CN108181288B - 一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针及其制备方法以及应用 - Google Patents
一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针及其制备方法以及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针及其制备方法以及应用，纳米荧光探针是以化合物1 6‑(4‑十二烷基哌嗪)‑2‑(2‑吗啉代乙基)‑1H‑苯并[de]‑异喹啉‑1,3(2H)‑二酮为发光化合物负载于两亲性嵌段高分子纳米材料聚苯乙烯‑b‑聚丙烯酸叔丁酯（PS‑b‑PtBA）内制得，具有较好的水溶性和N,N‑二甲基亚砜溶解性。并且该复合纳米荧光探针具有较好的光稳定性、抗干扰性在较大范围内荧光强度与pH值呈线性关系，可应用于溶液和活细胞内的pH检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针及其制备方法以及应用。
背景技术
细胞内pH值在细胞行为中起着重要作用，如细胞的增殖和凋亡、离子转运、酶活性、蛋白质降解和内吞作用等等；在一个哺乳动物细胞中，线粒体的pH值约为8，细胞质和细胞核内的pH值在7.2-7.4之间，而在酸性细胞器如胞内体和溶酶体的pH值沿内吞路径可以从6.3到4.7变化。鉴于许多酸性细胞器pH值异常与一些常见疾病相关，开发高效的传感和监测活体细胞内pH变化的探针非常重要，这有助于我们在细胞层面上更好地了解其生理及病理过程。
近年来，荧光化学传感器以其易于操作、灵敏度高、特异性强等优点成为人们关注的热点，内标的pH纳米传感器已成为pH传感和成像的有力工具，尤其是基于1,8-萘酰亚胺的荧光分子探针的研究越来越引起人们的重视，作为荧光染料1,8-萘酰亚胺由于分子内旋转存在扭曲的分子内电荷转移或推拉电子效应，通过外界环境对其电荷转移和电子云分别进行影响可以得到金属阳离子、阴离子、质子和其他生物分子的荧光探针材料，与此同时基于聚合物组装体、量子点、二氧化硅纳米颗粒、金纳米颗粒和碳点为基体的荧光pH传感器也迅速发展，但这些有机分子作为荧光探针进行离子或分子识别时在水相中溶解度不好，极大地限制了其在生物环境中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针及其制备方法以及应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针，纳米荧光探针是以化合物1 6-(4-十二烷基哌嗪)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮为发光化合物负载于两亲性嵌段高分子纳米材料聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯(PS-b-PtBA)内制得，所述化合物1的结构式如下：
进一步的，所述两亲性嵌段高分子纳米材料为聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA，两亲性嵌段高分子纳米材料的链段n在30-40之间，m在20-35之间，其结构式如下：
进一步的，所述化合物1的合成包括以下步骤：
1)化合物3 6-溴-2-(2-吗啉基乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成称取0.554g 4-溴-1,8-萘酐于三口反应瓶中，加入10mL乙醇反应，同时超声溶解并搅拌，此时反应液的颜色为深黄色，再向反应混合液中加入525μL的4-乙氨基-2-吗啉，升温至78℃，直至反应液的颜色由深黄色逐渐变为浅黄色，反应液中有固体析出，回流1.5h后，停止反应；反应液降至室温，将反应液进行减压抽滤，得浅黄色固体化合物3，将得到的浅黄色固体化合物3进行干燥后得到0.663g的化合物3，其产率为85％；
2)化合物2 2-(2-吗啉基乙基)-6-哌嗪基-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成称取298.7mg化合物3，129.2mg哌嗪置于50mL三口烧瓶中，加入10mL乙二醇单甲醚，氩气保护下于124℃反应4h，薄层色谱板监测反应过程；反应结束后冷却至室温，经柱层层析分离提纯，真空干燥得231.2mg橙黄色固体化合物2，其产率为78.2％，其中洗脱剂体积比为VDCM/VEtOH＝25/1；
3)化合物1 6-(4-十二烷基哌嗪)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成称取100mg化合物2，138.2mg碳酸钾，56μL溴十二烷溶于15mL乙腈中，回流反应8h，薄层色谱板监测反应过程；反应结束冷却至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤三次，将滤饼溶于5mL二氯甲烷，经柱层层析分离提纯真空干燥得101.9mg橙黄色固体化合物1，其产率为72.4％；其中洗脱剂体积比为VDCM/VEtOH＝20/1。
进一步的，所述两亲性嵌段高分子纳米材料的制备包括以下步骤：
1)聚苯乙烯PS-Br大分子引发剂的合成
