CN102702451B - 一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于高分子纳米生物医药材料领域，具体涉及一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束及其制备方法。两亲性嵌段聚合物通过直接溶解法自组装形成胶束，该胶束表面带有大量的正电荷，在不加入任何其他抗生素的条件下，本身就具有高效杀菌抑菌效果。同时该胶束具有很好的生物相容性和生物可降解性。聚合物胶束具有良好的pH敏感性能，其结构会随着外界pH值的变换而发生变化，胶束的核壳结构可以包裹多种药物，具有广泛的应用前景。

Description

一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束及其制备方法

技术领域

本发明属于高分子纳米生物医药材料领域，具体涉及一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束及其制备方法。

背景技术

近年来，随着高分子合成方法（ATRP、RAFT、NMP、ROP、点击化学）和表征技术的发展，各种结构和功能的嵌段聚合物如雨后春笋般被合成出来。由于嵌段聚合物其不同链段性能的差异，使得嵌段聚合物在很多领域都有很广泛的应用，其中一个很重要的应用就是嵌段聚合物在选择性溶剂中组装成各种形态的纳/微米粒子成为可能。目前发现的聚合物组装体形态主要有：球形胶束、棒状胶束、圆盘状胶束、球形囊泡、碗状囊泡、多层囊泡、大复合囊泡、片状、管状、纤维状、树枝状等。其中球形胶束的形态最为广泛。

健康是人们最为关注的话题之一，然而，细菌无处不在、无孔不入，它们的传播和蔓延严重威胁着人类的健康。利用杀菌和抗菌材料来杀灭和抑制有害细菌的生长、繁殖是提高人类健康水平的一个重要手段。

抗菌聚合物是由含有阳离子的极性亲水功能性链段和非极性疏水链段（或整个链段都疏水），或者由一种疏水单体和一种亲水性单体无规共聚得到的功能性基团构成的。这样的聚合物/共聚物结构能够提供很高的表面活性，吸附/解吸附能力和由高亲油性导致的高细胞粘附亲和性，从而有效地破坏组织结构和细胞膜的完整性，最终使细胞膜破裂，细胞质漏出，细胞溶解。目前，共价型高分子抗菌剂的研究主要集中于季铵盐、吡啶盐、胍盐、卤胺型、膦盐等。

聚2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（PTA）是一种新型聚合物，不需要季铵化，就具有很高的抗菌活性，同时对人体细胞的毒性很小，可用于防污油漆和涂料。

聚氧乙烯（PEO）在水溶液中具有很好的亲水性，并且无生物毒性，生物相容，是美国食品安全局批准的可用于人体的生物高分子材料。聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEA)是一种pH响应性的聚合物链段，其pKa = 7.4，PDEA链段在低pH水中可溶，中性和碱性水中不溶。

中国专利（CN101210062A，公开日2008年7月2日）公开了一种抗菌聚合物材料的制备方法，该聚合物材料是由抗菌齐聚物为主的多组分聚合物组成，该材料对人体安全，能起到一定的杀菌抑菌效果，可用于医用和卫生行业。中国专利（CN1241947A，公开日2000年1月19日）公开了一种抗菌剂涂布的形成水凝胶的吸收性聚合物制备方法，该产品可用于制备一次性吸收制品，如一次性尿布，具有一定的抗菌效果。 

上述制备的聚合物虽具有一定的抗菌抑菌效能，但其制备方法较为复杂，聚合物的抗菌效果不佳，同时以上聚合物的耐候性较差，不便于长期使用，更无法应用于生物医学领域，尤其是难以长期应用于人体。

针对目前抗菌聚合物抗菌抑菌效果不佳的原因，我们提出利用两亲性嵌段聚合物自组装的方法制备抗菌聚合胶束，通过大幅度提高胶束表面的局部阳离子浓度，来大大提高聚合物的抗菌效果。该胶束既可以作为药物的载体，同时自身具有很好的抗菌杀菌效果，而且该聚合物具有水溶性和生物降解性能，聚合物胶束具有良好的pH敏感性能，其结构会随着外界pH值的变换而发生变化，在生物医学领域具有很广泛的应用前景，国内外还没有相关专利发明出现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束及其制备方法。该胶束具有良好的杀菌抑菌效果，同时具有很好的生物相容性和生物可降解性，聚合物胶束具有良好的pH敏感性能，其结构会随着外界pH值的变换而发生变化，胶束的核壳结构也可以用作药物载体材料。

为解决现有技术中的上述问题，本发明提供的技术方案是：

一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束，所使用的聚合物为两亲性嵌段聚合物PEO-b-PDEA-b-PTA，PDEA、PEO和PTA均为生物相容、生物可降解材料，该聚合物通过直接溶解法自组装形成胶束；其中PDEA形成胶束的内核，PEO和PTA形成胶束的外壳，形成的胶束粒径为20~100nm，胶束表面带有大量正电荷。

