88, mutación c.2987_2988insAC para el gen NF1, mutación c.4084C>T para el gen NF1, mutación c.7501delG para el gen NF1, mutación c.863_864insTCTG para el gen NPM1, mutación c.182A>G para el gen NRAS, mutación c.2738delG para el gen PARP1, mutación c.398A>C para el gen PARP2, mutación c.1694_1695insA para el gen p Dg FRA, mutación c.2525A>T para el gen PDg FrA, mutación c.1633G>A para el gen PIK3CA, mutación c.3140A>G para el gen PIK3CA, mutación c.3204_3205insA para el gen PIK3CA, mutación c.388C>T para el gen PTEN, mutación c.741_742insA para el gen PTEN, mutación c.800delA para el gen PTEN, mutación c.226G>A para el gen PTPN11, mutación c.433C>T para el gen RAD51, mutación c.958C>T para el gen RB1, mutación c.2753T>C para el gen RET, mutación c.1394_1395insT para el gen SMAD4, mutación c.818G>A para el gen TP53, mutación c.743G>A para el gen TP53, mutación c.723delC para el gen TP53, mutación c.524G>A para el gen TP53, mutación c.263delC para el gen TP53, y mutación c.426_429delTGAC para el gen VHL. Cada genotipo de una pluralidad de genotipos se puede seleccionar entre las mutaciones/genotipos mencionados anteriormente.
En algunas realizaciones, el genotipo es una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS y/o una región reguladora de uno cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, cada genotipo de la pluralidad de genotipos consiste en una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS y/o una región reguladora de uno cualquiera de los mencionados anteriormente.
Además de la base de datos COSMIC, se han identificado mutaciones específicas como mutaciones somáticas que se producen con frecuencia en diversos cánceres. Por ejemplo, Boland et al., identificaron 26 genes diferentes que con frecuencia están mutados en diversos tipos de cáncer (véase Boland, G. M., et al., Oncotarget, 6 (24): 20099 (2015)). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, en donde el gen se selecciona entre AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, o 26 genes diferentes, y los genes se seleccionan entre AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11.
En algunas realizaciones, el genotipo es una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11 y/o una región reguladora de uno cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, cada genotipo de la pluralidad de genotipos consiste en una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11 y/o una región reguladora de uno cualquiera de los mencionados anteriormente.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, en donde el gen se selecciona entre ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 genes diferentes, y los genes se seleccionan entre ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL.
En algunas realizaciones, el genotipo es una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL y/o una región reguladora de uno cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, cada genotipo de la pluralidad de genotipos consiste en una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL y/o una región reguladora de uno cualquiera de los mencionados anteriormente.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen que comprende una mutación, en donde el gen es BRAF y la mutación es V600E, el gen es EGFR y la mutación es T790M, el gen es EFGR y la mutación es delL747-P753insS, el gen es ERBB2 y la mutación es A775_G776insYVMA, o el gen es KRAS y la mutación es G12D. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre BRAF, EGFR, ERBB2, y KRAS y las mutaciones se seleccionan entre V600E (BRAF), T790M (EGFR), delL747-P753insS, (EGFR), A775_G776insYVMA (ERBB2), y G12D (KRAS). En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen que comprende una mutación, las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, o 4 genes diferentes, y los genes se seleccionan entre BRAF, EGFR, ERBB2, y KRAS.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen que comprende una mutación seleccionará entre mutación V600E para el gen BRAF, mutación D770_N771insG para el gen EGFR, mutación E746_A750delELREA para el gen EGf R, mutación T790M para el gen EGFR, mutación D816V para el gen KIT, mutación G12D para el gen KRAS, mutación Q61R para el gen NRAS, mutación H1047R para el gen PIK3CA, y mutación N1068fs*4 para el gen PIK3CA. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen que comprende una mutación, las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes diferentes, y los genes se seleccionan entre BRAF, EGFR, Er BB2, KIT, KRAS, NRAS, y PIK3CA. Por ejemplo, la pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 de mutación V600E para el gen BRAF, mutación D770_N771insG para el gen EGFR, mutación E746_A750delELREA para el gen EGFR, mutación T790M para el gen EGFR, mutación D816V para el gen KIT, mutación G12D para el gen KRAS, mutación Q61R para el gen NRAS, mutación H1047R para el gen PIK3CA, y mutación N1068fs*4 para el gen PIK3CA.
En algunas realizaciones, el genotipo es una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2, y KRAS. En algunas realizaciones, cada genotipo de la pluralidad de genotipos consiste en una mutación para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2, y KRAS.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende ARN, tal como microARN ("miARN" o "miR"). La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre miR-224-5p, miR-452-5p, miR-23b-5p, miR-203-5p, miR-1201-5p, miR-149-5p, miR-671-3p, miR-944-5p, miR-27b-3p, y miR-22-3p, que están regulados por disminución en ciertos cánceres (véase, por ejemplo, Warnecke-Eberz, U. et al., Tumor Biology 36 (6): 4643 (2015)). La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre miR-223-5p, miR-223-3p, miR-483-5p, miR-409-3p, miR-196b-5p, miR-192-5p, miR-146a-5p, y miR-126-5p, que están regulados por aumento en ciertos cánceres (véase, por ejemplo, Warnecke-Eberz, U. et al., Tumor Biology 36 (6): 4643 (2015)). En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad se selecciona entre una secuencia de nucleótidos que codifica un microARN seleccionado entre miR-224-5p, miR-452-5p, miR-23b-5p, miR-203-5p, miR-1201-5p, miR-149-5p, miR-671-3p, miR-944-5p, miR-27b-3p, miR-22-3p, miR-223-5p, miR-223-3p, miR-483-5p, miR-409-3p, miR-196b-5p, miR-192-5p, miR-146a-5p, y miR-126-5p.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, y hsa-miR-20a-5p, que son predictivos de diabetes mellitus gestacional (véase, por ejemplo, Zhu, Y., et al., Int. J. Gynecology Obstetrics 130 (1):49 (2015)). En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad se seleccionan entre una secuencia de nucleótidos que codifica un microARN seleccionado entre hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, y hsa-miR-20a-5p.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, y let-7f, que se pueden correlacionar con la capacidad de invasión del cáncer de ovarios (véase, por ejemplo, Kobayashi, M. et al., J. Translational Medicine 12: 4 (2014)). La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre miR-200a, miR-200b, y miR-200c, que están asociados al cáncer de ovarios de baja invasión (véase, por ejemplo, Kobayashi, M. et al., J. Translational Medicine 12: 4 (2014)). En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad se selecciona entre una secuencia de nucleótidos que codifica un microARN seleccionado entre let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, miR-200a, miR-200b, y miR-200c.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre miR-21, miR-494, y miR-1973, que están regulados por aumento en el linfoma de Hodgkin. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el microARN miR-185, que se correlaciona con la metástasis de cáncer colorrectal, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el microARN miR-133b, que a la inversa se correlaciona con la metástasis de cáncer colorrectal. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender la secuencia de nucleótidos del microARN miR-324a, que se correlaciona con la supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón de células no microcíticas. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el microARN miR-21, que se correlaciona con la proliferación celular en carcinomas hepatocelulares. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el microARN miR-205, y a la inversa se correlaciona con la metástasis del cáncer de mama. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más microARN seleccionados entre miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 y miR-429, que a la inversa están correlacionados con la progresión del cáncer de mama.
Diversos microARN de secuencias específicas se encuentran en el plasma humano a concentraciones de menos de 1 copia por ml a aproximadamente 105 copias por ml. Un control puede comprender una secuencia de nucleótidos de un microARN a una concentración de aproximadamente 1 copia por ml a aproximadamente 109
como de aproximadamente 1 aproximadamente 108 copias por ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 107 copias por ml, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 106 copias por ml. Un control puede comprender cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 copias por ml, de aproximadamente 10 a aproximadamente 103 copias por ml, de aproximadamente 100 a aproximadamente 104 copias por ml, de aproximadamente 103 a aproximadamente 105 copias por ml, de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 copias por ml, de aproximadamente 105 a aproximadamente 107 copias por ml, de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 copias por ml, o de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 copias por ml. Un control puede comprender cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN a la misma concentración
(por ejemplo, copias por ml) o a concentraciones diferentes.
Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN puede existir en un ácido nucleico diferente de la primera mezcla, o el mismo ácido nucleico de la primera mezcla puede comprender más de una secuencia de nucleótidos de microARN de una pluralidad. Por ejemplo, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN puede existir en el mismo ácido nucleico de la primera mezcla, por ejemplo, para un control "multiplexado". Por lo tanto, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede consistir básicamente en múltiples copias de un ácido nucleico que codifica cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN. En otras realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos consiste básicamente en múltiples copias de ácidos nucleicos en donde cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN existe en un ácido nucleico que no contiene ninguna otra secuencia de nucleótidos de la pluralidad.
Cada ácido nucleico de la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender exactamente una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende al menos un ácido nucleico que comprende más de una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender múltiples copias de un ácido nucleico que comprende cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN, por ejemplo, para un control multiplexado.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN. Cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN se puede seleccionar entre la secuencia de nucleótidos de miR-224-5p, miR-452-5p, miR-23b-5p, miR-203-5p, miR-1201-5p, miR-149-5p, miR-671-3p, miR-944-5p, miR-27b-3p, miR-22-3p, miR-223-5p, miR-223-3p, miR-483-5p, miR-409-3p, miR-196b-5p, miR-192-5p, miR-146a-5p, miR-126-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-20a-5p, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, miR-200a, miR-200b, y miR-200c. Por lo tanto, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN, en donde la pluralidad comprende las secuencias de nucleótidos de miR-224-5p, miR-452-5p, miR-23b-5p, miR-203-5p, miR-1201-5p, miR-149-5p, miR-671-3p, miR-944-5p, miR-27b-3p, miR-22-3p, miR-223-5p, miR-223-3p, miR-483-5p, miR-409-3p, miR-196b-5p, miR-192-5p, miR-146a-5p, miR-126-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-20a-5p, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, miR-200a, miR-200b, y/o miR-200c, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN, y cada secuencia de nucleótidos de microARN de la pluralidad se selecciona entre las secuencias de nucleótidos que codifican hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsamiR-20a-5p, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, miR-1201-5p, miR-126-5p, miR-133b, miR-141, miR-146a-5p, miR-149-5p, miR-185, miR-192-5p, miR-196b-5p, miR-1973, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203-5p, miR-205, miR-21, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-22-3p, miR-224-5p, miR-23b-5p, miR-27b-3p, miR-324a, miR-409-3p, miR-429, miR-452-5p, miR-483-5p, miR-494, miR-671-3p, y miR-944-5p. Por lo tanto, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN, en donde la pluralidad comprende las secuencias de nucleótidos de hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsamiR-20a-5p, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, miR-1201-5p, miR-126-5p, miR-133b, miR-141, miR-146a-5p, miR-149-5p, miR-185, miR-192-5p, miR-196b-5p, miR-1973, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203-5p, miR-205, miR-21, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-22-3p, miR-224-5p, miR-23b-5p, miR-27b-3p, miR-324a, miR-409-3p, miR-429, miR-452-5p, miR-483-5p, miR-494, miR-671-3p, y/o miR-944-5p, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad se selecciona entre una secuencia de nucleótidos que codifica un microARN enumerado en la base de datos PhenomiR (http://mips.helmholtzmuenchen.de/phenomir/index.gsp), la base de datos de microRNA.org (http://www.microrna.org), o la base de datos miRBase (http://www.mirbase.org). En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN; la pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, o 600 microARN diferentes; y cada secuencia de nucleótidos de microARN de la pluralidad se selecciona entre una secuencia de nucleótidos que codifica un microARN enumerado en la base de datos PhenomiR, la base de datos microRNA.org, o la base de datos miRBase.
En algunas realizaciones, la regulación por aumento o la regulación por disminución de un microARN codificado por una secuencia de nucleótidos está asociada a una enfermedad, tal como cáncer.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN, y cada secuencia de nucleótidos de microARN de la pluralidad se selecciona entre una secuencia de nucleótidos que codifica hsa-mir-708, hsa-let-7a-1, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-1, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g, hsa-let-7i, hsa-mir-100, hsa-mir-101-1, hsa-mir-103-1, hsa-mir-103-2, hsa-mir-106a, hsa-mir-106b, hsa-mir-107, hsa-mir-10a, hsa-mir-10b, hsa-mir-1-1, hsa-mir-122, hsamir-1226, hsa-mir-124-1, hsa-mir-124-2, hsa-mir-124-3, hsa-mir-125a, hsa-mir-125b-1, hsa-mir-125b-2, hsa-mir-126, hsa-mir-127, hsa-mir-128-1, hsa-mir-128-2, hsa-mir-129-1, hsa-mir-129-2, hsa-mir-130a, hsa-mir-130b, hsa-mir-132, hsa-mir-133a-1, hsa-mir-133b, hsa-mir-134, hsa-mir-135a-1, hsa-mir-135a-2, hsa-mir-135b, hsa-mir-136, hsa-mir-137, hsa-mir-138-1, hsa-mir-138-2, hsa-mir-139, hsa-mir-140, hsa-mir-141, hsa-mir-142, hsa-mir-143, hsa-mir-144, hsa-mir-145, hsa-mir-146a, hsa-mir-146b, hsa-mir-147, hsa-mir-148a, hsa-mir-148b, hsa-mir-149, hsa-mir-150, hsamir-151, hsa-mir-152, hsa-mir-153-1, hsa-mir-153-2, hsa-mir-154, hsa-mir-155, hsa-mir-15a, hsa-mir-15b, hsa-mir-16-1, hsa-mir-17, hsa-mir-181a-1, hsa-mir-181b-1, hsa-mir-181b-2, hsa-mir-181c, hsa-mir-182, hsa-mir-183, hsa-mir-184, hsa-mir-185, hsa-mir-186, hsa-mir-187, hsa-mir-188, hsa-mir-18a, hsa-mir-190, hsa-mir-191, hsa-mir-192, hsamir-193a, hsa-mir-193b, hsa-mir-194-1, hsa-mir-194-2, hsa-mir-195, hsa-mir-196a-1, hsa-mir-196a-2, hsa-mir-196b, hsa-mir-197, hsa-mir-198, hsa-mir-199a-1, hsa-mir-199a-2, hsa-mir-199b, hsa-mir-19a, hsa-mir-19b-1, hsa-mir-19b-2, hsa-mir-200a, hsa-mir-200b, hsa-mir-200c, hsa-mir-202, hsa-mir-203, hsa-mir-204, hsa-mir-205, hsa-mir-206, hsamir-208a, hsa-mir-20a, hsa-mir-21, hsa-mir-210, hsa-mir-211, hsa-mir-212, hsa-mir-214, hsa-mir-215, hsa-mir-216a, hsa-mir-217, hsa-mir-218-1, hsa-mir-218-2, hsa-mir-219-1, hsa-mir-219-2, hsa-mir-22, hsa-mir-221, hsa-mir-222, hsa-mir-223, hsa-mir-224, hsa-mir-23a, hsa-mir-23b, hsa-mir-24-1, hsa-mir-24-2, hsa-mir-25, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-mir-26b, hsa-mir-27a, hsa-mir-27b, hsa-mir-28, hsa-mir-296, hsa-mir-299, hsa-mir-29a, hsa-miR-29b, hsa-mir-29b-1, hsa-mir-29b-2, hsa-mir-29c, hsa-mir-301a, hsa-mir-302a, hsa-mir-302b, hsa-mir-302c, hsa-mir-302d, hsa-mir-30a, hsa-mir-30b, hsa-mir-30c-1, hsa-mir-30d, hsa-mir-30e, hsa-mir-31, hsa-mir-32, hsa-mir-320a, hsa-mir-323, hsa-mir-324, hsa-mir-325, hsa-mir-326, hsa-mir-328, hsa-mir-330, hsa-mir-331, hsa-mir-335, hsa-mir-337, hsamir-338, hsa-miR-338-3p, hsa-mir-339, hsa-mir-33a, hsa-mir-340, hsa-mir-342, hsa-mir-345, hsa-mir-346, hsa-mir-34a, hsa-mir-34b, hsa-mir-34c, hsa-mir-361, hsa-mir-365-1, hsa-mir-367, hsa-mir-369, hsa-mir-370, hsa-mir-371, hsa-mir-372, hsa-mir-373, hsa-mir-374a, hsa-mir-375, hsa-mir-376a-1, hsa-mir-376c, hsa-mir-377, hsa-mir-378, hsamir-379, hsa-mir-380, hsa-mir-381, hsa-mir-382, hsa-mir-383, hsa-mir-384, hsa-mir-409, hsa-mir-410, hsa-mir-411, hsa-mir-423, hsa-mir-424, hsa-mir-425, hsa-mir-432, hsa-mir-433, hsa-mir-449b, hsa-mir-451, hsa-mir-452, hsa-mir-485, hsa-mir-486, hsa-mir-487b, hsa-mir-494, hsa-mir-495, hsa-mir-497, hsa-mir-503, hsa-mir-505, hsa-mir-510, hsamir-513a-1, hsa-mir-518c, hsa-mir-520b, hsa-mir-520d, hsa-mir-542, hsa-mir-582, hsa-mir-601, hsa-mir-608, hsa-mir-622, hsa-mir-629, hsa-mir-630, hsa-mir-639, hsa-mir-644, hsa-mir-646, hsa-mir-649, hsa-mir-654, hsa-mir-663, hsamir-7-1, hsa-mir-7-2, hsa-mir-7-3, hsa-mir-765, hsa-mir-873, hsa-mir-877, hsa-mir-891a, hsa-mir-9-1, hsa-mir-9-2, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-93, hsa-mir-9-3, hsa-mir-95, hsa-mir-96, hsa-mir-98, hsa-mir-99a, mmu-mir-100, mmu-mir-106a, mmu-mir-10a, mmu-mir-10b, mmu-mir-1-1, mmu-mir-125b-1, mmu-mir-130b, mmu-mir-133a-1, mmu-mir-133b, mmu-mir-139, mmu-mir-140, mmu-mir-150, mmu-mir-17, mmu-mir-181c, mmu-mir-184, mmu-mir-18a, mmu-mir-20a, mmu-mir-20b, mmu-mir-22, mmu-mir-223, mmu-mir-292, mmu-mir-296, mmu-mir-298, mmu-mir-29c, mmu-mir-301a, mmu-mir-346, mmu-mir-375, mmu-mir-466a, mmu-mir-500, mmu-mir-669a-1, mmu-mir-680-1, mmu-mir-686, mmu-mir-706, mmu-mir-711, mmu-mir-714, mmu-mir-7a-1, o mmu-mir-9-1, o mmu-mir-99a. Por ejemplo, una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN puede codificar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,1 17, 18, 19, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 120, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, o aproximadamente 600 de las mencionadas anteriormente. Una pluralidad de secuencias de nucleótidos de microARN puede codificar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,1 17, 18, 19, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 120, aproximadamente 150, de aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, o aproximadamente 600 de las mencionadas anteriormente.
