CN113171453A - 一种基于多孔铁基mof结构的放疗增敏材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于多孔铁基mof结构的放疗增敏材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料及其制备方法和应用。所述放疗增敏材料由负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL‑101(Fe)‑NH2纳米粒子组成；所述放疗增敏材料中葡萄糖氧化酶负载量为19.6～42.2μg/mg；优选地，所述多孔铁基MOF结构的MIL‑101(Fe)‑NH2纳米粒子的孔隙率为180～2500 m3/g。

Description

一种基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料及其制备方法和应用，属于纳米生物医学领域。
背景技术
在中国癌症已经成为疾病死因之首，其发病率和死亡率在逐年攀升，并且发病机制复杂多变。癌症治疗已经成为医学研究领域面临的巨大挑战。目前癌症治疗仍然以手术治疗、化学药物治疗和放射治疗三大治疗方式为主，其中放射治疗作为一种非侵入的肿瘤治疗手段，被广泛的应用于不同种类的肿瘤治疗中。但是，低剂量的射线对肿瘤治疗效果十分有限，提高射线的放射剂量又会增加其对正常器官和组织的损伤产生并发生症，使得临床治疗效果并不理想。因此，开发放疗增敏剂来提高高能射线对肿瘤的杀伤效果，同时减轻放射性损伤具有重大的研究意义。
放射治疗主要通过高能X-射线或γ射线直接与细胞DNA相互作用导致生物大分子损伤，或者间接作用于水分子产生活性氧(ROS)来破坏DNA或其他细胞成分，诱导细胞凋亡和坏死。通过利用能与肿瘤特异性结合的物质，放大射线对肿瘤细胞的杀伤效果，同时降低对周围正常组织的放射损伤是提高放疗疗效一条有效途径。目前，很多材料被证明具有放疗增敏的潜力。例如高原子序数的金属纳米材料与高能射线具有较强的相互作用，导致散射光子、光电子、俄歇电子的生成，继而产生ROS造成生物损伤。但是其生物相容性差，功能单一，极大的限制了其应用。
基于纳米材料增加肿瘤局部氧含量、提高肿瘤放疗效果在近几年也得到了广泛关注。葡萄糖是生命必需的能量供应源，是细胞新陈代谢的主要物质之一。葡萄糖氧化酶(GOx)具备催化葡萄糖分解产生H2O2的高效生物酶活性。因此可利用GOx的这种生物特性来催化肿瘤细胞处的葡糖糖分解生成内源性的H2O2用于放疗增敏。铁基多孔MOF材料是近年来兴起的一种金属有机骨架化合物,它具备特殊的骨架结构、内部孔道丰富以及生物降解性可调等优势，可将葡萄糖氧化酶利用酰胺化反应修饰在其表面。同时铁基多孔MOF材料中含有的不饱和的铁离子能够与产生的H2O2发生类芬顿反应产生活性氧，进而增强放射治疗效果。因此研发一种基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，使其具有良好的生物相容性、低的毒副作用和优异的肿瘤组织富集和渗透效率具有重要意义。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，该材料以Fe原子为金属中心，以2-氨基对苯二甲酸为有机配体，通过自组装形成的三维网络骨架有序多孔材料MIL-101(Fe)-NH2。所述的MIL-101(Fe)-NH2为大型笼状结构典型的介孔结构，具备良好的孔道结构、超高比表面、易功能化，以及孔隙限域功能，能够有效保持葡萄糖氧化酶的活性；所述放疗增敏材料能够消耗肿瘤细胞内源性能量葡萄糖，产生活性氧，同时提高射线对肿瘤细胞的杀伤效果，有望在未来的临床放射治疗癌症中发挥巨大的应用潜力。
第一方面，本发明提供了一种基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，所述放疗增敏材料由负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子组成；所述放疗增敏材料中葡萄糖氧化酶负载量为19.6～42.2μg/mg；所述多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的孔隙率为180～2500m3/g。
酶分子负载量少于上述范围时，会影响酶的活力，进而降低对葡萄糖的分解效率，而超过上述范围时，会造成葡萄糖氧化酶的泄露，此外实验过程中，该方法下得到的最大负载量为42.2μg/mg。
较佳的，所述负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的表面还包覆牛血清白蛋白(BSA)。装载葡萄糖氧化酶以后再包覆牛血清白蛋白能够降低特异性吸附，进而提高纳米粒子在肿瘤部位的滞留效率，此外包覆牛血清白蛋白还可以有效保护葡萄糖氧化酶的活性中心，防止在输运过程中造成酶的失活。
较佳的，所述的牛血清白蛋白与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比为：(1～1.5)：1。超过该范围会使得牛血清白蛋白的醛基过多的与葡萄糖氧化酶的氨基反应，导致酶活性降低，低于该范围又会将酶暴露出来，导致在输运过程中失活。
本发明提供的基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，其以多孔铁基MOF结构MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子为载体，具有晶体结构稳定、水热稳定性好、比表面积高，催化活性高，负载能力强的特点。
本发明以多孔铁基MOF结构MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子为载体、与负载的葡萄糖氧化酶和包覆的牛血清白蛋白组成基于MOF结构的放疗增敏材料。如图1所示，MIL-101(Fe)-NH2负载葡萄糖氧化酶(GOx)并包覆牛血清白蛋白(BSA)后得MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA。然后通过细胞的内吞作用将本发明制备的基于MOF的放疗增敏材料输运到肿瘤细胞内部，降低了非特异性吸附，提高纳米粒子在肿瘤区域的滞留效率。从而使得GOx能够催化肿瘤组织处的葡萄糖产生H2O2，MIL-101(Fe)-NH2中未饱和配位的Fe与原位生成的H2O2发生类芬顿反应产生ROS，与软X-射线联用后可进一步增强ROS的生成，进而杀死肿瘤细胞，因此该放疗增敏材料有望在未来肿瘤放射治疗领域发挥巨大的应用潜力。
