CN114246870B - MIL-101(Fe)-T705及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于材料合成技术领域，具体涉及一种MIL‑101(Fe)‑T705及其制备方法和应用。本发明的MIL‑101(Fe)‑T705以对苯二甲酸、六水氯化铁和法匹拉韦为原料，以N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，采用溶剂热合成法制备而成；所述MIL‑101(Fe)‑T705的六孔结构空隙被填满，法匹拉韦以颗粒形式吸附在MIL‑101(Fe)上。本发明利用MOF材料的表面积大的特点，作为药物载体结合药物法匹拉韦，形成新型纳米材料合成物MIL‑101(Fe)‑T705，通过实验证明其有很好的体外抗金黄色葡萄球菌和流感病毒效果。本发明为更好的对抗临床关于细菌抗生素的耐药问题提供了一种新思路。

Description

MIL-101(Fe)-T705及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于材料合成技术领域，具体涉及一种MIL-101(Fe)-T705及其制备方法和应用。
背景技术
随着纳米材料研究的兴起，纳米技术作为医药领域新方向为临床细菌病毒等引起的复杂疾病的治疗开辟了道路。首先，MIL-101(Fe)作为一种经典的羧酸类MOF，易于制备，具有稳定的化学结构；其次作为基底材料，拥有过氧化物酶活性能有效催化H2O2的还原反应；含有的羧酸配体残基可作为活性位点，用于药物载体的共价固定，能构建稳定的传感界面。法匹拉韦作为一种核苷类抗流感病毒药物，除流感病毒外，该药还对多种RNA病毒展现出良好的抗病毒活性作用，如埃博拉病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、狂犬病毒等。最新研究表明，法匹拉韦对新型冠状病毒肺炎也有一定的抑制作用。然而，目前尚未有将MIL-101(Fe)与药物法匹拉韦相结合更好的对抗临床关于细菌抗生素的耐药问题的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种MIL-101(Fe)-T705及其制备方法和应用。本发明将MIL-101(Fe)与药物法匹拉韦相结合能够更好的对抗临床关于细菌抗生素的耐药问题。
本发明的技术方案是：
一种MIL-101(Fe)-T705，以对苯二甲酸、六水氯化铁和法匹拉韦为原料，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，采用溶剂热合成法制备而成；所述MIL-101(Fe)-T705的六孔结构空隙被填满，法匹拉韦以颗粒形式吸附在MIL-101(Fe)上。
进一步地，所述MIL-101(Fe)-T705的制备方法包括以下步骤：
称取对苯二甲酸和六水氯化铁，置于容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，超声使之分散均匀，加入法匹拉韦，继续超声，倒入反应釜中，置于烘箱中反应一定时间，反应釜冷却至室温后，取出；吸去上清，沉淀用乙醇溶解，溶解液吸出放入离心管，离心管配平离心，吸出上清液，沉淀用乙醇重复洗涤3次，最后用乙醇稀释倒入玻璃培养皿中，干燥，即得。
进一步地，对苯二甲酸、六水氯化铁、N,N-二甲基甲酰胺和法匹拉韦的用量比为1.5-1.8g：0.6-0.9g：12-16mL：0.01-0.03g。
进一步地，法匹拉韦的质量为对苯二甲酸和六水氯化铁总质量的0.2-1％。
进一步地，法匹拉韦的质量为对苯二甲酸和六水氯化铁总质量的0.8％。
进一步地，加入N,N-二甲基甲酰胺，超声使之分散均匀，超声功率为120W，超声时间为12-18min。
进一步地，加入法匹拉韦，继续超声，超声功率为120W，超声时间为15-25min。
进一步地，置于75-155℃烘箱中反应17-22h。