Cada ácido nucleico de la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender un identificador de código de barras como se describe en el presente documento, a continuación.
Segunda mezcla de ácidos nucleicos
Un control puede comprender una segunda mezcla de ácidos nucleicos. La primera mezcla de ácidos nucleicos y la segunda mezcla de ácidos nucleicos pueden estar mezcladas en el control. Cada mezcla de ácidos nucleicos de un control puede estar mezclada en el control.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar un segundo genotipo que es diferente al primer genotipo. En ciertas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos codifica genotipos "normales" (es decir, genotipos que no están asociados a enfermedad) con respecto al genotipo o genotipos de interés. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos no codifica una aneuploidía, un genotipo asociado a una enfermedad hereditaria, un genotipo asociado a una enfermedad transmisible, o un genotipo asociado a una neoplasia. Sin embargo, la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar una aneuploidía, un genotipo asociado a una enfermedad hereditaria, un genotipo asociado a una enfermedad transmisible, o un genotipo asociado a una neoplasia, siempre y cuando el genotipo no enmascare el genotipo de interés asociado a la primera mezcla de ácidos nucleicos o de otro modo no confunda el uso del control.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una o más pluralidades de secuencias de nucleótidos, que pueden codificar uno o más genotipos, por ejemplo, una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar uno o más genotipos.
En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende secuencias de nucleótidos que codifican básicamente todo el genoma de una célula, pluralidad de células, línea celular, o sujeto. Por ejemplo, la línea celular puede ser un genoma de una línea celular de linfocitos inmortalizados, un genoma de una línea celular de fibroblastos, o un genoma de una línea celular de citotrofoblastos. En ciertas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende secuencias de nucleótidos que codifican básicamente todo el genoma de una célula humana, línea celular humana, o sujeto humano. La línea celular puede ser, por ejemplo, GM24385. La segunda mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de una célula, pluralidad de células, línea celular, o donante, por ejemplo, una célula, pluralidad de células, línea celular, o donante que no porte una aneuploidía, enfermedad hereditaria, provirus, y/o mutación de cáncer. Por ejemplo, la segunda mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de un donante humano, por ejemplo, de células o fluidos corporales del donante humano. La segunda mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos, fibroblastos, placenta, y/o adipocitos de un donante humano. En ciertas realizaciones preferentes, la segunda mezcla de ácidos nucleicos se obtiene a partir de PBMC. La segunda mezcla de ácidos nucleicos se puede obtener a partir de la placenta de un donante humano. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ADN sin células obtenido a partir de un donante (por ejemplo, donante humano, tal como una hembra humana). El donante puede ser un donante humano sano (por ejemplo, que no tiene cáncer). El ADN sin células se puede obtener a partir de plasma sanguíneo o suero sanguíneo. El control puede comprender además plasma sanguíneo o suero sanguíneo tal como plasma sanguíneo humano o suero sanguíneo humano. De aproximadamente un 50 % a un 100 % del control puede ser plasma sanguíneo o suero sanguíneo, tal como de aproximadamente un 90 % a un 100 %, de aproximadamente 90 % a un 99,999 %, o de aproximadamente un 95 % a un 99,99 % (por ejemplo, en donde el plasma sanguíneo o suero sanguíneo comprende ADN sin células). El ADN sin células se puede obtener a partir de orina. En ciertas realizaciones, el donante humano puede ser masculino o femenino. En ciertas realizaciones, el donante es femenino.
No es necesario que la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprenda secuencias de nucleótidos que codifiquen un genoma completo. Por ejemplo, una mezcla de ácidos nucleicos obtenida a partir de una célula puede codificar básicamente todo el genoma de la célula aunque puede que algunas secuencias de nucleótidos se hayan perdido durante las etapas de procesamiento, tal como durante las etapas de aislamiento y/o fragmentación. Del mismo modo, la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede presentar enriquecimiento o empobrecimiento de diversas secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para uso para someter a ensayo la solidez de una prueba o ensayo de diagnóstico. Alternativamente, la segunda mezcla de ácidos nucleicos se puede originar a partir de una o más fuentes no humanas, tal como una célula hospedadora que comprende una o más secuencias de nucleótidos suficientes para calibrar una prueba o ensayo de diagnóstico o para evaluar su rendimiento. En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos codifica básicamente todo el genoma de una célula, línea celular, o sujeto, por ejemplo, una célula humana, línea celular humana, o sujeto humano. En otras realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos no codifica el genoma de una célula, línea celular, o sujeto. La segunda mezcla de ácidos nucleicos también puede comprender secuencias de nucleótidos de patógenos humanos, por ejemplo, la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos virales, bacterianas, protistas o fúngicas, en donde el virus, bacteria, protista u hongo es un patógeno humano.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de cromatina, nucleosomas, y/o histonas, por ejemplo, la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos humanas que están básicamente libres de cromatina, nucleosomas, e histonas. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede carecer de cromatina, nucleosomas, y/o histonas. En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende cromatina, nucleosomas, y/o histonas. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos metilados o la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de ácidos nucleicos metilados. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ácidos nucleicos bicatenarios que comprenden extremos "pegajosos", por ejemplo, en donde un ácido nucleico bicatenario comprende uno o dos salientes en 3', uno o dos salientes en 5', o un saliente en 3' y un saliente en 5'. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de salientes en 3' y/o en 5'. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede consistir básicamente en ácidos nucleicos de extremos romos. Básicamente, todos los extremos 5' de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla pueden estar fosforilados. En algunas realizaciones, básicamente todos los extremos 5' de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla no están fosforilados. Básicamente, todos los extremos 3' de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla pueden estar desfosforilados. En algunas realizaciones, básicamente todos los extremos 3' de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla están fosforilados. La desfosforilación de los extremos 5' de los ácidos nucleicos (y/o los extremos 3') de un control puede inhibir el ligamiento involuntario. La terminación roma de los ácidos nucleicos de un control puede inhibir el emparejamiento y/o la agregación involuntarios de ácidos nucleicos. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos mitocondriales, o la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede carecer básicamente de secuencias de nucleótidos mitocondriales. La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender ADN y/o ARN. En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos carece básicamente de ARN. En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende ARN.
En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para realizaciones en las que la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos. En ciertas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera secuencia de nucleótidos que está relacionada con la primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en realizaciones en las que el genotipo de interés es aneuploidía, la primera secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede ser idéntica a la primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos. Del mismo modo, en realizaciones en las que el genotipo de interés está asociado a una enfermedad hereditaria, la primera secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar un genotipo sano o normal, que está relacionado con, pero que varía de la primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos, que codifica el genotipo de enfermedad. Además, en realizaciones en las que el genotipo de interés está asociado a una neoplasia, la primera secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar un genotipo sano o normal, que está relacionado con, pero que varía de la primera secuencia de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos, que puede codificar un genotipo de enfermedad.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una segunda secuencia de nucleótidos. En ciertas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos está relacionada con, o es idéntica a la segunda secuencia de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos. La segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos diferente a la primera secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un primer cromosoma, la segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un segundo cromosoma, y la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos puede ser aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, cuando la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos en una proporción diferente para uso como un control de aneuploidía. Por lo tanto, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 8, 9, 13, 18, 21, 22, o X, de los cuales la trisomía puede dar como resultado un feto viable, y la segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un cromosoma diferente, por ejemplo, un cromosoma diferente que es un autosoma, tal como los cromosomas 1, 6, o 7, que se usan comúnmente como cromosomas de referencia. Sin embargo, aunque no se sabe que otros cromosomas trisómicos den como resultado una descendencia viable, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, o Y, por ejemplo, para calibrar un ensayo de diagnóstico o para cribar una trisomía en un feto antes de que la trisomía presente un fenotipo letal. Del mismo modo, la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos puede variar de aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, para uso para determinar la ploidía de un cromosoma sexual. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma Y, la segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un autosoma, y la proporción entre el número de copias de la primera secuencia de nucleótidos con respecto al número de copias de la segunda secuencia de nucleótidos puede ser aproximadamente 1:2 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una tercera secuencia de nucleótidos, por ejemplo, para uso para determinar si un feto tiene el síndrome de Klinefelter. En este caso, la primera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un cromosoma humano X; una segunda secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un autosoma; una tercera secuencia de nucleótidos puede tener homología de secuencia con el cromosoma Y; y la proporción del número de copias de la primera, la segunda, y la tercera secuencias de nucleótidos puede ser aproximadamente 1:2:1 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, cuando la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende la primera, la segunda, y la tercera secuencias de nucleótidos en una proporción de aproximadamente 2:2:1.
En algunas realizaciones, la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos y una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para realizaciones en las que la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos y una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos. En ciertas realizaciones, la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla de ácidos nucleicos está relacionada con la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en realizaciones en las que el genotipo de interés es aneuploidía, la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla puede ser idéntica (o tener homología de secuencia con) a la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla. Del mismo modo, en realizaciones en las que el genotipo de interés está asociado a una enfermedad hereditaria, la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo sano o normal, que está relacionado con, pero que varía de una secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla, que puede codificar un genotipo de enfermedad del mismo locus genético como la secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla. Además, en realizaciones en las que el genotipo de interés está asociado a una neoplasia, la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo sano o normal, que está relacionado con, pero que varía de una secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla, que puede codificar un genotipo de enfermedad del mismo locus genético como la secuencia de nucleótidos de la segunda mezcla.
En ciertas realizaciones, la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla de ácidos nucleicos está relacionada con, o es idéntica a la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de la primera mezcla de ácidos nucleicos. La segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla puede tener homología de secuencia con diferentes secuencias de nucleótidos con la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de la segunda mezcla. Por ejemplo, la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un primer cromosoma, la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia con un segundo cromosoma, y la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos en la segunda pluralidad puede ser aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, cuando la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende números de copias para una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos en una proporción diferente para uso como un control de aneuploidía. Por lo tanto, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 8, 9, 13, 18, 21, 22, o X, de los cuales la trisomía puede dar como resultado un feto viable, y cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un cromosoma diferente, por ejemplo, un cromosoma diferente que es un autosoma. Sin embargo, aunque no se sabe que otros cromosomas trisómicos den como resultado una descendencia viable, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con uno cualquiera de los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, o Y, por ejemplo, para calibrar un ensayo de diagnóstico o para cribar una trisomía en un feto antes de que la trisomía presente un fenotipo letal. Del mismo modo, la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede variar de aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, para uso para determinar la ploidía de un cromosoma sexual. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia para el cromosoma Y, cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un autosoma, y la proporción entre el número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede ser aproximadamente 1:2 en la segunda mezcla de ácidos nucleicos.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos que tienen homología de secuencia con el primer cromosoma que no están incluidas en la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos. Del mismo modo, la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender secuencias de nucleótidos que tienen homología de secuencia con el segundo cromosoma que no están incluidas en la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, para uso para determinar si un feto tiene el síndrome de Klinefelter. En esta realización, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad puede tener homología de secuencia con un cromosoma humano X; cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad puede tener homología de secuencia con un autosoma; cada secuencia de nucleótidos de la tercera pluralidad puede tener homología de secuencia con el cromosoma Y; y la proporción del número de copias de cualesquiera tres secuencias de nucleótidos seleccionadas entre la primera, la segunda, y la tercera pluralidades puede ser aproximadamente 1:2:1.
La segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos, y una cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, cuando la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos, y una cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos. Cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma 13, cada secuencia de nucleótidos de la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma 18, y cada secuencia de nucleótidos de la tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para el cromosoma 21. Cada secuencia de nucleótidos de la cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener homología de secuencia para los cromosomas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, o 22, preferentemente los cromosomas 1, 6, o 7. La proporción del número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada entre la primera, la segunda, y la tercera pluralidades con respecto al número de copias de cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada entre la cuarta pluralidad puede ser aproximadamente 1:1 en la segunda mezcla, por ejemplo, en donde la proporción es aproximadamente 7:6 en la primera mezcla.
Una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de una primera mezcla y una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos de una segunda mezcla pueden consistir en las mismas secuencias de nucleótidos. Una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de una primera mezcla y una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos de una segunda mezcla pueden consistir en las mismas secuencias de nucleótidos. Una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos de una primera mezcla y una tercera pluralidad de secuencias de nucleótidos de una segunda mezcla pueden consistir en las mismas secuencias de nucleótidos. Una cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos de una primera mezcla y una cuarta pluralidad de secuencias de nucleótidos de una segunda mezcla pueden consistir en las mismas secuencias de nucleótidos.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación o genotipo que están asociados al cáncer, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo normal o de tipo silvestre que corresponde a la mutación o genotipo de la primera mezcla. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica un genotipo (o mutación) que está asociado a cáncer, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica un genotipo de tipo silvestre que corresponde a un genotipo (o mutación) que está asociado a cáncer en la primera mezcla.
La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación o genotipo que están asociados al cáncer, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar básicamente todo un genoma humano, en donde el genoma humano no comprende la mutación o genotipo. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica un genotipo (o mutación) que está asociado a cáncer, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar básicamente todo un genoma humano, en donde el genoma humano no comprende las mutaciones o genotipos de la pluralidad.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo enumerado en la base de datos COSMIC, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo de tipo silvestre que corresponde al genotipo enumerado en la base de datos COSMIC. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo enumerado en la base de datos COSMIC, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica genotipos de tipo silvestre que corresponden a cada genotipo de la primera pluralidad. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 genotipos enumerados en la base de datos COSMIC, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica genotipos de tipo silvestre que corresponden a cada genotipo en la primera pluralidad. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 genotipos enumerados en la base de datos COSMIC, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica genotipos de tipo silvestre que corresponden a cada genotipo en la primera pluralidad. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un genotipo enumerado en la base de datos COSMIC, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos codifica básicamente todo un genoma humano, en donde el genoma humano no comprende el genotipo. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo enumerado en la base de datos COSMIC, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos codifica básicamente todo un genoma humano, en donde el genoma humano no comprende los genotipos de la primera pluralidad.
Del mismo modo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo enumerado en la Tabla 1, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica genotipos de tipo silvestre que corresponden a cada genotipo en la primera pluralidad. Por ejemplo, la primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, o 66 genotipos enumerados en la Tabla 1, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica genotipos de tipo silvestre que corresponden a cada genotipo en la primera pluralidad. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, en donde el gen se selecciona entre MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la parte del gen, pero que comprende una secuencia de tipo silvestre . En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica la parte de cada gen, pero que comprende una secuencia de tipo silvestre para cada gen. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, o 44 genes diferentes, y los genes se seleccionan entre MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica la parte de cada gen, pero que comprende una secuencia de tipo silvestre para cada gen. La primera mezcla de ácidos nucleicos puede comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo enumerado en la Tabla 1, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede codificar básicamente todo un genoma humano, en donde el genoma humano no comprende los genotipos de la primera pluralidad.
En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, en donde el gen se selecciona entre AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la parte del gen, pero que comprende una secuencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, y los genes se seleccionan entre AKT1, a Tm , BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica la parte de cada gen, pero que comprende una secuencia de tipo silvestre para cada gen. En algunas realizaciones, la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación, las secuencias de nucleótidos de la pluralidad codifican partes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, o 26 genes diferentes, y los genes se seleccionan entre AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11, y la segunda mezcla de ácidos nucleicos comprende una segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos codifica la parte de cada gen, pero que comprende una secuencia de tipo silvestre para cada gen. Por ejemplo, la segunda pluralidad de secuencias de nucleótidos puede codificar básicamente todo un genoma humano, en donde el genoma humano no comprende las mutaciones de la primera pluralidad.