较佳的，所述MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子中的Fe的价态在+2和+3价之间，粒径为80～300nm。
第二方面，本发明提供了一种上述放疗增敏材料(由负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子组成)的制备方法，包括：将铁源、2-氨基对苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)依次装入的水热反应釜中发生反应；将得到的产物分离、洗涤、干燥得到活化后的铁基MOF结构纳米粒子MIL-101(Fe)-NH2；将所得的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在超纯水中，加入葡萄糖氧化酶(GOx)，搅拌后离心收集产物；再经冷冻干燥后得到所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料。
本发明中采用溶剂热法也称水热法，将铁源、有机配体(2-氨基对苯二甲酸)和溶剂(DMF)装入密闭的反应器中，通过加热反应器使其产生高温高压的反应环境，使反应物溶解并重新结晶形成新的产物。金属铁离子作为Lewis酸，有机配体作为Lewis碱，溶剂在离湿条件下水解促使有机配体去质子化，推动Lewis酸－碱反应进行。本方法得到的产物MIL-101(Fe)-NH2的结晶度高且易控制粒径大小。
第三方面，本发明提供了一种上述放疗增敏材料(由负载葡萄糖氧化酶且包覆牛血清白蛋白的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子组成)的制备方法，包括：将铁源、2-氨基对苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)依次装入的水热反应釜中发生反应；将得到的产物分离、洗涤、干燥得到活化后的铁基MOF结构纳米粒子MIL-101(Fe)-NH2；将所得的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在超纯水中，先加入葡萄糖氧化酶(GOx)，再加入牛血清白蛋白，搅拌后离心收集产物；再经冷冻干燥后得到所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料。
较佳的，所述铁源选自FeCl3·H2O和Fe(NO3)3·9H2O中至少一种；所述铁源和2-氨基对苯二甲酸的摩尔比为1.6～2:1。
较佳的，所述在水热反应釜中发生反应的温度为80～150℃，时间为12～48h。
较佳的，所述活化所用的溶剂为甲醇、乙腈、丙酮或二氯甲烷中的至少一种。所述活化包括：MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在甲醇或丙酮或乙腈或二氯甲烷中，在40～60℃下搅拌12～48h进行溶剂交换，然后再用甲醇或丙酮洗涤，最后将所的产品在40-80℃的烘箱中干燥10～48h，目的在于除去MOF骨架和孔道中参与的溶剂分子和未反应的反应物分子。
较佳的，所述的葡萄糖氧化酶与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比：1:(4～8)。
第四方面，本发明提供了上述多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料在抗肿瘤药物中的应用。所述的多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料对肿瘤细胞具有杀伤效果。
较佳的，当MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA浓度为5μg/mL～10μg/mL时，肿瘤细胞存活率分为44.2％～49.4％；当MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA浓度增加至20μg/mL时，细胞存活率降低至13.8％，表现出优异的肿瘤细胞杀伤性能。
较佳的，软X-射线照射和所述多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料协同增强对肿瘤细胞的杀伤效果。
有益效果：
本发明的制备的基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料具有如下优势：①制备工艺简单，生物相容性好；②消耗肿瘤组织内源葡萄糖产生过氧化氢，阻断了肿瘤细胞的能量供应，达到饿死癌细胞的目的；③MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子稳定性好，比表面积高，能够与产生的过氧化氢发生原位类芬顿催化反应；④与软X-射线联用能够显著增强射线的肿瘤细胞杀伤能力。
附图说明
图1为本发明制备的负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的表面还包覆牛血清白蛋白的放疗增敏材料(MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA)的合成示意图。
图2为本发明实施例1中制备的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的特征图：图2中的a和b分别为MIL-101(Fe)-NH2和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的扫描电镜特征图；图2中的c为MIL-101(Fe)-NH2和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的XRD图。
图3为本发明实施例3中制得的MIL-101(Fe)-NH2-GOx中GOx的负载量。