取洁净的50mL的希莱克瓶一个，采用加热抽真空-氮气置换的方式进行无氧无水操作，按照2-溴丙酸甲酯/溴化亚铜/五甲基二乙烯三胺/苯乙烯的比例为1/1/2/100进行投料，即先称取0.05g溴化亚铜于希莱克瓶中，再加入4mL重蒸甲苯、39μL的2-溴丙酸甲酯、146μL五甲基二乙烯三胺，最后再加入4mL苯乙烯，搅拌均匀；用液氮将反应样品冷冻、抽真空15min、通氮气、解冻，如此反复三次，将其置于90℃油浴锅中，恒温反应21h；采用0℃的冰水浴淬冷停止反应；在此反应液中加入5mL的四氢呋喃进行稀释，得到绿色溶液；将得到的绿色溶液过中性氧化铝柱，用甲苯不断淋洗除去铜盐，得无色澄清的液体；利用旋转蒸发仪将得到的无色澄清的液体浓缩至20mL；将得到的浓缩液逐滴滴入200mL冰冻甲醇中，得到白色沉淀，减压抽滤得白色沉淀物，于40℃真空干燥箱中干燥24h。得到4.6g的大分子引发剂PS-Br，数均分子量为3540，分布系数为1.34；
2)聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA的合成
取一洁净的50mL的希莱克瓶，采用加热抽真空-氮气置换的方式进行无氧无水操作，然后按大分子引发剂/溴化亚铜/五甲基二乙烯三胺/丙烯酸叔丁酯比例1/1.2/2.4/40进行投料，在氮气保护下，依次加入2.5g的PS-Br、0.122g CuBr、355μLPMDETA、4.1mL丙烯酸叔丁酯和15mL甲苯，搅拌均匀，用液氮将反应样品冷冻、抽真空15min、通氮气、解冻，如此反复三次，将其置于100℃的油浴锅中，恒温反应4h，采用0℃的冰水浴淬冷停止反应，在此反应液中加入5mL四氢呋喃进行稀释，得到绿色溶液，将得到的绿色溶液过中性氧化铝柱，用甲苯不断淋洗除去铜盐，将得到的微黄的滤液利用旋转蒸发仪浓缩至10mL，将浓缩液逐滴滴入80mL冰冻甲醇中，得到白色沉淀，减压抽滤收集白色沉淀，于40℃真空干燥箱中干燥24h，得到2.0g的PS-b-PtBA，数均分子量为7300，分布系数为1.45；
3)聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA水解生成聚苯乙烯-b-聚丙烯酸PS35-b-PAA30在50mL的三口瓶中加入1.93g PS-b-PtBA，用20mL的二氯甲烷将其溶解，按PS-b-PtBA叔丁基官能团的摩尔数的五倍加入2.96mL三氟乙酸，室温搅拌24h，待反应结束时，用旋转蒸发仪除去部分的二氯甲烷，将得到的15mL浓缩液滴加至水/甲醇的混合溶液中进行聚沉，其中，水和甲醇的体积比为1:3，先用3000rpm离心下来一部分，再用9000rpm离心未离下来的部分，将最终离心下来的固体于40℃真空干燥箱中干燥24h，得到1.5g的PS35-b-PAA30，数均分子量为6819，分布系数为1.31；两亲嵌段共聚物PS35-b-PAA30为50nm的囊泡。
一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
1)纳米胶束的制备：将100mg两亲性嵌段共聚物聚苯乙稀-b-聚丙烯酸置于50mL茄形瓶中，加入10mLN,N-二甲基甲酰胺，以500转/分在室温下搅拌10分钟至完全溶解，再将1-4mg化合物1加入混合溶液中，搅拌使其完全溶解，再加入30mL超纯水，以1000转/分在搅拌30分钟形成具有疏水性质的化合物1与嵌段共聚物的疏水端包裹在内部，嵌段共聚物的亲水端在外的纳米胶束溶液；
2)纳米荧光探针的制备：向纳米胶束溶液中加入二氯甲烷进行透析，然后除去纳米胶束溶液中的有机溶剂和未被包裹的化合物1，将透析后得到的复合液于40℃进行真空干燥，最终得到复合pH探针L。
进一步的，所述步骤2)中透析次数为3次。
一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针的应用，用于水溶液、细胞内荧光成像与pH的检测。
本发明具有的优点是：本发明以1,8-萘酐为原料得到的pH的荧光探针化合物本身易溶于二氯甲烷，难溶于N,N-二甲基亚砜(化合物1在DMSO的溶解度为0.05mg/mL)，但是在形成两亲性嵌段复合纳米探针后具有较好的水溶性和N,N-二甲基亚砜溶解性，且保留了pH荧光探针的性质，而且该复合纳米荧光探针具有较好的光稳定性、抗干扰性在较大范围内荧光强度与pH值呈线性关系，以400nm为激发波长，随着时间由0min增至180min，复合pH探针L(pH＝7.4)在507nm处荧光的强度没有变化，金属离子(K+、Ca2+、Na+、，Mg2+、Al3+、Pb2+、Mn2 +、Au3+)、阴离子(ClO4 –、HCO3 –、CO3 2–、SO4 2–、NO3 –、C2O4 2–、HSO3 –、HSO4 –、S2O3 2–、SH–、I–、N3 –、PO4 3–、P2O7 4–、H2PO4 –、SO3 2–、HPO4 2–、SiO3 2–、ClO3 –、CH3COO–、F–、Br–、Cl–)和生物小分子(甘氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、高半胱氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、色氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸)的存在未改变复合pH探针L(pH＝7.4)在507nm处荧光发射光谱的强度。探针的荧光强度在pH＝4.0至pH＝9.0范围内与pH值保持较好的线性关系。
附图说明
图1化合物1掺杂质量分数为1％复合pH探针L在pH＝4.0和pH＝9.0时的荧光发射光谱；
