CN117344009A

CN117344009A - 检测膀胱癌的试剂盒

Info

Publication number: CN117344009A
Application number: CN202210739954.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡迪; 董兰兰; 张良禄
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2024-01-05
Anticipated expiration: 2042-06-28
Also published as: CN117344009B

Abstract

本发明涉及一种检测膀胱癌的试剂盒。该试剂盒包括用于检测标志区的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考，标志区包括Chr10:101140208～101140464的的全长或部分区域；或者，标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域。该试剂盒用于诊断膀胱癌时灵敏度高，特异性好。

Description

检测膀胱癌的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学，特别是涉及一种检测膀胱癌的试剂盒。

背景技术

膀胱癌是全球第九位最常见的恶性肿瘤，也是男性和女性最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，而且男性的发病率比女性高出4倍以上。膀胱癌的5年生存率与诊断时的疾病分期相关，原位癌的5年生存率高达95.8％，而转移性膀胱癌的5年生存率低至4.6％。因此，准确和及时的诊断对于膀胱癌患者的预后至关重要。

目前，膀胱镜检查和尿液脱落细胞学检查是诊断膀胱癌的两种主要方式，但尿液脱落细胞学检查的灵敏度相对较低，膀胱镜检查和病理活检是膀胱癌诊断的金标准。与目前的其它方法相比，虽然膀胱镜诊断的灵敏度更高，然而，膀胱镜检查是一种侵入性操作，患者不得不承受痛苦，而且操作膀胱镜受尿道狭窄的影响，可能会造成尿道穿孔、出血或感染等。近日也出现了一些非侵入性的诊断方法，例如检测尿液中的蛋白质标记物核基质蛋白22(NMP-22)和膀胱肿瘤抗原(BTA)等来诊断膀胱癌，但其特异性不高。

发明内容

本发明经研究发现，通过检测Chr10:101140208～101140464的正链或负链的全长或部分区域的甲基化水平、或者检测Chr10:101140208～101140464的正链或负链的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的正链或负链的全长或部分区域的组合的甲基化水平来诊断膀胱癌的灵敏度高，特异性好，可以改善现有的膀胱癌检测方法特异性不高的缺陷。

基于此，本申请提供一种检测标志区的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用，以GRCh38.p14为参考，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的正链或负链的全长或部分区域；或者，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的正链或负链的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的正链或负链的全长或部分区域。

在其中一个实施例中，所述标志区包括Chr10:101140241～101140431的全长或部分区域；或，所述标志区为Chr10:101140241～101140431的全长或部分区域和Chr12：52007046～52007471的全长或部分区域。

在其中一个实施例中，所述标志区包括下述区域之一：区域1：Chr10:101140208～101140464的正链；区域2：Chr10:101140431～101140214；区域7：Chr10:101140255～101140395的正链；区域8：Chr10:101140325～101140440的正链；区域9：Chr10:101140237～101140445的正链；区域10：Chr10:101140401～101140241；区域11：Chr10:101140385～101140254；区域12：Chr10:101140374～101140226；

或者，所述标志区为第一区与第二区的组合，其中：所述第一区为下述区域之一：区域1：Chr10:101140208～101140464的正链；区域2：Chr10:101140431～101140214；区域7：Chr10:101140255～101140395的正链；区域8：Chr10:101140325～101140440的正链；区域9：Chr10:101140237～101140445的正链；区域10：Chr10:101140401～101140241；区域11：Chr10:101140385～101140254；区域12：Chr10:101140374～101140226；所述第二区为下述区域之一：区域3：Chr12:52006931～52007205的正链；区域4：Chr12:52007242～52007466的正链；区域5：Chr12:52007494～52007312；区域6：Chr12:52007301～52006941；区域13：Chr12:52007046～52007189的正链；区域14：Chr12:52007315～52007462的正链；区域15：Chr12:52007471～52007372；区域16：Chr12:52007170～52007087。

一种检测膀胱癌的试剂盒，包括用于检测标志区的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域；或者，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域。

在其中一个实施例中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述标志区的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。

在其中一个实施例中，所述试剂包括检测引物对，所述检测引物对包括如下引物对中的至少一组：用于检测Chr10:101140208～101140464的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对；用于检测Chr10:101140431～101140214的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对；用于检测Chr10:101140255～101140395的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对；用于检测Chr10:101140325～101140440的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域8引物对；用于检测Chr10:101140237～101140445的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域9引物对；用于检测Chr10:101140401～101140241的全长或部分区域的甲基化水平的区域10引物对；用于检测Chr10:101140385～101140254的全长或部分区域的甲基化水平的区域11引物对；用于检测Chr10:101140374～101140226的全长或部分区域的甲基化水平的区域12引物对。

在其中一个实施例中，所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19～22所示；及/或，所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～26所示；及/或，所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:63～64所示；及/或，所述区域8引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:66～67所示；及/或，所述区域9引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:69～70所示；及/或，所述区域10引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:72～73所示；及/或，所述区域11引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:75～76所示；及/或，所述区域12引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:78～79所示；。

在其中一个实施例中，所述检测引物对还包括如下引物对中的至少一组：用于检测Chr12:52006931～52007205的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对；用于检测Chr12:52007242～52007466的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对；用于检测Chr12:52007494～52007312的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对；用于检测Chr12:52007301～52006941的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对；用于检测Chr12:52007046～52007189的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域13引物对；用于检测Chr12:52007315～52007462的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域14引物对；用于检测Chr12:52007471～52007372的全长或部分区域的甲基化水平的区域15引物对；用于检测Chr12:52007170～52007087的全长或部分区域的甲基化水平的区域16引物对。

在其中一个实施例中，所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27～30所示；及/或，所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31～34所示；及/或，所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:35～38所示；及/或，所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:39～42所示；及/或，所述区域13引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:81～82所示；及/或，所述区域14引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:84～85所示；及/或，所述区域15引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:87～88所示；及/或，所述区域16引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:90～91所示。

在其中一个实施例中，所述试剂还包括与所述检测引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有荧光基团，其中：与所述区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示；及/或，与所述区域8引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:68所示；及/或，与所述区域9引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示；及/或，与所述区域10引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示；及/或，与所述区域11引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示；及/或，与所述区域12引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:80所示；及/或，与所述区域13引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示；及/或，与所述区域14引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:86所示；及/或，与所述区域15引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示；及/或，与所述区域16引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:92所示。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而不是旨在于限制本发明。

术语解释

术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语“膀胱癌”指发生于膀胱粘膜上的癌症，根据其组织类型可分为尿路上皮(移行)细胞癌、鳞状细胞癌、腺细胞癌以及一些少见的小细胞癌、混合型、癌肉瘤或者转移癌等，其中尿路上皮细胞癌占膀胱癌的90％以上。

术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。

术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。例如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。

术语“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

术语“Taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’～3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

术语“桑格尔测序”即一代测序，其反应系统包含：目标片段、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶，引物等，还需要加入不同荧光基团标记的4种双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，通过光激发将四种光波长信号转化为电脑可识别的电信号，根据反应管中最后掺入的ddNTP的荧光信号判断目的DNA序列。