Primera y segunda mezclas de ácidos nucleicos
En algunas realizaciones, el control comprende una primera mezcla de ácidos nucleicos que codifica un primer genotipo y una segunda mezcla de ácidos nucleicos que codifica un segundo genotipo, y la proporción entre el número de copias de cada secuencia de nucleótidos que codifica el primer genotipo con respecto al número de copias de cada secuencia de nucleótidos que codifica el segundo genotipo es de aproximadamente 1:1000 a 1000:1, tal como de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 1:40 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 30: 1, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 7:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:4, a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 3:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1; de aproximadamente 1:1000 a 1:1, tal como de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:40 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:4, a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cada secuencia de nucleótidos que codifica el primer genotipo con respecto al número de copias de cada secuencia de nucleótidos que codifica el segundo genotipo es de aproximadamente 1:200 a aproximadamente 1:2, tal como de aproximadamente 1:200 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:33 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:33 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:2, o de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:3. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cada secuencia de nucleótidos que codifica el primer genotipo con respecto al número de copias de cada secuencia de nucleótidos que codifica el segundo genotipo es aproximadamente 1:1000, 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:15, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1,20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 100:1, o 1000:1.
En algunas realizaciones, el control comprende una primera mezcla de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica un primer genotipo y una segunda mezcla de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica un segundo genotipo, y la proporción entre el número de copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad que codifica el primer genotipo con respecto al número de copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad que codifica el segundo genotipo es de aproximadamente 1:1000 a 1000:1, tal como de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 1:40 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 7:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:4, a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 3:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1; de aproximadamente 1:1000 a 1:1, tal como de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:40 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:15 a
aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:4, a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad que codifica el primer genotipo con respecto al número de copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad que codifica el segundo genotipo es de aproximadamente 1:200 a aproximadamente 1:2, tal como de aproximadamente 1:200 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:33 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:33 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:2, o de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:3. En algunas realizaciones, la proporción entre el número de copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad que codifica el primer genotipo con respecto al número de copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad que codifica el segundo genotipo es aproximadamente 1:1000, 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:15, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1,9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1,40:1, 50:1, 100:1, o 1000:1.
En algunas realizaciones, la concentración de ácidos nucleicos en el control es de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, tal como de aproximadamente 500 pg/ml a aproximadamente 500 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 400 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 200 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 15 ng/ml, de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, de aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 25 ng/ml, de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, de aproximadamente 25 ng/ml a aproximadamente 35 ng/ml, de aproximadamente 30 ng/ml a aproximadamente 40 ng/ml, de aproximadamente 35 ng/ml a aproximadamente 45 ng/ml, de aproximadamente 40 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 45 ng/ml a aproximadamente 55 ng/ml, de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ml, de aproximadamente 55 ng/ml a aproximadamente 65 ng/ml, de aproximadamente 60 ng/ml a aproximadamente 70 ng/ml, de aproximadamente 65 ng/ml a aproximadamente 75 ng/ml, de aproximadamente 70 ng/ml a aproximadamente 80 ng/ml, de aproximadamente 75 ng/ml a aproximadamente 85 ng/ml, de aproximadamente 80 ng/ml a aproximadamente 90 ng/ml, de aproximadamente 85 ng/ml a aproximadamente 95 ng/ml, o de aproximadamente 90 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En algunas realizaciones, la concentración de ácidos nucleicos en el control es de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, tal como aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 15 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 30 ng/ml, aproximadamente 35 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 45 ng/ml, o aproximadamente 50 ng/ml. En algunas realizaciones, la concentración de ácidos nucleicos en el control es de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 40 ng/ml.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos en la primera mezcla representan aproximadamente un 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 0,63 %, 1 %, 1,25 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 83 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % de la concentración total de ácidos nucleicos en el control. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos en la primera mezcla representan de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 45 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 65 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 85 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 95 %, o de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 % de la concentración total de ácidos nucleicos en el control.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos en la segunda mezcla representan aproximadamente un 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 0,63 %, 1 %, 1,25 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 83 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % de la concentración total de ácidos nucleicos en el control. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos en la segunda mezcla representan de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 45 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 65 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 85 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 95 %, o de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 % de la concentración total de ácidos nucleicos en el control.
En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en el control es de aproximadamente 20 a aproximadamente 10.000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 35 a aproximadamente 1000 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 900 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nucleótidos, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en el control es de aproximadamente 50 a aproximadamente 350 nucleótidos, tal como de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 nucleótidos. La longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en el control puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 110 nucleótidos, aproximadamente 120 nucleótidos, aproximadamente 130 nucleótidos, aproximadamente 140 nucleótidos, aproximadamente 150 nucleótidos, aproximadamente 160 nucleótidos, aproximadamente 170 nucleótidos, aproximadamente 180 nucleótidos, aproximadamente 190 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 210 nucleótidos, aproximadamente 220 nucleótidos, aproximadamente 230 nucleótidos, aproximadamente 240 nucleótidos, aproximadamente 250 nucleótidos, aproximadamente 260 nucleótidos, aproximadamente 270 nucleótidos, aproximadamente 280 nucleótidos, aproximadamente 290 nucleótidos, o aproximadamente 300 nucleótidos.
En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la primera mezcla de ácidos nucleicos es de aproximadamente 20 a aproximadamente 10.000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 35 a aproximadamente 1000 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 900 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nucleótidos, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la primera mezcla de ácidos nucleicos es de aproximadamente 50 a aproximadamente 350 nucleótidos, tal como de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 nucleótidos. La longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la primera mezcla de ácidos nucleicos puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 110 nucleótidos, aproximadamente 120 nucleótidos, aproximadamente 130 nucleótidos, aproximadamente 140 nucleótidos, aproximadamente 150 nucleótidos, aproximadamente 160 nucleótidos, aproximadamente 170 nucleótidos, aproximadamente 180 nucleótidos, aproximadamente 190 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 210 nucleótidos, aproximadamente 220 nucleótidos, aproximadamente 230 nucleótidos, aproximadamente 240 nucleótidos, aproximadamente 250 nucleótidos, aproximadamente 260 nucleótidos, aproximadamente 270 nucleótidos, aproximadamente 280 nucleótidos, aproximadamente 290 nucleótidos, o aproximadamente 300 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la primera mezcla de ácidos nucleicos es de aproximadamente 8 a aproximadamente 1000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 800 nucleótidos, de aproximadamente 12 a aproximadamente 600 nucleótidos, de aproximadamente 14 a aproximadamente 400 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 16 a aproximadamente 400 nucleótidos, de aproximadamente 17 a aproximadamente 300 nucleótidos, de aproximadamente 18 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 19 a aproximadamente 100 nucleótidos, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos. La longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la primera mezcla de ácidos nucleicos puede ser aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 11 nucleótidos, aproximadamente 12 nucleótidos, aproximadamente 13 nucleótidos, aproximadamente 14 nucleótidos, aproximadamente 15 nucleótidos aproximadamente 16 nucleótidos, aproximadamente 17 nucleótidos, aproximadamente 18 nucleótidos aproximadamente 19 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 21 nucleótidos aproximadamente 22 nucleótidos, aproximadamente 23 nucleótidos, aproximadamente 24 nucleótidos aproximadamente 25 nucleótidos, aproximadamente 26 nucleótidos, aproximadamente 27 nucleótidos aproximadamente 28 nucleótidos, aproximadamente 29 nucleótidos, o aproximadamente 30 nucleótidos.
En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla de ácidos nucleicos es de aproximadamente 20 a aproximadamente 10.000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 35 a aproximadamente 1000 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 900 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nucleótidos, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla de ácidos nucleicos es de aproximadamente 50 a aproximadamente 350 nucleótidos, tal como de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 nucleótidos. La longitud media o longitud mediana de los ácidos nucleicos en la segunda mezcla de ácidos nucleicos puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 110 nucleótidos, aproximadamente 120 nucleótidos, aproximadamente 130 nucleótidos, aproximadamente 140 nucleótidos, aproximadamente 150 nucleótidos, aproximadamente 160 nucleótidos, aproximadamente 170 nucleótidos, aproximadamente 180 nucleótidos, aproximadamente 190 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 210 nucleótidos, aproximadamente 220 nucleótidos, aproximadamente 230 nucleótidos, aproximadamente 240 nucleótidos, aproximadamente 250 nucleótidos, aproximadamente 260 nucleótidos, aproximadamente 270 nucleótidos, aproximadamente 280 nucleótidos, aproximadamente 290 nucleótidos, o aproximadamente 300 nucleótidos.
La longitud de los ácidos nucleicos en la primera mezcla, segunda mezcla, o control se puede seleccionar, por ejemplo, usando perlas de SPRI (AmPure), electroforesis en gel, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio aniónico, y/o HPLC, por ejemplo, antes de combinar los ácidos nucleicos con liposomas.
II. CONTROLES INTERNOS
En algunos casos, la divulgación se refiere a un control interno, en donde el control interno es un ácido nucleico que comprende un identificador de código de barras, y el identificador de código de barras es una secuencia de nucleótidos que no tiene homología de secuencia con ninguna secuencia de nucleótidos humana.
El identificador de código de barras puede tener menos de un 95 %, un 90 %, un 80 %, un 70 %, un 60 %, un 50 %, o incluso menos de un 40 % de identidad de secuencia con cualquier secuencia de nucleótidos humana conocida. El identificador de código de barras puede tener de 6 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, tal como de 6 a aproximadamente 25, de 6 a aproximadamente 20, de 6 a aproximadamente 15, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. El identificador de código de barras puede tener 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
El control interno puede tener de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, tal como de aproximadamente 100 a aproximadamente 300, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250, de aproximadamente 150 a aproximadamente 300, de aproximadamente 150 a aproximadamente 250, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, de aproximadamente 120 a aproximadamente 220, de aproximadamente 150 a aproximadamente 220, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud.
El control interno puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos humana. La secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos humana puede tener de aproximadamente 35 a aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, tal como de aproximadamente 35 a aproximadamente 300, de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. El código de barras puede tener de 6 a aproximadamente 20 nucleótidos de longitud; la secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos humana puede tener de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud; y/o el control interno puede tener de aproximadamente 156 a aproximadamente 220 nucleótidos de longitud.
La secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos humana puede comprender al menos una variante de un solo nucleótido con respecto a la secuencia de nucleótidos humana. La al menos una variante de un solo nucleótido puede comprender una variante de un solo nucleótido que no se sabe que se encuentre en seres humanos. La al menos una variante de un solo nucleótido puede comprender una variante de un solo nucleótido que es un alelo letal dominante. La al menos una variante de un solo nucleótido puede comprender una variante de un solo nucleótido que nunca se ha observado en seres humanos. La al menos una variante de un solo nucleótido puede comprender una variante de un solo nucleótido que se sabe que se encuentra en seres humanos. La al menos una variante de un solo nucleótido puede comprender una variante de un solo nucleótido que no es un alelo letal dominante conocido.
En algunos casos, la divulgación se refiere a una composición que comprende un control interno. La composición puede comprender una pluralidad de controles internos. Por ejemplo, una composición puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 controles internos. Cada control interno de una pluralidad de controles internos puede comprender el mismo código de barras o cada control interno puede comprender un código de barras diferente. Cada control interno de una pluralidad de controles internos puede comprender una secuencia de nucleótidos diferente que tenga homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos humana, es decir, cada control interno puede comprender una secuencia de nucleótidos que tenga homología de secuencia con una secuencia de nucleótidos humana diferente a la de los otros controles internos de la pluralidad. La composición puede comprender además liposomas.
Una pluralidad de controles internos pueden comprender una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos como se describe en el presente documento, anteriormente, en donde cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica ya sea una parte de un gen (y/o una región reguladora del mismo) que comprende una mutación o una mutación o genotipo que están asociados al cáncer o una enfermedad hereditaria. Cada control interno puede comprender una secuencia de nucleótidos diferente de la primera pluralidad de secuencias de nucleótidos.
En algunos casos, la divulgación se refiere a una muestra que comprende ácidos nucleicos obtenidos a partir de un sujeto humano y un control interno (o una pluralidad de controles internos). La longitud media de los ácidos nucleicos en la muestra puede ser de aproximadamente 35 a aproximadamente 600 nucleótidos, tal como de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 400, de aproximadamente 125 a aproximadamente 300, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos. Los ácidos nucleicos pueden codificar básicamente todo el genoma del sujeto humano. La muestra puede comprender además liposomas. En el presente documento también se desvela un método de adiciones de una muestra humana con un control interno, que comprende combinar una muestra humana que comprende ácidos nucleicos con un control interno (o una composición que comprende una pluralidad de controles internos).
En algunos casos, la divulgación se refiere a un método para analizar los ácidos nucleicos en una muestra humana, que comprende combinar la muestra humana con un control interno (o una composición que comprende una pluralidad de controles internos) y analizar la muestra. La muestra humana puede comprender ácidos nucleicos que codifican básicamente todo un genoma humano. El método puede comprender además combinar la muestra humana con liposomas antes, después, o de forma simultánea con la combinación de la muestra humana con el control interno (o composición). El método puede comprender combinar la muestra humana con una composición que comprende el control interno y liposomas. El método puede comprender analizar la muestra mediante PCR cuantitativa o secuenciación de nueva generación.
III. LIPOSOMAS
El control comprende liposomas. El control puede comprender un liposoma seleccionado entre una vesícula mutilamelar, una vesícula unilamelar pequeña, una vesícula unilamelar grande, y una vesícula cocleada. En algunas realizaciones, el liposoma comprende una vesícula unilamelar. En ciertas realizaciones, un liposoma encapsula una solución acuosa, por ejemplo, el liposoma puede definir un compartimento acuoso, que comprende uno o más ácidos nucleicos de un control. En ciertas realizaciones, el liposoma comprende una bicapa. En algunas realizaciones, los liposomas son vesículas unilamelares. Se conocen métodos para preparar composiciones que comprenden liposomas y ácidos nucleicos en donde los ácidos nucleicos están asociados a los liposomas (véanse, por ejemplo, el documento de publicación de Patente de Estados Unidos N.° US 2015/0147815); Shim, G. et al., Asian J Pharmaceutical Sciences 8: 72 (2013); Berg, E.S. y K. Skaug, J. Microbiological Methods 55: 303 (2003); Monnard, P.-A., et al., Biochimica et Biophysica Acta 1329: 39 (1997).
En algunas realizaciones, los liposomas son artificiales.
En algunas realizaciones, los liposomas se obtienen a partir de una célula. Los liposomas pueden comprender microvesículas de origen celular, vesículas extracelulares, vesículas de desprendimiento, exovesículas, exosomas, ectosomas, oncosomas, y/o cuerpos apoptóticos. Los liposomas se pueden obtener a partir de lípidos celulares. En algunas realizaciones, los liposomas no se obtienen a partir de células o lípidos celulares.
Los liposomas pueden comprender proteínas, tales como proteínas transmembrana o glicoproteínas. En algunas realizaciones, los liposomas están básicamente libres de proteína. En algunas realizaciones, los liposomas están básicamente libres de proteínas transmembrana. En algunas realizaciones, los liposomas están básicamente libres de glicoproteínas. En algunas realizaciones, los liposomas están básicamente libres de polisacáridos, por ejemplo, un control puede carecer básicamente de polisacáridos.
En otros aspectos de la divulgación, el control no comprende liposomas. El control puede comprender una emulsión. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos del control están asociados a los liposomas. Por ejemplo, al menos aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 86 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, o incluso un 99,9 % de los ácidos nucleicos en el control pueden estar asociados a los liposomas. De aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 100 % de los ácidos nucleicos en el control pueden estar asociados a los liposomas, tal como de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 100 %, o de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 %. En algunas realizaciones, básicamente todos los ácidos nucleicos en el control están asociados a los liposomas.
Los liposomas encapsulan los ácidos nucleicos del control. Por ejemplo, los liposomas pueden encapsular al menos aproximadamente un 10 % de los ácidos nucleicos en el control, tal como al menos aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 86 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, o incluso al menos aproximadamente un 99,9 % de los ácidos nucleicos en el control. Los liposomas pueden encapsular de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 100 % de los ácidos nucleicos en el control, tal como de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 100 %, o de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 %. Los liposomas pueden encapsular básicamente todos los ácidos nucleicos en el control.
Los liposomas pueden comprender fosfolípidos.
Los liposomas pueden comprender al menos un lípido seleccionado entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, y esfingomielina.
Los liposomas pueden comprender al menos un lípido seleccionado entre el grupo que consiste en dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, diestearoil fosfatidilcolina, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, dimiristoil fosfatidilserina, diestearoil fosfatidilserina, dipalmitoil fosfatidilserina, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, dimiristoil fosfatidilinositol, dipalmitoil fosfatidilinositol, diestearoil fosfatidilinositol, 1-palmitoil-2-oleoil-snglicero-3-fosfoinositol, dimiristoil fosfatidilglicerol, dipalmitoil fosfatidilglicerol, diestearoil fosfatidilglicerol, 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol), dimiristoil fosfatidiletanolamina, dipalmitoil fosfatidiletanolamina, diestearoil fosfatidiletanolamina, y 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina.
