CN117757991A - 一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测的领域，公开了一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，包括样本采集与处理、冻干反应体系、基于POCT检测平台的DNA和mRNA检测及数据分析；本发明靶向HPV16/18的E6/E7基因设计特异性引物，基于实时荧光定量PCR(qPCR)和定量逆转录PCR(RT‑qPCR)技术方法，采用预冻干反应试剂，通过简单样本处理在POCT检测仪器上对宫颈脱落细胞样品中HPV16/18E6/E7基因的DNA和mRNA同时进行检测，qPCR和RT‑qPCR两个反应计算所得的两个CT值的差值可评估待检样本中HPV16/18的E6/E7基因mRNA的转录水平，进而提示宫颈癌发生相关的HPV16/18的E6/E7基因是否整合进入人基因组中，为临床患者的HPV感染和宫颈癌筛查提供更加快速、便捷和准确的判断依据。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测的技术领域，具体为一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，根据国家癌症中心发布的2022年全国癌症报告，2016年我国宫颈癌新发病例11.9万，发病率为11.34/10万，居女性恶性肿瘤发病率第五，妇科恶性肿瘤发病率第二；死亡病例3.7万，死亡率为3.36/10万，居女性恶性肿瘤死亡率第七，妇科恶性肿瘤死亡率第二，宫颈癌发病率和死亡率有农村高于城市的特点以及患者群体年轻化的趋势，据中国宫颈癌发病率和死亡率的最新统计数据宫颈癌的发病率和死亡率都有不同上升。
宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)密不可分，据统计，95％以上宫颈癌是由人乳头状瘤病毒持续感染引起的，现行的宫颈癌筛查流程要求，高危型HPV16、18型阳性的患者须直接接受阴道镜检查，然而90％患者为一过性感染，会自行转阴，过度诊断可能导致医疗资源浪费，对携带者、患者、医生均造成了负担。因此要求有针对HPV感染与宫颈癌关联更加明确、更为有效、对患者伤害更小的检测方法进行阴道镜检查前分诊，避免过度诊断。HPV E6与E7基因与宫颈癌密切相关，编码主要的宫颈癌相关致癌蛋白，宫颈病变直至浸润癌的发展过程中E6、E7基因整合入宿主细胞基因组后，会导致此二者的过表达(即转录大量病毒mRNA)，进而诱发肿瘤。综上，可采用针对HPV E6、E7 mRNA表达水平的测试对宫颈癌相关的HPV基因组整合情况进行初步判断。
HPV检测辅助宫颈癌诊断中有较多应用，其中，美国FDA批准了4家公司的5个宫颈癌相关高危型HPV检测产品，有四种针对HPV DNA进行检测，包括凯杰采用第二代杂交捕获法的产品Hybrid Capture 2、豪洛捷采用酶切信号放大法的产品Cervista HPV、罗氏和BD公司采用实时荧光定量聚合酶链式反应法的产品Cobas HPV及Onclarity HPVAssay，仅有一种针对mRNA的检测，即豪洛捷采用转录介导等温核酸扩增技术的产品Aptima HPV；暂无针对HPV E6、E7mRNA的逆转录qPCR试剂盒。国产试剂盒中，有采用sanger测序、二代测序等方法针对病毒DNA的人源基因整合，但其实验时间长、对实验仪器和专业人员要求较高等缺点使得其无法运用于基层检测，凯普公司基于RT-qPCR的高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒，但仍缺乏运用于基层的简单、快速、便捷的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，以解决背景技术中提出的问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，用于提示宫颈癌发生相关的HPV16/18基因人体基因组整合，其特征在于，包括：样本采集与处理、冻干反应体系、基于POCT检测平台的DNA和mRNA检测及数据分析；将宫颈刷采集的宫颈脱落细胞样本与A管中样本处理液混合处理；所述反应体系包括：将处理后的样本分别与B1管中的冻干粉和B2管中的冻干粉溶解混匀，获得反应液管B1和B2；将溶液试剂B1和溶液试剂B2分别转移至POCT仪器适配的反应管内，通过POCT仪器分别进行qPCR和RT-qPCR扩增反应；扩增反应完毕后，POCT仪器分析扩增曲线并得出两个反应的CT值，CT1和CT2，两者相减获得ΔCT值；通过将ΔCT值与临床样本检测结果分析所得截断值N进行比对，可评估待检样本中HPV16/18的E6/E7基因mRNA的转录水平，进而提示宫颈癌发生相关的HPV16/18的E6/E7基因是否整合进入人基因组。