本发明的另一目的在于提供所述的MIL-101(Fe)-T705在制备抗菌、抗病毒药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明利用MOF材料的表面积大的特点，作为药物载体结合药物法匹拉韦，形成新型纳米材料合成物MIL-101(Fe)-T705，通过实验证明其有很好的体外抗金黄色葡萄球菌和流感病毒效果。
(2)本发明将MIL-101(Fe)与药物法匹拉韦相结合，为更好的对抗临床关于细菌抗生素的耐药问题提供了一种新思路。
附图说明
图1MIL-101(Fe)的合成路线图；
图2MIL-101(Fe)-T705的合成路线图；
图3为MIL-101(Fe)、T-705、MIL-101(Fe)-T705的X射线衍射图谱；
图4为T705、MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)的傅立叶红外光谱图；
图5为MIL-101(Fe)、MIL-101(Fe)-T705的扫描电镜图；
图6为MIL-101(Fe)-T705中各个元素的EDS mapping图；
图7为MIL-101(Fe)-T705的EDAX光谱；
图8为MIL-101(Fe)-T705的XPS全谱图及O1s、C 1s、Fe 2p、F 1s、N 1轨道的XPS谱图；
图9为MIL-101(Fe)-T705的N2吸附/脱附等温曲线图；
图10为MIL-101(Fe)-T705的孔径分布图；
图11为MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)、T705的紫外吸收光谱图；
图12为不同温度下制备得到的MIL-101(Fe)-T705的紫外吸收光谱图；
图13为不同浓度法匹拉韦条件下制备得到的MIL-101(Fe)-T705的紫外吸收光谱图；
图14为MIL-101(Fe)-T705的热重分析曲线图；
图15为MIL-101(Fe)-T705的Zeta电位分布图；
图16为MIL-101(Fe)-T705的粒径分布图；
图17为不同浓度MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)、T705对金黄色葡萄球菌存活率的影响；
图18为不同浓度的MIL-101(Fe)-T705的最小抑菌浓度；
图19为不同浓度的MIL-101(Fe)-T705的最小杀菌浓度；
图20为不同浓度的MIL-101(Fe)-T705对金黄色葡萄球菌的24h抑制生长曲线图；
图21为MIL-101(Fe)-T705与MDCK细胞共培养12h、24h、48h、72h后细胞的存活率；
图22为不同浓度MIL-101(Fe)-T705病毒滴度比较
图23为不同浓度MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)、T-705的病毒滴度对比；
图24为不同浓度的MIL-101(Fe)-T705与流感病毒共培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后的病毒滴度生长曲线；
图25为不同浓度的MIL-101(Fe)-T705病毒滴度结合Ct值比较。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、MIL-101(Fe)的合成
采用溶剂热合成法制备MIL-101(Fe)，MIL-101(Fe)的合成路线如图1所示。称取1.714g对苯二甲酸(H2BDC/C8H6O4)和0.824g六水氯化铁(Fecl3·6H2O)，置于容器中，加入15mL N,N-二甲基甲酰胺，超声使之分散均匀，超声功率为120W，超声时间为15min。然后倒入反应釜(聚四氟乙烯内衬)中，置于150℃烘箱中反应20h。反应釜冷却至室温后，取出。此时可见上清澄清，底部红棕色沉淀。随后小心吸除上清，沉淀用乙醇溶解。沉淀的溶解液吸出放入15mL离心管并标记。离心管配平离心(10000r/min，10min)，用乙醇洗涤重复3次，直到上清变澄清透明。最后用乙醇稀释倒入玻璃培养皿中，置于110℃烘箱中干燥8h，即得。
实施例2、MIL-101(Fe)-T705的合成