本发明经研究发现，通过检测Chr10:101140208～101140464的正链和/或负链的全长或部分区域的甲基化水平，诊断膀胱癌的灵敏度高，特异性好，可以改善传统的膀胱癌的特异性不高的缺陷。进一步地，通过检测Chr10:101140208～101140464的正链和/或负链的全长或部分区域和于Chr12:52006931～52007494的正链和/或负链的全长或部分区域的甲基化水平来诊断膀胱癌的灵敏度更高，同时特异性也较好。

基于上述，本申请一实施方式提供了一种检测标志区的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用。

在一些实施例中，以GRCh38.p14为参考，标志区包括Chr10:101140208～101140464的正链或负链的全长或部分区域。可选地，标志区为Chr10:101140208～101140464的正链或负链的全长或部分区域。进一步地，标志区包括Chr10:101140241～101140431的正链或负链的全长或部分区域。可选地，标志区包括下述区域之一：区域1：Chr10:101140208～101140464；区域2：Chr10:101140431～101140214；区域7：Chr10:101140255～101140395；区域8：Chr10:101140325～101140440；区域9：Chr10:101140237～101140445；区域10：Chr10:101140401～101140241；区域11：Chr10:101140385～101140254；区域12：Chr10:101140374～101140226。

需要说明的是，本文中，“可选地”表示举例。另外，如未特殊说明，染色体上的位置均是以GRCh38.p14为参考；此外，染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构，对于用染色体位置表示的区域，如果未指明是DNA的正链还是负链，则表示既可以是该区域的DNA的正链，也可以是该区域的DNA的负链，还可以是该区域的DNA的正负两条链。例如，若区域Chr10:101140208～101140464被描述为“Chr10:101140208～101140464”，则表示可以是Chr10:101140208～101140464区域内的DNA的正链，也可以是Chr10:101140208～101140464区域内的DNA的负链，还可以是Chr10:101140208～101140464区域内的DNA的正、负两条链。若区域Chr10:101140208～101140464被描述为“Chr10:101140464～101140208的正链”，则表示Chr10:101140208～101140464区域内的DNA的正链。若区域Chr10:101140208～101140464被描述为“Chr10:101140208～101140464的负链”，则表示Chr10:101140208～101140464区域内的DNA的负链。另外，区域被描述为“Chr10:101140464～101140208”时，也表示Chr10:101140208～101140464区域内的DNA的负链。

在一些实施例中，标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域、和Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域的组合。采用Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域与Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域的组合，可以提高检测灵敏度。进一步地，标志区包括Chr10:101140241～101140431的全长或部分区域、和Chr12：52007046～52007471的全长或部分区域的组合。可选地，标志区为Chr10:101140241～101140431的全长或部分区域、和Chr12：52007046～52007471的全长或部分区域的组合。

可选地，标志区为第一区与第二区的组合，其中：第一区为下述区域之一：区域1：Chr10:101140208～101140464的正链；区域2：Chr10:101140431～101140214；区域7：Chr10:101140255～101140395的正链；区域8：Chr10:101140325～101140440的正链；区域9：Chr10:101140237～101140445的正链；区域10：Chr10:101140401～101140241；区域11：Chr10:101140385～101140254；区域12：Chr10:101140374～101140226；第二区为下述区域之一：区域3：Chr12:52006931～52007205的正链；区域4：Chr12:52007242～52007466的正链；区域5：Chr12:52007494～52007312；区域6：Chr12:52007301～52006941；区域13：Chr12:52007046～52007189的正链；区域14：Chr12:52007315～52007462的正链；区域15：Chr12:52007471～52007372；区域16：Chr12:52007170～52007087。

基于上述，本申请一实施方式还提供了一种检测膀胱癌的试剂盒，该试剂盒包括用于检测标志区的甲基化水平的试剂。具体地，标志区如上文所述，此处不再赘述。

可选地，上述检测膀胱癌的试剂盒通过如下方法中的一种或多种实现对标志区的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。相应地，所述试剂盒中包括上述检测甲基化水平的方法所必需的试剂。可以理解的是，在其他实施例中，上述检测膀胱癌的试剂盒检测标志区的甲基化水平的方法不限于上述。

在一些实施例中，上述试剂盒通过桑格尔测序法检测标志区的甲基化水平以诊断或辅助诊断膀胱癌。具体地，标志区为Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域；用于检测标志区的甲基化水平的试剂包括检测引物对，该检测引物对包括如下引物对中的至少一组：

用于检测Chr10:101140208～101140464的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对；用于检测Chr10:101140431～101140214的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对；用于检测Chr10:101140255～101140395的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对；用于检测Chr10:101140325～101140440的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域8引物对；用于检测Chr10:101140237～101140445的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域9引物对；用于检测Chr10:101140401～101140241的全长或部分区域的甲基化水平的区域10引物对；用于检测Chr10:101140385～101140254的全长或部分区域的甲基化水平的区域11引物对；用于检测Chr10:101140374～101140226的全长或部分区域的甲基化水平的区域12引物对。可选地，区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19～22所示；区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～26所示。当然，区域1引物对和区域2引物对不限于上述，还可以是其他的根据检测的目标区域设计的引物对。

进一步地，上述试剂盒通过桑格尔测序法检测标志区的甲基化水平，标志区为Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域的组合。此时，用于检测标志区的甲基化水平的试剂还包括如下引物对中的至少一组：

用于检测Chr12:52006931～52007205的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对；用于检测Chr12:52007242～52007466的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对；用于检测Chr12:52007494～52007312的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对；用于检测Chr12:52007301～52006941的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对；用于检测Chr12:52007046～52007189的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域13引物对；用于检测Chr12:52007315～52007462的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域14引物对；用于检测Chr12:52007471～52007372的全长或部分区域的甲基化水平的区域15引物对；用于检测Chr12:52007170～52007087的全长或部分区域的甲基化水平的区域16引物对。可选地，区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27～30所示；区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31～34所示；区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:35～38所示；区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:39～42所示。当然，区域3引物对～区域6引物对不限于上述，还可以是其他的根据检测的目标区域设计的引物对。

在另一些实施例中，上述试剂盒通过甲基化荧光定量PCR法检测标志区的甲基化水平以诊断或辅助诊断膀胱癌。具体地，标志区为Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域；用于检测标志区的甲基化水平的试剂包括检测引物对，该检测引物对包括如下引物对中的至少一组：

用于检测Chr10:101140208～101140464的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对；用于检测Chr10:101140431～101140214的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对；用于检测Chr10:101140255～101140395的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对；用于检测Chr10:101140325～101140440的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域8引物对；用于检测Chr10:101140237～101140445的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域9引物对；用于检测Chr10:101140401～101140241的全长或部分区域的甲基化水平的区域10引物对；用于检测Chr10:101140385～101140254的全长或部分区域的甲基化水平的区域11引物对；用于检测Chr10:101140374～101140226的全长或部分区域的甲基化水平的区域12引物对。可选地，区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:63～64所示；区域8引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:66～67所示；区域9引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:69～70；区域10引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:72～73所示；区域11引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:75～76所示；区域12引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:78～79所示。当然，区域7引物对～区域12引物对不限于上述，还可以是其他的根据检测的目标区域设计的引物对。