优选的，所述B1管内的冻干粉由HPV16/18病毒E6/E7基因(靶标)引物和探针、人源基因RNase P(内标)引物和探针、2×FastAmpli Premix-UNGⅣ(Probe qPCR)(DG)以及无酶水通过冻干程序冻干制得；所述B2管内的冻干粉由HPV16/18病毒E6/E7基因(靶标)引物和探针、内标引物、内标探针、4x冻干保护液、12.5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix(withdNTP)(DG)、50×FastAmpli Part RTase(DG)、5×FastAmpli RT Buffer(dNTP free)(DG)和无酶水通过冻干程序冻干制得。
优选的，所述冻干程序包括：
S1：预冻；
S1.1：温度：4℃；时长：30min；状态：Hold；压强：1atm；
S1.2：温度：-50℃；时长：1℃/min；状态：降温；压强：1atm；
S1.3：温度：-50℃；时长：180min；状态：Hold；压强：1atm；
S2：一次升华；
S2.1：温度：-40℃；时长：1℃/min；状态：升温；压强：极限真空；
S2.2：温度：-40℃；时长：720min；状态：Hold；压强：极限真空；
S3：二次升华；
S3.1：温度：25℃；时长：1℃/min；状态：升温；压强：极限真空；
S3.2：温度：25℃；时长：300min；状态：Hold；压强：极限真空。
优选的，所述B1冻干粉和B2冻干粉溶解混匀方法为：
S1：将B1冻干粉和B2冻干粉分别进行瞬时离心；
S2：向B1冻干粉和B2冻干粉中分别加入25μL处理后的样本细胞悬液；
S3：混匀离心；
POCT平台的扩增方法为：
S3.1：温度：50℃；时间：10min；循环数：1；
S3.2：温度：95℃；时间：2.5min；循环数：1；
S3.3：温度：95℃；时间：3s；循环数：45；
S3.4：温度：60℃；时间：15s；循环数：45。
优选的，所述HPV16引物包含HPV16 E6和HPV16 E7引物，其中HPV16 E6引物分为上游引物HPV16-E6-F与下游引物HPV16-E6-R；HPV16 E7引物分为上游引物HPV16-E7-F与下游引物HPV16-E7-R；HPV16探针包含HPV16-E6-P探针和HPV16-E7-P探针；
所述上游引物HPV16-E6-F序列：5'AATGTTTCAGGACCCACAGG3'；
所述下游引物HPV16-E6-R序列：5'GTTGCTTGCAGTACACACATTC3'；
所述上游引物HPV16-E7-F序列：5'TCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA3'；
所述下游引物HPV16-E7-R序列：5'GCACAACCGAAGCGTAGA3'；
所述HPV16探针HPV16-E6-P和HPV16-E7-P，都标记有FAM荧光基团；
所述HPV16-E6-P序列：FAM-5'ACCACAGTTATGCACAGAGCTGCA3'-MGB；所述HPV16-E7-P序列：FAM-5'AGAACCGGACAGAGCCCATTACAA3'-MGB；HPV18引物包含HPV18 E6和HPV16 E7引物，其中HPV18 E6引物分为上游引物HPV18-E6-F与下游引物HPV18-E6-R；HPV18 E7引物分为上游引物HPV18-E7-F与下游引物HPV18-E7-R；HPV16探针包含HPV18-E6-P探针和HPV18-E7-P探针；
所述上游引物HPV18-E6-F序列：5'ACCCTACAAGCTACCTGATCT3'；
所述下游引物HPV18-E6-R序列：5'ACCTCTGTAAGTTCCAATACTGTC3'；
所述上游引物HPV18-E7-F序列：5'AATTCCGGTTGACCTTCTATGT3'；
所述下游引物HPV18-E7-R序列：5'GGCTGGTAAATGTTGATGAT3'；