图2化合物1掺杂质量分数为2％复合pH探针L在pH＝4.0和pH＝9.0时的荧光发射光谱；
图3化合物1掺杂质量分数为4％复合pH探针L在pH＝4.0和pH＝9.0时的荧光发射光谱；
图4两亲嵌段共聚物、化合物2和掺杂质量分数为2％的复合pH探针L的傅立叶转换红外线光谱：(a)两亲嵌段共聚物PS35-b-PAA30；(b)化合物2；(c)化合物1掺杂质量分数为2％的复合pH探针L；
图5(a,b)两亲嵌段共聚物(PS-b-PAA)的TEM图片；(c,d)复合pH探针L的TEM；
图6复合pH探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9)随pH变化(间隔为0.2)的荧光光谱，激发波长为400nm；
图7复合pH探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9)的荧光强度与pH的线性关系图，激发波长为400nm。
图8 10倍当量K+、Ca2+、Na+、，Mg2+、Al3+、Pb2+、Mn2+、Au3+金属离子对复合pH探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9，pH＝7.4)选择性检测pH的荧光抗干扰柱状图，激发波长为400nm。
图9 10倍当量阴离子对复合pH探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9，pH＝7.4)选择性检测pH的荧光抗干扰柱状图，1-24分别对应于：探针L(pH＝7.4))、ClO4 –、HCO3 –、CO3 2–、SO4 2–、NO3 –、C2O4 2–、HSO3 –、HSO4 –、S2O3 2–、SH–、I–、N3 –、PO4 3–、P2O7 4–、H2PO4 –、SO3 2–、HPO4 2–、SiO3 2–、ClO3 –、CH3COO–、F–、Br–、Cl–，激发波长为400nm。
图10 10倍当量甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、高半胱氨酸(Hcy)、精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)对复合探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9，pH＝7.4)选择性检测pH的荧光抗干扰柱状图，激发波长为400nm。
图11温度对复合探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9，pH＝7.4)检测pH＝7.4HEPES溶液荧光强度的影响，激发波长为400nm。
图12复合探针L(0.1mg/mL，VDMSO:VHEPES＝1:9，pH＝7.4)检测pH＝7.4HEPES溶液的荧光稳定性，检测温度为25℃，激发波长为400nm。
图13复合纳米探针L的细胞荧光共聚焦显微镜图像，第一行a)、d)、g)、j)为不同pH值绿光通道的细胞荧光共聚焦显微镜图像，第二行b)、e)、h)、k)为不同pH值红光通道的细胞荧光共聚焦显微镜图像，第三行c)、f)、j)、l)为不同pH值绿光通道的细胞荧光共聚焦显微镜图像。
具体实施方式
实施例
一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针，纳米荧光探针是以化合物1 6-(4-十二烷基哌嗪)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮为发光化合物负载于两亲性嵌段高分子纳米材料聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯(PS-b-PtBA)内制得，所述化合物1的结构式如下：
进一步的，所述两亲性嵌段高分子纳米材料为聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA，两亲性嵌段高分子纳米材料的链段n在30-40之间，m在20-35之间，其结构式如下：
化合物1采用如下合成路线：
1)化合物3(6-溴-2-(2-吗啉基乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮)的合成：
称取4-溴-1,8-萘酐(0.554g,2mmol)于50mL三口反应瓶中，加入10mL乙醇，超声溶解，搅拌，此时反应液的颜色为深黄色，向此反应混合液中加入4-乙氨基-2-吗啉(525μL,4mmol)，升温至78℃，反应液的颜色由深黄色逐渐变为浅黄色，并有固体析出，回流1.5h后，停止反应，反应液降至室温，将反应液进行减压抽滤，得浅黄色固体。将得到的浅黄色固体进行真空干燥，最后得化合物3(0.663g，产率为85％)。
表征如下：1H NMR(CDCl3,400MHz):δH 2.62(s,4H),2.727(t,2H),3.70(t,4H),7.86(m,1H),8.05(d,1H),8.41(d,1H),8.57(d,1H),8.85(d,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δC163.62,163.60,133.31,132.04,131.23,131.12,130.64,130.32,129.03,128.10,123.05,122.18,67.02,56.09,53.81,37.30.