进一步地，上述试剂盒通过甲基化荧光定量PCR法进行检测，标志区为Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的正链或负链的全长或部分区域的组合。此时，用于检测标志区的甲基化水平的试剂还包括如下引物对中的至少一组：用于检测Chr12:52006931～52007205的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对；用于检测Chr12:52007242～52007466的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对；用于检测Chr12:52007494～52007312的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对；用于检测Chr12:52007301～52006941的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对；用于检测Chr12:52007046～52007189的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域13引物对；用于检测Chr12:52007315～52007462的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域14引物对；用于检测Chr12:52007471～52007372的全长或部分区域的甲基化水平的区域15引物对；用于检测Chr12:52007170～52007087的全长或部分区域的甲基化水平的区域16引物对。可选地，区域13引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:81～82所示；区域14引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:84～85所示；区域15引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:87～88所示；区域16引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:90～91所示。当然，区域13引物对～区域16引物对不限于上述，还可以是其他的根据检测的目标区域设计的引物对。

进一步地，在上述试剂盒通过甲基化荧光定量PCR法检测时，用于检测标志区的甲基化水平的试剂还包括与检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团。更进一步地，与区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示；与区域8引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示；与区域9引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示；与区域10引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:74所示；与区域11引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示；与区域12引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:80所示；与区域13引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示；与区域14引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:86所示；与区域15引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示；与区域16引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:92所示。

在一些实施例中，采用甲基化荧光定量PCR法检测的上述试剂盒还包括内参引物对和与内参引物对对应的内参探针。可选地，内参引物对包括针对ACTB基因设计的ACTB引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:93～94所示，与ACTB引物对对应的内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参引物对和内参探针对应设计即可。

可选地，检测探针和内参探针为Taqman探针。进一步地，检测探针和内参探针上均连接有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。可选地，检测探针和内参探针上连接有荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然，在同一个反应体系中有两种以上的探针时，不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针和内参探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。

在一些实施例中，上述的任一实施例的试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸；甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；质控试剂用于质控；PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系；核酸测序试剂用于测序。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。如未特殊说明，以下实施例中的区域1～16对应的引物均是针对该区域的全长设计。

实施例1

1.收集样本

1)收集64例经病理检测确诊为膀胱癌患者的癌组织样本和对应的64例癌旁组织样本，所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。

2)收集120例经病理检测确诊的膀胱癌患者及98例常规体检的健康人的尿液样本。此外，还收集了常见的泌尿系统良性疾病(包括腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本60例，泌尿系统其他恶性肿瘤(肾癌、前列腺癌等)患者的尿液样本36例，收集到的每份尿液样本的体积大于50mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。

2.提取样本DNA

使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。

3.样本DNA转化和纯化

组织样本和尿液样本中DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤见试剂盒说明书。

4.PCR扩增及测序

1)对于区域1(SEQ ID NO:1)和区域2(SEQ ID NO:4)，分别以亚硫酸氢盐转化后的完全甲基化的序列和亚硫酸氢盐转化后完全未甲基化的序列为模板(如表1所示)，设计甲基化的引物对和非甲基化的引物对以扩增相应的区域的全长，并筛选最佳的甲基化引物对和非甲基化引物对的配比，以保证在一个PCR反应体系中加入甲基化引物对和非甲基化引物对时，当模板中存在大于等于1％的甲基化序列时，即可扩增得到甲基化的产物，仅当模板为非甲基化序列时，扩增产物为非甲基化产物。

2)分别以转化后的膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本的DNA为模板，以表2中SEQ ID NO:19～22、SEQ ID NO:23～26为引物对，同时扩增甲基化和未甲基化的DNA片段。

3)分别以转化后的膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者尿液样本中的DNA为模板，以表2中SEQ ID NO:19～22或SEQ ID NO:23～26为引物对，同时扩增甲基化和未甲基化的DNA片段。

4)按照表3中的配方配制PCR反应体系，体系中用到的DNA聚合酶为Prime STAR HSDNA Polymerase(Takara,Cat:R010A)，PCR扩增程序见表4。在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)同时从5’端和3’端测序。

表1区域1～区域6的DNA序列及染色体位置

表2甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列

表3PCR反应体系

表4PCR反应程序

5.结果分析

根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非甲基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域是甲基化阳性的。计算各类样本在每个区域中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目。若某个样本在某一区域为甲基化阳性，则认为该样本为癌症阳性样本；若某个样本在某一区域为甲基化阴性，则认为该样本为癌症阴性样本。

区域1和区域2在膀胱癌患者的癌组织、癌旁组织样本中的甲基化状态、检测灵敏度和特异性如表5所示；其在膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者的尿液样本中的甲基化状态、检测灵敏度和特异性如表6所示。灵敏度为病理结果为阳性的样本中按照本实施例的方法所获得的检测结果为甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中按照本实施例的方法所获得的检测结果为甲基化阴性的比例。

表5区域1和区域2检测组织样本的灵敏度和特异性

表6区域1和区域2检测尿液样本的灵敏度和特异性

由表5和表6可以看出，基于桑格尔测序的方法，利用Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域(区域1和区域2)的甲基化水平检测膀胱癌患者的性能良好：在组织样本中，其检测膀胱癌癌组织样本的灵敏度大于84％，其检测癌旁组织样本的特异性高于92％；在尿液样本中，该区域的诊断性能同样十分优异，其检测膀胱癌尿液样本的灵敏度高于81％，其检测健康人尿液样本的特异性高于93％；此外，其检测良性泌尿系统疾病和其他泌尿系统恶性肿瘤尿液样本的特异性分别高于93％和94％。

实施例2

为了提升试剂盒在临床应用中的价值，本实施例提供了基于甲基化荧光定量PCR法检测Chr10:101140208～101140464正链或负链的部分区域的甲基化水平的试剂盒和方法，该方法根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本。具体步骤包括：

1.样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化步骤同实施例1。

2.甲基化荧光定量PCR反应

为了提升扩增效率，甲基化荧光定量PCR法检测的区域稍短于桑格尔测序所检测的区域，即选取区域1中的区域7、区域8和区域9进行扩增，选取区域2中的区域10、区域11和区域12进行扩增。分别以完全甲基化的转化后的区域7～区域12的DNA序列为模板(SEQ IDNO:53～58)，设计检测引物对和探针，进行甲基化荧光定量PCR反应。区域7～区域12的核苷酸序列如表7所示，其检测引物对及探针可检测的胞嘧啶的甲基化位点如表7所示。

表7核苷酸序列及检测引物对和探针识别的胞嘧啶核苷酸位点

1)分别以转化后的膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本的DNA为模板，再分别以表8中SEQ ID NO:63～64、66～67、69～70、72～73、75～76、78～79为引物对，以对应的SEQ ID NO:65、68、71、74、77、80为检测探针，扩增各自对应的目的区域。

