TWI666270B - 一種抗菌複合材料及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種由中尺寸多孔性矽材和複數個銀奈米粒子所組成的複合材料，其中上述的中尺寸多孔性矽材包含一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，該複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述之中尺寸多孔性矽材的表面且該複數個銀奈米粒子在該表面的分布密度是107-1013number/cm2。其次，本發明也揭露該複合材料的製備方法和其在抗菌上的應用。

Description

一種抗菌複合材料及其製備方法
本發明是關於一種由中尺寸多孔性矽材和複數個銀奈米粒子所組成的複合材料。特別地，該複合材料是一新穎的抗菌複合材料。其次，本發明也提供該複合材料的製備方法和其應用。
長久以來，控制微生物的生長以維護社會大眾的安全和健康一直是一重要課題，在過去，諸如陽離子聚合物、多肽、酶和無機奈米粒子等都曾被探討其相關性質。
美國專利號US 7,893,104曾揭露了一種利用溶凝膠法製備粒子懸浮液的技術。
美國專利號US 8,318,698揭露了一種抗菌化合物，該抗菌化合物是以化學共價鍵結固定金屬在物體的表面上。
美國專利號US 9,491,946揭露了一種奈米粒子的內部空間結構含有重量百分比範圍10-24wt%的銀的配方組成物。
但是迄今為止，一種同時具有大的抗菌面積、易於控制的尺寸、規則的多孔性、良好的熱穩定性、容易進行表面修飾化和生物相容性等多種優點的複合材料仍然是一亟需突破的瓶頸。
綜上所述，一種由具有規則的多孔性基材所構成的抗菌複合材料在微生物控制的相關產業領域仍是一極具潛力開發和需要研究的課題。
鑒於上述之發明背景，為了符合產業上之要求，本發明的第一目的在於提供一複合材料，該複合材料係由一中尺寸多孔性矽材和複數個銀奈米粒子所組成，該中尺寸多孔性矽材包含一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，其中上述之複 數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述之中尺寸多孔性矽材的表面且該複數個銀奈米粒子在該表面的分布密度是107-1013number/cm2。
具體的，本發明的複合材料使用傅立葉-穿透式電子顯微鏡分析時，其結果顯示該複合材料具有二維六角形堆積的繞射圖樣和p6mm空間群的結構特徵。其次，本發明在沒有使用封端劑(capping agents)的情況下就能製成具有非常均勻分布的銀奈米粒子的複合材料，且維持該銀奈米粒子的高活性並防止其因產生凝聚現象而失去活性。第三，本發明所提供的複合材料上的複數個銀奈米粒子和官能基修飾化的矽材表面之間的物理性吸附作用力相當穩定，因此長時間使用本發明所述的複合材料時，其銀離子的釋放消耗非常低，使的本發明的複合材料相較於習知技術具有無法預期的效果。
本發明的第二目的在於提供一種抗菌複合材料的製備方法，其包含如下所述步驟。
步驟一、提供一中尺寸多孔性矽材，該中尺寸多孔性矽材包含一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子。
步驟二、使上述之中尺寸多孔性矽材和一矽烷反應得到一胺基化的矽材，該矽烷在該中尺寸多孔性矽材上形成一矽氧(Si-O)鍵結。
步驟三、加入一銀離子前驅物到一包含上述之胺基化矽材的溶媒。
步驟四、加入一還原劑至上述的溶媒中使上述的銀離子前驅物形成複數個銀奈米粒子，該複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述之胺基化矽材的表面上形成一抗菌複合材料，該抗菌複合材料的表面上之銀奈米粒子分布密度是107-1013number/cm2。
本發明所述的表面具有垂直奈米管的中尺寸多孔性矽材是以矽化合物作為起始物製備而得到，該矽化合物包含烷基矽烷、四乙氧基矽烷(tetraethoxysilane(TEOS))、四甲氧基矽烷(tetramethoxysilane)、氣相二氧化矽(fumed silica)、沸石(zeolite seeds)、矽酸鈉和一矽烷前驅物，該矽烷前驅物包含任一可產生矽酸或矽酸鹽的含矽化合物。
本發明為了達到同時在中尺寸多孔性矽材之表面上導入不同官能基之目的，本發明採用將上述之中尺寸多孔性矽材和具有多樣化官能基的矽烷進行反應的技術方案予以實現該目的，該矽烷包括3-氨基丙基三甲氧基矽烷((3- aminopropyl)trimethoxysilane)和N-[(3-三甲氧基矽基)丙基]乙二胺(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine)。
本發明的又-目的在於提供一種抑制細菌在物體表面生長的方法，該方法包含：提供一組成物，該組成物包含一有效濃度的複合材料，該複合材料是選自下列群組之一及其組合：抗菌酶-矽複合材料和銀-矽複合材料；和塗佈上述之組成物在一物體表面，借以抑制細菌在該物體表面生長。
較佳地，上述之抗菌酶-矽複合材料是溶菌酶-矽複合材料；為了達到優異的抗菌效果，每克的該溶菌酶-矽複合材料包含50~3000毫克的溶菌酶。
第二，本發明的銀-矽複合材料的銀離子釋放濃度小於0.6ppm，表示上述之銀-矽複合材料的抗菌效果穩定，因此在長時間使用的情況下也能維持良好的抗菌效果，明顯比傳統之抗菌效果會隨時間衰變的抗菌材料優異。
綜上所述，本發明揭露了一種由具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽材和兩種抗菌劑以物理作用力互相結合所組成的抗菌複合材料，上述兩種抗菌劑分別是銀奈米粒子(AgNPs)和抗菌酶。其次，本發明也提供了一種銀-矽抗菌 複合材料的製備方法和上述之抗菌複合材料在抗革蘭氏陽菌和格蘭氏陰菌的應用。
有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之一較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。為了能徹底地瞭解本發明，將在下列的描述中提出詳盡的步驟及其組成。顯然地，本發明的施行並未限定於該領域之技藝者所熟習的特殊細節。另一方面，眾所周知的組成或步驟並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要之限制。本發明的較佳實施例會詳細描述如下，然而除了這些詳細描述之外，本發明還可以廣泛地施行在其他的實施例中，且本發明的範圍不受限定，其以之後的專利範圍為準。
根據本發明的第一實施例，本發明提供一種複合材料，該複合材料係由一中尺寸多孔性矽材和複數個銀奈米粒子所組成，該中尺寸多孔性矽材包含一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，其中上述之複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述之中尺寸多孔性矽材的表面且該複數個銀奈米粒子在該表面的分布密度是107-1013number/cm2。
於一具體實施範例，其中上述之中尺寸多孔性矽材的平均孔洞直徑是2~15nm。
於一具體實施範例，該複合材料的傅立葉-穿透式電子顯微鏡(FFT-TEM(fast Fourier transform))分析結果顯示其具有二維六角形堆積的繞射圖樣和p6mm空間群。
於一具體實施範例，其中上述之中尺寸多孔性矽材的表面包含胺基。
於一具體實施範例，其中上述之複數個銀奈米粒子的平均直徑小於20nm。
於一具體實施範例，該複合材料係為下述群組的組成之一：抗菌塗料、醫療器材或衛浴材料。
於一具體實施範例，上述之抗菌塗料係使用在細胞培養器材、內視鏡、假牙、手術設備或生醫材料。
根據本發明第二實施例，本發明提供一種抗菌複合材料的製備方法，其包含如下步驟：(1)提供一中尺寸多孔性矽材，該中尺寸多孔性矽材包含一表 面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子；(2)使上述之中尺寸多孔性矽材和一矽烷反應得到一胺基化的矽材，該矽烷在該中尺寸多孔性矽材上形成一矽氧(Si-O)鍵結；(3)加入一銀離子前驅物到一包含上述之胺基化矽材的溶媒；和(4)加入一還原劑至上述的溶媒中使上述的銀離子前驅物形成複數個銀奈米粒子，該複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述之胺基化矽材的表面上形成一抗菌複合材料，該抗菌複合材料的表面上之銀奈米粒子分布密度是107-1013number/cm2。
於一具體實施範例，其中上述之矽烷包括3-氨基丙基三甲氧基矽烷((3-aminopropyl)trimethoxysilane)和N-[(3-三甲氧基矽基)丙基]乙二胺(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine)。
於一具體實施範例，其中上述之銀離子前驅物是硝酸銀。較佳地，上述之硝酸銀的使用濃度是0.1~3.0mM。
於一具體實施範例，其中上述之還原劑是濃度0.1-10mM的硼氫化鈉。
據本發明第三實施例，本發明提供一種抑制細菌在物體表面生長的方法，該方法包含：提供一組成物，該組成物包含一有效濃度的複合材料，該 複合材料是選自下列群組之一及其組合：抗菌酶-矽複合材料和銀-矽複合材料；和塗佈上述之組成物在一物體表面，借以抑制細菌在該物體表面生長。
較佳地，上述之抗菌酶-矽複合材料是溶菌酶-矽複合材料。
於一具體實施範例，上述之溶菌酶-矽複合材料係由一溶菌酶和一中尺寸多孔性矽材所組成，該中尺寸多孔性矽材係選自一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，且該中尺寸多孔性矽材的平均孔洞直徑是1~15奈米(nm)。
於一具體實施範例，其中上述每公克之抗菌酶-矽複合材料含有50-3000毫克的溶菌酶。
於一具體實施範例，其中上述之銀-矽複合材料的銀離子釋放濃度小於0.6ppm。
於一具體實施範例，其中上述之銀-矽複合材料係由複數個銀奈米粒子和一中尺寸多孔性矽材所組成，該中尺寸多孔性矽材係選自一表面具有垂直奈 米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，且該中尺寸多孔性矽材的平均孔洞直徑是1~15nm。
於一具體實施範例，其中上述之複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述的中尺寸多孔性矽材的表面，該銀奈米粒子的表面分布密度是107-1013number/cm2且平均直徑小於20nm。
於一具體實施範例，其中上述之中尺寸多孔性矽材的表面具有胺基。.