所述HPV18探针HPV18-E6-P和HPV18-E7-P，都标记有FAM荧光基团；
所述HPV18-E6-P序列：VIC-5'ACGGAACTGAACACTTCACTGCAAGA3'-MGB；
所述HPV18-E7-P序列：VIC-5'TAAGCGACTCAGAGGAAGAAA3'-MGB。
优选的，所述内标引物分为上游引物RP-F与下游引物RP-R；
所述上游引物RP-F序列：5'AGATTTGGACCTGCGAGCG3'；
所述下游引物RP-R序列：5'GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3'；
所述内标探针为ROX探针；
所述ROX探针为RP-P序列：5'TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG3'。
优选的，所述HPV16/18引物和内标引物的终浓度为0.2～0.4μM，所述HPV16/18探针和内标探针的终浓度为0.1～0.2μM。
优选的，所述FastAmpli Premix-UNGⅣ(Probe qPCR)(DG)和FastAmpli PartTaq/UNG Mix(with dNTP)(DG)均包括相关酶、5～15mM的Tris-HCL、2～4mM的氯化钾、2.5～5mM的氯化镁和0.1～0.2mM的dNTPs。
优选的，所述相关酶为Taq酶和UNG酶，所述Taq酶的浓度为4～8U，所述UNG酶的浓度为8-12U。
优选的，所述FastAmpli Part RTase(DG)包括逆转录酶，所述逆转录酶的浓度为8-12U。
与现有技术相比，采用了上述技术方案的一种检测HPV16/18病毒基因在人体基因组整合的分子POCT检测方法，具有如下有益效果：
一、本发明通过靶向HPV16/18的E6/E7基因设计特异性引物，通过POCT检测方法，两管法一次同时检测患者DNA水平E6/E7基因的含量和mRNA水平的E6/E7基因转录情况。通过评估待检样本中HPV16/18的E6/E7基因mRNA的转录水平，可提示HPV16/18的E6/E7基因是否整合进入人基因组中，为临床患者HPV的筛查和宫颈癌的诊断提供更加准确的判断依据；
二、本发明通过简单样品处理步骤可快速对临床样本进行直接扩增检测，相对繁琐的传统的RNA提取流程，显著提高检测效率，缩短检测流转时间至30分钟，符合POCT检测的要求；本发明在对RNA水平进行检测的同时，可以检测出HPV16/18的DNA含量，对于诊断患者是否发生HPV16/18感染也具有重要指导意义；
三、本发明采用原位冷冻干燥的技术对反应试剂进行冻干处理。冻干试剂即使常温储存也具有良好的稳定性，以及较高的易操作性和便利性，不仅有利于检测试剂的运输和保存，也通过提高检测样本的投入比例，大大提高检测灵敏度。
四、本发明采用分子POCT检测方法，为一种在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种核酸检测方式，该方法能够快速取得检测结果的同时免去了样本的处理和数据分析等繁琐的步骤，不必依赖于专业人员的操作，小至自我测试和门急诊，大至重症监护病房，POCT可以应用在各种医疗场合中，符合HPV在基层的检测和在全国地区实施两癌基层筛查的需求。
附图说明
图1为实施例一的检测步骤图；
图2-1为实施例二该方法检测Hela细胞(HPV18 E6/E7基因整合)的qPCR扩增曲线示意图；
图2-2为实施例二该方法检测Hela细胞(HPV18 E6/E7基因整合)的RT-qPCR扩增曲线示意图；
图3-1为实施例三该方法检测Siha细胞(HPV16 E6/E7基因整合)的qPCR扩增曲线示意图；
图3-2为实施例三该方法检测Siha细胞(HPV16 E6/E7基因整合)中的HPV16含量的RT-qPCR扩增曲线示意图；
图4-1为实施例四该方法检测HPV16阳性但未基因整合临床样本HPV16含量的qPCR扩增曲线示意图；
图4-2为实施例四该方法检测HPV16阳性但未基因整合临床样本HPV16含量的RT-qPCR扩增曲线示意图；
图5-1为实施例五该方法检测HPV18阳性但未基因整合临床样本HPV18含量的qPCR扩增曲线示意图；
图5-2为实施例五该方法检测HPV18阳性但未基因整合临床样本HPV18含量的RT-qPCR扩增曲线示意图；