图4为本发明实施例1中制得的MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA催化葡萄糖分解行为曲线图；图4中的a为标准曲线图，图4中的b为MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA(20μg/mL)分散在10mM葡萄糖溶液后的生成的H2O2浓度。
图5为本发明实施例5中不同浓度MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA分别对体细胞的杀伤效果图(图5中的a)和肿瘤细胞的杀伤效果图(图5中的b)。
图6为本发明实施例1中制得的MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA增强抗肿瘤效果图。
图7为本发明实施例8中铁源与2-氨基对苯二甲酸不同摩尔比制得的MIL-101(Fe)-NH2的XRD图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。应理解，以下附图和实施例用于说明本发明，而非限制本发明。
以下示例性说明本发明所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx的制备方法：
将铁源(例如，FeCl3·H2O或Fe(NO3)3·9H2O)与2-氨基对苯二甲酸依次装入含聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，迅速加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌均匀后密封，在80～150℃反应，12～48h。作为一个示例，所述的FeCl3·H2O或Fe(NO3)3·9H2O与2-氨基对苯二甲酸的摩尔比可为1.6～2:1。所述反应为水热反应，可在110℃下反应24h。
将水热后得到的产物离心分离，洗涤后的产物在，40～80℃烘箱中干燥，10～48h得到铁基MOF结构纳米粒子MIL-101(Fe)-NH2。作为一个示例，用乙醇洗涤后的产物可在40℃烘箱中干燥10h。
将MIL-101(Fe)-NH2分散在甲醇中，在40～60℃下搅拌12～48h后离心分离，产物用丙酮洗涤，40～80℃的烘箱中干燥10～48h得到活化后的MIL-101(Fe)-NH2。作为一个示例，所制备的MIL-101(Fe)-NH2分散在甲醇中40℃搅拌24h后离心分离，产物用丙酮洗涤，40℃烘箱中干燥10h得到活化后的MIL-101(Fe)-NH2。所述MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子活化过程中所用溶剂可为甲醇、乙腈、丙酮或二氯甲烷中的至少一种。
将MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在25mL超纯水中，搅拌均匀后加入葡萄糖氧化酶(GOx)，搅拌12～48h后离心收集产物，冷冻干燥后得到所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx。作为一个示例，所述超纯水的体积可为25mL。所述的葡萄糖氧化酶与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比可为1:4～8。所述搅拌的时间为24h。
本发明中将葡萄糖氧化酶(GOx)装载到MIL-101(Fe)-NH2中并包覆牛血清白蛋白(BSA)是关键环节。单独使用GOx抑制肿瘤效果十分不理想，并且在药物输运过程中会损伤血管和正常器官，本发明中采用MIL-101(Fe)-NH2孔道负载GOx并包覆BSA的方法实现GOx的输运。
以下示例性说明本发明所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的制备方法：
将FeCl3·H2O或Fe(NO3)3·9H2O与2-氨基对苯二甲酸依次装入含聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，迅速加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌均匀后密封，在80～150℃反应，12～48h。作为一个示例，所述的FeCl3·H2O或Fe(NO3)3·9H2O与2-氨基对苯二甲酸的摩尔比可为1.6～2:1。所述反应为水热反应，在110℃下反应24h。
将水热后得到的产物离心分离，洗涤后的产物在，40～80℃烘箱中干燥，10～48h得到铁基MOF结构纳米粒子MIL-101(Fe)-NH2。作为一个示例，用乙醇洗涤后的产物在40℃烘箱中干燥10h。
将MIL-101(Fe)-NH2分散在甲醇中，在40～60℃下搅拌12～48h后离心分离，产物用丙酮洗涤，40～80℃的烘箱中干燥10～48h得到活化后的MIL-101(Fe)-NH2。作为一个示例，室温搅拌24h后离心分离，产物用丙酮洗涤，40℃烘箱中干燥10h得到活化后的MIL-101(Fe)-NH2。所述MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子活化过程中所用溶剂可为甲醇、乙腈、丙酮或二氯甲烷中的至少一种。
将MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在超纯水中，搅拌均匀后加入葡萄糖氧化酶，再加入牛血清白蛋白，搅拌12～48h后离心收集产物，冷冻干燥后得到所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx。作为一个示例，所述超纯水的体积可为25mL。所述牛血清白蛋白与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比可为1～1.5:1。所述的葡萄糖氧化酶与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比可为1：4～8。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
所述实施例中用到的样品如下：