於一具體實施範例，其中上述之物體包括塑膠、橡膠、金屬、陶瓷、玻璃、紗布、棉花和纖維。
以下以詳細的實驗例說明本發明，但所揭示之實驗例僅是本發明的較佳實驗例，並非用以限制本發明之申請專利範圍。
實驗例一：合成具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜(SBA-15薄膜或SBA-15(⊥)薄膜)
本發明所述之具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜以SBA-15薄膜或SBA-15(⊥)薄膜表示，該SBA-15薄膜或SBA-15(⊥)薄膜是在酸性條件下利用一包含四級胺鹽的介面活性劑系統作為反應溶媒並使用矽酸鹽做為模板所製備而成。其中上述之包含四級胺鹽的介面活性劑系統是由十六烷基三甲基溴化銨cetyltrimethyl ammonium bromide((C16H33)N(CH3)3Br,CTAB)、十二烷基硫酸鈉sodium dodecyl sulfate(NaC12H25SO4,SDS)和共聚物poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-poly(ethylene glycol)(EO20PO70EO20,P123)所構成。具體的製備步驟如下：首先將0.75克的CTAB、0.89克的SDS和0.7克的P123加入150克的水中在45℃下混合攪拌形成所述的介面活性劑系統。接者將2.75克的矽酸鈉溶在150克0.04M的硫酸水溶液，並用氫氧化鈉調整pH值到4.3後形成一矽源溶液，將該矽源溶液加入上述預先製備好的介面活性劑系統並於45℃進行反應，反應後得到一混濁的溶液，該溶液中的沉澱物繼續在120℃反應24小時，藉此擴大該沉澱物表面之垂直奈米孔道到所需要的尺寸大小範圍，然後藉由過濾程序收集上述之沉澱物，該沉澱物在600℃煅燒6小時後所得到的產物就是本發明所述的SBA-15(⊥)薄膜。
結構特徵分析
以下利用各種精密儀器分析鑑定實驗例一所製備的SBA-15(⊥)薄膜的結構特徵。
掃瞄式電子顯微鏡Scanning Electron Microscopy(SEM)
掃描式電子顯微鏡的機型是Hitachi S-800場發式掃描電子顯微鏡，操作的加速電壓是5kV.。首先將待測樣品使用碳膠帶固定在分析用的載板上，並且於分析前使用真空乾燥該待測樣品後再進行分析。
穿透式電子顯微鏡Transmission Electron Microscopy(TEM)
TEM穿透式電子顯微鏡的機型是Hitachi H-7100穿透式電子顯微鏡，操作的加速電壓是75kV。首先將待測樣品分散在乙醇或水中，再沉積在碳包覆的銅網上，並且於分析前使用空氣乾燥該待測樣品後再進行分析。
粉末X射線繞射分析Powder X-ray Diffraction(XRD)
粉末X射線繞射分析是以PANalytical X’Pert PRO繞射儀在銅靶材的Kα放射波長等於0.154nm時進行待測樣品的繞射圖譜數據收集。其操作參數是45kV和40mA。對於低角度(2θ=0.5°-8°)的XRD掃描，其發散狹縫是 1/32度；對於廣角度(2θ=10°-80°)的XRD掃描，其發散狹縫是1/2度。待測樣品於分析前使用研缽研磨成均勻的粉末後再放置在量測載盤上進行量測分析。
氮氣吸附-脫附分析Nitrogen Adsorption-desorption Analysis
待測樣品的氮氣吸附-脫附等溫線圖是由Micrometric ASAP 2010分析儀在凱式溫度77K對該待測樣品進行測量並由電腦軟體繪製。其次，該待測樣品的特定表面積分析則是以BET(Brunauer-Emmett-Teller)方法在線性相對壓力0.05到0.3的區間對該待測樣品進行量測。第三，該待測樣品的表面孔洞之孔徑大小是以孔徑分佈圖的波峰位置決定，該孔徑分佈圖則是由BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方法所量測得到的吸附等溫線圖計算後進行繪製。而上述之待測樣品的孔洞體積則是利用在相對壓力(P/P0)0.993的單點吸附量進行估算。
Zeta電位(ζ)量測分析Zeta-potential
Zeta電位(ζ)的定義是一介於接近一物體表面的內部Helmholtz層和該物體懸浮的液相之間的電位。該電位代表在一特定狀態下的物體所帶有的電荷，上述之特定狀態是指該物體是懸浮在去離子水的狀態。以實驗例一為例，將所得到的SBA-15(⊥)薄膜先分散懸浮在去離子水中配製成待測樣品溶液後，再將 約800μL的該待測樣品溶液放置在Zetasizer Nano ZS90分析儀的分析室體(zeta cell)中進行該SBA-15(⊥)薄膜的Zeta電位的測量。
傅利葉轉換紅外光譜分析Fourier Transform Infrared Spectroscopy(FTIR)
待測樣品的傅利葉轉換紅外光譜(FT-IR)是以Nicolet 550光譜儀進行掃描分析。首先將待測樣品和KBr以重量比例1：200進行混合後，進行壓碇程序製備得到光譜儀分析用之樣品，該分析用之樣品再以Nicolet 550光譜儀進行掃描分析，其掃描分析的波數(wave number)量測範圍是從400到4000cm-1。
紫外光-可見光光譜分析Ultraviolet-visible(UV-vis)Spectroscopy
紫外光-可見光(UV-vis)光譜是由Hitachi U-3010光譜儀對待測樣品進行量測。首先將待測樣品均勻分散在去離子水中後放入石英管，然後再以Hitachi U-3010光譜儀進行分析。其中上述之(UV-vis)光譜的波長量測範圍是從300到700nm。
感應耦合電漿質譜儀Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry(ICP-MS)
待測樣品之銀離子的定量分析是使用感應耦合電漿質譜技術，所使用的感應耦合電漿質譜儀是Perkin-Elmer Alan-6000分析儀。待測樣品先以氫氟酸或王水進行消化處理，然後稀釋到分析濃度後再以上述之感應耦合電漿質譜儀進行該待測樣品之銀離子的定量分析。
實驗例一所製備得到的具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性薄膜(SBA-15(⊥)Thin Film)的結構特徵分析
如圖1和圖2所示，圖1是以掃描式電子顯微鏡觀察分析該SBA-15(⊥)薄膜的側面所得到的側面影像圖(side-view of the SBA-15(⊥)thin films)；圖2則是以穿透式電子顯微鏡觀察分析該SBA-15(⊥)薄膜所得到的俯視影像圖(top-view of the SBA-15(⊥)thin films)，根據圖1和圖2所示，實驗例一所製備的SBA-15(⊥)薄膜的橫向尺寸是微米等級，其厚度約為100nm。其次，上述之SBA-15(⊥)薄膜具有垂直奈米管道，且該垂直奈米管道具有完全開口的孔洞，同時該孔洞的孔徑大小一致約為9nm且該孔洞是規則狀的六角型並整齊依序排列在SBA-15(⊥)薄膜上。
如圖3所示，實驗例一所製備的SBA-15(⊥)薄膜的XRD分析圖譜在0.90°、1.5°和1.7°的位置有繞射波峰，此分析結果顯示該SBA-15(⊥)薄膜具有 一周期長度比例(d空間群)為2：：1，藉此證明該SBA-15(⊥)薄膜上的垂直奈米管道是六角型排列的結構特徵。而明確的波峰分布更進一步顯示證實該垂直奈米管道是整齊規則的排列在該SBA-15(⊥)薄膜上。
如圖4所示，該SBA-15(⊥)薄膜的表面型態(紋理)分析是利用氮氣吸附-脫附分析進行分析，其分析數據彙整於表1。根據分析結果顯示該SBA-15(⊥)薄膜具有type IV吸附分支和H1 type磁滯迴線，此結果再次證明該SBA-15(⊥)薄膜含有統一形狀的柱體形的中尺寸多孔洞的構造。同時，上述之SBA-15(⊥)薄膜的表面積是507m2/g，孔洞體積是0.93cm3/g且具有幾乎相同的孔洞尺寸(孔徑)大小，其約為9.6nm。
實驗例二：表面官能基化且具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜
為製備官能基化具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜，本實驗例二使用具有不同官能基的矽烷修飾實驗例一所製備的SBA-15(⊥)薄膜的表面而進一步得到各式表面官能基化且具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜，其通用製備步驟敘述如下。
將1克的實驗例一所製備得到的SBA-15(⊥)薄膜加到含有500毫升的乙醇和5毫升的矽烷的溶液中，所得到的混合液在80℃迴流24小時反應，待反應完全後經由過濾和乾燥步驟得到最終表面官能基化且具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜。
上述通用製備步驟中所述之矽烷分別是3-氨基丙基三甲氧基矽烷((3-aminopropyl)trimethoxysilane,APTMS),N-[(3-三甲氧基矽基)丙基]乙二胺(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine,EDPTMS),N-[(3-三甲氧基矽基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(3-(trimethoxysilyl)propyl-N,N,N-trimethylammonium chloride,TMAC)和3-氫硫基丙基三甲氧基矽烷((3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane,MPTMS)，對應得到的表面官能基化且具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜分別以SBA-15(⊥)_NH2,SBA-15(⊥)_NHCH2CH2NH2,SBA-15(⊥)_N(CH3)3OH和SBA-15(⊥)_SH表示。SBA-15(⊥)_SH再經氧化劑處理， 可得到SBA-15(⊥)_SO3H。未進行官能基化的SBA-15(⊥)薄膜表面本身具有氫氧基，以SBA-15(⊥)_OH表示。官能基化所使用的上述之矽烷因為和原本SBA-15(⊥)薄膜表面的氫氧基反應，而在SBA-15(⊥)表面形成矽-氧(Si-O)鍵結，藉此將上述之各式官能基固定在該SBA-15(⊥)的表面上而達到所述之表面官能基化的目的。
實驗例三：製備本發明之複合材料
製備本發明之複合材料的代表性步驟敘述如下。將1毫克未官能基化的(native)SBA-15薄膜或已官能基化的SBA-15薄膜個別懸浮在2毫升1.0mM硝酸銀水溶液中得到一混合溶液，該混合溶液在黑暗和室溫條件下攪拌2小時然後將0.2毫升冰浴的20mM硼氫化鈉水溶液加入上述之混合溶液，並持續攪拌一小時待該混合溶液反應完全產出沉澱物後，用去離子水反覆清洗該沉澱物，再以離心法分離出上述之沉澱物，進行乾燥後所得到的產物就是本發明所述之複合材料，該複合材料標示為SBA-15_X_Ag，其中X代表SBA-15薄膜表面上的官能基，如SBA-15_NH2_Ag即表示表面帶有NH2胺基且具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和複數個銀奈米粒子所構成的複合材料。
其次，本發明提供另一種分別在未官能基化(native)或已官能基化的SBA-15薄膜上形成複數個銀奈米粒子的方法，該方法是將上述之SBA-15薄膜浸泡在2毫升1.0mM硝酸銀水溶液中，然後在室溫暗處攪拌2小時後，直接在150℃鍛燒12小時使複數個銀奈米粒子形成在上述之SBA-15薄膜上得到本發明所述之複合材料。
實驗例三所製備本發明複合材料之結構特徵
為證明實驗例三所述之具有垂直奈米管道之中尺寸多孔性矽材與下列之矽烷APTMS或EDPTMS已經成功完成官能基化，以實驗例三所述之代表性步驟所製備的本發明之複合材料使用傅利葉轉換紅外光儀進行分析。本發明的複合材料的紅外光譜(FT-IR)如圖5所示，其特徵波峰位置的各個代表官能基詳列於表2。未官能基化的(native)SBA-15薄膜的光譜帶顯示從-OH(νs,3426cm-1)，Si-O-Si(νas,1093cm-1；νs,805cm-1)，Si-OH(νs,967cm-1)，Si-O(δ,467cm-1)到H2O(δ,1633cm-1)皆出現對應的特徵波峰(νs代表對稱拉伸(symmetric stretching)，νas代表不對稱拉伸(asymmetric stretching)，δ代表彎曲(bending))。但是如圖5虛線(-)和點線(--)所示，以本發明實驗例三所述之代表性步驟所製備得到的SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag和SBA-15_NH2_Ag的複合材料的紅外光譜在2930和1406cm-1的位置有明顯的特徵波峰，據此證明其表面 結構具有碳氫鍵結(-CH group)的拉伸和彎曲振動；其次，在967cm-1位置代表矽-氫氧鍵(Si-OH group)的特徵波峰也明顯的消失，據此證明，上述之SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag和SBA-15_NH2_Ag的複合材料之表面已經完成官能基化並具有胺基。
如表3所列之Zeta電位，其是實驗例三所使用的未官能基化的(native)SBA-15薄膜和已官能基化的SBA-15薄膜的Zeta電位，其中，SBA-15_OH表示未官能基化的SBA-15薄膜，其Zeta電位是-33mV；SBA-15_SO3H則是SBA-15_OH經過硫酸官能基化的薄膜，其Zeta電位是-27mV，可能因為其修飾程度和官能基的pKa的影響，SBA-15_SO3H和SBA-15_OH具有相近的Zeta電位強度。但是，當SBA-15_OH和帶有胺基的矽烷試劑進行官能基化時，可得到帶有不同強度的正Zeta電位之胺基化的SBA-15薄膜。其中，SBA- 15_NH(CH2)2NH2和SBA-15_NH2分別是SBA-15_OH與二級和一級胺反應所得到的胺基化的SBA-15薄膜，其中，SBA-15_NH(CH2)2NH2的Zeta電位是2mV，而SBA-15_NH2的Zeta電位是12mV；其次，當SBA-15_OH以四級胺進行修飾所得到的SBA-15_N(CH3)3OH，其Zeta電位是31mV。
實驗例三之影響銀奈米粒子尺寸的關鍵參數探討之一：銀離子前驅物之濃度
在實驗例三所述之代表性步驟，首先固定所使用之SBA-15_NH2和還原劑的總用量後，使用不同濃度的硝酸銀水溶液(0.20,0.50,1.0，和1.5mM)分別進行本發明所述之SBA-15_NH2_Ag複合材料的製備，並以穿透式電子顯微鏡分析以不同濃度的硝酸銀水溶液所製備得到的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子的尺寸。如表4和圖6(a)所示，當使用的硝酸銀水溶液是低濃度的0.20mM，所得到的SBA-15_NH2_Ag複合材料上銀奈米粒子的尺寸是7.8(±1.6)nm且根據圖6(a)顯示其銀奈米粒子的生成量較少。當使用的硝酸銀水溶液之濃度增 加到0.5mM，所得到的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子的尺寸明顯增加到8.2(±1.7)nm，且分布密度提高至約每平方公分有1.7×1011個粒子。如表4和圖6(b)所示，當使用的硝酸銀水溶液濃度再增加到1.0mM，所得到的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子的尺寸是8.6(±1.6)nm，同時分布密度更提高至每平方公分表面有6.7×1011個粒子。進一步再提高使用的硝酸銀水溶液濃度到1.5mM時，所得到的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子形成更大的尺寸，其數值是17(±5)nm，但是其分布密度降低至每平方公分表面僅有2.6×1010個粒子。綜上所述，當使用的硝酸銀水溶液的濃度是低於或等於1.0mM，所製備的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子尺寸小於10nm，且當硝酸銀水溶液的濃度是1.0mM時，其所製備的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子的分布密度最高。為了探討本發明其他的製程參數對於本發明複合材料上之銀奈米粒子的生成影響，後續研究將硝酸銀水溶液濃度設定在1.0mM。