图6-1为实施例六该方法检测HPV阴性临床样本HPV含量的qPCR扩增曲线示意图；
图6-2为实施例六该方法检测HPV阴性临床样本HPV含量的RT-qPCR扩增曲线示意图。
具体实施方式
实施例一：一种检测HPV16/18病毒基因在人体基因组整合的分子POCT检测方法，用于提示宫颈癌发生相关的HPV16/18基因人体基因组整合，包括样本采集与处理、冻干反应体系、基于POCT检测平台的DNA和mRNA检测及数据分析；
样本采集为通过宫颈拭子采样，样本处理是对宫颈拭子采样到的样本进行处理，具体步骤是：
S1:将宫颈拭子与样本处理液于A管中充分混合；
S2：分别将冻干粉管B1管和B2管进行瞬时离心；
S3：分别取25μL的细胞悬液与B1管中的冻干粉和B2管中的冻干粉溶解混匀，获得相应的反应液；
S4：将S3所述反应液分别转移至POCT仪器适配的反应管内，分别进行qPCR和RT-qPCR扩增反应，具体扩增反应程序如下：
S5：分别获得CT1和CT2，两者相减获得ΔCT值；
对比ΔCT值与截断值N，判断HPV16/18病毒E6/E7基因mRNA表达水平高低，提示基因整合风险，具体结果判定如下：
(1)对于检测ΔCT值≤N的样本，报告为该样本HPV16/18E6/E7基因mRNA表达水平高，进而提示HPV16/18病毒整合风险高；
(2)对于测定ΔCT值＞N的样本，报告为该样本HPV16/18E6/E7基因mRNA表达水平低，进而提示HPV16/18病毒整合风险低。
需要说明的是，截断值N的确定方法如下：
S1:设置A和B两组队列，其中A组纳入100名HPV16感染患者进行测试，B组纳入100名HPV18感染患者进行测试；
S2：对上述200名测试人员进行NGS测序，确定HPV16/18基因整合信息；其中，A组的100名测试者中，有X名发生HPV16基因整合，剩余(100-X)名未发生HPV16基因整合；B组的100名测试者中，有Y名发生HPV18基因整合，剩余(100-Y)名未发生HPV18基因整合；
S3：同时，对上述200名测试者使用该方法进行qPCR和RT-qPCR扩增检测，计算ΔCT值；
S4：以真阳性率(FPR)为横坐标，假阳性概率(TPR)为纵坐标绘制ROC曲线；
ROC曲线绘制方法如下：
A和B组都分别分成两类，Class＝1的表示阳性样本，Class＝0的表示阴性样本，Value表示测量的ΔCT值；
1)依据Value值从大到小分别对A和B组中各100个测试者进行排序；
2)依次把Value值作为阈值(即阈值依次为ΔCT1,ΔCT2,....ΔCT100)，当测试的Value值大于等于此阈值时被认为是阳性，否则此测试被认为是阴性；
3)分别计算A和B组中上述各100个阈值对应的每个样本的TPR和FPR，依次把这2组中各100个Value值作为阈值，得到A和B组的各100组(TPR,FPR)值，把这2组中的各100组(TPR,FPR)数据使用SPSS软件制作分别制得ROC曲线；
4)最接近左上角一点即约登指数的最大值，即为截断值N。
本实施例中，B1管中的冻干粉由HPV16/18引物、HPV16/18探针、内标引物、内标探针、2×FastAmpli Premix-UNGⅣ(Probe qPCR)(DG)以及无酶水通过冻干程序冻干制得。
B2管中的冻干粉由HPV16/18病毒E6/E7基因(靶标)引物和探针、人源基因RNase P(内标)引物和探针、4x冻干保护液、12.5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix(with dNTP)(DG)、50×FastAmpli Part RTase(DG)、5×FastAmpli RT Buffer(dNTP free)(DG)和无酶水通过冻干程序冻干制得。
所述HPV16引物包含HPV16 E6和HPV16 E7引物，其中HPV16 E6引物分为上游引物HPV16-E6-F与下游引物HPV16-E6-R；HPV16 E7引物分为上游引物HPV16-E7-F与下游引物HPV16-E7-R；HPV16探针包含HPV16-E6-P探针和HPV16-E7-P探针；
所述上游引物HPV16-E6-F序列：5'AATGTTTCAGGACCCACAGG3'；
所述下游引物HPV16-E6-R序列：5'GTTGCTTGCAGTACACACATTC3'；
所述上游引物HPV16-E7-F序列：5'TCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA3'；
