CN114469893B

CN114469893B - 一种季铵盐化二氧化硅纳米颗粒及制备方法与应用

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Publication number: CN114469893B
Application number: CN202210086410.7A
Authority: CN
Inventors: 吴富根; 杨静; 祝雅璇
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2042-01-25
Also published as: CN114469893A

Abstract

本发明公开了一种季铵盐化二氧化硅纳米颗粒及制备方法与应用，该纳米颗粒内部是由四乙氧基硅烷通过水解聚合形成的用于吸附并聚集细菌的网状结构，纳米颗粒的表面含有用于抗菌的长链烷烃的季铵盐基团。以二甲基十八烷基[3‑(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵和四乙氧基硅烷为原料，通过一步加热搅拌的方法，利用易得且便宜的商品化原料，以大于90%的产率制备得到该季铵盐化的二氧化硅纳米颗粒。该纳米颗粒通过“吸附—聚集—破坏”的机理来杀伤细菌，同时该纳米颗粒具有良好的水分散性和较低的细胞毒性，并可在室温下长期稳定保存至少400天，适合在含水体系中的各种抗菌应用。

Description

一种季铵盐化二氧化硅纳米颗粒及制备方法与应用

技术领域

本发明属于抗菌纳米材料，具体涉及一种季铵盐化二氧化硅纳米颗粒及制备方法与应用。

背景技术

纳米材料由于其表面性能活跃和易于修饰等性质，在能源、催化、生物成像和载药等领域发挥着重要的作用。为减少抗生素的使用以及找到新的更为有效的抗菌药物或试剂，人们已经开发出了各种抗菌纳米材料，包括金、钯、银及其氧化物、铜及其氧化物或硫化物、二氧化钛、氧化硒、氧化镁、氧化钙和氧化锌等含金属纳米材料，碳量子点、石墨烯和氧化石墨烯等基于碳的一维或二维纳米材料，由聚集诱导发光分子、多肽、天然有机大分子和两亲性高分子等组装形成的纳米颗粒等。然而，这些材料常常原料价格高昂、制备流程复杂、有较明显的生物毒性或制备产率低，限制了其在生物体内的应用以及工业大规模生产。特别是以碳材料为原料制备的纳米材料，如之前曾报道过的用二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵和甘油通过一步水热法制备的碳量子点，虽然也可以起到抗菌的作用，但是并不能诱导细菌产生聚集行为，且对细胞有一定的毒性，因此其抗菌应用受到了限制。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种以硅源作为原材料的具有新的“吸附-聚集-破坏”的抗菌机制、良好的抗菌效果以及较好的生物安全性的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒；本发明的第二目的在于提供上述季铵盐化二氧化硅纳米颗粒的制备方法；本发明的第三目的在于提供上述季铵盐化二氧化硅纳米颗粒作为抗菌试剂以及在制备抗菌药物方面的应用。

技术方案：本发明的一种季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，该纳米颗粒在微观上是由四乙氧基硅烷通过水解聚合形成的用于吸附并聚集细菌的网状结构，纳米颗粒的表面含有用于抗菌的长链烷烃的季铵盐基团。

进一步的，所述长链烷烃的季铵盐基团由二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵提供。

进一步的，所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵为溶于甲醇溶液的混合液，其占混合液质量百分比为40~45%。

进一步的，该纳米颗粒的平均粒径为33~34nm。

上述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）将四乙氧基硅烷和溶于甲醇的二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵溶液依次加入去离子水，经摇晃得混合液；

（2）将步骤（1）所得混合液置于油浴中磁力搅拌反应，然后将反应完成后所得的溶液进行透析，得到纯化后的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒。

进一步的，所述步骤（1）中，四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的摩尔比为3~4：1。

进一步的，所述步骤（2）中，反应温度为55~65℃，反应时间为8~20 h，磁力搅拌转速为800~1000转/分钟。

进一步的，所述步骤（2）中，透析采用的透析液为去离子水，透析膜的截留分子量为1 kDa~100 kDa。

上述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒可以用于抗菌试剂。

上述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒还可以用于制备抗菌药物。

本发明材料的成型原理：利用两种硅烷化试剂，通过一步加热搅拌的方法制备。参见图1，四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵在水中分别水解后带有羟基，随后四乙氧基硅烷之间的羟基进行脱水聚合形成网状结构，同时四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵之间同样通过羟基间的脱水进行聚合，使得含长链烷烃的季铵盐基团在最外侧的表面。