2)化合物2(2-(2-吗啉基乙基)-6-哌嗪基-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮)的合成称取化合物3(298.7mg,0.75mmol)，哌嗪(129.2mg,1.5mmol)置于50mL三口烧瓶中，加入10mL乙二醇单甲醚，氩气保护下124℃反应4h，薄层色谱板监测反应过程。反应结束后冷却至室温，经柱层层析分离提纯(洗脱剂：VDCM/VEtOH＝25/1)，真空干燥得橙黄色固体(231.2mg，产率78.2％)。
表征如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si):δH 1.19(m,4H),2.50(m,20H),2.56(t,2H),3.08(m,4H),4.17(t,2H),7.43(d,1H),7.85(t,1H),8.43(d,1H),8.52(t,2H).
3)化合物1 6-(4-十二烷基哌嗪)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成称取化合物2(100mg,0.25mmol)，K2CO3(138.2mg,1mmol)，溴十二烷(56μL,0.25mmol)溶于15mL乙腈中，回流反应8h，薄层色谱板监测反应过程。反应结束冷却至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤三次，将滤饼溶于5ml二氯甲烷，经柱层层析分离提纯(洗脱剂：VDCM/VEtOH＝20/1)真空干燥得橙黄色固体(101.9mg，产率72.4％)。
表征如下：1H NMR(CDCl3,400MHz):δH 0.92(m,3H),1.32(d,20H),1.59(s,2H),2.51(t,2H),2.61(s,4H),2.71(t,2H),2.80(s,4H),3.33(s,3H).3.7(t,3H),4.35(t,2H),7.25(t,1H),7.7(t,1H),8.43(d,1H),8.52(d,1H),8.58(d,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δC164.51,164.01,158.08,132.62,131.09,130.39,129.94,126.17,125.60,123.20,116.57,114.91,67.08,58.80,56.22,53.83,53.30,53.04,37.07,31.93,29.69,29.66,29.61,29.37,27.58,22.70,14.14.HRMS(EI)m/z:C34H50N4O3[M+H]+,563.3962.
进一步的，所述两亲性嵌段高分子纳米材料的制备包括以下步骤：
1)聚苯乙烯(PS-Br)大分子引发剂的合成
取洁净的50mL的Schlenk瓶一个，加入一个合适大小的磁子，采用加热抽真空-氮气置换的方式进行无氧无水操作。按照MBP/CuBr/PMDETA/St＝1/1/2/100的摩尔比进行投料，即先称取0.05g CuBr于50mL的Schlenk中，再加入4mL无水甲苯，39μL MBP，146μLPMDETA，最后再加入4mL(3.96g)的苯乙烯，搅拌均匀，用液氮将反应样品冷冻、抽真空约15min、通氮气、解冻，如此反复三次，将其置于90℃的油浴锅中，恒温反应21h。采用0℃的冰水浴淬冷停止反应，在此反应液中加入5毫升四氢呋喃进行稀释，得到绿色溶液，将得到的绿色溶液过中性氧化铝柱，用甲苯不断淋洗除去铜盐，得无色澄清的液体。利用旋转蒸发仪将得到的无色澄清的液体浓缩至20mL左右，将得到的浓缩液逐滴滴入200mL冰冻甲醇中，得到大量的白色沉淀，减压抽滤得白色沉淀物，于40℃真空干燥箱中干燥24h。得到4.6g的大分子引发剂，数均分子量为3540，分布系数为1.34。
2)聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯(PS-b-PtBA)的合成
取一洁净的50mL的Schlenk瓶，采用加热抽真空-氮气置换的方式进行无氧无水操作。然后按PS-Br/CuBr/PMDETA/tBA＝1/1.2/2.4/40的摩尔比进行投料，在氮气保护下，依次加入2.5g PS-Br、0.122g CuBr、355μL PMDETA、4.1mL的丙烯酸叔丁酯和15mL甲苯，搅拌均匀，用液氮将反应样品冷冻、抽真空15min、通氮气、解冻，如此反复三次，将其置于100℃的油浴锅中，恒温反应4h，采用0℃冰水浴淬冷停止反应，在此反应液中加入5毫升四氢呋喃进行稀释，得到绿色溶液，将得到的绿色溶液过中性氧化铝柱，用甲苯不断淋洗除去铜盐，将得到的微黄的滤液利用旋转蒸发仪浓缩至10mL，将浓缩液逐滴滴入80mL冰冻甲醇中，得到大量的白色沉淀，减压抽滤收集白色沉淀，于40℃真空干燥箱中干燥24h，得到2.0g的PS-b-PtBA，数均分子量为7300，分布系数为1.45。