實驗例三之影響銀奈米粒子尺寸的關鍵參數探討之二：還原劑之濃度
為最適化本發明之複合材料的製備方法的還原條件，。在固定所使用之SBA-15_NH2的量和硝酸銀水溶液濃度1.0mM後，使用一系列不同濃度的硼氫化鈉水溶液(0.40,1.0,2.0，和6.0mM)分別進行本發明所述之SBA-15_NH2_Ag複合材料的製備。如表5所示，在使用低濃度0.40mM的硼氫化鈉水溶液時，SBA-15_NH2上幾乎沒有生成任何的銀奈米粒子，當硼氫化鈉水溶液濃度增加到1.0mM，大尺寸的銀奈米粒子22(±6)nm還原生成在SBA-15_NH2上。在硼氫化鈉水溶液濃度增加到2.0mM時，所得到的SBA-15_NH2_Ag複合材料上的銀奈米粒子的尺寸是8.6(±1.6)nm，且分布密度是每平方公分有6.7×1011個粒子。當硼氫化鈉水溶液濃度增加到6.0mM，可製備合成含有大量小尺寸的銀奈米粒子6.9(±1.3)nm的SBA-15_NH2_Ag複合材料，且其銀奈米粒子的分布密度高達每平方公分有7.3×10個粒子。
不同官能基化的中尺寸多孔性矽材上之銀奈米粒子的生成探討
首先，SBA-15_OH和SBA-15_SO3H矽材皆具有負的zeta電位，上述之SBA-15_OH和SBA-15_SO3H在和銀離子前驅物混合時可以藉由靜電吸引力吸附銀離子，但是當該銀離子被硼氫化鈉還原成銀奈米粒子時，由於上述之SBA-15_OH和SBA-15_SO3H具有負的zeta電位而和生成的銀奈米粒子產生相斥作用，導致上述之銀奈米粒子無法一直吸附在具有負zeta電位值的SBA-15_OH和SBA-15_SO3H上，因此無法形成銀奈米粒子穩定吸附在上述矽材表面的複合材料。其次，SBA-15_NH(CH2)2NH2和SBA-15_NH2矽材皆具有正的zeta電位，如圖7(a)所示，該圖是SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag的穿透式電子顯微鏡影像圖，又如圖7(b)所示，該圖是SBA-15_NH2_Ag的穿透式電子顯微鏡影像圖，其顯示具有正zeta電位值的SBA-15_NH(CH2)2NH2和SBA-15_NH2矽材上會有大量銀奈米粒子被還原在其上而形成本發明所述之複合材料。為進一步確認上述SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag和SBA-15_NH2_Ag上之銀奈米粒子的尺寸，其尺寸分佈統計如圖8(a)和圖8(b)所示，根據圖8(a)，其SBA- 15_NH(CH2)2NH2_Ag含有較大尺寸的銀奈米粒子，其直徑約為14(±3.7)nm，而根據圖8(b)，SBA-15_NH2_Ag的銀奈米粒子尺寸明顯較小，其約為8.5(±0.25)nm。上述兩種複合材料上之銀奈米粒子尺寸的差異是和該複合材料上的胺基的孤電子對和銀離子間的配位程度有關。其中，SBA-15_NH(CH2)2NH2有較低的正zeta電位值，因此和銀離子的排斥力相對較弱，所以和大量銀離子配位，經還原反應後得到較大尺寸的銀奈米粒子。然而，SBA-15_NH2有較高的正zeta電位，因此和銀離子的靜電排斥力大，導致在成核區域聚集的銀離子數量較少。當還原反應後，SBA-15_NH2上的銀奈米粒子沒有過度生長，因此其銀奈米粒子的尺寸較小。至於SBA-15_N(CH3)3OH，由於該矽材上具有四級銨官能基的關係，因此SBA-15_N(CH3)3OH有最大的正zeta電位，但是由於缺少孤電子對的因素，使得SBA-15_N(CH3)3OH很難與銀離子配位，導致在還原反應後只有少量銀奈米粒子固定在SBA-15_N(CH3)3OH。
其次，不同的還原條件會使銀離子前驅物在不同官能基化的中尺寸多孔性矽材形成不同尺寸的銀奈米粒子。於一較佳實驗例，首先將SBA-15_NH2浸泡在1.0mM硝酸銀水溶液，室溫下在暗處攪拌2小時，然後在150℃鍛燒12小時，硝酸銀所解離的銀離子會在SBA-15_NH2上直接形成銀奈米粒子，經鍛燒 處理後再冷卻的SBA-15_NH2會從白色轉變為墨綠色。所形成的銀奈米粒子的尺寸小於2nm且是均勻地分佈於該SBA-15_NH2上。
實驗例三所製備複合材料之X射線繞射結構特徵
X射線繞射圖譜是用來確認本發明所述之複合材料上的銀奈米粒子的存在，如圖9所示，SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag和SBA-15_NH2_Ag的廣角X射線繞射圖譜都在以下2 θ角：38.1°，44.1°，64.3°，77.4°出現特徵繞射波峰。換言之，SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag和SBA-15_NH2_Ag的晶格結構符合銀的面心立方繞射平面(1 1 1)，(2 0 0)，(2 2 0)，(3 1 1)。上述之特徵繞射波峰由謝樂方程式(Scherrer equation)做進一步分析以估算該銀奈米粒子之微晶的尺寸，其結果列於表6，其中SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag的晶體尺寸約為12-15nm，SBA-15_NH2_Ag的晶體尺寸則為11-13nm，此結果與圖8(a)和8(b)的穿透式電子顯微鏡觀察結果一致。
理論上，奈米尺寸大小的銀粒子會引發表面電漿共振(surface plasma resonance)，當銀奈米粒子尺寸小於15nm時，在約400nm會產生一個特徵波峰(extinction peak)，如圖10所示，未官能基化(native)的SBA-15在光譜中無任何的特徵波峰，但是SBA-15_NH2_Ag和SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag皆在396nm位置有明確的特徵波峰。根據以上所述，上述之特徵波峰(extinction peak)的存在，具體證明本發明的製備方法可以成功的分別在SBA-15_NH2和SBA-15_NH(CH2)2NH2_的矽材上形成具有奈米尺寸的銀粒子。
抗菌效能研究：最低抑菌濃度(MIC)與最低殺菌濃度(MBC)測試
為研究抗菌效能，本發明使用大腸桿菌(Escherichia coli)進行最低抑菌濃度測試(minimum inhibition concentration，MIC)和最低殺菌濃度測試(minimum bactericidal concentration，MBC)。在MIC測試，先製備一系列不同濃度的銀-矽複合材料溶液並將分別其放入各試管中進行細菌培養，每個試管中的菌株的最終濃度控制在約5×106CFU/mL。在37℃培養24小時後，因細菌過度成長，試管中溶液變為混濁；但是當試管中的溶液呈現澄清狀，以肉眼觀察見不到菌落的生成時，該試管中的銀-矽複合材料溶液濃度定義為最低抑菌濃度(MIC)。MIC測試後，再進行MBC測試，上述之每個試管各取100μL的銀-矽複合材料溶液，在培養皿(agar plates)上進行繼代培養，如果培養皿上無菌落 生成，該繼代培養所使用之銀-矽複合材料溶液的濃度則定義為最低殺菌濃度(MBC)。
SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag和SBA-15_NH2_Ag的MIC和MBC測試皆是以肉眼進行觀察(eye’s observation)判定，其實驗步驟如下所述。首先，準備六根試管，分別置入濃度為0,0.8,0.9,1.0,1.1與1.2mg/mL的SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag的測試溶液，且加入約5×106CFU/mL等量的細菌。當試管中測試溶液出現混濁情形，代表細菌過度成長，沒有抑菌效果。當測試溶液的濃度提高到1.1mg/mL，試管中的測試溶液是澄清狀態，所以SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag的測試溶液之MIC值是1.1mg/mL。當上述之SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag測試溶液繼續進行繼代培養時，濃度為1.2mg/mL之SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag測試溶液沒有在培養皿上培養出菌落，因此該測試溶液之MBC是1.2mg/mL。以相同的方式，使用SBA-15_NH2_Ag製備不同濃度的測試溶液進行實驗，其測試溶液之濃度分別是0,0.5,0.6,0.7,0.8和0.9mg/mL。當SBA-15_NH2_Ag測試溶液濃度超過0.6mg/mL時，試管中測試溶液呈澄清狀態，沒有觀察出菌落，因此其MIC是0.6mg/mL。其次，當SBA-15_NH2_Ag測試溶液濃度是0.7mg/mL時，繼代培養的實驗結果是沒有菌落產生，因此SBA-15_NH2_Ag的MBC是0.7mg/mL。
將上述之MIC和MBC測試的結果，從所使用之複合材料的濃度轉換為銀的濃度，以感應耦合電漿質譜儀對銀進行定量分析，可得到上述之複合材料的銀負載量(loading amount)。實驗數據如表7所示。其中，銀奈米粒子尺寸約為14nm的SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag的複合材料，其MIC是1.1mg/mL(相當於18μg Ag/mL)，其MBC是1.2mg/mL(相當於19μg Ag/mL)。銀奈米粒子尺寸小於8.5nm的SBA-15_NH2_Ag的複合材料，其MIC是0.6mg/mL(相當於7.2μg Ag/mL)，其MBC是0.7mg/mL(相當於8.4μg Ag/mL)。
為了進一步證明本發明之複合材料的抗菌應用性，將銀-矽複合材料塗佈到不同的基材上，其效果以ISO測試法進行評估。抗菌活性(antibacterial activity)R之計算如表8和表9所示。判斷一個複合材料之抗菌效果是否優異之標準是其抗菌活性必須要大於2。
ISO 22196：硬質基材上之抗菌活性評估
為在硬質基材上進行抗菌活性評估，將SBA-15_NH2_Ag以旋轉塗佈(spin-coated)方式塗佈在玻璃片上，再以ISO 22196方法進行檢驗。對照組是沒有塗佈複合材料的玻璃片，所測試的硬質基材上皆培養約5×105CFU/cm2的大腸桿菌(E.coli)。在37℃，相對濕度超過95%的環境下培養24小時之後，將該硬質基材上的大腸桿菌以一洗液沖下(wash down)，並稀釋該洗液後再塗抹至瓊脂碟做菌落計算(colony counting)。對照組的玻璃片上，其菌株濃度約為2×107CFU/cm2，故其對數值是7.2；相較之下，以SBA-15_NH2_Ag塗佈之玻璃片上則沒有菌落生成，因此其對數值是在0以下。在ISO 22196測試，抗菌活性的定義是實驗組和對照組每平方公分的菌落形成單位(colony forming units)的對數值之差值，如表8所示，SBA-15_NH2_Ag的抗菌活性大於7.2。
ISO 20743：軟質基材上之抗菌活性評估
為在軟質基材上進行抗菌活性評估，此處所使用的軟質基材是紗布。首先，將SBA-15_NH2_Ag浸塗(dip-coating)到紗布(gauze swab)上，並以清潔 的紗布作為對照組。所測試的每塊紗布上培養等量的細菌，在培養活菌後，以洗液將細菌洗出，稀釋該洗液後再以瓊脂平皿培養法(agar plate culture method)做菌落計數。其結果顯示對照組有較多菌落形成，但是以SBA-15_NH2_Ag做評估測試的實驗組沒有菌落形成。培養之後，對照組的菌株濃度約為6×109CFU/mL，對數值是9.8。但是SBA-15_NH2_Ag則沒有觀察到菌落形成，對數值小於0。ISO 20743的抗菌活性定義是每毫升的聚落形成單位(colony forming units)的對數值之差值，因此，如表9所示，所述之SBA-15_NH2_Ag的抗菌活性大於9.8。
銀離子釋放測試
本發明之銀-矽複合材料上的銀奈米粒子的穩定性測試，是測量SBA-15_NH2_Ag在37℃下，pH 7.4的磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline solution)環境下(in vitro)觀測二星期其(in vitro)銀離子釋放量。銀離子的總累計釋放量係由感應耦合電漿質譜儀量測，如圖11所示。銀離子的釋放情形在第 一個小時有突釋效應(initial burst effect)，然後在濃度平衡下，逐漸成為平穩狀態(plateau)。其中，每一公克的銀-矽複合材料所釋放的銀離子總量低於0.94毫克，計算後之濃度相當0.47ppm，此結果證明了本發明之複合材料的銀奈米粒子在殺菌過程(bactericidal process)不會大量流失。因此，相較之下，本發明的複合材料和其他傳統抗菌複合材料具有優異且無法預期的穩定性。
本發明之複合材料之於臨床微生物的抗菌活性評估
針對本發明之複合材料在醫療上應用，以本發明之複合材料對於臨床微生物的細菌抑制能力作進一步實驗評估，本發明依據Nature protocols進行SBA-15_NH2_Ag對於臨床微生物的抗菌活性評估，所述之評估方法是臨床微生物接種菌量為5×105CFU/mL時，以所使用之SBA-15_NH2_Ag複合材料的MIC值做為評估基準。所測試的臨床微生物包含革蘭氏陰性桿菌(gram-negative bacilli)和革蘭氏陽性球菌(gram-positive cocci)。革蘭氏陰性桿菌包括有鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii，ATCC 19606)，克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae，ATCC 13883)，大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 25922)，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853).革蘭氏陽性球菌包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis，ATCC 29212)，屎腸球菌(Enterococcus faecium，ATCC 19434)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 25923)。如表 10所示，SBA-15_NH2_Ag對於大部分的革蘭氏陰性桿菌，如鮑氏不動桿菌，克雷伯氏肺炎菌，綠膿桿菌，SBA-15_NH2_Ag具有相當低的MIC值0.0125mg/mL(相當於0.15μg Ag/mL)。對於大腸桿菌SBA-15_NH2_Ag也有相當低的MIC值0.00625mg/mL(相當於0.075μg Ag/mL)。另外，對於革蘭氏陽性球菌則有不同的結果，SBA-15_NH2_Ag對糞腸球菌有較高的MIC值0.1mg/mL(相當於1.2μg Ag/mL)，對於屎腸球菌則是較低的0.00625mg/mL(相當於0.075μg Ag/mL)。較特別的是SBA-15_NH2_Ag對於金黄色葡萄球菌有非常低MIC值，低於0.003125mg/mL(相當於0.0375μg Ag/mL)，幾乎已達測試的偵測極限(detection limit)。基於上述結果，SBA-15_NH2_Ag對於臨床微生物，具有極佳的抗菌活性，在應用於醫療設備和儀器的抗菌塗佈領域上具有很大的潛力。
GPC：Gram-positive cocci.