本发明纳米颗粒的抗菌原理为：该纳米颗粒通过“吸附-聚集-破坏”的机理来杀伤细菌，首先纳米颗粒通过疏水和静电相互作用吸附到细菌表面，通过网状的结构将细菌细胞严密“包围”；随后纳米颗粒诱导细菌形成微米级的聚集体；最后纳米颗粒会导致细菌细胞壁/膜的破坏，诱导细胞内活性氧大量生成，进而破坏细菌的DNA，并最终导致细胞死亡。

有益效果：与现有技术相比，本发明的具有如下显著优点：（1）本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，可以有效抑制和杀死革兰氏阳性菌，具有粒径均一、生物相容性好、水分散性好、制备简单、成本低廉、产率高以及保质期长等优点，可作为一种新型的硅基纳米材料用于治疗微生物感染、体表消毒以及日常抑菌清洁等；（2）本发明制得的二氧化硅纳米颗粒制备过程简单、生产成本低廉、产率可高达93~100%左右；（3）本发明制得的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒具有较小的粒径、很好的水分散性和极高的稳定性，适合在含水体系中的各种抗菌应用，具有显著的工业生产和生物抗菌领域的应用价值；（4）能有效聚集并杀死革兰氏阳性菌，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为33 μg mL⁻¹；（5）细胞毒性低：在200 μgmL⁻¹下对正常的肝细胞（L02）的细胞毒性评价（MTT）结果表明至少有86%以上的细胞存活率。

附图说明

图1为四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵水解并形成季铵盐化二氧化硅材料的示意图；

图2为不同摩尔比的四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵反应所形成的季铵盐化二氧化硅材料的扫描电子显微镜（SEM）图，其中TS0、TS0.5和TS1的比例尺均为2 μm，TS2、TS3、TS4和TS8的比例尺均为400 nm；

图3为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图；

图4为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒的水动力学直径随时间变化图；

图5为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的平板涂布结果统计图；

图6为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒与金黄色葡萄球菌共孵育后的扫描电子显微镜（SEM）图；

图7为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒与金黄色葡萄球菌共孵育不同时间点的荧光共聚焦显微镜图；

图8为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒促使金黄色葡萄球菌胞内活性氧大量生成的荧光强度表征图；

图9为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒与金黄色葡萄球菌共孵育后，对细菌的基因组进行提取和纯化处理后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图；

图10为本发明所得季铵盐化二氧化硅纳米颗粒对正常肝细胞（L02）的毒性检测（MTT）结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

四乙氧基硅烷购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵溶液购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

实施例1

（1）将6 mmol（1.344 mL）四乙氧基硅烷和1.5 mmol（2.014 mL）二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵依次加入12 mL去离子水，摇晃得到混合液，然后加入磁子；

（2）将甲基硅油在磁力加热搅拌台上预热到60℃后，将步骤（1）所得的混合液置于其中，加热搅拌8小时，制得季铵盐化二氧化硅材料；

（3）通过透析纯化上述季铵盐化二氧化硅材料。

其中，所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵为溶于甲醇中的混合液，其占混合液质量百分比为42%；透析液为去离子水，透析膜截留分子量可选50 kDa。

实施例2

（2）将甲基硅油在磁力加热搅拌台上预热到65℃后，将步骤（1）所得的混合液置于其中，加热搅拌20小时，制得季铵盐化二氧化硅材料；

（3）通过透析纯化上述季铵盐化二氧化硅材料。

其中，所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵为溶于甲醇中的混合液，其占混合液质量百分比为40%；透析液为去离子水，透析膜截留分子量可选1 kDa。

实施例3

（2）将甲基硅油在磁力加热搅拌台上预热到55℃后，将步骤（1）所得的混合液置于其中，加热搅拌15小时，制得季铵盐化二氧化硅材料；

（3）通过透析纯化上述季铵盐化二氧化硅材料。

其中，所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵为溶于甲醇中的混合液，其占混合液质量百分比为45%；透析液为去离子水，透析膜截留分子量可选100 kDa。

实施例4

具体制备过程同实施例1，不同之处在于：四乙氧基硅烷与二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的摩尔比分别为0：1、0.5：1、1：1、2：1、3：1和8：1时，所得季铵盐化二氧化硅材料分别命名为TS0、TS0.5、TS1、TS2、TS3和TS8，实施例1制备的材料命名为TS4，它们的扫描电子显微镜图片见图2。其中，TS3和TS4为球形的纳米颗粒，即本发明所指的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒。说明四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的摩尔比应介于3：1与4：1之间，其中摩尔比4：1为最优选。