3)聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯(PS-b-PtBA)水解生成PS35-b-PAA30
在50mL的三口瓶中加入1.93g PS-b-PtBA，用20mL的二氯甲烷将其溶解，按PS-b-PtBA叔丁基官能团的摩尔数(据PtBA段的数均分子量计算得到)的五倍加入三氟乙酸，即加入2.96mL三氟乙酸，室温搅拌24h，待反应结束时，用旋转蒸发仪除去部分的二氯甲烷，将得到的15mL的浓缩液滴加至水/甲醇的混合溶液(V水:V甲醇＝1:3)中进行聚沉，由于得到聚沉下来的聚合物颗粒较小，于是选择了离心处理，先用3000rpm离心下来一部分，再用9000rpm离心未离下来的部分，将最终离心下来的固体于40℃真空干燥箱中干燥24h，得到1.5g的PS35-b-PAA30，数均分子量为6819，分布系数为1.31，两亲嵌段共聚物PS35-b-PAA30为50nm的囊泡。
进一步的，化合物1与两亲性嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)复合pH探针L的合成复合时选取小分子的包覆质量分数分别为1％、2％和4％，以包覆质量分数2％为例，合成过程如下：首先，称取100mg两亲嵌段共聚物聚苯乙稀-b-聚丙烯酸(PS35-b-PAA30)置于50mL的茄形瓶中，加入10mL的有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，以500转/分在室温下搅拌10分钟至完全溶解，再准确称取2mg化合物1置于上述溶液中，搅拌使其完全溶解，量取30mL的超纯水，快速倒入上述混合液中，以1000转/分在室温下搅拌30分钟形成具有疏水性质的化合物1与嵌段共聚物的疏水端包裹在内部，嵌段共聚物的亲水端在外的纳米胶束溶液，在形成胶束后，用二氯甲烷作溶剂，通过三次透析除去混合溶液里的有机溶剂和未被包裹的化合物1，将透析后得到的复合液40℃真空干燥除去溶剂，最终得到复合pH探针L；若包覆质量分数为1％时，化合物1的加入量为1mg，若包覆质量分数为4％时，化合物1的加入量为4mg。
一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针的应用，用于水溶液、细胞内荧光成像与pH的检测。
实验分析
1.化合物1最佳掺杂质量分数的选择
复合时选取小分子的包覆质量分数分别为1％、2％和4％，图1、图2和图3分别是化合物1掺杂质量分数为1％、2％和4％时，复合pH探针在pH＝4.0和pH＝9.0时以400nm为激发波长，复合pH探针L浓度为0.1mg/mL，测试体系为VDMSO:VHEPES＝1:9得到的荧光发射光谱；由图1可知，当化合物1掺杂质量分数为1％时，复合pH探针L在pH＝4.0和pH＝9.0时荧光发射峰的位置和强度几乎没变化；由图2可知，当化合物1掺杂质量分数为2％时，复合pH探针L在pH＝4.0和pH＝9.0时荧光发射峰的位置几乎没变化，但荧光强度大约降低了6倍；由图3可知，当化合物1掺杂质量分数为4％时，复合pH探针L在pH＝4.0和pH＝9.0时荧光发射峰的位置几乎没变化，荧光强度降低的倍数也没有继续增加。综上所述，化合物1最佳掺杂质量分数为2％。
2.两亲嵌段共聚物PS35-b-PAA30、化合物2和复合pH探针L的傅立叶转换红外光谱表征
为了进一步研究化合物1掺杂质量分数为2％的复合pH探针的复合情况，将两亲嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)、化合物2、化合物1掺杂质量分数为2％的复合pH探针进行了傅立叶转换红外光谱的表征；如图4中(a)是两亲嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)的红外光谱图，由图谱可知，在3000cm-1附近存在宽而散的吸收峰，这归属于羧酸中强的O-H的伸缩振动；1700cm-1附近存在非常强的吸收峰，这归属于羰基(C＝O)的伸缩振动；1500cm-1和1450cm-1处的吸