所述下游引物HPV16-E7-R序列：5'GCACAACCGAAGCGTAGA3'；
所述HPV16探针HPV16-E6-P和HPV16-E7-P，都标记有FAM荧光基团；
所述HPV16-E6-P序列：FAM-5'ACCACAGTTATGCACAGAGCTGCA3'-MGB；所述HPV16-E7-P序列：FAM-5'AGAACCGGACAGAGCCCATTACAA3'-MGB；HPV18引物包含HPV18 E6和HPV16 E7引物，其中HPV18 E6引物分为上游引物HPV18-E6-F与下游引物HPV18-E6-R；HPV18 E7引物分为上游引物HPV18-E7-F与下游引物HPV18-E7-R；HPV16探针包含HPV18-E6-P探针和HPV18-E7-P探针；
所述上游引物HPV18-E6-F序列：5'ACCCTACAAGCTACCTGATCT3'；
所述下游引物HPV18-E6-R序列：5'ACCTCTGTAAGTTCCAATACTGTC3'；
所述上游引物HPV18-E7-F序列：5'AATTCCGGTTGACCTTCTATGT3'；
所述下游引物HPV18-E7-R序列：5'GGCTGGTAAATGTTGATGAT3'；
所述HPV18探针HPV18-E6-P和HPV18-E7-P，都标记有FAM荧光基团；
所述HPV18-E6-P序列：VIC-5'ACGGAACTGAACACTTCACTGCAAGA3
'-MGB；
所述HPV18-E7-P序列：VIC-5'TAAGCGACTCAGAGGAAGAAA3'-MGB。
HPV16/18引物和内标引物的终浓度为0.2～0.4μM，所述HPV16/18探针和内标探针的终浓度为0.1-0.2μM。
FastAmpli Premix-UNGⅣ(Probe qPCR)(DG)和FastAmpli Part Taq/UNG Mix(with dNTP)(DG)均包括相关酶、5～15mM的Tris-HCL、2～4mM的氯化钾、2.5～5mM的氯化镁和0.1～0.2mM的dNTPs。
相关酶为Taq酶和UNG酶，Taq酶的浓度为4～8U，UNG酶的浓度为8-12U。
FastAmpli Part RTase(DG)包括逆转录酶，逆转录酶的浓度为8-12U。
冻干程序包括：
S1：预冻；
S1.1：温度：4℃；时长：30min；状态：Hold；压强：1atm；
S1.2：温度：-50℃；时长：1℃/min；状态：降温；压强：1atm；
S1.3：温度：-50℃；时长：180min；状态：Hold；压强：1atm；
S2：一次升华；
S2.1：温度：-40℃；时长：1℃/min；状态：升温；压强：极限真空；
S2.2：温度：-40℃；时长：720min；状态：Hold；压强：极限真空；
S3：二次升华；
S3.1：温度：25℃；时长：1℃/min；状态：升温；压强：极限真空；
S3.2：温度：25℃；时长：300min；状态：Hold；压强：极限真空。
实施例二：本实施例运用实施例一公开的检测方法对Hela细胞(HPV18E6/E7基因整合)进行检测，以验证实施例一的HPV18病毒基因在Hela细胞中的DNA和mRNA的检测方法，提示宫颈癌发生相关的HPV18基因整合风险判定的准确性。
具体实施过程如下：
确定引物和探针：
HPV16引物：
上游引物HPV16-E6-F序列：5'AATGTTTCAGGACCCACAGG3'；
下游引物HPV16-E6-R序列：5'GTTGCTTGCAGTACACACATTC3'；
上游引物HPV16-E7-F序列：5'TCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA3'；
下游引物HPV16-E7-R序列：5'GCACAACCGAAGCGTAGA3'；
HPV16的FAM荧光探针:
HPV16-E6-P序列：FAM-5'ACCACAGTTATGCACAGAGCTGCA3'-MGB；
HPV16-E7-P序列：FAM-5'AGAACCGGACAGAGCCCATTACAA3'-MGB；HPV18引物：
上游引物HPV18-E6-F序列：5'ACCCTACAAGCTACCTGATCT3'；
下游引物HPV18-E6-R序列：5'ACCTCTGTAAGTTCCAATACTGTC3'；