采用溶剂热合成法制备MIL-101(Fe)-T705，MIL-101(Fe)-T705的合成路线如图2所示。称取1.714g对苯二甲酸(H2BDC/C8H6O4)和0.824g六水氯化铁(Fecl3·6H2O)，置于容器中，加入15mL N,N-二甲基甲酰胺，超声使之分散均匀，超声功率为XX，超声时间为15min。然后加入0.020g的法匹拉韦，继续超声，超声功率为120W，超声时间为20min。然后倒入反应釜(聚四氟乙烯内衬)中，置于150℃烘箱中反应20h。反应釜冷却至室温后，取出。此时可见上清透明，底部有沉淀，吸去上清，沉淀用等量乙醇(15mL)溶解。溶解液吸出放入离心管。离心管配平离心(10000r/min，10min)，吸出上清液用15mL离心管分装并标记。沉淀用乙醇重复洗涤3次。最后用乙醇稀释倒入玻璃培养皿中，置于110℃烘箱中干燥8h，即得。
试验例一、纳米材料的表征
1、XRD图谱分析
使用RigakuUltima IV衍射系统通过Cu Kα辐射记录样品在2θ范围内(5～50°)的X射线衍射图(XRD)。图3为MIL-101(Fe)、T-705、MIL-101(Fe)-T705的X射线衍射图谱。由图3可知，MIL-101(Fe)在衍射角2θ＝8.92°，9.26°，15.57°，18.72°，21.91°出现明显衍射特征峰。由相关文献可知，MIL-101(Fe)在2θ＝5-25°有明显特征峰，与JCPDS卡片数据库匹配，表明自制的样品为MIL-101(Fe)。
同时，从CSD晶体数据库获得的法匹拉韦(T-705)X射线衍射图谱可以看出，MIL-101(Fe)-T705的2θ＝24.11°，25.02°，27.87°，29.58°，33.11°，35.04°，35.61°，38.12°，40.91°分别与T-705的衍射峰相对应。因此由以上结果可以得出MIL-101(Fe)和T-705成功合成了MIL-101(Fe)-T705。
2、红外光谱检测
采用Bruker ALPHAII光谱仪记录样品在波长范围为500-4000cm-1的傅里叶变换红外(FT-IR)光谱图。红外光谱的整个范围分为4000-1300cm-1和1300-600cm-1两个区域。4000-1300cm-1范围之内可以反映官能团和化学键的特征性伸缩振动。而1300-600cm-1内，除去上述提到的之外，还会有环境未知因素等产生的叠加效应，这被称之为指纹区。这部分并不能完全解释清楚，因此大多用来对比。
图4为T705、MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)的傅立叶红外光谱图(FTIR)。由图4可知，在T-705样品的FTIR中，位于3200cm-1和1660cm-1的吸收峰是特征峰-NH2和C＝O的存在。而1057cm-1处是T-705内咪唑基所特有的特征峰，而由于含有咪唑基团，T-705又属于芳杂环化合物，在1596cm-1，1558cm-1，1465cm-1，1431cm-1处出现芳香化合物所特有的强度不等的4个特征峰。MIL-101(Fe)呈现了完全不同的特征峰，在722cm-1，1013cm-1，1275cm-1，1383cm-1，1504cm-1，1688cm-1处出现吸收峰。722cm-1处特征峰主要来源于苯环中C-H键的振动，1383cm-1和1504cm-1则可以解释为羧基-COOH的对称和非对称振动，1688cm-1处的特征峰是与自由羧基中存在的C＝O键相关，表明了连续二羧基相连。在MIL-101(Fe)-T705的FTIR中，出现了位于727cm-1，776cm-1，1013cm-1，1280cm-1，1392cm-1，1509cm-1，1679cm-1的MIL-101(Fe)特征吸收峰，同时也出现了1606cm-1，1572cm-1，1509cm-1，1426cm-1的T-705芳杂环特征峰，进一步证明MIL-101(Fe)存在T-705，证明合成了MIL-101(Fe)-T705。
3、形貌表征