Los liposomas pueden comprender al menos un lípido seleccionado entre el grupo que consiste en 1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfocolina ("DPPC") y 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DMPC").
Cualquiera de los lípidos desvelados en el presente documento puede estar opcionalmente pegilado. Por ejemplo, un liposoma puede comprender un lípido basado en fosfoetanolamina modificado con PEG, tal como 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; o 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350].
Los liposomas pueden comprender colesterol.
Los liposomas pueden comprender un catión fosfonio o un catión amonio sustituido, en donde el catión fosfonio o el catión amonio sustituido comprenden al menos un grupo hidrocarbilo. El al menos un grupo hidrocarbilo puede ser un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo. El grupo hidrocarbilo puede comprender de 8 a 22 átomos de carbono. En un control, de un 0 % a aproximadamente un 5 % de los lípidos pueden comprender un catión fosfonio o un catión amonio sustituido en peso, tal como de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 4 % o de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 3 %. Los liposomas pueden comprender al menos un lípido seleccionado entre el grupo que consiste en didodecildimetilamonio, dioctadecildimetilamonio, didecildimetilamonio, dodeciletildimetilamonio, etilhexadecildimetilamonio, dihexadecildimetilamonio, y dimetilditetradecilamonio. Los liposomas pueden comprender una sal de alquilamonio, tal como un haluro de alquilamonio (por ejemplo, bromuro de didodecildimetilamonio).
Un control puede comprender un agente quelante, tal como ácido etilendiamintetraacético (EDTA). Un control puede comprender azida de sodio (por ejemplo, como conservante).
En algunas realizaciones, el diámetro medio o mediano de los liposomas es de aproximadamente 30 a aproximadamente 1000 nm, tal como de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 400 nm, o de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm. El diámetro medio o mediano de los liposomas puede ser aproximadamente 100 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 130 nm, aproximadamente 140 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 160 nm, aproximadamente 170 nm, aproximadamente 180 nm, aproximadamente 190 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 210 nm, aproximadamente 220 nm, aproximadamente 230 nm, aproximadamente 240 nm, aproximadamente 250 nm, aproximadamente 260 nm, aproximadamente 270 nm, aproximadamente 280 nm, aproximadamente 290 nm, o aproximadamente 300 nm.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control que comprende liposomas son más estables que los ácidos nucleicos de un control que no comprende liposomas, es decir, un control con una concentración similar de ácidos nucleicos del mismo origen en un tampón similar. La estabilidad puede hacer referencia a una propensión reducida a la agregación. Es menos probable que los ácidos nucleicos de un control que comprende liposomas se agreguen que los ácidos nucleicos de un control que no comprende liposomas. La agregación se puede determinar, por ejemplo, midiendo la longitud aparente de los ácidos nucleicos en un control, por ejemplo, usando un sistema Bioanalyzer (Agilent). Los ácidos nucleicos de un control de acuerdo con diversas realizaciones de la invención no entran dentro de un intervalo de tamaños observados de aproximadamente 35 pares de bases a aproximadamente 1000 pares de bases (tal como de aproximadamente 50 pares de bases a aproximadamente 1000 pares de bases), por ejemplo, tal como se observa usando un sistema Bioanalyzer. Los ácidos nucleicos de un control se han agregado si se observa que la mayoría de los ácidos nucleicos del control tienen más de 1000 pares de bases, por ejemplo, tal como se observa usando un sistema Bioanalyzer.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control son estables durante un periodo de tiempo de aproximadamente un periodo de tiempo de aproximadamente un periodo de tiempo de aproximadamente un periodo de tiempo de aproximadamente y/o los ácidos nucleicos no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C, tal como de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C, por ejemplo, la mayoría de de los ácidos nucleicos del control entran dentro de un intervalo de tamaños observados de aproximadamente 35 pares de bases a aproximadamente 1000 pares de bases tal como se analiza mediante un sistema Bioanalyzer después de su almacenamiento. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control son estables y/o los ácidos nucleicos no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control son estables y/o los ácidos nucleicos no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 45 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años, tal como de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 18 meses, o de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 12 meses. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control son estables y/o los ácidos nucleicos no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años, tal como de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 18 meses, o de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 12 meses. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control son estables y/o los ácidos nucleicos no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años, tal como de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 18 meses, o de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 12 meses.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control son estables cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 42 °C, por ejemplo, la mayoría de los ácidos nucleicos del control entran dentro de un intervalo de tamaños observados de aproximadamente 50 pares de bases a aproximadamente 1000 pares de bases tal como se analiza mediante un sistema Bioanalyzer después de su almacenamiento o el control se puede secuenciar de forma satisfactoria después de su almacenamiento mediante secuenciación de nueva generación. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 42 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años, tal como de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 18 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 12 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 12 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 meses, de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 4 meses, o de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 3 meses.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 42 °C, por ejemplo, la mayoría de los ácidos nucleicos del control entran dentro de un intervalo de tamaños observados de aproximadamente 50 pares de bases a aproximadamente 1000 pares de bases tal como se analiza mediante un sistema Bioanalyzer después de su almacenamiento. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de un control no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 42 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años, tal como de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 18 meses, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 12 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 12 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 meses, de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 4 meses, o de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 3 meses.
El periodo de tiempo puede ser de al menos 1 día, al menos 1 semana, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, o al menos 1 año. El periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 5 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 5 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 5 años, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 5 años, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 5 años, de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 años, de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 2 años, o de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 2 años. El periodo de tiempo puede ser aproximadamente 1 día, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, o aproximadamente 1 año.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Fuente de ácidos nucleicos de trisomía
Las placentas y las membranas asociadas se enjuagaron en tampón de estabilización frío. Cada muestra se procesó individualmente. Bajo visualización directa con un microscopio de disección, la membrana coriónica se separó cuidadosamente de las vellosidades flotantes/de anclaje y se trituró en trozos de 3-4 mm. Los fragmentos se retiraron del medio mediante centrifugación. Las células se liberaron del tejido mediante una serie de etapas de disociación enzimática. Las células disociadas se recogieron, se centrifugaron, se lavaron y se combinaron. Las células se resuspendieron en medio suplementado con DMEM/F12, se sembraron en el mismo medio en pocillos recubiertos de gelatina y se cultivaron en condiciones estándar (en O2 al 20 %). Las colonias de células indiferenciadas, que se formaron después de 7-10 días, se diseccionaron manualmente, y grupos de 20-40 células se volvieron a sembrar en placas y se hicieron pases de 5-10 veces. Las colonias se obtuvieron a partir de múltiples membranas coriónicas (6-11 semanas de gestación). Una parte se almacenó mediante congelación en los pases 3­ 5.
Ejemplo 2: Fuente de ácidos nucleicos maternos
La sangre completa femenina se validó como femenina, heterocigótica para la mutación del Factor V Leiden, y mutante homocigótica para la mutación MTHFR 677. Se aislaron líneas de linfocitos B de la sangre y se inmortalizaron con VEB usando métodos estándar. La línea de linfocitos B transformados por el EBV de Factor V EF0000004 (denominado "Factor V" en el presente documento) se expandió y se usó para preparar reservas congeladas y sedimentos de células completas.
Alternativamente, el ADN genómico se obtuvo a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para uso en los Ejemplos 14-17. El ADN obtenido a partir de PBMC representó una distribución de NCV más normal mediante el algoritmo Illumina (basado en MPS) que el ADN genómico obtenido a partir de líneas celulares transformadas con EBV.
Ejemplo 3: Fuente de ácidos nucleicos trisómicos
Los citotrofoblastos (progenitores de trofoblastos) se obtuvieron de la Dra. Katherine Bianco (UCSF), quien proporcionó nueve líneas celulares congeladas: tres líneas celulares cariotipadas como trisomía 13, tres líneas celulares cariotipadas como trisomía 18 y tres líneas celulares cariotipadas como trisomía 21 (Tabla 2). Las líneas celulares del citotrofoblastos eran masculinas (XY) o femeninas (XX), y cada línea celular tiene una edad gestacional única. Para el desarrollo se eligieron tres líneas celulares de citotrofoblastos: línea celular 3 de trisomía 13 (T13 C3), línea celular 1 de trisomía 18 (T18 C1) y línea celular 2 de trisomía 21 (T18 C2). Las tres líneas celulares eran masculinas (XY) y eran capaces de expandirse. Las líneas celulares se expandieron inicialmente para hacer múltiples reservas maestras congeladas.
Tabla 2: Líneas celulares de trofoblastos
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Las células se cultivaron hasta confluencia en condiciones estériles en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % usando un medio predefinido que consistía en DMEM/F12, Glutamax (Invitrogen, N.° de parte 10565042), suero bovino fetal al 10 % (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, SB431542 10 pM un inhibidor de TGF-beta (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida) (Tocris, N.° de parte 1614), y 10 ng/ml de factor - 2 de crecimiento de fibroblastos humanos recombinante (FGF), 146 aa (R&D Systems, N.° de catálogo 233-FB-025).
Usando las reservas maestras de los tres citotrofoblastos, las líneas celulares se expandieron de nuevo para preparar múltiples reservas de trabajo congeladas. Durante la expansión de las reservas de trabajo, se hizo el cariotipo de las muestras con ocultación para confirmar sus genotipos (Figura 2). Las reservas de trabajo de los tres citotrofoblastos y la línea celular del factor V se expandieron para producir sedimentos de células completas. El ADN genómico de cada uno de los tres citotrofoblastos y la línea celular del Factor V se purificaron a partir de los sedimentos celulares usando el Método Gentra Puregene (Qiagen). Después de la purificación, la concentración de ADN genómico se midió en un espectrofotómetro NanoDrop 2000/2000c (Thermo) y la pureza se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa.
Ejemplo 4: Método de fragmentación de ADN
El ADN genómico se diluyó a 150 ng/pl en Tris-EDTA, pH 8,0 y se fragmentó en fragmentos más pequeños usando un aparato de ultrasonidos enfocado M220 (Covaris). El ADN genómico de las líneas celulares de Trisomía se fragmentó en un MilliTube de 1 ml a un pico máximo medio de 150 pares de bases. El ADN genómico de la línea celular del Factor V se fragmentó en un MilliTube de 1 ml a un máximo medio de 170 pares de bases.
El ADN fragmentado se analizó para determinar la eficacia de la fragmentación mediante electroforesis en gel de agarosa y el tamaño del fragmento usando el kit de ADN de alta sensibilidad para el sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent). Las imágenes de gel de agarosa indican la disgregación completa de todo el ADN genómico en fragmentos de tamaño <1000 pb (Figura 3), y los datos del sistema Bioanalyzer proporcionan una imagen más precisa de la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN y la distinción entre los resultados de las dos metodologías de fragmentación diferentes (Figura 4).
Ejemplo 5: Mezcla de ácidos nucleicos fragmentados
Se mezclaron volumétricamente fracciones de ADN a partir de soluciones de reserva de 0,15 mg/ml. Generalmente, se prepara una solución fetal a materna a 1:3 (25 %) y a partir de ese momento se hacen diluciones dos veces para series de linealidad (12,5 %, 6,25 %, 3,12 %). A continuación estas preparaciones se pueden usar como reservas de ADN, por ejemplo, para la encapsulación de liposomas.
Ejemplo 6: Preparación de liposomas
Se pueden incorporar pequeños fragmentos de ADN (<1000 pares de bases) en liposomas como describen Monnard, et al. (Biochim Biophys Acta. (1997) 1329 (1): 39-50). En algunas realizaciones, los liposomas se construyen con fosfolípidos saturados debido a la homogeneidad estructural de los liposomas resultantes y debido a la falta de grupos funcionales alqueno propensos a la oxidación. Estos lípidos también exhiben temperaturas de gelificación favorables a temperatura ambiente o por encima de ella, lo que garantiza que los liposomas estarán en una fase de gel durante el almacenamiento refrigerado y serán menos susceptibles de fugas o degradación. Específicamente, se investigaron DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina, N.° CAS 63-89-8) y DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, N.° CAS 18194-24-6). El colesterol (N.° CAS 57-88-5) y DdAb (bromuro de didodecildimetilamonio, N.° CAS: 3282-73-3) fueron aditivos usados para las formulaciones sometidas a ensayo. En una realización, los liposomas comprendían DMPC y DDAB en proporciones molares de 1:0,025. La mezcla de lípidos DMPC:DDAB se preparó mediante disolución en ciclohexano/etanol (66:1) a 50 mg/ml seguido de liofilización para preparar un sustrato homogéneo finamente dividido para la formación de vesículas. Después de la liofilización, los lípidos se rehidrataron con tampón TE (TRIS 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) a 200 mg/ml, formando una suspensión espesa. La suspensión se sometió a un baño de ultrasonidos durante 20 min, lo que dio como resultado una suspensión uniforme de vesículas adecuadas para la incorporación de ADN. A esta suspensión, se le añadió una solución de 3 equivalentes en volumen de ADN fragmentado y mezclado en tampón TE (0,15 mg/ml) para una concentración final de ADN de 0,1125 mg/ml. A continuación el ADN fragmentado se incorporó en los liposomas usando métodos estándar de congelación-descongelación mediante los cuales las muestras se congelaron en nitrógeno líquido (-196 °C) durante 1 min y a continuación se calentaron a 45 °C durante 15 min para un total de 5 ciclos (Mayer, et al., Biochim et Biophys Acta (1985) 817: 193-196). En esta etapa, el ADN se incorpora en las vesículas sin procesar, que son multilamelares y de diferentes tamaños.
Los liposomas sin procesar se sometieron a extrusión, lo que reduce el tamaño de los liposomas, creando de ese modo una población de tamaño controlado y reproducible, y altera las vesículas multilamelares. El proceso de extrusión se logró usando la mini-extrusora Avanti® (Avanti Polar Lipids, N.° de parte: 610000) fijada con un disco de extrusión de policarbonato con poros de 100 nm, 200 nm, o 400 nm. Las muestras sin procesar se procesaron, sin dilución a 35-50 °C, para un total de 31 pases, dando como resultado una distribución de tamaño altamente uniforme.
Después de la extrusión, los liposomas se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico, mediante dilución de los liposomas extruidos a 20 mg/ml de lípido en tampón Tris (50 mM) y pase sobre una columna de purificación HiTrap DEAE FF empaquetada previamente de 5 ml (GE Healthcare, N.° de parte: 17-5154-01). Los liposomas purificados (denominados "LipoADN en volumen") se recogieron en una fracción de 4 ml, que no fue retenida por la columna, mientras que el ADN no incorporado permaneció unido a la fase estacionaria (Figura 6). El ADN unido se puede eluir posteriormente aumentando la concentración de sal en la fase móvil a cloruro sódico 1 M. Ejemplo 7: Los liposomas protegen los ácidos nucleicos de las nucleasas
Dos preparaciones de liposomas de DMPC cargados con ADN extruidos a través de un disco de extrusión de policarbonato de 100 nm, un liposoma "fantasma" correspondiente y ADN aislado se trataron con nucleasa Benzonase en diversas condiciones. La correlación positiva entre la concentración de ADN con y sin Benzonase indica que los liposomas encapsulan el ADN, protegiéndolo de ese modo de la digestión enzimática (Tabla 3). La adición de Triton interrumpió los vehículos de liposoma permitiendo la digestión completa del ADN. El ADN residual fue detectado mediante el método de qPCR KAPA que se describe a continuación después de inactivación con Proteinasa K y extracción de ácido nucleico.
T l . L li m r n l i n l i fr m n l i i n n B nz n
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Ejemplo 8: Métodos analíticos
Bioanalyzer. Se usó un sistema Bioanalyzer 2100 de Agilent junto con los kits de ADN 1000 y ADN de alta sensibilidad para evaluar las longitudes medias y las distribuciones de longitudes del ADN sometido a ultrasonidos y el ADN en los liposomas. Dado que se ha informado que el ADNcf obtenido a partir del feto es más corto que el ADNcf obtenido a partir de la madre, el sistema Bioanalyzer se usó para confirmar que la longitud media de cada ADN de línea celular de aneuploidía sometido a ultrasonidos era más corta que la longitud media del ADN normal sometido a ultrasonidos.
Nanodrop. Se usó un espectrofotómetro NanoDrop 2000 de ThermoFisher para medir la concentración de ADN genómico, ADN fragmentado y suspensiones de liposomas. La absorción a 260 nm se usó para calcular la concentración de ADN bicatenario, es decir, 1 OD260 = 0,05 mg/ml. Los valores de absorción de la dispersión de luz obtenidos para los liposomas a 260 nm se usaron para monitorizar la consistencia de las concentraciones de las muestras replicadas durante todo el proceso de preparación de los liposomas. Análisis de seguimiento de nanopartículas. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) usa las propiedades de la dispersión de la luz y el movimiento browniano para obtener la distribución del tamaño de partículas de las muestras en suspensión líquida (véase la Figura 6). Además, también se pueden determinar los recuentos de partículas de manera que se pueda determinar la concentración de liposomas. El análisis de NTA se completó en Particle Characterization Laboratories Incorporated (Novato, CA) usando un instrumento NanoSight LM10-HS (Malvern instruments, Worcestershire, Reino Unido). Antes del envío, las muestras se diluyeron a 100:1 y se llevó a cabo una dilución adicional de acuerdo con el criterio del laboratorio de ensayos antes del análisis, que generalmente era una dilución adicional de 2000:1.