上游引物HPV18-E7-F序列：5'AATTCCGGTTGACCTTCTATGT3'；
下游引物HPV18-E7-R序列：5'GGCTGGTAAATGTTGATGAT3'；
HPV18的VIC荧光探针:
HPV18-E6-P序列：VIC-5'ACGGAACTGAACACTTCACTGCAAGA3'-MGB；HPV18-E7-P序列：VIC-5'TAAGCGACTCAGAGGAAGAAA3'-MGB内标引物：
内标上游引物RP-F序列：5'AGATTTGGACCTGCGAGCG3'；
内标下游引物RP-R序列：5'GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3'；
内标的ROX探针为RP-P序列：
5'ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-MGB3'；
2.配置冻干体系
冻干试剂A配置：
冻干试剂B配置：
冻干程序：
3.样本处理与加样
S1:用处理液重悬制备5x105个/ml浓度的Hela细胞；
S2：分别将B1管和B2管进行瞬时离心；
S3：分别取25μL的细胞悬液与B1管中的冻干粉和B2管中的冻干粉溶解混匀，获得相应的反应液；
4.扩增反应：
将S3所述反应液分别转移至反应管内，分别进行qPCR和RT-qPCR扩增反应，具体扩增反应程序如下：
5.实验结果
结合图2-1的qPCR扩增曲线示意图，Hela细胞中靶标HPV18的CT值为29.85；结合图2-2的RT-qPCR扩增曲线示意图，Hela细胞中靶标HPV18的CT值为19.35，计算ΔCT为10.5>N。以上检测结果说明，Hela细胞中具有较高的HPV18病毒E6/E7基因的mRNA转录水平，提示HPV18病毒基因整合进入Hela细胞基因组。以上推论与已发表的Hela细胞基因组中存在HPV18基因组整合的研究结果相符。
实施例三：本实施例运用实施例一公开的检测方法对Siha细胞(HPV16 E6/E7基因整合)进行检测，以验证实施例一的病HPV16病毒基因在Siha细胞中DNA和mRNA的检测方法，提示宫颈癌发生相关的HPV16基因整合风险判定的准确性，具体检测过程与实施例一和实施例二一致，所获实验结果如下：结合图3-1的qPCR扩增曲线示意图，Siha细胞中靶标HPV16的CT值为36.24；结合图3-2的RT-qPCR扩增曲线示意图，Siha细胞中靶标HPV16的CT值为24.59，计算ΔCT为11.65。以上检测结果说明，Siha细胞中HPV16病毒的E6/E7基因的mRNA转录水平很高，提示HPV16病毒基因整合进入Siha细胞基因组。以上实验结果与已发表的Siha细胞基因组中存在HPV18基因组整合的研究结果相符。
实施例四：本实施例运用实施例一公开的检测方法对已知HPV16阳性未整合临床样本细胞进行检测，以验证实施例一的病毒融合风险判定准确性，具体检测过程与实施例一和实施例二一致，所获实验结果如下：结合图4-1的qPCR扩增曲线示意图，该HPV16阳性临床样本中靶标HPV16的CT值为33.58；结合图4-2的RT-qPCR扩增曲线示意图，该HPV16阳性临床样本中靶标HPV16的CT值为32.13，计算ΔCT为1.45。以上检测结果说明，该HPV16阳性临床样本中HPV16病毒的E6/E7基因的mRNA转录水平较低，提示HPV16病毒基因未整合进入人基因组中。以上实验结果与该样本为HPV16一过性感染，HPV16病毒基因未整合进入该样本基因组中的这一结论相符。
实施例五：本实施例运用实施例一公开的检测方法对已知HPV18阳性未整合临床样本细胞进行检测，以验证实施例一的病毒融合风险判定准确性，具体检测过程与实施例一和实施例二一致，所获实验结果如下：结合图5-1的qPCR扩增曲线示意图，该HPV18阳性临床样本中靶标HPV16的CT值为28.26；结合图5-2的RT-qPCR扩增曲线示意图，该HPV16阳性临床样本中靶标HPV18的CT值为27.88，计算ΔCT为0.38。以上检测结果说明，该HPV18阳性临床样本中HPV18病毒的E6/E7基因的mRNA转录水平较低，提示HPV18病毒基因未整合进入人基因组中。以上实验结果与该样本为HPV18一过性感染，HPV18病毒基因未整合进入该样本基因组中的这一结论相符。