在200eV-30kev的加速电压下，采用扫描电子显微镜(SEM,TESCAN Mira4)观察样品MIL-101(Fe)、MIL-101(Fe)-T705的形貌、形状和尺寸，见图5。扫描电镜有很高的分辨率，景深在相同放大倍数下远大于光学显微镜，能够很直观的观察到物质的立体结构。从图5(a)、5(b)可以看到，MIL-101(Fe)呈现六孔立体结构，均匀分散，结合上述XRD结果，认为MIL-101(Fe)合成成功。从图5(c)、5(d)、5(e)、5(f)可以看到，法匹拉韦以球形形态牢牢的吸附在六孔结构内。随后本发明通过EDAX和元素映射进行了深入研究，从图6、图7中可以清楚地看出，MIL-101(Fe)-T705中存在C、N、O、F、Cl、Fe等元素，C、O和Fe等元素分布代表以三价铁为中心的MIL-101(Fe)骨架的建立，而F和N等元素分布表明法匹拉韦粒子以圆球形态镶嵌在骨架之上。这与上述XRD结果一致，进一步证明了MIL-101(Fe)-T705纳米复合物的合成。
4、XPS检测
利用Al Kα辐射，利用Thermo fisher Scientific K-Alpha+x射线光电子能谱仪(XPS)对MIL-101(Fe)-T705的化学成分、化学价态和价带进行了分析。为了进一步研究复合物的表面化学组成和化学价态，通过XPS检测对MIL-101(Fe)-T705复合材料中含有的元素及化学构成进行了分析。图8(A)给出了MIL-101(Fe)-T705的全谱图，可以看出MIL-101(Fe)-T705主要是由C、O、Fe、Cl、F、N这几种元素组成。图8(B-F)显示了O1s、C 1s、Fe 2p、F1s、N 1s。O1s中结合能位于532.62eV和532.43eV的两个特征峰分别对应于T-705，MIL-101(Fe)中的C＝O和Fe-O。C1s的高分辨率被分为三个峰，285.53eV的特征峰对应于T-705的C-N，284.05eV和288.33eV的两个特征峰分别归属于MIL-101(Fe)中有机配体对苯二甲酸上的苯环和羧酸基团。在Fe2p的高分辨谱中，其结合能位于710.36eV和726.13eV处分别对应于Fe(III)的Fe2p1/2和Fe2p3/2峰，而结合能于713.11eV和717.33eV的特征峰证实了材料中存在游离态的三价铁离子。此外，F1s和N1s的XPS高分辨谱也进一步说明了MIL-101(Fe)-T705中氮元素和氟元素的存在。
5、比表面积测定
Brunauer-Emmett-Teller(BET)的表面积和孔结构通过N2(77.4K)吸附-解吸实验在Micromeritics ASAP 2020v4.03上进行评估。为了估算比表面积，本发明采用了BET方法分析了MIL-101(Fe)和MIL-101(Fe)-T705的孔体积和孔径，得到的N2吸附/脱附等温曲线如图9所示。由图9可知，MIL-101(Fe)表现出典型的IV型氮气吸附-脱附曲线，说明其是多孔材料，而MIL-101(Fe)-T705曲线几乎没有变化，再结合相应的孔径分布图10和表1可以看出，MIL-101(Fe)的比表面积为199.7194m2 g-1，孔径为2.33771nm，MIL-101(Fe)-T705的比表面积为1.7382m2g-1，孔径为20.20013nm。因此，在引入T-705后，MIL-101(Fe)-T705的比表面积和孔容缩小，孔径增大，这认为是T-705颗粒填充MIL-101(Fe)的空隙而引起的。
表1：MIL-101(Fe)和MIL-101(Fe)-T705的比表面积、孔径和孔体积测试结果
样品 比表面积(m2 g-1) 孔径(nm) 孔体积(cm3 g-1)
MIL-101(Fe) 199.7194 2.33771 0.116722
MIL-101(Fe)-T705 1.7382 20.20013 0.008778
6、紫外可见光光谱比较
采用日立U-3010型紫外-可见漫反射分光光度计(UV-vis DRS)，以DMSO为参考，测量紫外-可见吸收光谱。图11为MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)、T705的紫外吸收光谱图。反应温度对纳米材料的合成有着非常重要的影响。如图12所示，随着反应温度的不断增加，特征峰发生蓝移，75℃和100℃制备得到的MIL-101(Fe)-T705特征吸收峰在284nm，150℃特征峰蓝移至278nm处。而且随着温度的不断增加，纳米颗粒吸收峰的半峰宽也逐渐缩小变窄，可以解释为150℃时得到的纳米粒径均一分散性较好。