實驗例四：合成擴孔中尺寸多孔性之矽奈米粒子(MSN_Ex)
擴孔中尺寸多孔性之矽奈米粒子(Pore-expanded Mesoporous Silica Nanoparticles)的合成是用軟模板法(soft-template method)，以癸烷(decane)作為擴孔劑(pore-expanding reagent)。分別將0.772克的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)與320克的水在50℃混合後，再將2.4毫升癸烷以24克乙醇溶解。由於，十六烷基三甲基溴化銨水溶液和癸烷/乙醇溶液混合之後，會產生水包油型微乳液(oil-in-water(O/W)microemulsions)，上述之水包油型微乳液在50℃攪拌12小時後，加入5.96克的氫氧化銨(NH4OH，35wt%)並再攪拌10分鐘。然後再加入6.68毫升的四乙氧基矽烷/乙醇混合液(29wt%)，在50℃攪拌1小時，並在50℃靜置20小時。以過濾法分離副產物得一溶液，該溶液以水熱法(hydrothermally treated)加熱到80℃持續24小時。以離心方法收集沉澱物後將其懸浮在50毫升的鹽酸/乙醇中，加熱到50℃並攪拌2小時來移除十六烷基三甲基溴化銨模板(CTAB templates)得到產物，此產物即為本發明所述之擴孔中尺寸多孔性之矽奈米粒子(MSN_Ex)。上述之產物以乙醇清洗並儲存在99.5%的乙醇中。
擴孔中尺寸多孔性之矽奈米粒子之結構特徵
擴孔中尺寸多孔性之矽奈米粒子的粉末X射線繞射分析如圖12所示，圖12中顯示具有中尺寸結構的布拉格反射峰(Bragg reflection peaks)，其中SBA-15的布拉格反射峰在1.07°，其晶格常數(cell parameter)是12.6nm。SBA-15經水熱法處理後得到的SBA-15_Hy，該SBA-15_Hy有三個布拉格反射峰，其位置分別是在0.897°，1.53°和1.73°，此顯示SBA-15_Hy具有二維六角晶格結構(presenting 2D-hexagonal(p6mm)structures)，其晶格常數(cell parameter)是11.4nm。其次，實驗例四所合成之擴孔中尺寸多孔性之矽奈米粒子(MSN_Ex)在2Theta角度1.25°的位置有布拉格反射峰，其晶格常數為8.19nm。
如圖13所示，本發明之中尺寸多孔性矽材的氮吸附脫附等溫線(Nitrogen adsorption-desorption isotherms)是典型的type IV吸附等溫線，該中尺寸多孔性矽材的物理參數列於表11。其中，SBA-15的BET表面積是524m2/g，BJH孔徑尺寸為4.4nm。SBA-15_Hy比表面積(specific surface area)為507m2/g，於相對高壓0.75時，顯示具有毛細凝聚現象(major capillary condensation)，與SBA-15比較，代表SBA-15_Hy上存在尺寸約9.6nm的中尺寸孔洞。而MSN_Ex的BET表面積是907m2/g，孔徑是6.2nm，因此可以增加其氮氣吸 附量。由於奈米粒子間距離相近的關係(textural porosity)，在相對壓力約0.9到1.0之間，就觀察到毛細凝聚現象之發生。
實驗例五：製備溶菌酶-矽複合材料
代表性製程如下述，取實驗例一或實驗例四所製備之中尺寸多孔性矽材10毫克，與20毫升的400毫克/升的溶菌酶溶液混合後，以不同pH值的磷酸鈉緩衝液(pH 4.6，6.8，9.5)調配成不同的濃度20，100，500mM的溶液，上述之溶液在室溫下搖盪24小時，然後以離心步驟分離該溶液，即得到本發明所述之溶菌酶-矽複合材料(lysozyme silica biocomposite)。殘留在上層溶液(supernatants)的溶菌酶以紫外光/可見光光譜儀(UV-vis spectrometer)在280nm定量分析該中尺寸多孔性矽材對溶菌酶的負載量。
為了要最適化溶菌酶在本發明之中尺寸多孔性矽材的吸收，不同的製程參數，如pH值和緩衝溶液的離子強度(ionic strength)也在本發明的研究探討範圍。傳統的習知技術，載體(support)與抗菌肽(antimicrobial peptides)以及蛋白質(AMPs)的鍵結是屬於共價鍵(covalent bond)，此方式使得AMPs的構型(conformation)發生改變，或者因遮蔽了其活性位置(active site)而降低了抗菌能力(antimicrobial ability)。但是本發明的技術，其AMPs穩定地固定(包含但不局限於溶菌酶)在本發明的中尺寸多孔性矽材的孔洞中且能防止溶菌酶的釋出。由於大部分AMPs組成皆少於50個胺基酸，因此小分子的AMPs比起大分子更容易裝載固定在本發明的中尺寸多孔性矽材的孔洞中，同時本發明也使用較大分子的溶菌酶來證明本發明的中尺寸多孔性矽材之孔徑和表面性質已經最適化而可以裝載入各式分子大小的AMPs。
由於溶菌酶吸附到中尺寸多孔性矽材的驅動力是靜電吸引力。綜上所述，蛋白質鍵結強度和吸附能力受限於pH值和離子強度。故在本發明的技術進一步調整上述因子來增加溶菌酶的吸附，並選擇以SBA-15_Hy作為酵素載體(enzyme loading)。
不同酸鹼環境對溶菌酶吸附之影響
溶菌酶和本發明之中尺寸多孔性矽材的等電點(isoelectric points，pI)分別約為11與2.0。但是，當該中尺寸多孔性矽材在pH超過10時，其可以溶解於食鹽水溶液。因此，在pH值從2.0到10之範圍，帶正電荷的溶菌酶可以吸附在帶負電荷的中尺寸多孔性矽材表面，且不會造成上述之中尺寸多孔性矽材的分解(decomposition)。據此，溶菌酶吸附的pH值控制在4.6，6.8和9.5，並將400毫克/升的溶菌酶放在20mM磷酸鈉緩衝液。中尺寸多孔性矽材的酵素(溶菌酶)固定化能力(enzyme-loading capacity)是藉由紫外光/可見光光譜儀(UV-vis spectrometer)在280nm測量上層溶液的溶菌酶吸附量。如圖14所示，在pH值4.6時，每公克中尺寸多孔性矽材僅吸附0.195毫克的溶菌酶；當pH值提升至6.8，每公克中尺寸多孔性矽材就能吸附約384mg/g溶菌酶，據此，本發明之中尺寸多孔性矽材和溶菌酶間的靜電交互作用增強。其中，上述之溶菌酶對於本發明之中尺寸多孔性矽材最高負載量是572mg/g，其進行吸附時的酸鹼值條件為在pH 9.5，該酸鹼值接近溶菌酶的等電點。
不同離子強度對溶菌酶吸附之影響
由於相對離子(counter ions)的遮蔽效應(shielding)，離子強度亦會影響本發明之中尺寸多孔性矽材和溶菌酶間的靜電交互作用。在本實驗評估，溶菌 酶吸附條件是在pH 9.5，將400毫克/升的溶菌酶放在20，100，500mM磷酸鈉緩衝液，如圖15所示，當緩衝液濃度是20mM，每公克本發明之中尺寸多孔性矽材吸附504毫克的溶菌酶，此表示上述之條件可達到高強度的鍵結。但是，當緩衝液濃度增加到100mM，溶菌酶之吸附量降至333毫克/克。當離子強度增加到500mM，僅少數之溶菌酶吸附。此代表當溶液中有過多的相對離子(counter ions)，會降低本發明之中尺寸多孔性矽材和溶菌酶之間的靜電交互作用。依據上述結果，為得到最高的溶菌酶之負載量，最佳的溶菌酶吸附條件是pH 9.5，在20mM磷酸鈉緩衝液。
本發明中尺寸多孔性矽材的溶菌酶之負載能力