2)分别以转化后的膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者尿液样本的DNA为模板，再分别以表8中SEQ ID NO:63～64、66～67、69～70、72～73、75～76、78～79为引物对，以对应的SEQ ID NO:65、68、71、74、77、80为检测探针，扩增各自对应的目的区域。

3)依次扩增每个样本中的区域7～区域12，在进行PCR反应时，每个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外，只加入单个区域的检测引物对和检测探针，同时加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。检测探针均为TaqMan探针，目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。区域7～区域12及ACTB基因的上下游检测引物及检测探针序列如表8所示。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应体系如表9所示，按照表10的扩增程序进行PCR扩增。

在对目的基因的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照同步进行检测。阴性对照为TE缓冲液。阳性对照的制备方法为：将ACTB基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的区域7～区域12对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(SEQ ID NO:53～58)进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。例如区域7的阳性对照为10³拷贝/微升的ACTB基因人工合成质粒和10³拷贝/微升的含SEQ ID NO:53的人工合成质粒按体积比1:1混合而成。

表8检测引物对及探针的核苷酸序列

表9荧光定量PCR反应体系

组分	规格	体积(μL)
			Platinum II PCR缓冲液	5×	5
dNTPs	各2.5mM	3
			目标区域上游引物	10μM	0.5
目标区域下游引物	10μM	0.5
			目标区域检测探针	10μM	0.5
ACTB基因上游引物	10μM	0.5
			ACTB基因下游引物	10μM	0.5
ACTB基因检测探针	10μM	0.5
			DNA聚合酶	/	0.5
待测样本DNA	/	5
			纯化水	/	补至25

表10荧光定量PCR反应程序

3.PCR结果分析

1)Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

2)质量控制：当阴性对照无扩增，阳性对照有明显的指数增长期，且阳性对照中目的基因和内参基因的Ct值均在25～30之间，待检样本的内参基因的Ct值≤35时，表明当次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

3)结果分析：

当某一检测区域在组织样本上的Ct值≤38时，即认为该样本在此区域被检出甲基化，则诊断为癌症阳性；若某一检测区域在组织样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即诊断为癌症阴性。区域7～区域12在64例膀胱癌癌组织和64例癌旁组织样本中的甲基化状态、及其检测的灵敏度和特异性如表11所示，灵敏度和特异性的计算方法与实施例1相同。

当某一检测区域在尿液样本上的Ct值≤45时，即认为该样本在此区域被检出甲基化，则诊断为癌症阳性；若某一检测区域在尿液样本上的Ct值>45或未检出，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即诊断为癌症阴性。区域7～区域12在120例膀胱癌患者、98例健康人、60例泌尿系统良性疾病患者和36例其他泌尿系统恶性肿瘤患者的尿液样本中的甲基化状态、检测灵敏度和特异性如表12所示，灵敏度和特异性的计算方法与实施例1相同。

表11Chr10:101140208～101140464内各区域检测组织样本的灵敏度和特异性

表12Chr10:101140208～101140464内各区域检测尿液样本的灵敏度和特异性

由表11和表12可以看出，基于甲基化荧光定量PCR法的检测方法，利用Chr10:101140208～101140464正链或负链的部分区域的甲基化水平检测膀胱癌患者的性能良好：整体看来，在组织样本中，这些区域检测膀胱癌癌组织样本的灵敏度都大于81％，其检测癌旁组织样本的特异性都高于90％；在尿液样本中，这些区域的诊断性能仍然表现较佳，其检测膀胱癌尿液样本的灵敏度都高于80％，其检测健康人尿液样本的特异性都高于92％，此外，其检测良性泌尿系统疾病和其他泌尿系统恶性肿瘤尿液样本的特异性分别高于91％和86％。具体来看，对不同的区域进行检测其灵敏度和特异性会有微小的差异，如区域7和区域10检测效果较佳，这两个区域检测膀胱癌组织样本的灵敏度均为85.94％，其检测癌旁组织样本的特异性分别为96.88％和95.31％；此外，区域7和区域10检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度分别为85％和83.33％，其检测健康人尿液样本的特异性分别为98.98％和96.94％，这两个区域对良性泌尿系统疾病和其他泌尿系统恶性肿瘤尿液样本的检测特异性也高于其它区域。因此，通过检测Chr10:101140208～101140464正链或负链的部分区域的甲基化水平也可以有效区分膀胱癌患者、其他泌尿系统良、恶性疾病患者和健康人；这说明检测较短的区域同样可以达到良好的诊断效果。

实施例3

本实施例提供了一种检测试剂盒，即同时检测Chr10:101140208～101140464的任意一个区域和Chr12:52006931～52007494任意一个区域的甲基化水平来诊断膀胱癌。具体地，通过桑格尔测序的方法检测选自Chr10:101140208～101140464的任意一个区域和选自Chr12:52006931～52007494任意一个区域的组合(具体组合方式见表13)的甲基化水平来诊断膀胱癌。

表13组合方式

具体步骤包括：

1.样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化步骤同实施例1。

2.PCR扩增及测序

对于区域3(SEQ ID NO:7)、区域4(SEQ ID NO:10)、区域5(SEQ ID NO:13)和区域6(SEQ ID NO:16)，分别以亚硫酸氢盐转化后的完全甲基化的序列和亚硫酸氢盐转化后完全未甲基化的序列为模板(表1)，设计甲基化的引物对和非甲基化的引物对(表2)。

1)分别以得到的膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本的DNA为模板，以表2中SEQ ID NO:27～30、SEQ ID NO:31～34、SEQ ID NO:35～38和SEQ ID NO:39～42为引物对，同时扩增甲基化和未甲基化的DNA片段。

2)分别以得到的膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者尿液样本中的DNA为模板，以表2中SEQ ID NO:27～30、SEQ ID NO:31～34、SEQ IDNO:35～38和SEQ ID NO:39～42为引物对，同时扩增甲基化和未甲基化的DNA片段。

3)PCR扩增时使用的甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列如表2所示，按照表3中的配方配制PCR反应体系，PCR扩增程序见表4。在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。

3.结果分析

若某个样本在Chr10:101140208～101140464的任意一个区域或/和Chr12:52006931～52007494的任意一个区域为甲基化阳性，则认为该样本为癌症阳性样本；当某个样本在Chr10:101140208～101140464的任意一个区域且在Chr12:52006931～52007494的任意一个区域为甲基化阴性，则认为该样本为癌症阴性样本。利用桑格尔测序的方法，根据表13提供的组合方式通过检测组合的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表14所示；其诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者的尿液样本的灵敏度和特异性如表15所示。