实施例六：本实施例运用实施例一公开的检测方法对已知HPV阴性临床样本细胞进行检测，以验证实施例一的病毒融合风险判定准确性，具体检测过程与实施例一和实施例二一致，所获实验结果如下：结合图6-1的qPCR扩增曲线示意图，该HPV阴性临床样本中靶标HPV16和HPV18均为检出；结合图6-2的RT-qPCR扩增曲线示意图，该HPV阴性临床样本中靶标HPV16和HPV18均为检出，无法计算ΔCT值。以上检测结果说明，该HPV阴性临床样本中HPV16/18病毒没有RNA转录，提示HPV16/18病毒基因未整合进入人基因组中。以上实验结果与该样本未被HPV16/18感染，HPV16/18病毒基因未整合进入该样本基因组中的这一结论相符。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，用于提示宫颈癌发生相关的HPV16/18基因人体基因组整合，包括样本采集与处理、冻干反应体系、基于POCT检测平台的DNA和mRNA检测及数据分析；
将宫颈刷采集的宫颈脱落细胞样本与A管中样本处理液混合处理；
所述反应体系包括：将处理后的样本分别与B1管中的冻干粉和B2管中的冻干粉溶解混匀，获得反应液管B1和B2；
将溶液试剂B1和溶液试剂B2分别转移至POCT仪器适配的反应管内，通过POCT仪器分别进行qPCR和RT-qPCR扩增反应；
扩增反应完毕后，POCT仪器分析扩增曲线并得出两个反应的CT值，CT1和CT2，两者相减获得ΔCT值；
通过将ΔCT值与临床样本检测结果分析所得截断值N进行比对，可评估待检样本中HPV16/18的E6/E7基因mRNA的转录水平，进而提示宫颈癌发生相关的HPV16/18的E6/E7基因是否整合进入人基因组。
2.根据权利要求1所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：
所述B1管中的冻干粉由HPV16/18病毒E6/E7基因(靶标)引物和探针、人源基因RNase P(内标)引物和探针、2×FastAmpli Premix-UNGⅣ(Probe qPCR)(DG)以及无酶水通过冻干程序冻干制得；
所述B2管中的冻干粉由HPV16/18病毒E6/E7基因(靶标)引物和探针、、人源基因RNaseP(内标)引物和探针、4x冻干保护液、12.5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix(with dNTP)(DG)、50×FastAmpli Part RTase(DG)、5×FastAmpli RT Buffer(dNTP free)(DG)和无酶水通过冻干程序冻干制得。
3.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：所述冻干程序包括：
S1：预冻；
S1.1：温度：4℃；时长：30min；状态：Hold；压强：1atm；
S1.2：温度：-50℃；时长：1℃/min；状态：降温；压强：1atm；
S1.3：温度：-50℃；时长：180min；状态：Hold；压强：1atm；
S2：一次升华；
S2.1：温度：-40℃；时长：1℃/min；状态：升温；压强：极限真空；
S2.2：温度：-40℃；时长：720min；状态：Hold；压强：极限真空；
S3：二次升华；
S3.1：温度：25℃；时长：1℃/min；状态：升温；压强：极限真空；
S3.2：温度：25℃；时长：300min；状态：Hold；压强：极限真空。
4.根据权利要求1所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：所述B1管及B2管内冻干粉溶解混匀方法为：
S1：将B1管和B2管分别进行瞬时离心；
S2：向B1管和B2管中分别加入25μL处理后的样本细胞悬液；
S3：混匀离心；
POCT平台的扩增反应方法为：
S3.1：温度：50℃；时间：10min；循环数：1；
S3.2：温度：95℃；时间：2.5min；循环数：1；
S3.3：温度：95℃；时间：3s；循环数：45；
S3.4：温度：60℃；时间：15s；循环数：45。
5.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：
所述HPV16引物包含HPV16 E6和HPV16 E7引物，其中HPV16 E6引物分为上游引物HPV16-E6-F与下游引物HPV16-E6-R；HPV16 E7引物分为上游引物HPV16-E7-F与下游引物HPV16-E7-R；HPV16探针包含HPV16-E6-P探针和HPV16-E7-P探针；