采用透射电子显微镜观察实施例1所得TS4纳米颗粒的形貌和粒径（见图3），可见其为球形，且粒径分布均一，约33.5 nm左右。

采用电位粒度分析仪分析实施例1所得TS4纳米颗粒，可见其水动力学直径粒径分布均一，略大于透射电子显微镜所示粒径大小，且可以在水溶液中室温保存至少400天（见图4）。

实施例5

具体制备过程同实施例1，不同之处在于：用三乙氧基甲基硅烷替换四乙氧基硅烷在一定条件下反应。

参见图1的反应过程，即：6 mmol三乙氧基甲基硅烷，1.5 mmol二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵和12 mL去离子水在60℃油浴中，磁力搅拌8小时得到液体，经透析纯化后，用激光笔测试，发现液体无明显光路（即无丁达尔现象，表明未形成纳米胶体颗粒），且使用电位粒度分析仪并未检测到纳米级颗粒形成。该结果证实，四乙氧基硅烷的引入于纳米颗粒的形成至关重要。

实施例6

平板涂布法测试实施例1的TS4纳米颗粒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的杀灭能力，方法如下：

选取培养过夜的S. aureus，以1：30的比例稀释，在37 ℃培养箱中生长2−3个小时至细菌在600 nm处的吸光度为0.5左右，此时细菌的个数约为1 × 10⁸ CFU mL⁻¹，用去离子水稀释5倍后，与2倍浓度的TS4纳米颗粒分散液等体积混合，得到的混合液最终含细菌个数约为1 × 10⁷ CFU mL⁻¹，含TS4纳米颗粒分别为0、20、50、100、150和200 µg mL⁻¹。上述混合液置于37 ℃培养4小时后，分别将菌液在水中分步稀释，最终稀释40000倍，并取稀释液50μL置于已凝固的培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，置于37℃培养20个小时后，对其进行拍照计数，实验结果见图5。计算细菌存活率 = （平板克隆形成单位数×涂板稀释倍数）/（对照组平板克隆形成单位数×涂板稀释倍数）。所有涂板实验至少重复三次。平板涂布实验结果表明，在细菌个数为~1 × 10⁷ CFU mL⁻¹情况下，TS4纳米颗粒分散液浓度超过50 µg mL⁻¹时，即可杀死绝大部分S. aureus。

实施例7

测试实施例1所得TS4纳米颗粒对S. aureus的最小抑菌浓度（MIC），方法如下：

选取培养过夜的S. aureus悬液，用LB培养基以1：30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2~3个小时至细菌在600 nm处的吸光度为0.5左右。将S. aureus悬液用LB培养基稀释1000倍，与含有不同2倍浓度的TS4纳米颗粒分散液等体积混合后，种于96孔板中，置于37℃培养18个小时后，没有出现明显浑浊的浓度，即为TS4纳米颗粒对S. aureus的MIC。实验结果表明，在S. aureus的个数为~1 × 10⁵ CFU mL⁻¹时，该TS4纳米颗粒浓度为33 µg mL⁻¹时，没有出现浑浊，33 µg mL⁻¹即为TS4纳米颗粒对S. aureus的MIC值。

实施例8

探索实施例1的TS4纳米颗粒与S. aureus相互作用的机制，借助扫描电子显微镜观察，方法如下：

选取培养过夜的S. aureus悬液，用LB培养基以1：30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2~3个小时至细菌在600 nm处的吸光度为0.5左右。取1 mL上述细菌悬液7500 rpm离心5 min，弃上清，并用1 mL含1 mg mL⁻¹ TS4纳米颗粒的分散液重悬，室温下震荡孵育4小时。孵育后得到的细菌与纳米颗粒悬液置于7500 rpm离心5 min，弃上清。随后，加入PBS重悬，7500 rpm离心5 min，弃上清，以清洗样品。接着，依次向沉淀物中加入30%、50%、70%、80%、90%和95%的酒精重悬，室温静置10 min，并7500 rpm离心5 min，弃上清，以对样品进行梯度脱水。最终得到的沉淀物重悬于无水乙醇，静置不少于10 min后滴加于干净硅片上，并在室温下干燥后用扫描电子显微镜观察拍照（见图6）。实验结果表明，TS4纳米颗粒可以致密地包裹在S. aureus的表面，并使细菌产生一定程度的聚集。