表14组合检测组织样本的灵敏度和特异性

表15组合检测尿液样本的灵敏度和特异性

从表14和表15可以看出，通过桑格尔测序的方法，检测选自Chr10:101140208～101140464的任意一个区域与选自Chr12:52006931～52007494的任意一个区域的组合的甲基化水平进而诊断膀胱癌患者的效果很好：对于组织样本，检测灵敏度高于90％，特异性高于85％；在尿液样本中，灵敏度高于90％，其检测健康人尿液样本的特异性高于91％，其检测良性泌尿系统疾病患者的尿液样本的特异性高于88％，其检测其他泌尿系统恶性肿瘤尿液样本的特异性高于86％。另外，在以上列举的8中组合方式中，通过检测组合A即区域1和区域3的组合的甲基化水平区分组织样本和尿液样本中的癌症样本和正常样本的性能最佳。通过检测组合A的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本和癌旁组织样本的灵敏度和特异性分别为95.31％和92.19％，其诊断膀胱癌患者的尿液样本的灵敏度为94.17％，其诊断健康人、泌尿系统良性疾病患者和其他泌尿系统恶性肿瘤患者的尿液样本的特异性分别为95.92％、93.33％和91.67％。

实施例4

本实施例提供了基于甲基化荧光定量PCR检测选自Chr10:101140208～101140464的任意一个区域和选自Chr12:52006931～52007494的任意一个区域的组合(组合方式见表16)的甲基化水平而诊断膀胱癌患者的试剂盒和方法，根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本。

1.样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化步骤同实施例1。

2.甲基化荧光定量PCR反应

为了提升扩增效率，甲基化荧光定量PCR检测的区域短于桑格尔测序所检测的区域，在Chr10:101140208～101140464中，共设计6对甲基化检测引物对和探针分别用来检测区域7～区域12(同实施例2)，在Chr12:52006931～52007494中，分别设计4对甲基化检测引物对和探针用来检测区域13～区域14。区域7～区域14的核苷酸序列如表7所示，各区域的检测引物对及探针的核苷酸序列如表8所示，各区域的检测引物对及探针可检测的胞嘧啶的甲基化位点如表7所示。

表16基于甲基化荧光定量PCR检测的组合方式

1)分别以转化后的膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本的DNA为模板，按照表16提供的组合方式，利用表8中的检测引物对和探针进行甲基化荧光定量PCR检测。分别以转化后的膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者尿液样本的DNA为模板，按照表16提供的组合方式，利用表8中的检测引物对和探针进行甲基化荧光定量PCR检测。

2)对于每个样本，每种组合方式单独进行检测，即一个PCR管中除加入必须的反应成分、模板以外，需加入组合方式对应的检测引物对和探针的组合，当然同时还需加入内参基因ACTB的检测引物对和探针。检测目标区域的探针为Taqman探针，区域7～区域12的检测探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB；区域13～区域16的检测探针5’端的报告基团为ROX，3’端猝灭基团为MGB；ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应液体系如表17所示，按照表10展示的扩增程序进行PCR扩增。

表17荧光定量PCR反应体系

4)阴性对照和阳性对照：在按照不同的组合方式检测样本时，阴性对照和阳性对照也应同时进行检测，阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将区域7～区域16各自对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(SEQ ID NO:53～62)进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。阳性对照DNA模板为10³拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、10³拷贝/微升的含SEQ ID NO:53～58中一种序列的人工合成质粒和10³拷贝/微升的含SEQ ID NO:59～62中一种序列的人工合成质粒。

5)Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

6)质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

3.PCR结果分析

根据Chr10:101140208～101140464、Chr12:52006931～52007494内各区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本，若扩增某一区域的Ct值≤38，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一区域的Ct值＞38，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。对于血液样本，若扩增某一区域的Ct值≤45，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一区域的Ct值＞45，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。若待测样本在Chr10:101140208～101140464的任意一个区域或/和Chr12:52006931～52007494的任意一个区域为甲基化阳性，则认为该样本为癌症阳性样本；仅当待测样本在Chr10:101140208～101140464的任意一个区域且在Chr12:52006931～52007494的任意一个区域为甲基化阴性，则认为该样本为癌症阴性样本，具体的判断标准如表18所示。

表18荧光定量法中样本的判断标准

利用甲基化荧光定量PCR检测的方法，根据表16提供的组合方式通过检测组合的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性的结果如表19所示；其诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者的尿液样本的灵敏度和特异性的结果如表20所示。

表19荧光定量法中组合检测组织样本的灵敏度和特异性

表20荧光定量法中组合检测尿液样本的灵敏度和特异性

从表19和表20可以看出，通过甲基化荧光定量PCR的方法，检测选自Chr10:101140208～101140464的任意一个区域和选自Chr12:52006931～52007494的任意一个区域的组合的甲基化水平进而诊断膀胱癌患者的效果很好：对于组织样本，任意一种组合的检测灵敏性高于92％，特异性高于87％；在尿液样本中，任意一种组合的灵敏度大于或等于90％，其检测健康人尿液样本的特异性高于90％，其检测良性泌尿系统疾病患者的尿液样本的特异性大于或等于90％，其检测其他泌尿系统恶性肿瘤尿液样本的特异性高于86％。另外，在以上列举的16种组合方式中，通过检测组合I即区域7和区域13的组合的甲基化水平区分组织样本和尿液样本中的癌症样本和正常样本的性能最佳。通过检测组合I的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本和癌旁组织样本的灵敏度和特异性分别为96.88％和92.19％，其诊断膀胱癌患者的尿液样本的灵敏度为95.83％，其诊断健康人、泌尿系统良性疾病患者和其他泌尿系统恶性肿瘤患者的尿液样本的特异性分别为95.92％、95％和94.44％。

综上，无论是利用桑格尔测序的方法，还是通过甲基化荧光定量PCR法，无论是组织样本，还是尿液样本来检测Chr10:101140208～101140464正链或负链的全长或部分区域的甲基化水平，都可以有效区分膀胱癌患者和健康人，其检测尿液样本的灵敏度可以达到85％，其检测健康人尿液样本的特异性可以达到98.98％。进一步地，可以利用桑格尔测序或者甲基化荧光定量PCR的方法来检测选自Chr10:101140208～101140464正链或负链的全长或部分区域和选自Chr12:52006931～52007494正链或负链的全长或部分区域的组合的甲基化水平来诊断膀胱癌。通过检测组合的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度高达95.83％，其检测健康人尿液样本的特异性高达95.92％以上，并且还能区分膀胱癌与其他泌尿系统恶性肿瘤，区分膀胱癌与泌尿系统良性疾病，特异性在94％以上。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 检测膀胱癌的试剂盒