还原剂的种类和用量在纳米材料合成中起到了至关重要的作用，因此考察法匹拉韦的用量对制备MIL-101(Fe)-T705的影响。本实验以二甲基亚砜(DMSO)做参照物，将合成物MIL-101(Fe)-T705溶于DMSO中用紫外可见分光光度计进行测定，得到紫外可见光光谱。
本实验以合成MIL-101(Fe)的基底物H2BDC和FeCl3·6H2O总量为标准，在此总量基础之上分别加入其含量的0.1％，0.2％，0.4％，0.8％，1％的T-705。之后进行合成，合成物分别命名为0.1％，0.2％，0.4％，0.8％，1％MIL-101(Fe)-T705。
由图13可知，MIL-101(Fe)-T705在波长200-350nm区间的紫外光区间有显著的吸收。在0.1％MIL-101(Fe)-T705处，半峰宽最窄，随着T-705的浓度不断加大，半峰宽不断增加，直到在0.8％MIL-101(Fe)-T705处，可以看到此时吸收峰最高。但到1％MIL-101(Fe)-T705处已没有明显吸收峰。这可以解释为一开始由于T-705量太少，MIL-101(Fe)的孔结构并没有完全充满，图只表现了MIL-101(Fe)的紫外吸收特点。同样的，1％可以解释为因为T-705的浓度不断加大，使得MIL的孔结构负载，所结合的粒径大小并不均匀。因此，得出结论，0.8％浓度的T-705较为合适于与MIL-101(Fe)结合成为MIL-101(Fe)-T705。
7、热重分析
热重分析(TGA)在NETZSCH STA 2500仪器上进行，目标温度为800℃，升温坡降为10℃min-1，空气流速为100mL min-1。MIL-101(Fe)-T705在空气中的热重分析(TGA)曲线如图14所示。MIL-101(Fe)-T705有一个非常明显的分解阶段，热分解率在75％左右。当温度在300℃左右时，MIL-101(Fe)-T705开始分解，当温度达到420℃时，质量不再变化，此时MIL-101(Fe)-T705已全部分解，主要原因是高温条件会导致MIL-101(Fe)-T705骨架中的羟基脱落，骨架坍塌。
8、Zeta电位测定
Zeta电位采用Malvern Zetasizer Nano ZS90仪器测试。本发明还对MIL-101(Fe)-T705进行了Zeta电位测定，MIL-101(Fe)-T705的Zeta电位分布图如图15所示。一般来说，Zeta电位绝对值越高，粒子间的静电斥力越大，体系不易沉降凝集，越稳定。由图15可知，MIL-101(Fe)-T705的平均电位在15.8±4.79mV左右，纳米材料表面带正电荷，具有一定的稳定性。
9、粒径分布测定
粒度分布采用Malvern Zetasizer Nano ZS90仪器测试。本发明还对MIL-101(Fe)-T705进行了粒径分布测定，MIL-101(Fe)-T705的粒径分布图如图16所示。由图16可知，MIL-101(Fe)-T705的粒径分布在200-500nm之间，平均粒径为377.4±4.89nm，多分散指数(dpi)＝0.35，分散较为均匀。
试验例二、MIL-101(Fe)-T705体外抗菌实验
1、细菌存活率测定
1.1、细菌培养
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus,ATCC 25923)由广东药科大学叶小华老师所赠。取-80℃冰箱保存的标准菌株，在LB琼脂平板采用划线法于37℃培养箱内培养24h进行细菌的第一代活化，待细菌长出后挑取单菌落进行第二代活化，当细菌到达对数生长期后，用接种环挑取平板上的单菌落溶于生理盐水中，混匀后用标准比浊法进行比浊，获得1×108CFU/mL的细菌悬液，稀释100倍得到1×106CFU/mL(CFU：colony formingunit)的细菌悬液，备用。
1.2、实验过程：