六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、九水合硝酸铁Fe(NO3)3·9H2O、葡萄糖从阿拉丁试剂有限公司购得，2-氨基对苯二甲酸(C8H7NO4)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)从国药集团化学试剂有限公司购得，牛血清白蛋白(BSA)从北京索莱宝生物有限公司购得，葡萄糖氧化酶(GOx)从上海百灵威化学技术有限公司购得，MTT以噻唑蓝的名称从sigma公司购得，DCFH-DA以2’,7’-二氯双氢荧光素二乙酸酯的名称从sigma公司购得。
实施例1
MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的制备：
0.675g FeCl3·6H2O(0.0025mol)和0.226g 2-氨基对苯二甲酸(0.00125mol)依次装入反应釜中(聚四氟乙烯内衬)，快速加入15mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)于上述反应釜中，搅拌均匀后密封，110℃反应24h。反应结束后离心收集产物，并分别用乙醇和去离子水洗涤产物三次，然后将洗涤后的产物置于40℃烘箱中10h得到制备的MIL-101(Fe)-NH2。MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的粒径在80～300nm。
实施例2
(1)MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的制备：
1.01g Fe(NO3)·9H2O和0.226g 2-氨基对苯二甲酸依次装入反应釜中(聚四氟乙烯内衬)，分别快速加入20，25，30mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)于上述反应釜中，搅拌均匀后密封，110℃反应24h。反应结束后离心收集产物，并分别用乙醇和去离子水洗涤产物三次，然后将洗涤后的产物置于40℃烘箱中10h得到制备的MIL-101(Fe)-NH2。MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的粒径范围在80～300nm。
(2)基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA纳米粒子的制备：
0.040g MIL-101(Fe)-NH2和5mg的GOx加入到25mL三次水中，搅拌均匀后加入0.050g BSA，搅拌24h后离心收集产物，冷冻干燥后得到MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA。
图2为本发明实施例1中制备的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的特征图：a和b分别为MIL-101(Fe)-NH2和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的SEM图片，图c为MIL-101(Fe)-NH2和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的XRD图。如图2中的a所示MIL-101(Fe)-NH2晶体尺寸均一，呈规整八面体结构，图2中的b所示制备的MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA颗粒大小稍有增加，但仍保持着相应的晶体结构。如图2中的c所示实验制备的MIL-101(Fe)-NH2与文献报道的标准XRD衍射图谱相一致，并且在装载连接GOx和表面修饰BSA后仍保持原来的晶体结构。
实施例3
MIL-101(Fe)-NH2-BSA的制备：
取实施例1中合成的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子0.040g，分散在25mL的三次水中，搅拌均匀后，加入0.050g BSA，搅拌24h后离心收集产物，冷冻干燥后得到MIL-101(Fe)-NH2-BSA。
实施例4
MIL-101(Fe)-NH2-GOx的制备：
取实施例1中合成的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子0.040g，分散在25mL的三次水中，搅拌均匀后，按照葡萄糖氧化酶与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子质量比为1:4，1:6，1:8，1:10，1:12，分别加入葡萄糖氧化酶10mg，6.7mg，5mg，4mg，3.3mg，搅拌24h后离心收集产物，冷冻干燥后得到MIL-101(Fe)-NH2-GOx。
采用荧光光谱法测定葡萄糖氧化酶的负载量。其方法如下：首先利用荧光探针FITC标记葡萄糖氧化酶，利用MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子后，利用荧光光谱仪测定FITC-GOx的发射光谱，进而获得葡萄糖氧化酶的负载量。
如图3所示，得到的MIL-101(Fe)-NH2-GOx负载葡萄糖氧化酶的含量在葡萄糖氧化酶与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子质量比为1:8时有最佳负载量。
实施例5
基于MOF的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA催化葡萄糖分解行为评价：
具体实施方式为采用草酸钛钾法测定MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA催化葡萄糖分解后产生的H2O2。取不同量100mg/L的H2O2溶液，再各加入H2SO4溶液和草酸钛钾溶液，5.0mL定容，静置10min后用UV-vis分光光度计在波长为400nm处测定吸光度。并以H2O2浓度为横坐标，吸光度变化值为纵坐标绘制一条标准曲线。随后称取0.8mg MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA分散在装有40mL去离子水的烧杯中，分散均匀后加入72mg葡萄糖，然后每隔特定的时间取1.0mL样品溶液，加入至含H2SO4溶液，草酸钛钾溶液和去离子水的混合液中，静置10min后用UV-vis分光光度计在波长为400nm处测定待测液的吸光度。依据所作的标准曲线即可得到样品溶液的H2O2浓度。