<160> 95

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttgagcttc ccggataccg ctcgcctgct cccggagctg ttcggccgcc ggctgcccgg 60

gtcgtgcact ttcagtaggg ccccgctgac tctcctgccc ttgggctagg cctcccgggg 120

atgccagact cctggggacg ctgggacccg cggcgcggcg ggacacgcag gactcccgcc 180

tctccgcccg gaattcgttg agacggaatc tcagcggatc ccgcgtccgc cgagcgccgc 240

ggccagggag aaaggcc 257

<210> 2

<211> 257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttgagtttt tcggatatcg ttcgtttgtt ttcggagttg ttcggtcgtc ggttgttcgg 60

gtcgtgtatt tttagtaggg tttcgttgat ttttttgttt ttgggttagg tttttcgggg 120

atgttagatt tttggggacg ttgggattcg cggcgcggcg ggatacgtag gattttcgtt 180

ttttcgttcg gaattcgttg agacggaatt ttagcggatt tcgcgttcgt cgagcgtcgc 240

ggttagggag aaaggtc 257

<210> 3

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgagtttt ttggatattg tttgtttgtt tttggagttg tttggttgtt ggttgtttgg 60

gttgtgtatt tttagtaggg ttttgttgat ttttttgttt ttgggttagg ttttttgggg 120

atgttagatt tttggggatg ttgggatttg tggtgtggtg ggatatgtag gatttttgtt 180

tttttgtttg gaatttgttg agatggaatt ttagtggatt ttgtgtttgt tgagtgttgt 240

ggttagggag aaaggttggt 260

<210> 4

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgggatccg ctgagattcc gtctcaacga attccgggcg gagaggcggg agtcctgcgt 60

gtcccgccgc gccgcgggtc ccagcgtccc caggagtctg gcatccccgg gaggcctagc 120

ccaagggcag gagagtcagc ggggccctac tgaaagtgca cgacccgggc agccggcggc 180

cgaacagctc cgggagcagg cgagcggtat ccgggaag 218

<210> 5

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgggattcg ttgagatttc gttttaacga atttcgggcg gagaggcggg agttttgcgt 60

gtttcgtcgc gtcgcgggtt ttagcgtttt taggagtttg gtattttcgg gaggtttagt 120

ttaagggtag gagagttagc ggggttttat tgaaagtgta cgattcgggt agtcggcggt 180

cgaatagttt cgggagtagg cgagcggtat tcgggaag 218

<210> 6

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgtgggat ttgttgagat tttgttttaa tgaattttgg gtggagaggt gggagttttg 60

tgtgttttgt tgtgttgtgg gttttagtgt ttttaggagt ttggtatttt tgggaggttt 120

agtttaaggg taggagagtt agtggggttt tattgaaagt gtatgatttg ggtagttggt 180

ggttgaatag ttttgggagt aggtgagtgg tatttgggaa gttt 224

<210> 7

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggcccgcc cggctggcat cccccagccg ccgccagccc cgccgagggg agccagcgcc 60

gtctctgagg ggcgtccggc gccggagcca tgaccctccg ccgactcagg aagctgcagc 120

agaaggagga ggcggcggcc accccggacc ccgccgcccg gactcccgac tcggaagtcg 180

cgcccgccgc tccggtcccg accccgggac cccctgccgc agccgccacc cctgggcccc 240

cagcggacga gctgtacgcg gcgctggagg actat 275

<210> 8

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggttcgtt cggttggtat tttttagtcg tcgttagttt cgtcgagggg agttagcgtc 60

gtttttgagg ggcgttcggc gtcggagtta tgatttttcg tcgatttagg aagttgtagt 120

agaaggagga ggcggcggtt atttcggatt tcgtcgttcg gattttcgat tcggaagtcg 180

cgttcgtcgt ttcggtttcg atttcgggat tttttgtcgt agtcgttatt tttgggtttt 240

tagcggacga gttgtacgcg gcgttggagg attat 275

<210> 9

<211> 284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatttgtggt ttgtttggtt ggtatttttt agttgttgtt agttttgttg aggggagtta 60

gtgttgtttt tgaggggtgt ttggtgttgg agttatgatt ttttgttgat ttaggaagtt 120

gtagtagaag gaggaggtgg tggttatttt ggattttgtt gtttggattt ttgatttgga 180

agttgtgttt gttgttttgg ttttgatttt gggatttttt gttgtagttg ttatttttgg 240

gtttttagtg gatgagttgt atgtggtgtt ggaggattat tatt 284

<210> 10

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggggcaccc tgccccgccg aaaggtgcgt cccccgcccg ccttcaggat ctgctcagcc 60

cctctccgac tccctacagg gcctgctgac tccgcagtgc cctctcctcg gcgtccgcgg 120

agtcccccac cttcttcccc ggcccgctgg gtgcctcgac tccccgcgtt ccccgctgct 180

gcgaaggccg tggccctcgc ctgcacaccg cgcccaggct cggtg 225

<210> 11

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggggtattt tgtttcgtcg aaaggtgcgt ttttcgttcg tttttaggat ttgtttagtt 60

ttttttcgat tttttatagg gtttgttgat ttcgtagtgt ttttttttcg gcgttcgcgg 120

agttttttat tttttttttc ggttcgttgg gtgtttcgat ttttcgcgtt tttcgttgtt 180

gcgaaggtcg tggttttcgt ttgtatatcg cgtttaggtt cggtg 225

<210> 12

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgggggtat tttgttttgt tgaaaggtgt gttttttgtt tgtttttagg atttgtttag 60

tttttttttg attttttata gggtttgttg attttgtagt gttttttttt tggtgtttgt 120

ggagtttttt attttttttt ttggtttgtt gggtgttttg attttttgtg ttttttgttg 180

ttgtgaaggt tgtggttttt gtttgtatat tgtgtttagg tttggtggtt t 231

<210> 13

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcgtgcatg gggcgcggag ttaagagcca ccgagcctgg gcgcggtgtg caggcgaggg 60

ccacggcctt cgcagcagcg gggaacgcgg ggagtcgagg cacccagcgg gccggggaag 120

aaggtggggg actccgcgga cgccgaggag agggcactgc ggagtcagca ggccctgtag 180

gga 183

<210> 14

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggcgtgtatg gggcgcggag ttaagagtta tcgagtttgg gcgcggtgtg taggcgaggg 60

ttacggtttt cgtagtagcg gggaacgcgg ggagtcgagg tatttagcgg gtcggggaag 120

aaggtggggg atttcgcgga cgtcgaggag agggtattgc ggagttagta ggttttgtag 180

gga 183

<210> 15

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggggtgtgta tggggtgtgg agttaagagt tattgagttt gggtgtggtg tgtaggtgag 60

ggttatggtt tttgtagtag tggggaatgt ggggagttga ggtatttagt gggttgggga 120

agaaggtggg ggattttgtg gatgttgagg agagggtatt gtggagttag taggttttgt 180

aggg 184

<210> 16

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggctgagcag atcctgaagg cgggcggggg acgcaccttt cggcggggca gggtgccccc 60

ggacacggcg agcgcgcggt acagctcggc agggtgatag tcctccagcg ccgcgtacag 120

ctcgtccgct gggggcccag gggtggcggc tgcggcaggg ggtcccgggg tcgggaccgg 180

agcggcgggc gcgacttccg agtcgggagt ccgggcggcg gggtccgggg tggccgccgc 240

ctcctccttc tgctgcagct tcctgagtcg gcggagggtc atggctccgg cgccggacgc 300

ccctcagaga cggcgctggc tcccctcggc ggggctggcg gcggctgggg gatgccagcc 360

g 361

<210> 17

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggttgagtag attttgaagg cgggcggggg acgtattttt cggcggggta gggtgttttc 60