实施例9

测试实施例1的TS4纳米颗粒诱导S. aureus形成聚集体的能力，方法如下：

选取培养过夜的S. aureus悬液，用LB培养基以1：30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2~3个小时至细菌在600 nm处的吸光度为0.5左右。取1 mL上述细菌悬液7500 rpm离心5 min，弃上清，并用1 mL含1 mg mL⁻¹ TS4纳米颗粒的LB培养基重悬于1.5 mL离心管中，重复上述操作，得到若干管相同的上述细菌和纳米颗粒悬液，置于37℃振荡培养箱中培养，分别在不同时间点用细菌死活染色试剂盒进行染色（所有细菌均会被发绿色荧光的SYTO 9染色，而死细菌会被发红色荧光的碘化丙啶染色），之后用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照，并整理所得结果见图7（其中绿色通道为SYTO 9染色结果，红色通道为碘化丙啶染色结果）。结果表明，TS4纳米颗粒可以诱导S. aureus形成微米级聚集体。

实施例10

测试实施例1的TS4纳米颗粒对S. aureus细胞内活性氧产生的影响，方法如下：

选取培养过夜的S. aureus悬液，用LB培养基以1：30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2~3个小时至细菌在600 nm处的吸光度为0.5左右。取1 mL上述细菌悬液7500 rpm离心5 min，弃上清，并用1 mL含1 mg mL⁻¹ TS4纳米颗粒的分散液重悬，室温下震荡孵育4小时。加入适量活性氧探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯，使悬液中其终浓度为10 μM，37℃振荡孵育20 min。接着，将所得悬液滴加到载玻片上，并用激光共聚焦显微镜进行观察，可以发现（见图8）实验组（使用TS4纳米颗粒处理的S. aureus）比对照组（只含S. aureus）显示出更强的绿色荧光强度，即产生了更多的胞内活性氧。

实施例11

测试实施例1的TS4纳米颗粒对S. aureus的DNA作用效果，方法如下：

选取培养过夜的S. aureus悬液，用LB培养基以1：30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2~3个小时至细菌在600 nm处的吸光度为0.5左右。取1 mL上述细菌悬液7500 rpm离心5 min，弃上清，并用1 mL含1 mg mL⁻¹ TS4纳米颗粒的分散液重悬，室温下震荡孵育4小时。之后，使用从天根生化科技(北京)有限公司所购买的细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）进行细菌DNA的提取和纯化，并混入适量6×核酸（DNA）电泳上样缓冲溶液。提前制备好0.7wt%琼脂糖凝胶并放入电泳槽内，而后将含缓冲液的DNA溶液加入0.7 wt%琼脂糖凝胶上样孔道内。然后，调节电压为90 V，电泳约50 min，取出凝胶，并在紫外观测仪上观察并记录电泳结果（见图9）。

实施例12

测试实施例1的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒的细胞毒性，方法如下：

选择正常肝细胞L02，以5 × 10⁴个 mL⁻¹细胞分别与浓度为0、10、20、40、80、100、160和200 µg mL⁻¹的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒孵育4小时后，利用酶标仪采用MTT检测法测定纳米颗粒对L02细胞的毒性，结果见图10。实验结果表明纳米颗粒浓度在远大于细菌MIC的浓度下，细胞仍有86%以上的存活率，说明该纳米颗粒具有良好的哺乳动物细胞相容性。

Claims

1.一种季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒在微观上是由四乙氧基硅烷通过水解聚合形成的用于吸附并聚集细菌的网状结构，纳米颗粒的表面含有用于抗菌的长链烷烃的季铵盐基团；所述长链烷烃的季铵盐基团由二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵提供，所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）将四乙氧基硅烷和溶于甲醇的二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵溶液依次加入去离子水，经摇晃得混合液；（2）将步骤（1）所得混合液置于油浴中磁力搅拌反应，然后将反应完成后所得的溶液进行透析，得到纯化后的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒；所述步骤（1）中，四乙氧基硅烷和二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵的摩尔比为3~4：1。

2.根据权利要求1所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，其特征在于：所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵为溶于甲醇溶液的混合液，其占混合液质量百分比为40~45%。

3.根据权利要求1所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒的平均粒径为33~34nm。

4.根据权利要求1所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，其特征在于：所述步骤（2）中，反应温度为55~65℃，反应时间为8~20 h；磁力搅拌转速为800~1000转/分钟。

5.根据权利要求1所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒，其特征在于：所述步骤（2）中，透析采用的透析液为去离子水，透析膜的截留分子量为1 kDa~100 kDa。

6.权利要求1所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒在制备抗菌试剂中的应用。

7.权利要求1所述的季铵盐化二氧化硅纳米颗粒在制备抗菌药物方面的应用。