收峰，这归属于羧基(COO-)的对称伸缩振动；690cm-1处存在强的吸收峰，这归属于芳烃中C-Br的伸缩振动；图4中(b)是化合物1的红外光谱表征图，在3000cm-1附近的吸收峰归属于芳环上C-H伸缩振动；1700cm-1附近强的吸收峰归属于萘酐上的羰基(C＝O)的伸缩振动；1400cm-1处强的吸收峰归属于C-N的伸缩振动；1010cm-1处强的吸收峰归属于吗啉上C-O的伸缩振动；图4中(c)是化合物1掺杂质量分数为2％的复合pH探针L的红外光谱表征图，由图4中(c)可知，两亲嵌段共聚物所具有的特征吸收峰在复合pH探针红外谱图中均有，并且在1010cm-1处出现了化合物1属于吗啉基团的C-O伸缩振动峰，同时由于化合物1在3000cm-1附近、1700cm-1附近及1400cm-1处有特征吸收峰，因此复合pH探针在这三处的红外吸收强度均加强。由此可见两亲嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)与化合物1实现了复合。
3.两亲嵌段共聚物PS35-b-PAA30和复合pH探针L的形貌分析
复合纳米探针要想实现细胞内物质的检测，其尺寸必须小于100nm，于是我们对两亲嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)和复合pH探针L进行了透射电镜(TEM)表征，如图5所示，图5中(a)、(b)为两亲嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)的透射电镜图，由图5中(a)可知该两亲嵌段共聚物(PS35-b-PAA30)为50nm左右的囊泡，这些具有两亲特性的囊泡由于分子间相互作用而形成胶束；由进一步放大的图5中(b)可知，该两亲性囊泡由于相互作用而形成胶束群；图5(c)、(d)为复合pH探针L的透射电镜图，从图5中(c)可以看出两亲性囊泡的整体形貌仍在，从进一步放大的图5中(d)可以看出在这些囊泡的边缘出现了膜，同时还可以看到分散在囊泡中的细颗粒，推断这些囊泡里小颗粒可能是包覆的化合物2。
4.溶液中复合pH探针L对pH的荧光传感性质以400nm为激发波长，我们研究了复合探针分子随着pH值的变化其荧光发射光谱的变化；由图6可知随着pH值的增加，复合探针L在507nm处荧光发射峰的强度逐渐降低。在酸性条件下pH＝4.0时，复合探针L的在507nm处荧光发射峰的强度达到最大值；相反，在碱性条件下pH＝9.0时，复合探针L的在507nm处荧光发射峰的强度达到最小值，在酸性条件下，复合探针L的荧光发射峰的强度之所以会随着pH值的降低而增加是因为化合物2中哌嗪部分胺基基团在酸性条件下的质子化作用就阻止了从胺基基团到1,8-萘酐荧光团的光诱导电子转移过程(PET)；由图6可进一步看出，当pH从9.0变化至4.0，复合pH探针L的在507nm处荧光发射峰的强度将近增加了6倍；图7显示了复合pH探针L的荧光强度与pH值的(从4.0至9.0)线性关系图，由图可知复合pH探针L的荧光强度随着pH值的变化呈现出了良好的线性关系。
5.复合pH探针L检测pH的抗干扰性
如图8所示，10倍当量金属离子(K+、Ca2+、Na+、，Mg2+、Al3+、Pb2+、Mn2+、Au3+)的加入基本上未改变复合pH探针L在507nm处荧光发射光谱的强度，由此可见复合pH探针L有抗金属离子干扰性；如图9所示，10倍当量阴离子(ClO4 –、HCO3 –、CO3 2–、SO4 2–、NO3 –、C2O4 2–、HSO3 –、HSO4 –、S2O3 2–、SH–、I–、N3 –、PO4 3–、P2O7 4–、H2PO4 –、SO3 2–、HPO4 2–、SiO3 2–、ClO3 –、CH3COO–、F–、Br–、Cl–)的加入基本上未改变复合pH探针L在507nm处荧光发射光谱的强度，由此可见该复合pH探针L有很好的抗阴离子干扰性；如图10所示，10倍当量生物小分子[甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、高半胱氨酸(Hcy)、精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)]的加入未改变复合pH探针L在507nm处荧光发射光谱的强度，由此可见该复合pH探针L有很强的抗生物小分子干扰性。
温度和光照对复合pH探针L在溶液中检测pH的影响由图11可知，温度从28℃增加到48℃，以400nm为激发波长，复合探针L在507nm处的荧光强度在降低，由此可见该复合pH探针L对温度有一定的敏感性，因此在溶液中对pH进行测试时需固定温度。