ggatacggcg agcgcgcggt atagttcggt agggtgatag ttttttagcg tcgcgtatag 120

ttcgttcgtt gggggtttag gggtggcggt tgcggtaggg ggtttcgggg tcgggatcgg 180

agcggcgggc gcgattttcg agtcgggagt tcgggcggcg gggttcgggg tggtcgtcgt 240

tttttttttt tgttgtagtt ttttgagtcg gcggagggtt atggtttcgg cgtcggacgt 300

tttttagaga cggcgttggt ttttttcggc ggggttggcg gcggttgggg gatgttagtc 360

g 361

<210> 18

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggggttgag tagattttga aggtgggtgg gggatgtatt ttttggtggg gtagggtgtt 60

tttggatatg gtgagtgtgt ggtatagttt ggtagggtga tagtttttta gtgttgtgta 120

tagtttgttt gttgggggtt taggggtggt ggttgtggta gggggttttg gggttgggat 180

tggagtggtg ggtgtgattt ttgagttggg agtttgggtg gtggggtttg gggtggttgt 240

tgtttttttt ttttgttgta gttttttgag ttggtggagg gttatggttt tggtgttgga 300

tgttttttag agatggtgtt ggtttttttt ggtggggttg gtggtggttg ggggatgtta 360

gttg 364

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tttgagtttt tcgcatatcg ttc 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgacctttct ccctaacagc g 21

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gggtgagttt tttggatatt gttt 24

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccaacctttc tccctaacca ta 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcgggattcg ttgagatttc t 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcttcctgaa taccgctcgc 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gatgtgggat ttgttgagat tttc 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaaacttccc aaagaccact cac 23

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcggttcgtt cggttgg 17

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ataatcctcc aacgccgct 19

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gatttgtggt ttgtttggtt gg 22

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aataataatc ctccaacgcc aca 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gggggtattt tgtttcgtcg 20

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agcaccgaac ctaaaggcg 19

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttgggggtat tttgttttgt tg 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaaaccaccg aacctaaaca ca 22

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ggcgtgtatg gggctcg 17

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tccctacaaa acctactaac tgcg 24

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aggggtgtgt atggggtgtg 20

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccctacaaaa cctactaacg cca 23

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ggttgagtag attttgaagg cg 22

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acgactaaca tcccctaacc g 21

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

aggggttgag tagattttga agttg 25

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

caactaacat ccgccaacca 20

<210> 43

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gccggctgcc cgggtcgtgc actttcagta gggccccgct gactctcctg cccttgggct 60

aggcctcccg gggatgccag actcctgggg acgctgggac ccgcggcgcg gcgggacacg 120

caggactccc gcctctccgc c 141

<210> 44

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gggatgccag actcctgggg acgctgggac ccgcggcgcg gcgggacacg caggactccc 60

gcctctccgc ccggaattcg ttgagacgga atctcagcgg atcccgcgtc cgccga 116

<210> 45

<211> 209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tcccggagct gttcggccgc cggctgcccg ggtcgtgcac tttcagtagg gccccgctga 60

ctctcctgcc cttgggctag gcctcccggg gatgccagac tcctggggac gctgggaccc 120

gcggcgcggc gggacacgca ggactcccgc ctctccgccc ggaattcgtt gagacggaat 180

ctcagcggat cccgcgtccg ccgagcgcc 209

<210> 46

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

attccgggcg gagaggcggg agtcctgcgt gtcccgccgc gccgcgggtc ccagcgtccc 60

caggagtctg gcatccccgg gaggcctagc ccaagggcag gagagtcagc ggggccctac 120

tgaaagtgca cgacccgggc agccggcggc cgaacagctc c 161

<210> 47

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cgggagtcct gcgtgtcccg ccgcgccgcg ggtcccagcg tccccaggag tctggcatcc 60

ccgggaggcc tagcccaagg gcaggagagt cagcggggcc ctactgaaag tgcacgaccc 120

gggcagccgg cg 132

<210> 48

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

cgtgtcccgc cgcgccgcgg gtcccagcgt ccccaggagt ctggcatccc cgggaggcct 60

agcccaaggg caggagagtc agcggggccc tactgaaagt gcacgacccg ggcagccggc 120

ggccgaacag ctccgggagc aggcgagcg 149

<210> 49

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gcagcagaag gaggaggcgg cggccacccc ggaccccgcc gcccggactc ccgactcgga 60

agtcgcgccc gccgctccgg tcccgacccc gggaccccct gccgcagccg ccacccctgg 120

gcccccagcg gacgagctgt acgc 144

<210> 50

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ctacagggcc tgctgactcc gcagtgccct ctcctcggcg tccgcggagt cccccacctt 60

cttccccggc ccgctgggtg cctcgactcc ccgcgttccc cgctgctgcg aaggccgtgg 120

ccctcgcctg cacaccgcgc ccaggctc 148

<210> 51

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

agagccaccg agcctgggcg cggtgtgcag gcgagggcca cggccttcgc agcagcgggg 60

aacgcgggga gtcgaggcac ccagcgggcc ggggaagaag 100

<210> 52

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ggggcccagg ggtggcggct gcggcagggg gtcccggggt cgggaccgga gcggcgggcg 60

cgacttccga gtcgggagtc cggg 84

<210> 53

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gtcggttgtt cgggtcgtgt atttttagta gggtttcgtt gatttttttg tttttgggtt 60

aggtttttcg gggatgttag atttttgggg acgttgggat tcgcggcgcg gcgggatacg 120

taggattttc gttttttcgt t 141

<210> 54

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gggatgttag atttttgggg acgttgggat tcgcggcgcg gcgggatacg taggattttc 60

gttttttcgt tcggaattcg ttgagacgga attttagcgg atttcgcgtt cgtcga 116

<210> 55

<211> 209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tttcggagtt gttcggtcgt cggttgttcg ggtcgtgtat ttttagtagg gtttcgttga 60

tttttttgtt tttgggttag gtttttcggg gatgttagat ttttggggac gttgggattc 120

gcggcgcggc gggatacgta ggattttcgt tttttcgttc ggaattcgtt gagacggaat 180

tttagcggat ttcgcgttcg tcgagcgtc 209

<210> 56

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

atttcgggcg gagaggcggg agttttgcgt gtttcgtcgc gtcgcgggtt ttagcgtttt 60

taggagtttg gtattttcgg gaggtttagt ttaagggtag gagagttagc ggggttttat 120

tgaaagtgta cgattcgggt agtcggcggt cgaatagttt c 161

<210> 57

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgggagtttt gcgtgtttcg tcgcgtcgcg ggttttagcg tttttaggag tttggtattt 60

tcgggaggtt tagtttaagg gtaggagagt tagcggggtt ttattgaaag tgtacgattc 120

gggtagtcgg cg 132

<210> 58

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cgtgtttcgt cgcgtcgcgg gttttagcgt ttttaggagt ttggtatttt cgggaggttt 60