Análisis con PicoGreen. Como método de cuantificación del contenido de ADN encapsulado en el LipoADN purificado se usó una modificación del kit de ensayo de ADNds Quant-iT™ PicoGreen® de ThermoFisher (N.° de parte P7589). PicoGreen es un colorante fluorescente que intercala el ADN bicatenario, dando como resultado un aumento de la fluorescencia detectable. PicoGreen es particularmente útil porque puede penetrar en los liposomas, puede unirse al ADN encapsulado y puede anular la necesidad de extracción cuando se analiza la muestra en volumen de alta concentración. Las muestras se prepararon combinando volúmenes iguales de las soluciones de analito y una dilución 1/200 de la solución de colorante PicoGreen tal como se describe en el manual de ThermoFisher. Además, las muestras se colocaron en un baño de PicoGreen durante 5 min antes de la detección para asegurar que el colorante se hubiera equilibrado completamente en los liposomas. Las curvas patrón para determinar la concentración de ADN se prepararon generalmente a partir de ADN fragmentado, que había sido cuantificado mediante Nanodrop antes de su fragmentación (véase la Figura 8).
Extracción de ADN. Antes del análisis de muestras de LipoADN usando una tecnología de PCR (por ejemplo, qPCR, ddPCR o NGS), los ácidos nucleicos se pueden extraer de sus vehículos liposomales. Esto se logró con mayor frecuencia usando el kit de ácido nucleico circulante QlAamp de Qiagen (N.° de parte: 55114), siguiendo el procedimiento especificado en el manual. Este kit se usa ampliamente en la investigación de ADNcf y en comunidades de ensayo. Las muestras de LipoADN de 0,05 ml a 1,0 ml se diluyeron a 1 ml en PBS antes de la extracción, y los ácidos nucleicos se eluyeron usando entre 50 y 75 |jl de tampón, dependiendo del ensayo. Alternativamente, el Plasma XS NucleoSpin® de Macherey-Nagle (N.° de parte: 740900) se puede usar para purificar los ácidos nucleicos de los liposomas.
Cuantificación de ADN mediante qPCR. La PCR digital se realizó usando un sistema de PCR digital por gotas QX200 de Bio-Rad. En los ensayos TaqMan se usaron cebadores y sondas bien conocidos para evaluar las concentraciones y las concentraciones relativas de los cromosomas 1, 13, 18, 21, X e Y. La sonda para el cromosoma 1 se marcó con HEX (hexaclorofluororesceína) y las sondas para los otros cromosomas se marcaron con FAM (fluoresceína). Todas las sondas se interrumpieron con BHQ-1 (Black Hole Quencher 1). Para obtener resultados precisos, aproximadamente 100 ng de ADN estaban presentes en cada reacción de 20 jl.
Una línea celular con una trisomía debería contener 3 copias de un cromosoma en lugar de los 2 habituales. En la práctica, sin embargo, no todas las células dentro de una línea celular son aneuploides, y el establecimiento del cariotipo reveló que varias líneas celulares en evaluación no eran aneuploides al 100 %. La evaluación del grado de aneuploidía es importante para garantizar que un control que pretende imitar una aneuploidía en una fracción fetal determinada lo haga. Por lo tanto, se usó PCR digital para evaluar el grado de aneuploidía en diversas líneas celulares. En la Figura 9 se muestra un ejemplo, en el que el ADN extraído de la línea celular T21 C1 presentaba un nivel de cromosoma 21 más bajo de lo esperado (el CNV de 3 es triploide, 2 es diploide y 1 es haploide), lo que sugiere que aproximadamente la mitad de la las células no son triploides. El ADN de las líneas celulares T13 C3 y T18 C1 mostró niveles de CNV más cercanos a los 3 esperados para los cromosomas aneuploides, y el análisis de PCR también indicó que estas dos líneas celulares contienen una copia del cromosoma Y (Figura 9).
La PCR digital también se usa para evaluar y seguir la concentración de ADN. Las mediciones convencionales de la OD260 de las concentraciones de ADN se pueden ver afectadas por la turbidez y la presencia de ARN, y la PCR digital es menos sensible en estas condiciones. Dado a que el ADN genómico tiene el potencial de tener centímetros de longitud, lo cual es incompatible con la PCR digital por gota, primero se digirió con un cóctel de enzimas de restricción que se seleccionaron porque no cortan dentro de los amplicones. Este cóctel estaba compuesto por EcoRV, Kpnl, Ncol, Scal y Sacl. En comparación, a diferencia de las enzimas de restricción, el tratamiento de ultrasonidos corta el ADN de una manera más aleatoria, lo que tiene el potencial, y se ha observado, de cortar dentro de las regiones que de otro modo podrían ser amplificadas mediante PCR digital. El efecto es que el ADN sometido a ultrasonidos tiene una concentración aparente menor mediante PCR digital que el ADN digerido con enzimas de restricción seleccionadas cuidadosamente. Midiendo la concentración aparente de ADN mediante PCR digital antes y después del tratamiento con ultrasonidos, es posible obtener un factor de conversión para ajustar la concentración aparente de ADN sometido a ultrasonidos con respecto al ADN digerido con enzimas de restricción. Esto es útil en etapas posteriores después de que el ADN sometido a otros sonidos se incorpore en los liposomas y este presente en concentraciones bajas. Al multiplicar la concentración aparente del ADN sometido a ultrasonidos diluido con el factor de conversión, es posible obtener una concentración precisa de ADN sometido a ultrasonidos diluido mediante PCR digital.
La PCR digital también se usa para evaluar la fracción fetal en el producto final, usando el amplicón para el cromosoma Y. Para las líneas celulares aneuploides masculinas, el cromosoma Y está presente en una copia por cada dos copias de los cromosomas normales y por cada 3 copias del cromosoma aneuploide. La fracción fetal se calcula multiplicando las copias aparentes del cromosoma Y con respecto a las copias aparentes del cromosoma 1 por un factor de dos. (Una muestra de fracción fetal al 100 % tendría un 50 % de copias aparentes del cromosoma Y con respecto a las copias del cromosoma diploide 1).
Ejemplo 9: Análisis de muestras de control que comprenden mezclas de ADN "materno" y de trisomía 21
Las muestras de ensayo se ejecutaron como "muestras de investigación" en el ensayo. Las muestras se formularon como se destaca en la Tabla 4, a continuación. Un panel de dilución de fracción fetal encapsulada en liposomas (T21) al 0 %, al 3,1 %, al 6,25 %, al 12,5 %, y al 25 % se formuló en ADN materno encapsulado en liposomas en tampón TE. En este estudio se incluyeron muestras formuladas al 25 % de fracción fetal en plasma como diluyentes (Basematrix, Seracon y Matribase) con el objetivo de evaluar cual es el diluyente más adecuado para la formulación de controles. Las muestras se formularon a una concentración de ~30 ng/ml.
T l 4. M r nr l m r n n ADN T21 v l r n l i í
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Las muestras se procesaron en el sitio de ensayo de la misma manera que las muestras de pacientes. En resumen, las muestras se sometieron a ensayo en una celda de flujo de R&D junto con otras muestras de ensayo. El criterio de aneuploidía implica puntuaciones de valor cromosómico normalizado (NCV) que cruzan un cierto umbral sobre una variación normal de los datos de referencia. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 4 mencionada anteriormente y en la Figura 10. Las muestras que comprenden una fracción fetal de un 12,5 % o un 25 % se denominaron aneuploidía y otras muestras se denominaron normales. Estos datos demuestran que el proceso que se muestra en la Figura 1 se puede usar para preparar un control de ADNcf intercambiable estable.
Ejemplo 10: Métodos de uso de controles con ensayos de diagnóstico que utilizan secuenciación de ácidos nucleicos Las muestras que contienen diferentes cantidades de ADN de T21 C1 sometido a ultrasonidos dentro de un fondo de ADN de Factor V sometido a ultrasonidos (ADN de fondo materno normal) se enviaron a GENEWIZ (South Plainfield, NJ) para su análisis. GENEWIZ recibió instrucciones para analizarlos mediante NGS en una plataforma Illumina HiSeq con lecturas de extremos emparejados de 2 x 150 bases usando su flujo de trabajo habitual de secuenciación aleatoria del genoma completo (WGS) comenzando con la etapa posterior al tratamiento con ultrasonidos (es decir, extracción seguida de pulido final y generación de bibliotecas). Mientras que el ensayo NIPT convencional usa lecturas más cortas (por ejemplo, 36 bases), se solicitaron lecturas más largas para mejorar el mapeo y tener el potencial de detectar fragmentos de ADN que tuvieran una longitud más corta que 150 bases, basándose en sus secuencias superpuestas.
Se obtuvieron archivos FastQ para lecturas de extremos emparejados. Estos archivos se analizaron para asignar lecturas de NGS individuales a los cromosomas y para determinar la abundancia relativa de las lecturas de los diferentes cromosomas. Los datos resultantes se compararon con los datos obtenidos a partir del análisis de archivos de NGS públicos de 903 muestras de NIPT que formaron parte del ensayo NIFTY y del análisis de archivos de NGS públicos de dos líneas celulares de referencia del consorcio Genome-In-A-Bottle (GIAB).
Las 903 muestras del ensayo NIFTY (BGI Diagnosis Co, P.R.C) informaron de una correlación entre el % de contenido de GC en las lecturas de NGS de una muestra determinada y sesgos en la abundancia aparente de las lecturas de diferentes cromosomas. Las lecturas de diferentes cromosomas difieren en términos de cuánto se ven afectadas por el contenido de GC, y la retirada de este sesgo es fundamental al comparar datos entre muestras para diferenciar entre muestras normales y anómalas. Parece que esta correlación es principalmente lineal, y los datos obtenidos de un ensayo NIPT se deberían corregir para la correlación o el ensayo NIPT se debería diseñar en torno a este factor.
Los resultados de la secuenciación GENEWIZ presentaron un contenido medio de GC mayor que los contenidos de GC encontrados en los datos públicos para cualquiera de las 903 muestras del ensayo NIFTY, las muestras NA12878 y NA24385 del genoma de referencia de GIAB obtenidas a partir de las líneas celulares GM12878 y GM24385 transformadas con EBV, y los PBL de tres donantes STL001/2/3. La extracción en gel de agarosa de las muestras antes de la secuenciación dio como resultado contenidos de GC aún mayores, dando como resultado un sesgo de abundancia cromosómica más fuerte (Figura 11). Por lo tanto, la extracción en gel de agarosa se debería evitar para reducir el sesgo de GC. Además, el sesgo de GC se puede mitigar aún más aplicando una corrección lineal.
Con la corrección del sesgo de GC, las concentraciones aparentes de muchos cromosomas entraron en rangos normales (Figura 12). Parecía que las muestras que contenían cantidades mayores de ADN de T21 eran positivas para T21. Parecía que aquellas que no contenían ADN de T21 (es decir, las muestras que comprenden únicamente ADN del Factor V) eran negativas para T21. Sin embargo, incluso con la corrección del contenido de GC, las abundancias cromosómicas aparentes fueron bajas para algunos cromosomas y altas para otros. En particular, parecía que los cromosomas 19 y X eran menos abundantes de lo esperado.
Ejemplo 11: Métodos de uso de controles con ensayos de diagnóstico que utilizan micromatrices de ácidos nucleicos Los controles que comprenden la trisomía 21 se prepararon de acuerdo con la Tabla 5 y se proporcionaron al laboratorio de micromatrices para su análisis.
Tabla 5. Características de los controles de trisomía 21
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Todas las muestras (excepto 426-04F-DNA) se diluyeron a 5 ml con PBS, y el ADN se extrajo usando el kit de ácidos nucleicos circulantes QlAamp de Qiagen y se eluyó en 100 pl. Las concentraciones para el ADN extraído se midieron usando el ensayo Qubit de ADNss (Tabla 6).
T l . n nr i n l nr l ri mí 21 rifi i n
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El ADN se amplificó con un procedimiento que consta de 3 etapas. En resumen, la totalidad de cada muestra, incluyendo 50 ng de la muestra 426-04F-DNA, se usó en las Etapas 1 y 2. Las muestras G y F-MB tenían concentraciones bajas, por lo que toda la muestra se llevó a la PCR (Etapa 3), en lugar de la mitad, que es el procedimiento habitual. También se procesó un ADN de disomía de referencia junto con las muestras. Después de la Etapa 3, que comprendía PCR, se midieron las concentraciones de ácido nucleico en las muestras y la referencia en un NanoDrop (Tabla 7).
Tabla 7. Concentración ureza de los controles de trisomía 21 des ués de la am lificación
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Los rendimientos de la amplificación pasaron el control de calidad, y se marcaron 1 pg de cada control (y referencia) con el kit de marcado de ADN CytoSure de Oxford Gene Technology. Los controles se marcaron con Cy3 y la referencia se marcó con Cy5. La eficacia del marcado se midió en un NanoDrop (Tabla 8).
Tabla 8. Marcado de los controles de trisomía 21
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El marcado pasó el control de calidad y las muestras se mezclaron con la referencia, se secaron y se prepararon para la hibridación en la micromatriz NIPt de Oxford Gene Technology durante la noche. El portaobjetos se lavó, se escaneó y se extrajo la característica después de una hibridación de 22 horas, y los archivos de salida resultantes se analizaron con un script de R preliminar para la detección de exceso del cromosoma 21.
Las muestras de pico de T21 al 25 % se comportaron bien en el ensayo NIPT, mostrando una señal positiva muy fuerte medida por los valores de -log10 P (Figura 14). Las métricas de control de calidad de la matriz fueron buenas, excepto para el control G, que presentó una DLRS alta ("dispersión de la proporción logarítmica derivativa"). Las muestras de T21 al 0 % y al 100 % dieron señales negativas y positivas fuertes, tal como se esperaba. El pico de T21 al 3 % no se detectó como una trisomía en el ensayo (Figura 14).
Ejemplo 12: Estabilidad y vida útil
Se prepararon muestras de trisomía del cromosoma 13 de acuerdo con los Ejemplo 4-6, con y sin liposomas. Las muestras se formularon con Matribase como se ha descrito en el Ejemplo 9. En resumen, un control de trisomía representativo que comprende ADN genómico de Trisomía 13 al 12 % y ADN genómico de PBMC al 88 % en peso se fragmentó y se encapsuló en liposomas. El control se diluyó hasta aproximadamente 20 ng/ml con MatriBase y se dividió en alícuotas en partes de 1,2 ml. Se prepararon controles adicionales sin liposomas, se diluyeron con MatriBase y se dividieron en alícuotas en partes de 1,2 ml.
Los controles se monitorizaron en paralelo. En cada punto temporal, se extrajo 1 ml de una alícuota usando el kit de ácido nucleico circulante QIAamp de QIAGEN con elución en 1 ml de tampón AVE. La estabilidad se evaluó mediante PCR digital de gotas y secuenciación de nueva generación (NGS). Para el ensayo de PCR digital, los controles se controlaron monitorizar no un gen de copia única en el cromosoma 1. Los ensayos de NGS se realizaron en un laboratorio de referencia externo que analiza rutinariamente muestras de pacientes con NIPS. La PCR digital sugirió que cada control liposomal y cada control no liposomal presentaban una estabilidad comparable y que la estabilidad era independiente de la temperatura (Figura 31).
Las muestras se almacenaron durante 33 días a temperaturas de 4 °C, 25 °C, o 42 °C, y a continuación los ácidos nucleicos se extrajeron como se ha descrito en el Ejemplo 8. Los controles se enviaron a un laboratorio de referencia comercial para su análisis usando su flujo de trabajo estándar con secuenciación en una plataforma Illumina HiSeq. El laboratorio comercial realizó la preparación de la biblioteca 14 días más tarde, después de los 33 días de almacenamiento, por lo que la preparación de la biblioteca se realizó 47 días después de preparar las muestras. Se extrajeron cantidades comparables de ADN de cada muestra; sin embargo, las muestras preparadas sin liposomas no funcionaron tan bien durante el método de preparación de la biblioteca NGS, dando como resultado rendimientos deficientes (Tabla 9). Por último, los controles formulados sin liposomas fallaron en la preparación de la biblioteca y no se pudieron secuenciar. Se volvió a intentar la preparación de la biblioteca y el segundo intento tampoco tuvo éxito, lo que sugiere que el fallo era atribuible a la degradación de los controles formulados sin liposomas más que a un error del operario. Cada uno de los controles que se formularon con liposomas se secuenció de forma satisfactoria (Figura 16 y Tabla 10).
Tabla 9. Extracción de ADN de muestras almacenadas y concentración después del método de preparación de la biblioteca NGS.