图4中的a为标准曲线图，b为MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA(20μg/mL)分散在10mM葡萄糖溶液后的生成的H2O2浓度；可以看出，2h后能产生0.17mM的H2O2，并且在4h内能保持较高的催化效率，分解葡萄糖的速度为0.22mg/min～0.26mg/min，持续不断地产生H2O2，这表明了GOx已经成功装载连接在MIL-101(Fe)-NH2上，并且保持着催化葡萄糖分解成H2O2的酶活性。
实施例6
基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA分别对正常细胞和肿瘤细胞的杀伤评价：
具体实施方式为采用MTT法：MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-2H-Tetrazolium Bromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基四氮唑噻唑蓝，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
体外测定MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA对小鼠体细胞(L929)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)的杀伤性。分别测定了L929和4T1细胞与含有不同浓度MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的培养基共培养后的细胞存活率。如图5中的(a)所示，当L929细胞与含不同浓度的MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的培养基共培养24h后，细胞存活率有明显不同。当MIL-101(Fe)-NH2-GOx浓度为5、10、20、40μg/mL时，L929的细胞存活率分别为59.4％、54.2％、21.9％、21.5％；而当MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA浓度为5、10、20、40μg/mL时，L929的细胞存活率分别为98.4％、87.0％、65.6％、64.8％；可以发现在低浓度时MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA对体细胞的毒性非常小，而MIL-101(Fe)-NH2-GOx对体细胞的毒性非常大。如图5中的(b)所示，当4T1细胞与含不同浓度的MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA培养基共培养24h后，细胞存活率均有明显的下降，当MIL-101(Fe)-NH2-GOx浓度为5、10、20、40μg/mL时，对应的4T1的细胞存活率为58.4％、54.2％、21.8％、21.7％；当MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA浓度为5、10、20、40μg/mL时，细胞存活率为49.4％、44.2％、13.8％、13.7％；MIL-101(Fe)-NH2-GOx对体细胞L929和肿瘤细胞4T1显示出了相似的杀伤力，而MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA表现出了对4T1细胞比体细胞L929更加显著杀伤作用。说明包覆BSA后能够稳定葡萄糖氧化酶，提高纳米粒子在肿瘤细胞的滞留效率，进而提高MIL-101(Fe)-NH2-GOx的抗肿瘤效果，同时能够降低对正常细胞的损伤。
实施例7
基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA分别协同软X射线对肿瘤细胞的杀伤性能评价：
具体实施方式为采用MTT法体外测定MIL-101(Fe)-NH2-GOx和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA分别协同软X射线对小鼠乳腺癌细胞(4T1)的杀伤性。分别测定了4T1细胞与不同浓度MIL-101(Fe)-NH2、MIL-101(Fe)-NH2-BSA和MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的细胞存活率，不同浓度MIL-101(Fe)-NH2-GOx与软X射线(60kV，6mA)联用后的细胞的存活率，以及不同浓度MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA与软X射线(60kV，6mA)联用后的细胞的存活率。
如图6所示MIL-101(Fe)-NH2和MIL-101(Fe)-NH2-BSA对4T1细胞没有杀伤作用，即使粉体浓度达到40μg/mL，细胞存活率都保持在90％以上。当4T1细胞与不同浓度的MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA共培养24h后，细胞存活率有了明显的下降。MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA表现出了对4T1细胞的显著杀伤作用。其中，在MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA浓度为5μg/mL和10μg/mL时，细胞存活率分别为49.4％和44.2％。当MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA浓度增加至20μg/mL时，细胞存活率降低至13.8％，表现出优异的肿瘤细胞杀伤性能。但是，当4T1细胞与MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA共培养并经软X射线辐照后，细胞存活率显著下降，即使MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA的浓度只有5μg/mL时，细胞存活率也降低到15.5％。而当4T1细胞只经软X射线辐照时，细胞存活率高达94.4％。从以上结果可以看出，低浓度的MIL-101(Fe)-NH2-GOx-BSA对软X射线具备显著的放疗增敏作用。