本发明提供的一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束的制备方法，具体步骤如下：

（1）大分子引发剂PEO-Br的合成

聚氧乙烯(PEO)与2-溴异丁酰溴以1:(1～3)的摩尔比加入到烧瓶中，加入溶剂和三乙胺，三乙胺与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(1～2)，反应进行12～40h。过滤、萃取、洗涤、溶解、沉淀，真空干燥得到大分子引发剂PEO-Br。

（2）ATRP合成聚合物

将大分子引发剂PEO-Br、配体bpy、催化剂溴化亚铜和单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA）加入到圆底烧瓶中，控制大分子引发剂PEO-Br、配体bpy和催化剂溴化亚铜的摩尔比为1：2：(1～2)，大分子引发剂PEO-Br和单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA）的摩尔比为1:(15～50)；随后加入溶剂反应8～36h，合成聚合物PEO-b-PDEA-b-Br。聚合物经沉淀处理进行纯化。随后向 PEO-b-PDEA-b-Br中加入2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（TA）和溶剂反应10～40h，合成聚合物PEO-b-PDEA-b-PTA；PEO-b-PDEA-b-Br和单体2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（TA）的摩尔比为1:(20～45)。

（3）自组装形成聚合物胶束

以8～20mg/mL的浓度将聚合物PEO-b-PDEA-b-PTA溶解在pH为1~2的水中，在搅拌条件下，以10秒一滴的速度向溶液中滴加pH为10~12的氢氧化钠溶液，调节溶液的pH值到7.0~7.8，随后搅拌4~15小时，得到PEO-b-PDEA-b-PTA胶束溶液。

（4）聚合物胶束的抗菌性能测试

将步骤（3）得到的PEO-b-PDEA-b-PTA胶束溶液加入到接种过大肠杆菌的LB培养基中培养，测试其抗菌性能，PEO-b-PDEA-b-PTA浓度为50~800μg.mL^-1。

本发明中，步骤（1）中所述聚氧乙烯PEO的分子量为1900～5000，步骤（2）中所述嵌段共聚物PEO-b-PDEA-b-PTA的相对分子量为4000～30000。

本发明中，步骤（1）、（2）、（3）中使用的溶剂均为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、丙酮、二甲亚砜或二甲基甲酰胺中的一至几种。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

（1）嵌段聚合物是利用原子转移自由基聚合（ATRP）合成的，聚合物分子量分布较窄且结构可控。

（2）合成的嵌段聚合物为生物相容性的，其自组装形成的胶束在不携带任何药物的情况下，具有很好的抗菌和杀菌效果。

（3）抗菌胶束应用于人体并不会产生毒害作用。同时，该聚合物胶束还可以包裹多种药物，是理想的药物载体。在这种情况下，多种抑菌和杀菌机制协同作用，可以大大提高抑菌和杀菌效果，降低细菌的抗药性。

（4）胶束能够在水溶液中长期存在且具有良好的杀菌效果。

（5）聚合物胶束通过直接溶解的方法制备，方法简单，适用范围较广，避免有机溶剂的残留问题。

（6）该胶束的PEO部分生物相容性良好，形成的胶束在人体中不易被免疫系统识别，用于人体无排异反应。

（7）该聚合物物胶束具有pH敏感性，其结构会随着外界的酸碱度的变化发生变化，在药物载体方面的应用前景广泛。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

（1）大分子引发剂PEO₄₃-Br的合成

将10g片状的PEO和250mL甲苯共沸蒸馏除去其中多余的水分，体系的温度降到室温，换成冰水浴，加入2mL三乙胺，1.9mL 2-溴异丁酰溴的甲苯溶液20mL，反应进行40h，过滤，萃取，收集有机相，干燥，过滤，沉淀，抽滤，真空干燥，得到白色粉末状大分子引发剂PEO₄₃-Br。

（2）ATRP合成聚合物

1g大分子引发剂PEO₄₃-Br，0.033g催化剂溴化亚铜（CuBr），0.078g配体bpy，0.5g单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA），2mL甲醇溶剂加入到50mL的圆底烧瓶中，无水无氧在氮气或氩气的保护条件下，进行原子转移自由基聚合（ATRP），温度60^oC，进行24h。随后加入0.8g 2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（TA），温度60^oC，进行24h。获得的聚合物旋蒸、过硅胶柱子、反复溶解旋蒸、泵抽，最后放真空烘箱24h，得到嵌段聚合物PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₂₀，该聚合物在25^oC室温条件下较粘。