為評估本發明中尺寸多孔性矽材的溶菌酶之負載能力，本評估使用2毫克中尺寸多孔性矽材進行評估，上述之中尺寸多孔性矽材分別懸浮在2毫升不同濃度，pH 9.5的溶菌酶溶劑(150,，300，600，750，1500，3000毫克/升)，和20mM磷酸鈉緩衝液中配製成測試溶液，上述測試溶液在室溫底下搖盪24小時，然後以離心步驟分離該測試溶液，殘留在上層液(supernatants)的溶菌酶濃度以紫外光/可見光光譜儀(UV-vis spectrometer)在280nm定量分析該中尺寸多孔性矽材對溶菌酶的負載量和測試溶液的平衡濃度。所得到之溶菌酶-矽複合材料產物分別標示為SBA-15_Lys，SBA-15_Hy_Lys，和MSN_Ex_Lys。
為研究調查本發明的中尺寸多孔性矽材對於溶菌酶負載能力，本評估將50毫克的本發明之中尺寸多孔性矽材在pH 9.5，20mM磷酸鈉緩衝液下，分別配製得到50毫升的1000毫克/升的溶菌酶溶液，上述之溶菌酶溶液在室溫下搖動24小時，然後以離心步驟分離該溶菌酶溶液，殘留在上層液(supernatants)的溶菌酶濃度以紫外光/可見光光譜儀(UV-vis spectrometer)在280nm來定量矽材對溶菌酶的負載量。
為建立本發明之溶菌酶-矽複合材料之溶菌酶脫附曲線，將1毫克的溶菌酶-矽複合材料懸浮於2毫升，pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline，PBS)並攪拌配製成測試溶液。於達到設計的實驗時間時，該測試溶液以離心方式分離得到一上層液，殘留在該上層液(supernatants)的溶菌酶濃度以紫外光/可見光光譜儀(UV-vis spectrometer)在280nm來定量矽材對溶菌酶的脫附量(desorption amounts)。
如圖16所示，該溶菌酶之吸附曲線是測量使用SBA-15，SBA-15_Hy與MSN_Ex中尺寸多孔性矽材作為吸附的載體在不同濃度的溶菌酶在pH值9.5，20mM磷酸鈉水溶液中進行吸附得到的溶菌酶的吸附量。以SBA-15_Lyz為例，，當溶菌酶溶液之平衡濃度(equilibrium concentration)-超過500毫克/升時， 其溶菌酶吸收曲線達到最大吸收值(maximum uptake)，每克的SBA-15矽材吸附約163毫克的溶菌酶。而SBA-15_Hy_Lyz的吸附曲線(The Langmuir-like adsorption curve)在平衡濃度低於450毫克/升時，其SBA-15_Hy_矽材對於溶菌酶就有爆發式的吸收(burst uptake)，並達到最大之溶菌酶吸附量595毫克/克。MSN_Ex_Lys的吸收曲線隨初始添加溶菌酶濃度增加呈現向上的趨勢，在平衡濃度130mg/L時，吸附的溶菌酶為2800mg/g。
如圖17所示，基於上述實驗數據，評估酵素固定在不同中尺寸多孔性矽材SBA-15、SBA-15_Hy和MSN_Ex的能力，當其實驗條件是在溶菌酶濃度1000mg/L固定不變，20mM，pH 9.5的磷酸鈉緩衝液時，SBA-15、SBA-15_Hy對溶菌酶的吸附能力會達到最大。每克的SBA-15_Lyz在一開始，只有98.7毫克的溶菌酶吸附，經數次沖洗，最後剩下82.4mg/g。SBA-15_Hy_Lyz有較大的孔徑9.6nm，於進行溶菌酶負載之後，溶菌酶吸附量達599mg/g，僅少量溶菌酶在清洗過程中流失，最終吸附量是589mg/g。SBA-15系列，在清洗流程初始，少量的溶菌酶浸出(leaching)，而後，無任何滲漏發生，表示只有極少量的多層蛋白質分子(multilayer protein molecules)固定在矽材外部表面。然而，MSN_Ex_Lys有最高的溶菌酶吸附量888mg/g，但與SBA-15系列矽材不同，在每次的清洗流程，約有45mg/g的溶菌酶流失，這代表多數藉由庫侖力 固定在MSN_Ex矽材外部表面的多層蛋白質分子，持續因清洗而流失。因此，經三次清洗後MSN_Ex_Lyz溶菌酶負載量只有754mg/g。
酵素負載後的矽材孔洞尺寸研究
在酵素負載後，為了研究矽材的孔洞尺寸，需使用氮氣吸附脫附分析(nitrogen adsorption-desorption analysis)結果請見圖18。溶菌酶-矽複合材料的所有氮氣吸附曲線結果顯示與原矽材比較都有明顯的氣體吸收量減少情形，證實了矽材有成功固定住蛋白質。SBA-15_Lyz吸附酵素量為82.4mg/g，其比表面積(specific surface areas)從524減至405m2/g，而孔徑仍維持4.4nm並無改變，如表12所示，意指酵素吸附僅發生在SBA-15的外表面，而不在中尺寸孔洞，這可能是由於溶菌酶的尺寸(3×3×4.5nm3)讓它們無法進入SBA-15的孔洞所致。然而，SBA-15_Hy_Lyz的BET表面積由507縮減到142m2/g，孔徑尺寸由9.6減至5.9nm，表示溶菌酶不僅吸附在SBA-15_Hy的外表面，也吸附於中尺寸孔洞內。相同的結果亦出現在MSN_Ex_Lys。MSN_Ex_Lys的BET表面積從907劇烈遞減至30.2m2/g，此外，MSN_Ex的中尺寸孔洞幾乎填滿酵素，使得MSN_Ex_Lys的孔洞體積接近於零。這樣的結果顯示多層蛋白質吸附在矽奈米粒子的外表面，也固定於中尺寸孔洞中。
為了決定溶菌酶從複合材料上溶出的程度，時間相依的釋放數據(time-dependent release profiles)在pH 7.4的PBS溶液中進行，結果紀錄於圖19。在釋出1小時後，SBA-15_Lyz的總脫附量約在80.5mg/g，釋出24小時，最終SBA-15_Lyz的酵素總量僅剩1.81mg/g，這可能是因為SBA-15的中尺寸孔洞狹窄，無法固定溶菌酶，讓溶菌酶和矽材間的相互作用力低所致。不同於SBA-15_Lyz，SBA-15_Hy_Lyz僅有少量，約26.9mg/g的溶菌酶脫附，最終仍保有高酵素負載量562mg/g。另外，MSN_Ex_Lyz的脫附總量在拉長實驗時間後，從250提高到602mg/g，是因為多層蛋白質(multilayer protein)和矽材之間 的靜電引力不夠大，無法固定住酵素。因此，最終MSN_Ex_Lyz酵素總量為152mg/g，遠低於SBA-15_Hy_Lyz酵素釋放24小時後的數據。
實驗例六：生物複合材料之抗菌塗佈
在本研究實驗例，將SBA-15_Hy_Lys以超音波震盪的方式懸浮於乙醇中，濃度為0.5mg/mL，再把40μL的混合液滴在面積為1×1cm的玻片上進行旋轉塗佈(spin-coating)，其轉速定為1500rpm並實施30秒，此流程共進行二次。溶菌酶-矽複合材塗佈於玻璃片上其作用是用來抑制細菌。在所有矽材，SBA-15_Hy_Lyz具有最高酵素負載量以及最少溶出量，故用作抗菌塗佈的實驗組，SBA-15_Hy是無抗菌劑的對照組。
螢光顯微鏡Fluorescence(FL)Microscopy
螢光顯微鏡圖像是由Olympus,IX71螢光顯微鏡拍攝。SYTO 9核酸染劑其最大的激發/放射值是480/500nm，碘化丙啶(propidium iodide)為490/635nm。
抗菌試驗Antibacterial Tests
一般而言，塗佈有SBA-15_Hy或SBA-15_Hy_Lys的測試玻片上接種有25μL大腸桿菌溶液，此溶液含有~5×105CFU/mL菌數和1mM EDTA。樣 品在37℃，濕度超過95%環境下接種24小時以避免乾燥。接種完畢，樣品以PBS清洗二次。有兩種鑑定方法來評估細菌的抑制。掃瞄式電子顯微鏡，以不同濃度的乙醇將樣品脫水(dehydration)，並進行臨界點乾燥(critical point drying)和鍍鉑(platinum plating)程序。利用螢光顯微鏡搭配細菌染色技術(bacterial staining techniques)用於判定活細菌與死亡細菌。活細菌可被綠螢光染料(SYTO 9 green)染色，而只有死亡細菌會被紅螢光染料(propidium iodide)染色。