所述上游引物HPV16-E6-F序列：5'AATGTTTCAGGACCCACAGG3'；
所述下游引物HPV16-E6-R序列：5'GTTGCTTGCAGTACACACATTC3'；
所述上游引物HPV16-E7-F序列：5'TCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA3'；
所述下游引物HPV16-E7-R序列：5'GCACAACCGAAGCGTAGA3'；
所述HPV16探针HPV16-E6-P和HPV16-E7-P，都标记有FAM荧光基团；
所述HPV16-E6-P序列：FAM-5'ACCACAGTTATGCACAGAGCTGCA3'-MGB；所述HPV16-E7-P序列：FAM-5'AGAACCGGACAGAGCCCATTACAA3'-MGB。
6.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：
HPV18引物包含HPV18 E6和HPV16 E7引物，其中HPV18 E6引物分为上游引物HPV18-E6-F与下游引物HPV18-E6-R；HPV18 E7引物分为上游引物HPV18-E7-F与下游引物HPV18-E7-R；HPV16探针包含HPV18-E6-P探针和HPV18-E7-P探针；
所述上游引物HPV18-E6-F序列：5'ACCCTACAAGCTACCTGATCT3'；所述下游引物HPV18-E6-R序列：5'ACCTCTGTAAGTTCCAATACTGTC3'；所述上游引物HPV18-E7-F序列：5'AATTCCGGTTGACCTTCTATGT3'；
所述下游引物HPV18-E7-R序列：5'GGCTGGTAAATGTTGATGAT3'；
所述HPV18探针HPV18-E6-P和HPV18-E7-P，都标记有VIC荧光基团；
所述HPV18-E6-P序列：VIC-5'ACGGAACTGAACACTTCACTGCAAGA3
'-MGB；
所述HPV18-E7-P序列：VIC-5'TAAGCGACTCAGAGGAAGAAA3'-MGB。
7.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：
所述内标引物分为上游引物RP-F与下游引物RP-R；
所述上游引物RP-F序列：5'AGATTTGGACCTGCGAGCG3'；
所述下游引物RP-R序列：5'GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3'；
所述内标探针为RP-P，标记有ROX荧光基团；
所述RP-P序列：ROX-5'TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG3-MGB'。
8.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：所述HPV16/18引物和内标引物的终浓度为0.2-0.4μM，所述HPV16/18探针和内标探针的终浓度为0.1-0.2μM。
9.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：所述FastAmpli Premix-UNGⅣ(Probe qPCR)(DG)和FastAmpliPartTaq/UNG Mix(with dNTP)(DG)均包括相关酶、5-15mM的Tris-HCL、2-4mM的氯化钾、2.5-5mM的氯化镁和0.1-0.2mM的dNTPs。
10.根据权利要求9所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：所述相关酶为Taq酶和UNG酶，所述Taq酶的浓度为4-8U，所述UNG酶的浓度为8-12U。
11.根据权利要求2所述的一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法，其特征在于：所述FastAmpli Part RTase(DG)包括逆转录酶，所述逆转录酶的浓度为8-12U。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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