实施例8
不同配比的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的制备：
0.540g FeCl3·6H2O(0.002mol)和0.226g 2-氨基对苯二甲酸(0.00125mol)依次装入反应釜中(聚四氟乙烯内衬)，快速加入15mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)于上述反应釜中，搅拌均匀后密封，110℃反应24h。反应结束后离心收集产物，并分别用乙醇和去离子水洗涤产物三次，然后将洗涤后的产物置于40℃烘箱中10h得到制备的MIL-101(Fe)-NH2-1.6。
0.608g FeCl3·6H2O(0.00225mol)和0.226g 2-氨基对苯二甲酸(0.00125mol)依次装入反应釜中(聚四氟乙烯内衬)，快速加入15mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)于上述反应釜中，搅拌均匀后密封，110℃反应24h。反应结束后离心收集产物，并分别用乙醇和去离子水洗涤产物三次，然后将洗涤后的产物置于40℃烘箱中10h得到制备的MIL-101(Fe)-NH2-1.8。所得样品XRD图如图7所示。

Claims (11)

1.一种基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，其特征在于，所述放疗增敏材料由负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子组成；所述放疗增敏材料中葡萄糖氧化酶负载量为19.6～42.2 μg/mg；优选地，所述多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的孔隙率为180～2500 m3/g。
2.根据权利要求1所述的基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，其特征在于，所述负载葡萄糖氧化酶的多孔铁基MOF结构的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的表面还包覆牛血白蛋白；优选地，所述的牛血清白蛋白与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比为：（1～1.5）：1。
3.根据权利要求1或2所述的基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料，其特征在于，所述MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子中的Fe的价态在+2和+3价之间，粒径为80～300 nm。
4.一种权利要求1所述的基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料的制备方法，其特征在于，包括：
将铁源、2-氨基对苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺依次装入的水热反应釜中发生反应；
将得到的产物分离、洗涤、干燥得到活化后的铁基MOF结构纳米粒子MIL-101(Fe)-NH2；
将所得的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在超纯水中，加入葡萄糖氧化酶，搅拌后离心收集产物；
再经冷冻干燥后得到所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料。
5.一种权利要求2所述的基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料的制备方法，其特征在于，包括：
将铁源、2-氨基对苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺依次装入的水热反应釜中发生反应；
将得到的产物分离、洗涤、干燥得到活化后的铁基MOF结构纳米粒子MIL-101(Fe)-NH2；
将所得的MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子分散在超纯水中，加入葡萄糖氧化酶，再加入牛血清白蛋白，搅拌后离心收集产物；
再经冷冻干燥后得到所述基于多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述铁源选自FeCl3·H2O和Fe(NO3)3·9H2O中至少一种；所述铁源和2-氨基对苯二甲酸的摩尔比为1.6～2:1。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述在水热反应釜中发生反应的温度为80～150℃，时间为12～48h。
8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述活化所用的溶剂为甲醇、乙腈、丙酮或二氯甲烷中的至少一种。
9.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶与MIL-101(Fe)-NH2纳米粒子的质量比：1:(4～8）。
10.一种权利要求1或2所述的多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料对肿瘤细胞具有杀伤效果。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，软X-射线照射和所述多孔铁基MOF结构的放疗增敏材料协同增强对肿瘤细胞的杀伤效果。
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