取1×106CFU/mL的细菌悬液平均分成6等份(EP管，100μL)，然后分别加入100μL一系列浓度(0.0002，0.0004，0.0008，0.0016，0.0032g/mL)的MIL-101(Fe)-T705在37℃水浴摇床中(120r/min，24h)振荡(每孔200μL加入96孔板中，做好标记)，酶标仪测定OD600计算细菌存活率。
1.3、实验条件：酶标仪测定600nm处的吸光度值。
1.4、实验结果：
不同浓度MIL-101(Fe)-T705、MIL-101(Fe)、T705对金黄色葡萄球菌存活率的影响如图17所示。由图17可以看出，对于金黄色葡萄球菌，随着MIL-101(Fe)和MIL-101(Fe)-T705用量的不断增大，细菌的存活率呈现逐渐下降的趋势。纳米材料的浓度严重影响纳米材料的性质，所以我们分析了不同浓度对于细菌存活率的影响，而且浓度越大的纳米材料对S.aureus抑制作用越明显。
由图17可看出，随着浓度不断增大，药物法匹拉韦(T-705)对细菌并无明显抑制作用，相反，随着MIL-101(Fe)和MIL-101(Fe)-T705用量不断增加，对S.aureus的抑制效果越明显，且合成物MIL-101(Fe)-T705抑制效果明显高于MIL-101(Fe)。对S.aureus来说，0.008g/mL的MIL-101(Fe)-T705作用后细菌存活率在70％左右，0.0016g/mL的MIL-101(Fe)-T705作用后细菌存活率在25％左右，但当浓度提升到0.0032g/mL(3.2mg/mL)时，MIL-101(Fe)-T705作用后的S.aureus不生长。因此可以总结得出MIL-101(Fe)-T705有一定抗菌活性，且0.0032g/mL(3.2mg/mL)浓度为最佳。
采用最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)作为MIL-101(Fe)-T705抗菌能力衡量指标。MIC指的是抑制细菌出现明显增长所需的最小抗菌剂浓度，MBC是指在一定条件下绝大细菌被杀死的最低浓度。MIC值越小，表明其抑制细菌生长的能力越强；MBC越小，表明杀菌能力越强。
2、最小抑菌浓度的测定
2.1、实验过程：
取6只EP管，编号。取6号作为空白对照组。1-5号分别加入900μL含MIL-101(Fe)-T705(浓度为0.0002，0.0004，0.0008，0.0016，0.0032g/mL)的LB培养液。6号加入900μL纯LB培养基。再在6只管中分别加入100μL的1×106CFU/mL的细菌(金黄色葡萄球菌)悬液，摇匀之后放于37℃摇床中(120r/min，24h)。培养液澄清透明的试管对应的最小浓度为该纳米颗粒对该种细菌的最小抑菌浓度(MIC)。
2.2、实验结果：
结果如图18所示，本发明考察了不同浓度的MIL-101(Fe)-T705对S.aureus的MIC，肉眼可见细菌培养液澄清透亮的EP管对应的MIL-101(Fe)-T705的浓度即为该材料的MIC。MIL-101(Fe)-T705的最小抑菌浓度为0.008g/mL。
3、最小杀菌浓度的测定
取MIL-101(Fe)-T705最小抑菌浓度对应的稀释度的试管和该稀释度上下两个稀释度对应的试管中取100μL进行涂板，将平放在37℃恒温培养箱中培养24h，观察生长情况，菌落数小于5或没有细菌生长的平板对应的材料浓度为MIL-101(Fe)-T705对应该细菌的最小杀菌浓度(MBC)。结果如图19所示，最小杀菌浓度为0.0032g/mL。
4、抑菌生长曲线的测定
4.1、实验过程：
考察不同浓度的MIL-101(Fe)-T705/MIL-101(Fe)的抑制细菌(革兰阳性金黄色葡萄球菌)生长曲线。取酶标板，每孔加入100μL的1×108CFU的细菌。再在每孔各加入MIL-101(Fe)-T705/MIL-101(Fe)(0，0.0002，0.0004，0.0008，0.0016，0.0032g/mL)100μL(溶解在pH7.4的PBS中)。3复孔。最后一孔为调零孔，该孔只有含相应各浓度的MIL-101(Fe)-T705的PBS，无菌液存在。设置空白对照组，纯PBS+等量菌液，无合成材料。将96孔板放入37℃培养箱中培养，24h中每小时拿出摇匀，用酶标仪测定其OD600值。以培养时间为横坐标，600nm处吸光度值为纵坐标，绘制细菌生长曲线。