（3）聚合物自组装形成胶束

聚合物溶解pH=1的水中，配制20mg/mL的溶液，搅拌条件下，以10秒一滴的速度向溶解中滴加pH=10的氢氧化钠水溶液，调节溶液的pH值到7.2。得到浅蓝色胶束溶液。DLS（动态光散射）及TEM测试结果显示胶束的粒径在15nm左右。

（4）聚合物胶束的抗菌性能测试

自组装后得到的PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₂₀胶束溶液加入到接种过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的LB培养基中培养，测试其抗菌性能，PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₂₀胶束在培养基中的浓度为800，400，200，100，50μg.mL^-1，24h后根据培养基的浊度来判断胶束的抗菌性能。

表1为PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₂₀聚合物胶束对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌统计表。

“+”代表有细菌生长，“-”代表无细菌生长。

实施例2

（1）大分子引发剂PEO₄₃-Br的合成

将10g片状的PEO和250mL甲苯共沸蒸馏除去其中多余的水分，体系的温度降到室温，换成冰水浴，加入2mL三乙胺，1.9mL 2-溴异丁酰溴的甲苯溶液20mL，反应进行40h，过滤，萃取，收集有机相，干燥，过滤，沉淀，抽滤，真空干燥，得到白色粉末状大分子引发剂PEO₄₃-Br。

（2）ATRP合成聚合物

1g大分子引发剂PEO₄₃-Br，0.033g催化剂溴化亚铜（CuBr），0.078g配体bpy，0.8g单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA），2mL甲醇溶剂加入到50mL的圆底烧瓶中，无水无氧在氮气或氩气的保护条件下，进行原子转移自由基聚合（ATRP），温度60^oC，进行30h。随后加入0.8g 2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（TA），温度60^oC，进行24h。获得的聚合物旋蒸、过硅胶柱子、反复溶解旋蒸、泵抽，最后放真空烘箱24h，得到嵌段聚合物PEO₄₃-b-PDEA₃₀-b-PTA₂₀，该聚合物在25^oC室温条件下较粘。

（3）聚合物自组装形成胶束

聚合物溶解pH=2的水中，配制15mg/mL的溶液，搅拌条件下，以10秒一滴的速度向溶解中滴加pH=11的氢氧化钠水溶液，调节溶液的pH值到7.4。得到浅蓝色胶束溶液。DLS（动态光散射）及TEM测试结果显示胶束的粒径在25nm左右。

（4）聚合物胶束的抗菌性能测试

自组装后得到的PEO₄₃-b-PDEA₃₀-b-PTA₂₀胶束溶液加入到接种过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的LB培养基中培养，测试其抗菌性能，PEO₄₃-b-PDEA₃₀-b-PTA₂₀胶束在培养基中的浓度为800，400，200，100，50μg.mL^-1，24h后根据培养基的浊度来判断胶束的抗菌性能。

实施例3

（1）大分子引发剂PEO₄₃-Br的合成

将10g片状的PEO和250mL甲苯共沸蒸馏除去其中多余的水分，体系的温度降到室温，换成冰水浴，加入2mL三乙胺，1.9mL 2-溴异丁酰溴的甲苯溶液20mL，反应进行40h，过滤，萃取，收集有机相，干燥，过滤，沉淀，抽滤，真空干燥，得到白色粉末状大分子引发剂PEO₄₃-Br。

（2）ATRP合成聚合物

1g大分子引发剂PEO₄₃-Br，0.033g催化剂溴化亚铜（CuBr），0.078g配体bpy，0.5g单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA），2mL甲醇溶剂加入到50mL的圆底烧瓶中，无水无氧在氮气或氩气的保护条件下，进行原子转移自由基聚合（ATRP），温度60^oC，进行24h。随后加入1.2g 2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（TA），温度60^oC，进行30h。获得的聚合物旋蒸、过硅胶柱子、反复溶解旋蒸、泵抽，最后放真空烘箱24h，得到嵌段聚合物PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₃₀，该聚合物在25^oC室温条件下较粘。

（3）聚合物自组装形成胶束

聚合物溶解pH=1.5的水中，配制30mg/mL的溶液，搅拌条件下，以10秒一滴的速度向溶解中滴加pH=12的氢氧化钠水溶液，调节溶液的pH值到7.6。得到浅蓝色胶束溶液。DLS（动态光散射）及TEM测试结果显示胶束的粒径在50nm左右。

（4）聚合物胶束的抗菌性能测试

自组装后得到的PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₃₀胶束溶液加入到接种过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的LB培养基中培养，测试其抗菌性能，PEO₄₃-b-PDEA₂₀-b-PTA₃₀胶束在培养基中的浓度为800，400，200，100，50μg.mL^-1，24h后根据培养基的浊度来判断胶束的抗菌性能。