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Se secuenció el ADN de muestras que comprendían liposomas, y se evaluó la ploidía de los cromosomas 13, 18 y 21 (Figura 16). El almacenamiento a diversas temperaturas durante 33 días no afectó al rendimiento de las muestras preparadas con liposomas.
Se intentó la secuenciación de nueva generación en las muestras en un punto temporal posterior después de un almacenamiento adicional, 125 días después de preparar las muestras. Los controles formulados sin liposomas fallaron en la preparación de la biblioteca y no se pudieron secuenciar. Se volvió a intentar la preparación de la biblioteca y el segundo intento tampoco tuvo éxito, lo que sugiere que el fracaso se atribuyó a la degradación de los controles formulados sin liposomas más que a un error del operario. Cada uno de los controles que se formularon con liposomas se secuenció de forma satisfactoria (Figura 32 y Tabla 10).
T l 1 . R l l n i i n r nr l r fri r 2- ° r 42 °
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Se prepararon dos muestras de acuerdo con los Ejemplos 4-6, una muestra que contenía liposomas (1:2Css) y una muestra preparada en paralelo sin liposomas (4:3Css). Las muestras se almacenaron durante 66 días a 42 °C y a continuación se analizaron en un sistema Bioanalyzer de Agilent. El análisis del sistema Bioanalyzer se realizó usando el ensayo de ADN 1000 de alta sensibilidad, que se usó para evaluar la estabilidad de acuerdo con el perfil de fragmentación de cada control. La muestra que contenía liposomas (1:2Css) mostró un pico centrado en 150 pb, que corresponde al ADN fragmentado (Figura 15). La muestra preparada sin liposomas (4:3Css) no mostró un pico a 150 pb y, en cambio, mostró una señal de alto peso molecular considerable a >3000 pb, coherente con la agregación de ADN (Figura 15). La agregación es coherente con el impacto negativo pronunciado en los procedimientos de preparación de bibliotecas posteriores requeridos como parte de la secuenciación (mencionado anteriormente). Por lo tanto, los liposomas pueden inhibir la agregación de ácidos nucleicos en un control.
Ejemplo 13: Controles de neoplasia
Se crearon controles para evaluar la concentración de 9 mutaciones asociadas a diversas neoplasias.
Los siete plásmidos utilizados para este experimento se enumeran en la Tabla 11. Cada plásmido (10 pg a 1 pg/pl) se digirió con Notl a 37 °C durante 3 horas. Notl se desactivó mediante una incubación de 20 minutos a 65 °C. A continuación, las muestras se purificaron usando el kit de limpieza de PCR de Qiagen y se calculó que las muestras eran de 196 ng/pl. Las muestras se cuantificaron mediante Nanodrop y dPCR (véase la Tabla 12). La determinación de la concentración de ng/pl mediante dPCR usa el cartucho de ampicilina y requiere un factor de multiplicación grande que se calcula, sin embargo, que el uso de este número para la normalización de los plásmidos sigue siendo válido. Cada plásmido linealizado se analizó mediante electroforesis en gel para determinar la eficacia de linealización.
Tabla 11: Plásmidos utilizados en la construcción del kit de mezcla de mutación de ADN-I (AF5-WT) de tumor circulante Serase ™
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T l 12: nifi i n l mi m i n N n r P R
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Los plásmido se normalizaron a 10 ng/jl en un volumen final de 75 |jl usando MB Water. La mezcla maestra de plásmido se diluyó 5 x 1:20 o 1:3200000 en MB Water y se midió mediante dPCR. La concentración de cada mutación se midió usando dPCR (Tabla 13).
T l 1 : n nr i n l mi n rm liz i n n n ífi m n
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La concentración de ADNg de GM24385 que entra en el proceso de fragmentación fue de aproximadamente 150 ng/jl, con el fin de fragmentar a ~170 pb usando parámetros de fragmentación previamente establecidos. La primera etapa para crear el producto fue diluir la solución de reserva de ADNg de GM24385 a 150 ng/jl. El ADNg se combinó y se midió mediante Qubit usando el kit de alta sensibilidad. La concentración de GM24385 fue de 233,6 ng/jl. Para preparar 11 ml de 150 ng/jl de reserva de ADNg, se diluyeron 7063,4 j l de GM24385 con 3936,6 j l de 0,1x TE a pH 8,0. La dPCR se realizó después de mezclar con la mezcla maestra de plásmido (véase a continuación) y la concentración de ADNg usando el ensayo de peso BRAF fue de 147,6 ng/jl.
En primer lugar, se realizaron "diluciones aproximadas" diluyendo la mezcla maestra de plásmido en el ADNg de GM24385 de 147,6 ng/jl. La concentración real de la dilución, medida por dPCR (SOP19195) y el conjunto de cebadores BRAF, fue AF de un 59,6 % y AF de un 0,11 %. Estas diluciones aproximadas se diluyeron adicionalmente hasta AF de un 4,97 % y AF de un 0,1075 %.
La AF de un 4,97 % se convirtió en la muestra de AF de un 5 % y se usó para hacer diluciones en serie de 2 veces para obtener las muestras de AF de un 1,25 % y AF de un 0,625 %. La dilución de AF de un 0,1075 % se convirtió en la muestra de AF de un 0,1 % y el ADNg de GM24385 de 147,6 ng/pl se convirtió en la muestra de AF de un 0 %. El volumen final de todas las muestras fue de 1,2 ml mínimo, para poder llevar 1,0 ml a través del proceso de fragmentación. Todas las muestras se tomaron para fragmentar y filtrar en este punto. La verificación del porcentaje de AF se realizó después de la fragmentación y el filtrado. Las muestras se diluyeron a 10 ng/pl y se midió el % de AF usando dPCR y usando cebadores frente a al menos un gen por plásmido. Durante esta etapa de verificación, se descubrió que se había cometido un error de cálculo. El error se produjo con la muestra de AF de un 0,1075 %, que en realidad era AF de un 1,075 %. Para rectificar esto, se combinaron 40 pl de AF fragmentada/filtrada al 1,075 % con 360 pl de AF fragmentada/filtrada al 0 % para prepara la AF de un 0,1 % (una dilución 1:10). Esta muestra se volvió a analizar mediante dPCR y se confirmó que era AF de un 0,1 %. En este punto, todas las muestras tenían un mínimo de 300 pl, que es el volumen necesario para la formación de liposomas. Los resultados de los ensayos de dPCR se enumeran en la Tabla 14 y se representan gráficamente en la Figura 17.
Tabla 14: Los porcentajes de frecuencia alélica (% de AF) resultan de experimentos de dPCR en muestras de AF de ADNct fra mentado/filtrado
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Después de la verificación de la mezcla de plásmidos mutante correcta con respecto a la frecuencia alélica (AF) del ADNg, se transfirieron 1000 pl de cada AF a un milliTUBE (Covaris P/N: 520130) para su uso en M220 de Covaris con el soporte milliTUBE (Covaris P/N: XT500348) para fragmentar los ácidos nucleicos. Para la fragmentación se establecieron los siguientes parámetros: Potencia máxima: 75,0, Factor de trabajo: 20,0, Ciclos por ráfaga: 200, Tiempo: 20 min y Temperatura: 4-8 °C. Una vez equilibrado el baño de agua a la temperatura establecida, el milliTUBE se colocó en el soporte y se ejecutó el programa. Después de cada ejecución, la muestra se almacenó a 2-8 °C.
El análisis de ADN del tamaño del fragmento de la fragmentación se realizó mediante electroforesis en gel y usando el sistema Bioanalyzer. El análisis en gel de agarosa se realizó con agarosa al 1,0 %. Se cargaron 150 ng de ADN por carril. El experimento mostró que el ADN genómico se completó fragmentado y la imagen del gel de agarosa se muestra en la Figura 18. Además, la Figura 19 es un gráfico del tamaño del pico del ADNg fragmentado utilizando el kit de ADN de alta sensibilidad Bioanalyzer en un sistema Bioanalyzer de Agilent. Las trazas del sistema Bioanalyzer se muestran en la Figura 19 con alturas de pico que varían entre 150-170 pb.
Preparación de lípidos
Se usó una mezcla molar al 2,5 % de DDAB (bromuro de didodecildimetilamonio) en mezcla lipídica liofilizada DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina) para la preparación de liposomas. Esto se logró creando una mezcla física de 400 mg de DMPC (Avanti Polar Lipids, P/N: 850345P) y 6,8 mg de DDAB (Sigma, P/N: 359025). Para obtener la mezcla/formación de lípidos adecuada, los lípidos se disolvieron en el disolvente alcohol t-butílico y a continuación se liofilizó para retirar el disolvente.
La cantidad de 6,8 mg era demasiado pequeña para realizar su pesada, por lo que primero se preparó una solución de 68 mg/ml en alcohol t-butílico (Sigma, P/N: 471712-100 ml) en un vial de vidrio pequeño. La densidad del alcohol t-butílico es diferente a la del agua (775 mg/ml), por lo que el disolventes y añadió por vía gravimétrica. Una vez preparada la solución de 68 mg/ml, se añadieron 400 mg de DMPC a un matraz de fondo redondo pequeño (50 ml) seguido de 100 pl de la solución de 68 mg/ml de DDAB. A continuación se añadieron al matraz 10 ml de alcohol tbutílico (7,75 g) por vía gravimétrica y los lípidos se disolvieron con ultrasonidos y calor. Fue necesario el uso de una pistola de calor en la punta de la pipeta de vidrio para evitar la congelación de la pipeta de vidrio. Después de la disolución, el matraz de fondo redondo se colocó bajo un vacío suave y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido. El disolvente se retiró al vacío. Después de secar durante la noche (~19 horas), el vacío se liberó y el sólido resultante se observó como un sólido de color blanco floculante. El material se sometió a agitación vorticial brevemente para liberar las escamas del lado de la pared de vidrio. El material se tapó con un tapón de goma y se usó como tal.
Una alícuota de 20 mg de lípidos catiónicos se transfirió a cada uno de los cinco tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Los tubos se rehidrataron con 100 pl de 1x TE (40 °C) calentado a pH 8,0. Los tubos se sometieron a ultrasonidos en un aparato de ultrasonidos de baño de agua caliente (~40 °C) durante 20 min.
Encapsulación de ADN
Antes de la encapsulación, se filtraron 1000 pl de cada una de las cinco mezclas de ADN fragmentado a través de un filtro Durapore de PVDF de 0,1 pm (Millipore P/N: UFC30VV00) a 12.000 x g hasta secar para retirar cualquier partícula grande que pudiera ensuciar la membrana de extrusión. Se añadieron 300 pl de ADN fragmentado y filtrado al tubo de microcentrífuga de lípido preparado. Después de la agitación vorticial, los tubos se sumergieron en nitrógeno líquido de modo que el volumen de líquido se sumergiera, pero no la tapa, durante 30-60 segundos. Una vez que los tubos estuvieron completamente congelados, se colocaron rápidamente en un bloque de calor a 40 °C durante 15-20 min. Después del periodo de descongelación, los tubos se sometieron a agitación vorticial de forma minuciosa. El ciclo de congelación/descongelación se repitió un total de cinco veces.
Extrusión de liposomas
Una miniextrusora Avanti (Avanti Polar Lipids, Inc; P/N 610000) se usó para el proceso de extrusión que sigue a continuación para extruir cada tubo de ADN fragmentado encapsulado. Para ello, toda la preparación de lípido/ADN, ~0,4 ml, se extrajo en un lado de la miniextrusora y se procesó para un total de 31 pases usando una membrana de extrusión de 0,1 pm (Whatman P/N: 800309). El material final se transfirió a tubos nuevos de microcentrífuga de 1,7 ml y el volumen se llevó a 1 ml con 1X TE a pH 8,0.
Purificación de liposomas
Los liposomas extruidos se purificaron sobre una columna de HiTrap DEAE FF de 5 ml (GE P/N: 17-5154-01) en el aparato de FPLC AKTA Explorer usando inyección manual y el método de "liposoma de bucle de 5 ml". Se inyectó 1 ml completo de liposoma y se recogió a los 2 minutos de elución, dando como resultado una solución de volumen de liposomas de "título alto" de 4 ml. El tampón A, que se usa como tampón de lavado, era tampón Tris 50 mM elaborado a partir de tampón Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5 (Quality Biological P/N: 351-006-721). El tampón B, que se usa como tampón de elución, fue 1x TBS con NaCl 1 M y se preparó a partir de TBS y NaCl.
Formulación de MatriBase al 50 %
La solución de MatriBase al 50 % se preparó a partir de una formulación a 1:1 de EDTA 2 mM (Amresco P/N: 0245-500G), azida sódica al 0,18 % (Sigma S2002), agua PicoPure, y Seracon MatriBase (SeraCare P/N: 22009). Para preparar esta formulación, se usó una balanza analítica para medir 2,7 g de azida sódica y 1,14 g de EDTA, que se transfirieron a un recipiente de 3 l y se añadieron 1,5 l de agua y el contenido se mezcló completamente. A continuación, se añadió una parte de 1,5 l de MatriBase y se volvió a mezclar. Por último, la mezcla de Seracon MatriBase al 50 % se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (Nalgene P/N: 430186) y se almacenó a 2 - 8 °C hasta su uso posterior. Esto da como resultado una formulación final de MatriBase al 50 % con EDTA 1 mM y azida sódica al 0,09 %. El tamaño del volumen final fue de 3000 ml.
Ensayo de volumen de liposomas, dilución para reserva intermedia y volumen final
La solución de alto título se sometió a agitación vorticial enérgicamente y se extrajeron 10 pl del volumen de LipoADN usando el kit de ácido nucleico circulante QlAamp. Antes de la extracción se realizó una dilución a 1:100: una alícuota de liposoma de 10 pl se diluyó en 1000 pl de MatriBase al 50 % en volumen. Se realizaron extracciones individuales y la elución de la columna final se realizó con 50 pl de tampón AVE del kit. Se realizaron ensayos de Qubit por triplicado en su volumen extraído usando el kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit (PN Q32851). A partir de esto, se determinó la concentración del volumen de alto título (Tabla 15).
T l 1 : R n imi n ADN rir li m in il ir l xr i n
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Basándose en estos datos de la Tabla 15, se preparó un volumen intermedio de acuerdo con la Tabla 16 ("Conc. de compuesto intermedio objetivo") a continuación con una concentración objetivo de 0,1 pg/ml y un volumen de 80 ml de volumen intermedio. Las muestras se prepararon mediante la adición de la reserva HT especificada a 80 ml de MatriBase al 50 %. Se mezcló una parte de 1 ml del volumen intermedio con 1 ml de agua Ultrapure y se extrajo usando el kit de ácido nucleico circulante QlAamp. Esto se hizo por duplicado. Después de extracciones por duplicado, la elución de la columna final se realizó con 50 pl de tampón AVE del kit. Se realizaron ensayos Qubit por triplicado en su volumen extraído utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit (PN Q32851). A partir de esto, se determinó la concentración del volumen de alto título, tabla a continuación Tabla 16.
T l 1 : R n imi n ADN il i n r n n nr i n in rm i l xr i n
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La reserva final se formuló con una concentración objetivo de 0,016 pg/ml de los volúmenes intermedios y la formulación de MatriBase al 50 % de acuerdo con la tabla 17 a continuación. A partir de los volúmenes acabados de 500 ml finales, se tomaron muestras de 3 alícuotas de 5 ml de cada uno y se extrajeron (sin dilución) usando el kit de ácido nucleico circulante QlAamp. Se realizaron extracciones por triplicado y la elución final de la columna se realizó con 50 pl de tampón AVE del kit. Se realizaron ensayos de Qubit por triplicado en su volumen extraído usando el kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit. La concentración media de Qubit se multiplicó por 0,050 ml para obtener los pg totales de ADN extraído. A continuación, el ADN total extraído se divide entre los 5000 pl, el volumen del Matribase extraído. A partir de esto, se asignó la concentración aparente final (Tabla 17). Todas las concentraciones cumplieron las especificaciones.
Tabla 17: Rendimiento^ final del ADN des ués de la formulación final des ués de la extracción
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Los extractos de volumen por unidad de masa se secuenciaron usando el ensayo de panel de oncología (NGS) Swift 56G basado en amplicón que se diseñó para el ADNcf. El objetivo del experimento fue verificar que el material secuenciable estuviera presente en el volumen terminado y que las muestras no se hubieran intercambiado durante la preparación. No se esperan señales de frecuencia de alelos confiables por debajo de un 5 % con este kit de biblioteca y se presentan para evaluación cualitativa, en lugar de cuantitativa.