4.2、实验条件：酶标仪上测定600nm处的吸光度值。
4.3、实验结果：
不同浓度的MIL-101(Fe)-T705对金黄色葡萄球菌的24h抑制生长曲线图如图20所示。对于MIL-101(Fe)-T705来说，对照组的S.aureus在5h后进入对数生长期，培养至15h后细菌生长进入平台期。当MIL-101(Fe)-T705的用量为0.002g/ml时，抑制生长曲线与S.aureus的生长曲线相似，但随着MIL-101(Fe)-T705的浓度逐渐增大，抑制生长曲线逐渐趋于平缓，尤其是在MIL-101(Fe)-T705的浓度在0.008g/mL和0.016g/mL时，15h后的生长曲线基本处于水平状态，细菌不再生长。而当MIL-101(Fe)-T705的浓度为0.032g/mL时，曲线呈现一条水平线，基本可以完全抑制细菌生长。
试验例三、MIL-101(Fe)-T705体外抗流感病毒实验
1、MIL-101(Fe)-T705的生物安全性
1.1、实验过程：
将MDCK细胞以1×105个/孔的密度100μL接种于96孔板中，37℃培养箱培养24h。MIL-101(Fe)-T705(0.0001，0.0002，0.0004，0.0008，0.0016，0.003mg/mL)进行对半梯度稀释100μL，加入细胞成层良好的96孔板中(直接加不必吸除原液)，并设置正常细胞对照组。6复孔。分别培养12，24，48，72h。(准备3个孔板)弃去旧培养液，PBS洗板一次，每孔加入10μLMTT试剂和90μLDMEM培养基。37℃培养0.5-1h。酶标仪测定490nm处吸光度值。计算细胞在不同浓度的MIL-101(Fe)-T705存在下的细胞存活率。
1.2、实验结果：
纳米材料在应用于生物体系中，最重要的一点就是要有良好的生物相容性。因此我们考察了MIL-101(Fe)-T705在MDCK细胞中的细胞毒性。如图21所示，在实验考察的一系列浓度范围内，MIL-101(Fe)-T705与MDCK细胞共培养12h，24h，48h，72h之后，与对照组MDCK细胞(不含任何纳米材料)相比，存活率并无统计学意义，证明MIL-101(Fe)-T705不产生细胞毒性，在生物体系研究中有很大潜力。
2、病毒滴度测定
2.1、实验过程：
使用半数组织培养物感染剂量(TCID50)测定流感病毒的病毒滴度，衡量病毒毒力。先将流感病毒PBS进行100倍稀释，准备8个1.5mL的EP管，每个管中加入900μL的维持液(含2％FBS)。在第一个管中加入100μL的已稀释100倍的病毒液，然后连续递次稀释为10-1-10-8。将各浓度稀释好的流感病毒加入至成层良好含MDCK细胞的96孔板中，8复孔，每孔接种100μL。35℃下培养箱培养1.5h后，小心吸出混合液，加入200μL维持液(含2％FBS)继续培养，均为8复孔。并设置正常细胞对照组。每天观察细胞病变，记录病变程度和孔数，细胞不再病变之后记录结果(5-7天)。细胞病变变小于50％的培养孔记为非病变孔，大于50％以上的培养孔记为病变孔。根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
2.2、实验结果：
2.3.1、不同含量MIL-101(Fe)-T705病毒滴度比较：
如图22所示，在分别加入所设置不同浓度的MIL-101(Fe)-T705之后，进行TCID50测定均与病毒对照组有统计学差异，证明MIL-101(Fe)-T705在一定浓度范围内可有效抑制流感病毒。
2.3.2、不同含量MIL-101(Fe)-T705，MIL-101(Fe)，T-705的病毒滴度对比
在上述基础之上，如图23所示，又分别比较了加入了不同浓度的MIL-101(Fe)，T-705，MIL-101(Fe)-T705之后的病毒毒力，MIL-101(Fe)-T705与其他两组在不同浓度上均有统计学差异，证明了MIL-101(Fe)-T705抗流感病毒的优越性。
3、流感病毒生长曲线的测定
3.1、实验过程：