实施例4

（1）大分子引发剂PEO₄₃-Br的合成

将10g片状的PEO和250mL甲苯共沸蒸馏除去其中多余的水分，体系的温度降到室温，换成冰水浴，加入2mL三乙胺，1.9mL 2-溴异丁酰溴的甲苯溶液20mL，反应进行40h，过滤，萃取，收集有机相，干燥，过滤，沉淀，抽滤，真空干燥，得到白色粉末状大分子引发剂PEO₄₃-Br。

（2）ATRP合成聚合物

1g大分子引发剂PEO₄₃-Br，0.033g催化剂溴化亚铜（CuBr），0.078g配体bpy，0.8g单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA），2mL甲醇溶剂加入到50mL的圆底烧瓶中，无水无氧在氮气或氩气的保护条件下，进行原子转移自由基聚合（ATRP），温度60^oC，进行30h。随后加入1.2g 2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯（TA），温度60^oC，进行30h。获得的聚合物旋蒸、过硅胶柱子、反复溶解旋蒸、泵抽，最后放真空烘箱24h，得到嵌段聚合物PEO₄₃-b-PDEA₃₀-b-PTA₃₀，该聚合物在25^oC室温条件下较粘。

（3）聚合物自组装形成胶束

聚合物溶解pH=2的水中，配制20mg/mL的溶液，搅拌条件下，以10秒一滴的速度向溶解中滴加pH=11的氢氧化钠水溶液，调节溶液的pH值到7.8。得到浅蓝色胶束溶液。DLS（动态光散射）及TEM测试结果显示胶束的粒径在35nm左右。

（4）聚合物胶束的抗菌性能测试

自组装后得到的PEO₄₃-b-PDEA₃₀-b-PTA₃₀胶束溶液加入到接种过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的LB培养基中培养，测试其抗菌性能，PEO₄₃-b-PDEA₃₀-b-PTA₃₀胶束在培养基中的浓度为800，400，200，100，50μg.mL^-1，24h后根据培养基的浊度来判断胶束的抗菌性能。

实施例2-4中获得的聚合物胶束与实施例1具有类似的性能。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种pH敏感且生物相容高效抗菌的聚合物胶束的制备方法，所使用的聚合物为两亲性嵌段聚合物PEO-b-PDEA-b-PTA，PDEA、PEO和PTA均为生物相容、生物可降解材料，该聚合物通过直接溶解法自组装形成胶束；其中PDEA形成胶束的内核，PEO和PTA形成胶束的外壳，形成的胶束粒径为20~100nm，胶束表面带有大量正电荷；其特征在于具体步骤如下：

（1）大分子引发剂PEO-Br的合成

聚氧乙烯与2-溴异丁酰溴以1:(1～3)的摩尔比加入到烧瓶中，加入溶剂和三乙胺，三乙胺与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(1～2)，反应进行12～40h；过滤、萃取、洗涤、溶解、沉淀，真空干燥得到大分子引发剂PEO-Br；

（2）ATRP合成聚合物

将大分子引发剂PEO-Br、配体bpy、催化剂溴化亚铜和单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯加入到圆底烧瓶中，控制大分子引发剂PEO-Br、配体bpy和催化剂溴化亚铜的摩尔比为1：2：(1～2)，大分子引发剂PEO-Br和单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA）的摩尔比为1:(15～50)；随后加入溶剂反应8～36h，合成聚合物PEO-b-PDEA-b-Br；聚合物经沉淀处理进行纯化；随后向 PEO-b-PDEA-b-Br中加入2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯和溶剂反应10～40h，合成聚合物PEO-b-PDEA-b-PTA；PEO-b-PDEA-b-Br和单体2-叔丁基氨乙基甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:(20～45)；

（3）自组装形成聚合物胶束

以8～20mg/mL的浓度将聚合物PEO-b-PDEA-b-PTA溶解在pH为1~2的水中，在搅拌条件下，以10秒一滴的速度向溶液中滴加pH为10~12的氢氧化钠溶液，调节溶液的pH值到7.0~7.8，随后搅拌4~15小时，得到PEO-b-PDEA-b-PTA胶束溶液；

（4）聚合物胶束的抗菌性能测试

将步骤（3）得到的PEO-b-PDEA-b-PTA胶束溶液加入到接种过大肠杆菌的LB培养基中培养，测试其抗菌性能，PEO-b-PDEA-b-PTA浓度为50~800μg.mL^-1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述聚氧乙烯PEO的分子量为1900～5000，步骤（2）中所述嵌段共聚物PEO-b-PDEA-b-PTA的相对分子量为4000～30000。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）、（2）、（3）中使用的溶剂均为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、丙酮、二甲亚砜或二甲基甲酰胺中的一至几种。