Para la preparación de la biblioteca de secuenciación, se usaron como entrada 10 pl de Extracto 1 y Extracto 2 para cada material de referencia. Las muestras se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el panel de oncología 56G (Swift Biosciences, N.° de Cat. AL-IL56G-12/48). Las bibliotecas preparadas se cuantificaron mediante qPCR (KAPA Biosystems, N.° de Cat. KK4824) en un instrumento ABI 7500 RT-PCR (Tabla 18). A continuación, las bibliotecas se normalizaron y se agruparon. Las bibliotecas agrupadas se desnaturalizaron y se procesaron durante 300 ciclos usando química v2 (Illumina, N.° de Cat. MS-102-2002) en un MiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Tabla 18. Secuenciación de controles de^ neo lasia
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Las muestras A-F se prepararon en bibliotecas como un conjunto, sin embargo, la preparación de bibliotecas de D1 y D2 se repitió debido a la cuantificación variable después de la preparación de la biblioteca. Las muestras A-F (10 bibliotecas) se secuenciaron en una sola celda de flujo MiSeq. Debido a las señales de AF variables entre ciertas réplicas, las Muestras F, D y C (6 bibliotecas) se volvieron a secuenciar en una segunda celda de flujo única para lograr una mayor profundidad de lectura. A continuación se presenta la tabla de resultados para la Ejecución 1 y la Ejecución 2 con gráficos resumidos (Tabla 19). También se recogieron datos de volumen de mezcla de ADN fragmentado al 5 % sin liposomas. La Tabla 20 muestra que las señales de AF antes y después de tratamiento con liposomas y la extracción son comparables y que el generador de señales de Variante SeraCare da como resultado señales comparables al canal de señales de variante Swifts.
Tabla 19A. Resultados del panel de oncología Swift 56G con procesamiento de datos en el procesador de variante
SeraCare
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Tabla 19B. Resultados del panel de oncología Swift 56G con procesamiento de datos en el procesador de variante
SeraCare
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Tabla 20. Muestra de AF de un 5 % com aración de análisis con el ensa o Swift 56G
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Conclusiones:
El material de referencia formulado al 5 % dio un rendimiento, tal como se esperaba, de una AF media de un 5,4 % ± 1,1 (Ejecución 1) y 5,2 % ± 1,1 (Ejecución 2). En la muestra de frecuencia de AF de un 1,25 %, la calidad de los datos se deteriora, pero la frecuencia media de los alelos sigue siendo coherente con el objetivo: 1,9 % ± 1,9 (Ejecución 1) y 1,7 % ± 1,9 (Ejecución 2). Curiosamente, en uno de los replicados de AF de un 1,25 % EGFR(6240) y EGFR(12378), que están en el mismo plásmido, están sesgadas de forma excesivamente alta a una AF de ~7 % y lo más probable es que sean el resultado de una preparación de biblioteca de baja complejidad. Las muestras con AF de un 0,6 %, un 0,1 % y un 0 % (WT) están en el ruido del ensayo, cuando se consideran mutaciones individuales, sin embargo, en la frecuencia media de alelos en una muestra dada se observa una proporción lineal (R = 0,9656) de un 5 % a un 0,1 %. Además, el material de referencia no se modifica a través del proceso de liposoma y extracción, y el generador de señales de variante SeraCare produce señales comparables a las del canal interno de Swift. Basándose en estos datos, se considera que los controles son conformes y están dentro de las especificaciones.
Ejemplo 14. Controles de Trisomía
Se preparó ADN de tres fracciones fetales al 12 % con respecto a fracción materna basándose en datos de concentración de ddPCR para cada uno de los tres ADN trisómicos. Para cada mezcla, se mezclaron 12,6 pg de ADNg Trisómico masculino (descrito en el Ejemplo 3, mencionado anteriormente) con 92,4 pg de ADN genómico de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se diluyó con 1x TE a pH 8,0 a 700 pl. El ADN genómico de Trisomía 13, el ADN genómico de Trisomía 18 y el ADN genómico de trisomía 21 se obtuvieron a partir de líneas celulares masculinas de Trisomía con licencia de UCSF (véase el Ejemplo 3, mencionado anteriormente). El ADN genómico materno se obtuvo a partir de PBMC. Para crear un volumen final de 700 pl de mezcla de ADNg fetal y materno, las cantidades de reserva de ADNg y tampón (1x TE, pH 8,0) usadas se muestran en la Tabla 21. Por ejemplo, para Trisomía 13, se mezclaron juntos 47 pl de ADNg de T13, 184 pl de ADNg de PBMC y 469 pl de tampón para lograr una concentración de 150 pg/ml en 700 pl. Una vez mezclado, se realizó electroforesis en gel con agarosa al 0,6 % con una cantidad de carga de ADN de 150 ng por carril (Figura 22), y se realizó PCR digital de gotas para analizar la fracción fetal (Tabla 21). La fracción fetal objetivo fue de 12 ± 3%, que se logró en las tres mezclas de Trisomía.
Tabla 21: Líneas de hTPC trisómicas
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Tabla 22. Mezcla de ADN materno fetal basándose en la concentración de ddPCR
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Tabla 23. Fracción fetal calculada en mezclas al 12 % basándose en la concentración de ddPCR
en el número de co ias
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Se mezcló ADN Trisómico y de PBMC, y se transfirieron 680 pl de solución a un milliTUBE (Covaris P/N: 520130) para uso en M220 de Covaris con el soporte milliTUBE (Covaris P/N: XT500348). Para la fragmentación se establecieron los siguientes parámetros: Potencia máxima: 60,0, Factor de trabajo: 20,0, Ciclos por ráfaga: 200, Tiempo: 40 minutos y Temperatura: 4-8 °C. Se equilibró un baño de agua a la temperatura establecida, se colocó el milliTUBE en el soporte y se ejecutó el programa de fragmentación. Después de cada ejecución, las mezclas fragmentadas de Trisomía se almacenaron a 2-8 °C hasta el día siguiente. Los ensayos se realizaron en el ADN fragmentado usando un sistema Bioanalyzer de Agilent y un fluorómetro Qubit 3.0. El análisis de ADN se realizó con el kit de ADN de alta sensibilidad en el sistema Bioanalyzer de Agilent (Figura 23). La concentración se detectó en el Qubit 3.0 con el kit de ensayo de rango amplio Qubit (Thermo P/N: Q32850).
Preparación de lípidos
Para la preparación de liposomas, se usó una mezcla molar al 2,5 % de DDAB liofilizado (bromuro de didodecildimetilamonio) en DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina). Esto se logró creando una mezcla física de 400 mg de DMPC (Avanti Polar Lipids, N.° de P 8500345P) y 6,8 mg de DDAB (Sigma, N.° de P 359025), que se añadió como una solución de 68 mg/ml en alcohol t-butílico (Sigma, N.° de P 471712-100 ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml. Se añadió gravimétricamente al matraz una parte de 10 ml a alcohol t-butílico y los lípidos se disolvieron con tratamiento de ultrasonidos. Después de la disolución, el matraz de fondo redondo se colocó bajo un vacío suave y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido. El disolvente se retiró al vacío. Después de 19 horas de secado, el vacío se liberó y el sólido resultante se observó como un sólido de color blanco floculante. Una medida de 40 mg de lípidos catiónicos (DDAB al 2,5 % en DMPC) se transfirió a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 ml. Esto se repitió un total de tres veces para cada control. Cada tubo se rehidrató con 200 pl de TE 1x calentado (40 °C) a pH 8,0. A continuación, los tubos se colocaron en un aparato de ultrasonidos de baño calentado (40 °C) y se sometió a ultrasonidos durante 20 minutos.
Encapsulación de ADN
Antes de la encapsulación, se filtraron 610 pl de mezcla de ADN fragmentado a través de un filtro de PVDF Durapore de 0,1 pm (Millipore P N: UFC30VV00) a 12.000 x g hasta su secado para retirar cualquier partícula grande que pudiera ensuciar la membrana de extrusión. Se añadió una parte de 600 pl de ADN fragmentado y filtrado de cada mezcla de trisomía por separado a cada uno de los tres tubos de lípidos preparados. Después de someter a agitación vorticial, los tres tubos se sumergieron en nitrógeno líquido de modo que las líneas de volumen se sumergieran durante 30 - 60 segundos. Una vez que los tubos estuvieron completamente congelados, se colocaron rápidamente en un bloque de calor a 40 °C durante 15 a 20 minutos. Después del periodo de descongelación, los tubos se sometieron a agitación vorticial de forma minuciosa. Este ciclo de congelación/descongelación se repitió un total de cinco (5) veces.
Extrusión de liposomas
Se usó una extrusora de acero de alta presión con gas argón a 300 psi para extruir cada tubo de ADN fragmentado encapsulado para un total de 10 pases, usando dos filtros intercalados de 0,1 pm (Whatman P/N: 100405) y un espaciador de malla de 13 mm en un tubo cónico estéril de 15 ml. Una vez extruido, a cada tubo se le añadieron 400 pl de 1 x TE, pH 8,0. A continuación, los tres tubos cónicos se almacenaron a 4-8 °C durante la noche.
Purificación de liposomas
Los liposomas extruidos se purificaron sobre una columna HiTrap DEAE FF de 5 ml (GE P/N: 17-5154-01) en el aparato de FPLC AKTA Explorer usando inyección manual y el método de "liposoma de bucle de 5 ml". Se inyectó todo 1 ml de liposoma y se recogieron 2 minutos de elución, lo que dio como resultado una solución del conjunto de liposomas de "título alto" de 4 ml. El tampón de lavado fue tampón Tris 50 mM preparado a partir de tampón Tris 1,0 M, pH 8,0 (Millipore P/N: 648314). El tampón de elución fue 1x TBS con NaCl 1 M, preparado a partir de TbS y NaCl.
Ensayo y dilución de volumen de liposomas
Las soluciones de alto título se sometieron a agitación vorticial enérgicamente y se extrajeron en volumen 5 pl de cada LipoADN usando el kit de ácido nucleico circulante QlAamp. Antes de la extracción, se diluyeron alícuotas de liposomas de 5 pl hasta 995 pl con 1x TE, pH 8,0. Las extracciones se realizaron por duplicado. Los ensayos Qubit por triplicado se realizaron sobre los volúmenes extraídos usando el kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit. Se determinó la concentración del volumen de alto título. Basándose en estos resultados, las muestras de alto título se diluyeron a 20 ng/ml de acuerdo con la Tabla 24 en una mezcla de Seracon MatriBase al 50 %. La mezcla de Seracon MatriBase (MB) al 50 % se preparó a partir de una formulación de EDTA 2 mM a 1:1 (Amresco P/N: 0245), azida sódica al 0,18 %, agua Ultrapure y Seracon MatriBase (SeraCare P/N: 22009). La mezcla de Seracon MatriBase al 50 % se filtró a través de un filtro de 0,2 pm (Nalgene P/N: 567-0020) antes de la adición del liposoma. Esto da como resultado una formulación final de MatriBase al 50 % con EDTA 1 mM y azida sódica al 0,09 %. Se hizo que el tamaño final del conjunto fuera de 200 ml. Todas las diluciones se completaron de forma aséptica en una campana de vitrina de bioseguridad.
Tabla 24. Análisis Qubit de concentraciones de li osomas de Trisomía
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El volumen de 20 ng/ml finalizados se extrajo usando un kit de extracción de ácido nucleico circulante QlAamp. Las alícuotas de 1 ml de cada Trisomía se extrajeron en duplicados usando el ensayo de HS Qubit. Las concentraciones finales medidas usando el ensayo Qubit se muestran en la Tabla 25.
Tabla 25. Análisis Qubit de concentraciones de volumen final
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Se analizó una sola unidad de 190 ml de volumen diluido del control de Trisomía 13. Se prepararon tres alícuotas replicadas de 1,0 ml a partir del mismo volumen y se enviaron a un laboratorio comercial para el análisis de ensayo NIPS usando un ensayo Verinata Health adaptado usando una química V.4 en una plataforma Illumina HiSeq. Las muestras se extrajeron de forma independiente y se tomaron mediante la preparación de la biblioteca. A continuación se muestra una tabla de puntuaciones del valor cromosómico normalizado (NCV) (Tabla 26) y los valores de los cromosomas 13, 18 y 21 se representan en un gráfico de barras en la Figura 24. Posteriormente, un laboratorio comercial diferente que ejecutaba un ensayo análogo en la plataforma Illumina HiSeq confirmó la identidad.
Tabla 26. Puntuaciones del valor cromosómico normalizado NCV ara controles de Trisomía 13
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Se analizó una sola unidad de 190 ml de volumen diluido del control de Trisomía 18. Se prepararon tres alícuotas replicadas de 1,0 ml a partir del mismo volumen y se enviaron a un laboratorio comercial para el análisis de ensayo NIPS usando un ensayo Verinata Health adaptado usando una química V.4 en una plataforma Illumina HiSeq. Las muestras se extrajeron de forma independiente y se tomaron mediante la preparación de la biblioteca. A continuación se muestra una tabla de puntuaciones del valor cromosómico normalizado (NCV) (Tabla 27) y los valores de los cromosomas 13, 18 y 21 se representan en un gráfico de barras en la Figura 25. Posteriormente, un laboratorio comercial diferente que ejecutaba un ensayo análogo en la plataforma Illumina HiSeq confirmó la identidad.
Tabla 26. Puntuaciones del valor cromosómico normalizado NCV ara controles de trisomía 18
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Se analizó una sola unidad de 190 ml de volumen diluido del control de trisomía 21. Se prepararon tres alícuotas replicadas de 1,0 ml a partir del mismo volumen y se enviaron a un laboratorio comercial para el análisis de ensayo NIPS usando un ensayo Verinata Health adaptado usando una química V.4 en una plataforma Illumina HiSeq. Las muestras se extrajeron de forma independiente y se tomaron mediante la preparación de la biblioteca. A continuación se muestra una tabla de puntuaciones del valor cromosómico normalizado (NCV) (Tabla 28) y los valores de los cromosomas 13, 18 y 21 se representan en un gráfico de barras en la Figura 26.
Tabla 27. Puntuaciones del valor cromosómico normalizado NCV ara controles de trisomía 18
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Ejemplo 15. Controles de trisomía 21
Los controles de trisomía 21 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 14, con concentraciones de ADN de aneuploidía objetivo con respecto al ADN total de un 1 %, un 2 %, un 4 %, y un 8 %. Los controles finales tenían concentraciones de ADN que variaban de 27,2 ng/ml (control de aneuploidías de trisomía 21 al 1 %), 26,8 ng/ml (2 %), 27,9 ng/ml (4 %), y 27,3 ng/ml (8 %).
Tres alícuotas de replicado de cada control de trisomía 21 se enviaron a un laboratorio comercial para el análisis de ensayo NIPS usando un ensayo Verinata Health adaptado usando una química V.4 en una plataforma Illumina HiSeq. Las muestras se extrajeron de forma independiente y se tomaron mediante la preparación de la biblioteca. Debido a complicaciones de análisis en el laboratorio, las muestras de la fracción fetal al 1 % y al 2 % se procesaron en una celda de flujo diferente y en una preparación de biblioteca no paralela a partir de las muestras de la fracción fetal al 4 % y al 8 %.
Los valores de NCV informados para valores de los cromosomas 13, 18, 21, X, e Y se enumeran en la Tabla 29 con valores medios y desviaciones estándar enumerados en la Tabla 30. Las Figuras 27 y 28 demuestran la proporción lineal esperada (R2 = 0,9992) entre NCV Y y NCV 21 y los niveles de ruido de punto de referencia correspondientes asociados al cromosomas 13 y al cromosoma 18. La Figura 29 confirman la proporción lineal entre la fracción fetal determinada mediante dPCR y la medición de NCV para el cromosoma Y (R2 = 0,9954) y para el cromosoma 21 (R2 = 0,9956).
Tabla 29: Valores individuales de NCV
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Tabla 30: Puntuaciones medias de NCV desviación estándar
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Ejemplo 16. Controles de trisomía de múltiples analitos
Una muestra que comprende ADN genómico de trisomía 21 al 12 %, ADN genómico de trisomía 18 al 12 %, ADN genómico de trisomía 13 al 12 %, y ADN femenino no aneuploide al 64 % (de las PBMC) se preparó de acuerdo con los métodos del Ejemplo 14. Se analizó una sola unidad de 190 ml del control de trisomía de múltiples analitos. Se prepararon tres alícuotas replicadas de 1,0 ml a partir del mismo volumen y se enviaron a un laboratorio comercial para el análisis de ensayo NIPS usando un ensayo Verinata Health adaptado usando una química V.4 en una plataforma Illumina HiSeq. Las muestras se extrajeron de forma independiente y se tomaron mediante la preparación de la biblioteca. A continuación se muestra una tabla de puntuaciones del valor cromosómico normalizado (NCV) (Tabla 31) y los valores de los cromosomas 13, 18 y 21 se representan en un gráfico de barras en la Figura 30.
Tabla 31
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Ejemplo 17. Control negativo de trisomía (control euploide)
Una muestra que comprende ADN genómico masculino a aproximadamente un 17,8 %, obtenido a partir de las PBMC, y ADN genómico femenino a aproximadamente un 82,2 %, obtenido a partir de las PBMC se preparó de acuerdo con los métodos del Ejemplo 14. Se analizó una sola unidad de 190 ml del control negativo de trisomía. Se prepararon tres alícuotas replicadas de 1,0 ml a partir del mismo volumen y se enviaron a un laboratorio comercial para el análisis de ensayo NIPS usando un ensayo Verinata Health adaptado usando una química V.4 en una plataforma Illumina HiSeq. Las muestras se extrajeron de forma independiente y se tomaron mediante la preparación de la biblioteca. El análisis se confirmó en un laboratorio comercial diferente que ejecuta un ensayo análogo en la plataforma Illumina HiSeq. A continuación se muestra una tabla de puntuaciones del valor cromosómico normalizado (NCV) (Tabla 32).