将细胞计数并铺于6孔板，1×106/孔，37℃，5％CO2培养24h，3复孔。弃去生长液，每孔加入2mL PBS洗涤2次。用DMEM以MOI＝0.001稀释病毒。每孔加入800μL病毒液，35℃，5％CO2孵育1h，吸附结束，吸出病毒液，PBS洗涤1次，加入含有不同浓度MIL-101(Fe)-T705的病毒维持液，培养箱继续培养。在感染12，24，36，48，72h后收集上清液，-80℃保存。之后对不同时间收集的上清液进行TCID50测定。
3.2、实验结果：
如图24所示，不同浓度的MIL-101(Fe)-T705在一定程度上可以降低流感病毒的毒力。与病毒对照组相比，在加入0.1，0.2，0.4μg/mL的MIL-101(Fe)-T705经过24h之后，毒力上升，无明显抑制作用。但在加入0.8，1.6，3.0μg/mL的MIL-101(Fe)-T705之后直至72h，毒力没有变化，有明显抑制流感病毒的能力。
4、荧光定量PCR的测定
4.1、实验过程：
准备24孔板，1×105/孔，37℃，5％CO2孵育培养24h。DMEM以MOI＝0.001稀释病毒。吸出生长液，PBS洗涤2次，每孔加入稀释好的病毒200μL，35℃，CO2孵育1h。用病毒维持液稀释MIL-101(Fe)-T705为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3μg/mL。病毒吸附结束之后，吸出病毒液，加入含不同浓度MIL-101(Fe)-T705的病毒维持液，3复孔，35℃，5％CO2孵育24h。收集上清，-80℃保存。将保存的病毒液反复冻融三次。按照试剂盒的提取A,B,C法，提取核酸配液，用ABI7500仪器进行测定。
4.2、实验结果：
通过荧光定量PCR计算24h时各浓度对应Ct值，结合上文不同含量MIL-101(Fe)-T705病毒滴度结果进行作图。
如图25所示，在结合荧光定量PCR结果之后，实验设置范围内的MIL-101(Fe)-T705浓度均与病毒对照组有显著性差异，进一步证实了MIL-101(Fe)-T705对流感病毒优良的抑制作用。

Claims (7)

1.一种MIL-101(Fe)-T705，其特征在于：以对苯二甲酸、六水氯化铁和法匹拉韦为原料，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，采用溶剂热合成法制备而成；所述MIL-101(Fe)-T705的六孔结构空隙被填满，法匹拉韦以颗粒形式吸附在MIL-101(Fe)上；
所述MIL-101(Fe)-T705的制备方法包括以下步骤：
称取对苯二甲酸和六水氯化铁，置于容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，超声使之分散均匀，加入法匹拉韦，继续超声，倒入反应釜中，置于烘箱中反应一定时间，反应釜冷却至室温后，取出；吸去上清，沉淀用乙醇溶解，溶解液吸出放入离心管，离心管配平离心，吸出上清液，沉淀用乙醇重复洗涤3次，最后用乙醇稀释倒入玻璃培养皿中，干燥，即得；
对苯二甲酸、六水氯化铁、N,N-二甲基甲酰胺和法匹拉韦的用量比为1.5-1.8g：0.6-0.9g：12-16mL：0.01-0.03g。
2.根据权利要求1所述的MIL-101(Fe)-T705，其特征在于：法匹拉韦的质量为对苯二甲酸和六水氯化铁总质量的0.2-1%。
3.根据权利要求2所述的MIL-101(Fe)-T705，其特征在于：法匹拉韦的质量为对苯二甲酸和六水氯化铁总质量的0.8%。
4.根据权利要求1所述的MIL-101(Fe)-T705，其特征在于：加入N,N-二甲基甲酰胺，超声使之分散均匀，超声功率为120W，超声时间为12-18min。
5.根据权利要求1所述的MIL-101(Fe)-T705，其特征在于：加入法匹拉韦，继续超声，超声功率为120W，超声时间为15-25min。
6.根据权利要求1所述的MIL-101(Fe)-T705，其特征在于：置于75-155℃烘箱中反应17-22h。
7.根据权利要求1-6任一项所述的MIL-101(Fe)-T705在制备抗菌、抗病毒药物中的应用。
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