由图12可知，以400nm为激发波长，随着时间由0min增至180min，复合pH探针L(pH＝7.4)在507nm处荧光的强度没有变化，由此可知复合探针L在溶液中检测pH具有良好的光稳定性。
由图13可知，复合纳米荧光探针L可以在细胞中检测pH的变化。
综上所述，本发明阐述了一种两亲嵌段共聚物复合纳米探针，具有较好的水溶性和N,N-二甲基亚砜溶解性，而且该复合纳米荧光探针具有较好的光稳定性、抗干扰性在较大范围内荧光强度与pH值呈线性关系，适用于细胞检测。
Claims (7)
1.一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针，其特征在于：纳米荧光探针是以化合物1 6-(4-十二烷基哌嗪)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮为发光化合物负载于两亲性嵌段高分子纳米材料聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA内制得，复合时选取小分子的包覆质量分数分别为1%、2%和4%，当包覆质量分数为2%时，合成过程如下：首先，称取100 mg两亲嵌段共聚物聚苯乙烯-b-聚丙烯酸PS35-b-PAA30置于50 mL的茄形瓶中，加入10 mL的有机溶剂N, N-二甲基甲酰胺（DMF），以500转/分在室温下搅拌10分钟至完全溶解，再准确称取2 mg化合物1置于茄形瓶溶液中，搅拌使其完全溶解，量取30 mL的超纯水，快速倒入茄形瓶混合液中，以1000转/分在室温下搅拌30分钟形成具有疏水性质的化合物1与嵌段共聚物的疏水端包裹在内部，嵌段共聚物的亲水端在外的纳米胶束溶液，在形成胶束后，用二氯甲烷作溶剂，通过三次透析除去混合溶液里的有机溶剂和未被包裹的化合物1，将透析后得到的复合液40 ℃真空干燥除去溶剂，最终得到复合pH探针L；若包覆质量分数为1%时，化合物1的加入量为1 mg，若包覆质量分数为4%时，化合物1的加入量为4mg，所述化合物1的结构式如下：
2.如权利要求1所述的一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针，其特征在于：所述两亲性嵌段高分子纳米材料为聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA，两亲性嵌段高分子纳米材料的链段n在30-40之间，m在20-35之间，其结构式如下：
3.如权利要求2所述的一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针，其特征在于，所述化合物1的合成包括以下步骤：
1)化合物3 6-溴-2-(2-吗啉基乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成
称取0.554 g 4-溴-1, 8-萘酐、525 μL的4-乙氨基-2-吗啉和10 mL乙醇于三口反应瓶中，搅拌并升温至78℃，回流1.5 h后，停止反应；反应液降至室温，将反应液进行减压抽滤，得浅黄色固体化合物3，将得到的浅黄色固体化合物3进行干燥，得到0.663 g的化合物3，其产率为85%；
2)化合物2 2-(2-吗啉基乙基)-6-哌嗪基-1H-苯并[de]-异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成
称取298.7 mg化合物3，129.2 mg哌嗪置于50 mL三口烧瓶中，加入10 mL乙二醇单甲醚，氩气保护下于124℃反应4 h，薄层色谱板监测反应过程；反应结束后冷却至室温，经柱层层析分离提纯，真空干燥得231.2 mg橙黄色固体化合物2，其产率为78.2%，其中洗脱剂体积比为VDCM/VEtOH=25/1；
3) 化合物1 6-(4-十二烷基哌嗪)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[de]-异喹啉-1, 3(2H)-二酮的合成
称取100 mg化合物2，138.2 mg碳酸钾，56 μL溴十二烷溶于15 mL乙腈中，回流反应8h，薄层色谱板监测反应过程；反应结束冷却至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤三次，将滤饼溶于5 mL二氯甲烷，经柱层层析分离提纯真空干燥得101.9 mg橙黄色固体化合物1，其产率为72.4%；其中洗脱剂体积比为VDCM/VEtOH=20/1。