T l 2. An li i l v l r r m mi n rm liz N V n nr l n iv ^ ri mí
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Ejemplo 18. Controles que comprenden liposomas pegilados
Se formularon liposomas que contenían ADN usando lípidos modificados con polietilenglicol (lípidos pegilados). Los liposomas consistían en mPEG2000-DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol) 2000]), DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina), y DDAB (bromuro de didodecildimetilamonio) en proporciones molares de 0,05:1:0025. La mezcla lipídica mPEG2000-DMPE:DMPC:DDAB se preparó mediante disolución en alcohol t-butílico a 60 mg/ml seguido de liofilización para preparar un sustrato homogéneo finamente dividido para la formación de vesículas. Después de la liofilización, los lípidos se rehidrataron con tampón TE (TRIS 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) a 60 mg/ml. La suspensión se sometió a un baño de ultrasonidos durante 5 minutos, lo que dio como resultado una suspensión uniforme de vesículas adecuada para la incorporación de ácidos nucleicos. A esta suspensión se añadió una solución de ADN fragmentado de 0,5 equivalentes de volumen en tampón TE (0,15 mg/ml) para una concentración final de ADN de 0,05 mg/ml. A continuación el ADN fragmentado se incorporó en los liposomas usando métodos estándar de congelación-descongelación de modo que las muestras se congelaron en nitrógeno líquido (-196 °C) durante 1 minuto y a continuación se calentaron a 45 °C durante 15 minutos para un total de 5 ciclos (Mayer, et al., Biochim et Biophys Acta 817: 193-196 (1985)). En esta etapa, el ADN se incorporó en las vesículas sin procesar, que eran multilamelares y tenían diferentes tamaños.
Los liposomas sin procesar sometieron a extrusión, usando la miniextrusora Avanti® (Avanti Polar Lipids, N.° de parte: 610000) fijada con un disco de extrusión de policarbonato con poros de 100 nm. Las muestras sin procesar se procesaron, sin dilución a 35-50 °C, para un total de 31 pases, dando como resultado una distribución de tamaño altamente uniforme.
Después de la extrusión, los liposomas se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico, diluyendo los liposomas extruidos hasta 20 mg/ml de lípido en tampón Tris (50 mM) y pase sobre una columna de purificación HiTrap DEAE FF empaquetada previamente de 5 ml (GE Healthcare, N.° de parte: 17-5154-01). Los liposomas purificados (denominados "volumen de LipoADN") se recogieron en una fracción de 4 ml, que no fue retenida por la columna, mientras que el ADN no incorporado permaneció unido a la fase estacionaria. El ADN unido se puede eluir posteriormente aumentando la concentración de sal en la fase móvil a cloruro sódico 1 M. Se encontró que el perfil cromatográfico era comparable al de las otras preparaciones de liposomas, mencionadas anteriormente. Se encontró que el análisis Qubit de las fracciones lipídicas purificadas contenía 40 ng/ml para el control de liposomas de mPEG2000-DMPE:DMPC:DDAB.
Ejemplo 19. Selección de tamaños de ácido nucleico
El ADN genómico de placenta (Sigma®; 1 ml a 150 ng/pl) se fragmentó usando un instrumento Covaris. Los experimentos se realizaron en tubos de PCR a partir de 50 pl de ADN genómico de placenta. La primera selección de tamaño se realizó usando las perlas de Ampure Beckman Coulter. El ADN de placenta genómico y las perlas Ampure se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo, se centrifugó brevemente para llevar el material al fondo del tubo y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se colocaron en una rejilla magnética de 96 pocillos durante 5 minutos para retirar las perlas magnéticas de la solución. Para la primera selección de tamaño, las perlas magnéticas se retiraron y el sobrenadante se guardó transfiriendo la muestra a un nuevo tubo de PCR. Para la segunda ronda de selección de tamaño, se añadieron más perlas Ampure al sobrenadante guardado y se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugando brevemente para llevar el material al fondo del tubo seguido de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se colocaron en la rejilla magnética de 96 pocillos durante 5 minutos para retirar las perlas magnéticas de la solución. Para este caso de selección de tamaño, el sobrenadante se retira y las perlas magnéticas se guardan. Las perlas magnéticas se lavaron dos veces en 100 pl de etanol al 80 % y se dejaron secar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para eluir el ADN de las perlas magnéticas, se añadieron 50 pl de tampón TE 0,1X de Quality Biological y las perlas se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo seguido de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo se colocó en la rejilla magnética durante 5 minutos para retirar las perlas y el sobrenadante se guardó para su análisis.
Las muestras se analizaron para determinar la distribución del tamaño del ADN usando un sistema Bioanalyzer de Agilent y Agilent. Las muestras también se analizaron para determinar la concentración usando el fluorómetro Qubit de Invitrogen y el Kit Qubit de alta sensibilidad.
La purificación de Ampure permitió la selección de ADN con longitudes medidas que varían de aproximadamente 144 pares de bases a 194 pares de bases a concentraciones que varían entre 8,7 ng/pl y 56,7 ng/pl (recuperación de un 5,8 % a un 37,8 %).
Ejemplo 20. Controles que comprenden liposomas pegilados
Se evaluó la viabilidad del uso de plasma sanguíneo femenino normal como fuente de ADN de fondo (es decir, fracción materna). Se prepararon liposomas de DMPC:DDAB que contenían ADN fragmentado al 100 % de cualquiera de las líneas de células primarias de trisomía 13 (T13) o trisomía 18 (T18). El tamaño medio del fragmento de ADN fue de ~170 nucleótidos. A continuación, el ADN fragmentado de T13 y T18 se encapsuló en liposomas y se purificó usando métodos similares a los descritos en el Ejemplo 14. Se recogieron muestras de plasma de dos donantes femeninas sanas en un BCT® de ADN sin células de 10 ml de STRECK. Las fracciones de plasma se aislaron usando métodos convencionales. Para determinar la concentración de ADN en plasma, se extrajeron 3 ml de plasma de cada donante por duplicado usando un kit de ácido nucleico circulante QlAamp de Qiagen , se eluyó en 50 pl de tampón AVE, y la concentración de ADN se determinó usando un Kit de ensayo de HS de ADNds Qubit® (ThermoFisher Scientific). A continuación, se formuló ADN que contenía liposomas en las dos muestras de plasma diferentes tal como se indica en la Tabla 33. Las fracciones con liposomas también se calcularon en función de la concentración del ADN contenido en las muestras de plasma individuales y la concentración del ADN con liposomas y el ADN plasmático que se combinaron .
Tabla 33. Formulación de controles ue com renden ADN de trisomía con li osomas ADNcf femenino
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Un laboratorio de referencia externo que realiza ensayos de NIPS de forma rutinaria determinó los valores de NCV. Se observó una proporción lineal (R2 = 0,994) entre el NCV para el cromosoma Y con respecto a la fracción fetal formulada, indicando esa eficacia de la formulación. También se midió que las muestras eran positivas para trisomía 13 y para trisomía 18 tal como lo evidencian los valores de NCV para los cromosomas 13 y 18 (Tabla 33; Figura 33).
Tabla 33. Valores cromosómicos normalizados (NVC) para controles de trisomía 13 y trisomía 18 masculinos formulados con ADN sin células circulantes femenino
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Se prepararon controles que comprendían un 1 %, un 2 %, un 4 %, o un 8 % de ADN de trisomía 21 y un 99 %, un 98 %, un 96 %, o un 92 % de ADN sin células circulantes femenino como se ha descrito anteriormente. Un laboratorio de referencia externo que realiza ensayos de NIPS de forma rutinaria determinó los valores de NCV. Se determinó una proporción lineal de NCV para el cromosoma 21 con respecto a la fracción de trisomía 21 formulada (Figura 34, R2 = 0,9985; Tabla 34). Los valores de NCV para los cromosomas 13 y 18 no se correlacionaron con el porcentaje de la fracción de trisomía 21.
Tabla 34. Valores cromosómicos normalizados (NVC) para controles de trisomía 21 formulados con ADN sin células circulantes femenino
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Uso de liposomas para reducir la agregación de los ácidos nucleicos de un control para uso in vitro para identificar una pluralidad de genotipos, comprendiendo el control liposomas y una primera mezcla de ácidos nucleicos, en donde la primera mezcla de ácidos nucleicos comprende una primera pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada secuencia de nucleótidos de la primera pluralidad codifica un genotipo de la pluralidad de genotipos, y la primera mezcla de ácidos nucleicos está incorporada en los liposomas.
2. Uso de liposomas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cada genotipo de la pluralidad de genotipos consiste en una mutación:
(a) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en ABL1, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ARHGAP5, ATM, ATR, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CBFB, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, DNMT3A, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB3, ERBB4 ("HER4"), ERCC1, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GABRA6, GABRG2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KMT2A, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MECOM, MET, MKL1, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, MYD88, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS/CSDE1, NTRK1, NUP214, PALB2, PARP I, PARP2, PDGFRA, PDGFRB, PICALM, P1K3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAD51, RAFT, RARA, RBI, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, RUNX1, RUNX1T1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TALI, TCF3, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL; o
(b) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RBI, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1, y GNAS; o
(c) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y STK11; o
(d) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RBI, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2, y VHL; o
(e) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2, y KRAS; o
(f) seleccionada entre el grupo que consiste en mutación V600E para el gen BRAF, mutación T790M para el gen EGFR, mutación delL747-P753insS para el gen EGFR, mutación A775_G776insYVMA para el gen ERBB2, y mutación G12D para el gen KRAS; o
(g) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2, KIT, KRAS, NRAS, y P1K3CA; o
(h) seleccionada entre el grupo que consiste en mutación V600E para el gen BRAF, mutación D770_N771insG para el gen EGFR, mutación E746_A750 de1ELREA para el gen EGFR, mutación T790M para el gen EGFR, mutación D816V para el gen KIT, mutación G12D para el gen KRAS, mutación Q61R para el gen NRAS, mutación H1047R para el gen PIK3CA, y mutación N1068fs*4 para el gen PIK3CA; o
(i) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en AKT1, AKT2, AKT3, APC, ARHGAP5, ATM, ATR, BRAF, CTNNB1, DNMT3A, EGFR, ERBB2, ERCC1, EZH2, FBXW7, FGFR3, FLT3, GABRA6, GABRG2, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, MSH2, MTOR, MYD88, NF1, NPM1, NRAS/CSDE1, PARP1, PARP2, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RAD51, RB1, RET, SMAD4, TP53, y VHL; o
(j) seleccionada entre el grupo que consiste en mutación 145G>A para el gen AKT1, mutación c.49G>A para el gen AKT1, mutación c.268G>T para el gen AKT2, mutación c.371A>T para el gen AKT3, mutación c.4248de1C para el gen APC, mutación c.4348C>T para el gen APC, mutación c.4666_4667insA para el gen APC, mutación c.1864G>A para el gen ARHGAP5, mutación c.1058_1059delGT para el gen ATM, mutación c.5557G>A para el gen ATM, mutación c.3790_3796delATAAAAG para el gen ATR, mutación c.1799T>A para el gen BRAF, mutación c.121A>G para el gen CYNNB1, mutación c.2644C>T para el gen DNMT3A, mutación c.2236_2250del15 para el gen EGFR, mutación c.2310_2311insGGT para el gen EGFR, mutación c.2369C>T para el gen EGFR, mutación c.2573T>G para el gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 para el gen ERBB2, mutación c.287C>A para el gen ERCC1, mutación c.1937A>T para el gen EZH2, mutación c.1394G>A para el gen FBXW7, mutación c.746C>G para el gen FGFR3, mutación c.2503G>T para el gen FLT3, mutación c.763G>C para el gen GABRA6, mutación c.1355A>G para el gen GABRG2, mutación c.626A>C para el gen GNAQ, mutación c.601C>T para el gen GNAS, mutación c.394C>T para el gen IDH1, mutación c.515G>A para el gen IDH2, mutación c.419G>A para el gen IDH2, mutación c.1849G>T para el gen JAK2, mutación c.2447A>T para el gen KIT, mutación c.1679T>A para el gen KIT, mutación c.35G>A para el gen KRAS, mutación c.3757T>G para el gen MET, mutación c.1151T>A para el gen MLH1, mutación c.1544G>T para el gen MPL, mutación c.2250delG para el gen MSH2, mutación c.2359_2360delCT para el gen MSH2, mutación c.2664A>T para el gen MTOR, mutación c.794T>C para el gen MYD88, mutación c.2987_2988insAC para el gen NF1, mutación c.4084C>T para el gen NF1, mutación c.7501delG para el gen NF1, mutación c.863_864insTCTG para el gen NPM1, mutación c.182A>G para el gen NRAS, mutación c.2738delG para el gen PARPI, mutación c.398A>C para el gen PARP2, mutación c.1694_1695insA para el gen PDGFrA, mutación c.2525A>T para el gen PDGFRA, mutación c.1633G>A para el gen PIK3CA, mutación c.3140A>G para el gen PIK3CA, mutación c.3204_3205insA para el gen PIK3CA, mutación c.388C>T para el gen PTEN, mutación e.741_742insA para el gen PTEN, mutación c.800delA para el gen PTEN, mutación c.226G>A para el gen PTPN11, mutación c.433C>T para el gen RAD51, mutación c.958C>T para el gen RBI, mutación c.2753T>C para el gen RET, mutación c.1394_1395insT para el gen SMAD4, mutación c.818G>A para el gen TP53, mutación c.743G>A para el gen TP53, mutación c.723delC para el gen TP53, mutación c.524G>A para el gen TP53, mutación c.263delC para el gen TP53, y mutación c.426_429delTGAC para el gen VHL; o
(k) para un gen seleccionado entre el grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, y TP53; o
(l) seleccionada entre el grupo que consiste en mutación c.1799T>A para el gen BRAF, mutación c.121A>G para el gen CTNNB1, mutación c.2236_2250de115 para el gen EGFR, mutación c.2369C>T para el gen eGf R, mutación c.2573T>G para el gen EGFR, mutación c.2324 2325ins12 para el gen ERBB2, mutación c.394C>T para el gen IDH1, mutación c.1679T>A para el gen KIT, mutación c.35G>A para el gen KRAS, mutación c.182A>G para el gen NRAS/CSDE1, mutación c.2525A>T para el gen PDGFRA, mutación c.1633G>A para el gen PIK3CA, mutación c.3140A>G para el gen PIK3CA, mutación c.800delA para el gen PTEN, mutación c.2753T>C para el gen RET, y mutación c.524G>A para el gen TP53.
3. Uso de liposomas de acuerdo con la reivindicación 2 (f) en donde la pluralidad de genotipos comprende mutación V600E para el gen BRAF, mutación T790M para el gen EGFR, mutación delL747-P753insS para el gen EGFR, mutación A775_G776insYVMA para el gen ERBB2, y mutación G12D para el gen KRAS.
4. Uso de liposomas de acuerdo con la reivindicación 2(h) en donde la pluralidad de genotipos comprende mutación V600E para el gen BRAF, mutación D770_N771insG para el gen EGFR, mutación E746 A750delELREA para el gen EGFR, mutación T790M para el gen EGFR, mutación D816V para el gen KIT, mutación G12D para el gen KRAS, mutación Q61R para el gen NRAS, mutación H1047R para el gen PIK3CA, y mutación N1068fs*4 para el gen PIK3CA.
5. Uso de liposomas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:
(a) los liposomas comprenden un lípido pegilado; o
(b) los liposomas comprenden un lípido basado en fosfoetanolamina modificada con PEG; o
(c) los liposomas comprenden un lípido basado en fosfoetanolamina modificada con PEG seleccionado entre el grupo que consiste en 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-diestearoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; y 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350].
6. Uso de liposomas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde:
(a) el diámetro mediano de los liposomas es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 1000 nm; o (b) el diámetro mediano de los liposomas es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 1000 nm y el diámetro medio de los liposomas es de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm; y/o
(c) los ácidos nucleicos del control son más estables que los ácidos nucleicos de un control que no comprende liposomas; y/o
(d) los ácidos nucleicos del control son más estables cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C que los ácidos nucleicos de un control que no comprende liposomas; y/o
(e) los ácidos nucleicos del control son más estables cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C que los ácidos nucleicos de un control que no comprende liposomas en donde los ácidos nucleicos del control son más estables cuando se almacenan durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años que los ácidos nucleicos de un control que no comprende liposomas y/o
(f) los ácidos nucleicos del control no forman agregados cuando se almacenan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C; y/o
(g) los ácidos nucleicos del control no forman agregados cuando se almacenan durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 años; y/o
(h) los ácidos nucleicos del control son estables cuando se almacenan durante un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 4 meses a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C; y/o (i) los ácidos nucleicos del control son estables cuando se almacenan durante un periodo de tiempo de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 5 meses a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C; y/o
(j) los ácidos nucleicos del control no forman agregados cuando se almacenan durante un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 4 meses a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C; y/o
(k) los ácidos nucleicos del control no forman agregados cuando se almacenan durante un periodo de tiempo de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 5 meses a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C.
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