agtttaaggg taggagagtt agcggggttt tattgaaagt gtacgattcg ggtagtcggc 120

ggtcgaatag tttcgggagt aggcgagcg 149

<210> 59

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gcagcagaag gaggaggcgg cggccacccc ggaccccgcc gcccggactc ccgactcgga 60

agtcgcgccc gccgctccgg tcccgacccc gggaccccct gccgcagccg ccacccctgg 120

gcccccagcg gacgagctgt acgc 144

<210> 60

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ttatagggtt tgttgatttc gtagtgtttt tttttcggcg ttcgcggagt tttttatttt 60

ttttttcggt tcgttgggtg tttcgatttt tcgcgttttt cgttgttgcg aaggtcgtgg 120

ttttcgtttg tatatcgcgt ttaggttc 148

<210> 61

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

agagttatcg agtttgggcg cggtgtgtag gcgagggtta cggttttcgt agtagcgggg 60

aacgcgggga gtcgaggtat ttagcgggtc ggggaagaag 100

<210> 62

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

ggggtttagg ggtggcggtt gcggtagggg gtttcggggt cgggatcgga gcggcgggcg 60

cgattttcga gtcgggagtt cggg 84

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

tgtcggttgt tcgggtcg 18

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

aacgaaaaga cgaaaatcct acg 23

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gttgggattc gcggcgcg 18

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

gggatgttag atttttggtg acg 23

<210> 67

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

tcgacgaacg cgaaatctg 19

<210> 68

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

ggcgcggcgg gatacg 16

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

tttcggagtt gttcggtcg 19

<210> 70

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

gacgctcgac gaacggg 17

<210> 71

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

ggcgcggcgg gatacg 16

<210> 72

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

atttcgggcg gagaggc 17

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aggaaactat tcgaccgcca 20

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

tttgcgtgtt tcgtcgcgtc g 21

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

tcgggagttt tgcgtgtttc 20

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

cgccgactac ccgaatgg 18

<210> 77

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

cgcgtcgcgg gttttagcg 19

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

tcgtgtttcg tcgcctcg 18

<210> 79

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

tcgctcgcct actgccg 17

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

cgggtagtcg gcggtcgaat ag 22

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

gtagtagaag gaggaggcgg c 21

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

aggcgtagaa ctcgtccgc 19

<210> 83

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

cgtttcggtt tcgatttcgg ga 22

<210> 84

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

gggttatagg gtttgttgat ttcc 24

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

gaacctaaac gggatataca aacg 24

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

tcgttgttgc gaaggtcgtg g 21

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

agagttagcg agtttgggcg 20

<210> 88

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

atcttcttcc ccgagccg 18

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

ggtgtgtagg cgagggttac ggt 23

<210> 90

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

ggggtttagg ggtggcg 17

<210> 91

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

acccgaactc ccgactgg 18

<210> 92

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

ggtcgggatc ggagcggc 18

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 94

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 95

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims

1.检测标志区的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用，其特征在于，以GRCh38.p14为参考，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域；或者，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志区包括Chr10:101140241～101140431的全长或部分区域；

或，所述标志区为Chr10:101140241～101140431的全长或部分区域和Chr12：52007046～52007471的全长或部分区域。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志区包括下述区域之一：

区域1：Chr10:101140208～101140464的正链；

区域2：Chr10:101140431～101140214；

区域7：Chr10:101140255～101140395的正链；

区域8：Chr10:101140325～101140440的正链；

区域9：Chr10:101140237～101140445的正链；

区域10：Chr10:101140401～101140241；

区域11：Chr10:101140385～101140254；

区域12：Chr10:101140374～101140226；

或者，所述标志区为第一区与第二区的组合，其中：

所述第一区为下述区域之一：

区域1：Chr10:101140208～101140464的正链；

区域2：Chr10:101140431～101140214；

区域7：Chr10:101140255～101140395的正链；

区域8：Chr10:101140325～101140440的正链；

区域9：Chr10:101140237～101140445的正链；

区域10：Chr10:101140401～101140241；

区域11：Chr10:101140385～101140254；

区域12：Chr10:101140374～101140226；

所述第二区为下述区域之一：

区域3：Chr12:52006931～52007205的正链；

区域4：Chr12:52007242～52007466的正链；

区域5：Chr12:52007494～52007312；

区域6：Chr12:52007301～52006941；

区域13：Chr12:52007046～52007189的正链；

区域14：Chr12:52007315～52007462的正链；

区域15：Chr12:52007471～52007372；

区域16：Chr12:52007170～52007087。

4.一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测标志区的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域；或者，所述标志区包括Chr10:101140208～101140464的全长或部分区域和Chr12:52006931～52007494的全长或部分区域。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述标志区的甲基化水平的检测：

甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括检测引物对，所述检测引物对包括如下引物对中的至少一组：

用于检测Chr10:101140208～101140464的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对；用于检测Chr10:101140431～101140214的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对；用于检测Chr10:101140255～101140395的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对；用于检测Chr10:101140325～101140440的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域8引物对；用于检测Chr10:101140237～101140445的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域9引物对；用于检测Chr10:101140401～101140241的全长或部分区域的甲基化水平的区域10引物对；用于检测Chr10:101140385～101140254的全长或部分区域的甲基化水平的区域11引物对；用于检测Chr10:101140374～101140226的全长或部分区域的甲基化水平的区域12引物对。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQID NO:19～22所示；及/或，所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～26所示；及/或，所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:63～64所示；及/或，所述区域8引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:66～67所示；及/或，所述区域9引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:69～70所示；及/或，所述区域10引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:72～73所示；及/或，所述区域11引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:75～76所示；及/或，所述区域12引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:78～79所示。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测引物对还包括如下引物对中的至少一组：

用于检测Chr12:52006931～52007205的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对；用于检测Chr12:52007242～52007466的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对；用于检测Chr12:52007494～52007312的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对；用于检测Chr12:52007301～52006941的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对；用于检测Chr12:52007046～52007189的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域13引物对；用于检测Chr12:52007315～52007462的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域14引物对；用于检测Chr12:52007471～52007372的全长或部分区域的甲基化水平的区域15引物对；用于检测Chr12:52007170～52007087的全长或部分区域的甲基化水平的区域16引物对。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQID NO:27～30所示；及/或，所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31～34所示；及/或，所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:35～38所示；及/或，所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:39～42所示；及/或，所述区域13引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:81～82所示；及/或，所述区域14引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:84～85所示；及/或，所述区域15引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:87～88所示；及/或，所述区域16引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:90～91所示。

10.根据权利要求7或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括与所述检测引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有荧光基团，其中：

与所述区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示；及/或，与所述区域8引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示；及/或，与所述区域9引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示；及/或，与所述区域10引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示；及/或，与所述区域11引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示；及/或，与所述区域12引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:80所示；及/或，与所述区域13引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示；及/或，与所述区域14引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:86所示；及/或，与所述区域15引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示；及/或，与所述区域16引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:92所示。

11.根据权利要求4～7和9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。