4.如权利要求3所述的一种检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针，其特征在于，所述两亲性嵌段高分子纳米材料的制备包括以下步骤：
1) 聚苯乙烯PS-Br大分子引发剂的合成
取50 mL的希莱克瓶一个，采用加热抽真空-氮气置换的方式进行无氧无水操作，按照2-溴丙酸甲酯/溴化亚铜/五甲基二乙烯三胺/苯乙烯的摩尔比为1/1/2/100进行投料，即先将溴化亚铜加入希莱克瓶中，再加入4 mL除过水的甲苯、2-溴丙酸甲酯、五甲基二乙烯三胺，最后再加入苯乙烯，搅拌均匀；用液氮将反应样品冷冻、抽真空15 min、通氮气、解冻，反复三次，将其置于90℃油浴锅中，恒温反应21 h；用0℃的冰水浴淬冷停止反应；再加入5 mL四氢呋喃稀释，得绿色溶液；将绿色溶液过中性氧化铝柱，用甲苯淋洗除去铜盐，利用旋转蒸发仪将得到的无色澄清的液体浓缩至20 mL；将得到的浓缩液逐滴滴入200 mL冰冻甲醇中，得白色沉淀，减压抽滤得白色沉淀物，于40℃真空干燥箱中干燥24 h，得到大分子引发剂PS-Br，其数均分子量为3540，分布系数为1.34；
2) 聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA的合成
取一洁净的50 mL的希莱克瓶，采用加热抽真空-氮气置换的方式进行无氧无水操作，然后按大分子引发剂/溴化亚铜/五甲基二乙烯三胺/丙烯酸叔丁酯比例1/1.2/2.4/40进行投料，在氮气保护下，依次加入PS-Br、CuBr、LPMDETA、丙烯酸叔丁酯和15 mL甲苯，搅拌均匀，用液氮将反应样品冷冻、抽真空15 min、通氮气、解冻，反复三次，将其置于100℃的油浴锅中，恒温反应4 h，用0℃冰水浴淬冷停止反应，再加入5 mL四氢呋喃稀释，得绿色溶液，将绿色溶液过中性氧化铝柱，用甲苯淋洗除去铜盐，将滤液利用旋转蒸发仪浓缩至10 mL，将浓缩液逐滴滴入80 mL冰冻甲醇中，得白色沉淀，减压抽滤收集白色沉淀，于40℃真空干燥箱中干燥24 h，得2.0 g的PS-b-PtBA，数均分子量为7300，分布系数为1.45；
3）聚苯乙烯-b-聚丙烯酸叔丁酯PS-b-PtBA水解生成聚苯乙烯-b-聚丙烯酸PS35-b-PAA30
在50 mL的三口瓶中加入1.93 g PS-b-PtBA，用20 mL的二氯甲烷将其溶解，按PS-b-PtBA叔丁基官能团的摩尔数的五倍加入2.96 mL三氟乙酸，室温搅拌24 h，用旋转蒸发仪除去部分二氯甲烷，剩余15 mL浓缩液，将浓缩液滴加至水/甲醇的混合溶液中进行聚沉，水和甲醇的体积比为1:3，先用3000 rpm离心一部分，再用9000 rpm离心剩余部分，将最终离心下来的固体于40℃真空干燥箱中干燥24 h，得到1.5 g的PS35-b-PAA30，数均分子量为6819，分布系数为1.31，两亲嵌段共聚物PS35-b-PAA30为50 nm的囊泡。
5.一种如权利要求1-4任一所述的检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）纳米胶束的制备：将100 mg两亲性嵌段共聚物聚苯乙烯-b-聚丙烯酸置于50 mL茄形瓶中，加入10 mL N, N-二甲基甲酰胺，以500转/分在室温下搅拌10分钟至完全溶解，再将1-4 mg化合物1加入混合溶液中，搅拌使完全溶解，再加入30 mL超纯水，以1000转/分的搅拌速率搅拌30分钟形成具有疏水性质的化合物1与嵌段共聚物的疏水端包裹在内部，嵌段共聚物的亲水端在外的纳米胶束溶液；
2）纳米荧光探针的制备：向纳米胶束溶液中加入二氯甲烷进行透析，将透析后得到的复合液于40 ℃进行真空干燥，最终得到复合pH探针L。
6.如权利要求5所述的检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中透析次数为3次。
7.一种如权利要求6所述的检测细胞内pH值的聚合物纳米荧光探针的应用，其特征在于：用于细胞内荧光成像与pH的检测。
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| CN106317742A (zh) * | 2016-08-01 | 2017-01-11 | 中山大学 | 一种功能纳米网络结构聚合物材料及其制备方法与应用 |
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