接著使用另一個測試法確認生物複合材的抗菌活性，簡而言之，塗佈有SBA-15_Hy or SBA-15_Hy_Lys的測試玻片接種25μL大腸桿菌溶液，此溶液含有~5×105CFU/mL菌數，樣品在37℃，濕度超過95%環境下接種24小時以避免乾燥。接種完畢，將測試玻片上之細菌洗下，再將洗滌液於LB培養基(LB Broth)進行繼代培養做為另一次的接種。
為評估抗菌塗佈的細菌抑制，使用細菌染色來判定活和死細菌。所有活細菌全部可被綠螢光染料(SYTO 9 green)染色，只有死亡的細菌會被紅螢光染料(propidium iodide)染色。兩種染料皆是核酸染劑(nucleic acid stain)。玻片上的細菌圖像由Olympus,IX71螢光顯微鏡拍攝。圖20(a)~(d)顯示塗佈有SBA-15_Hy或SBA-15_Hy_Lyz的玻片接種大腸桿菌之後的螢光顯微鏡圖像，SBA- 15_Hy的圖像中，擁有長絲狀(long string shape)的細菌被綠螢光標示，其圖片顯示完整的桿菌狀結構(bacilliform structures)而沒有任何的細菌溶解現象(bacteriolyzed phenomenon)。然而，許多被紅和綠螢光標示的細菌殘骸碎片可以在SBA-15_Hy_Lyz圖像中看見，圖20(c)和20(d)說明大腸桿菌被溶解(bacteriolyzed)和受到傷害。上述的結果說明本發明之複合材料可藉由溶菌酶溶解微生物的細胞壁因而對細菌有溶解能力(lytic ability)，根據上述實驗證實SBA-15_Hy_Lyz可以應用於抗菌塗佈的產業領域。
為確認生物複合材料的抗菌活性，將前述進行完細菌抑制後之玻片，以洗滌液清洗玻片並收集洗液做繼代培養的接種，結果請見圖21。特別的是實驗中所有細菌接種程序都無使用到EDTA。SBA-15_Hy_Lyz的實驗結果中，試管#1的溶液是澄清，沒有菌落的生成，證明SBA-15_Hy_Lyz的溶菌能力(bacteriolytic ability)。而SBA-15_Hy的實驗結果，試管#2的溶液是混濁，顯示菌落過度生長，證明SBA-15_Hy沒有抑菌效果(inhibition effect)。
綜上所述，本發明是提供了一種中尺寸多孔性矽材作為基材，該基材上進一步負載銀奈米粒子或天然的抗菌酶作為抗菌複合材料。對於銀奈米粒子的尺寸和分布密度的控制，本發明也做了詳盡的調查和研究，並找出製程最適 化的銀奈米粒子前驅物的用量比例和還原劑的濃度。在抗菌效果測試，SBA-15_NH2_Ag複合材料展現了最佳的效果，同時該SBA-15_NH2_Ag複合材料的銀離子釋放濃度只有0.47ppm(PBS溶液；37℃)；在臨床微生物測試上，SBA-15_NH2_Ag複合材料對於S.aureus的MIC小於0.003125mg/mL(0.0375μg Ag/mL)；而且SBA-15_NH2_Ag複合材料具有平板狀的形狀，特別有利於應用在抗菌塗佈的領域。其次，在溶菌酶-矽複合材料，該溶菌酶和矽材的交互作用力主要是靜電吸引力。本發明的MSN_Ex和SBA-15_Hy矽材則特別適合用於負載溶菌酶，其中SBA-15_Hy矽材的溶菌酶負載能力可達到562mg/g且該複合材料相當穩定，特別適合作為抗菌生物複合材料。
以上雖以特定實驗例說明本發明，但並不因此限定本發明之範圍，只要不脫離本發明之要旨，熟悉本技藝者瞭解在不脫離本發明的意圖及範圍下可進行各種變形或變更。此外，摘要部分和標題僅是用來輔助專利文件搜尋之用，並非用來限制本發明之權利範圍。
圖1是本發明範例1所製備的具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜的掃描式電子顯微鏡(SEM)影像圖；圖2是本發明範例1所製備的具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜的穿透式電子顯微鏡影像圖，內插圖是圖2經傅立葉轉換的穿透式電子顯微鏡(Fast Fourier Transform-TEM)影像圖；圖3是本發明範例1所製備的具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜的X射線繞射(XRD)圖譜；圖4是本發明範例1所製備的具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜的氮氣吸附-脫附等溫線圖(內插圖是相對應的具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜之孔徑分佈圖)；圖5是本發明所提供的SBA-15中尺寸多孔性矽材(黑線)、SBA- 15_NH(CH2)2NH2_Ag複合材料(虛線)和SBA-15_NH2_Ag(點線)複合材料的傅立葉紅外光譜圖；圖6(a)是本發明使用濃度0.2mM AgNO3(aq)合成之銀-矽複合材料的穿透式電子顯微鏡影像圖和圖6(b)是本發明使用濃度1.0mM AgNO3(aq)合成之銀-矽複合材料的穿透式電子顯微鏡影像圖；圖7(a)是本發明所提供的SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag複合材料的穿透式電子顯微鏡影像圖和圖7(b)是本發明所提供的SBA-15_NH2_Ag複合材料的穿透式電子顯微鏡影像圖；圖8(a)是本發明所提供的SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag複合材料表面上的奈米銀粒子之尺寸分佈圖和圖8(b)是本發明所提供的SBA-15_NH2_Ag複合材料表面上的奈米銀粒子之尺寸分佈圖；圖9是本發明所提供的SBA-15_NH(CH2)2NH2_Ag複合材料(實線)和SBA-15_NH2_Ag複合材料(虛線)的X射線繞射(XRD)圖譜；圖10是本發明所提供的SBA-15中尺寸多孔性矽材(黑線)、SBA- 15_NH(CH2)2NH2_Ag複合材料(虛線)和SBA-15_NH2_Ag(點線)複合材料的紫外-可見光(UV-vis)吸收光譜圖；圖11是本發明所提供的SBA-15_NH2_Ag複合材料的銀離子釋放濃度和時間的關係圖；圖12是本發明所提供的SBA-15中尺寸多孔性矽材(實線)、SBA-15_Hy中尺寸多孔性矽材(虛線)和MSN_Ex中尺寸多孔性矽材(點線)的X射線繞射(XRD)圖譜；圖13是本發明所提供的SBA-15中尺寸多孔性矽材(三角形點線)、SBA-15_Hy中尺寸多孔性矽材(正方形點線)和MSN_Ex中尺寸多孔性矽材(圓形點線)的氮氣吸附-脫附等溫線圖(內插圖是相對應的材料之孔徑分佈圖)圖14是SBA-15_Hy中尺寸多孔性矽材分別在pH 4.6,6.8，和9.5的條件下的溶菌酶吸附量圖；圖15是SBA-15_Hy中尺寸多孔性矽材分別在使用20,100,and 500mM的sodium phosphate緩衝液的溶菌酶吸附量圖； 圖16是本發明的SBA-15_Lyz溶菌酶-矽複合材料(三角形點線)、SBA-15_Hy_Lyz溶菌酶-矽複合材料(圓形點線)和MSN_Ex_Lyz溶菌酶-矽複合材料(正方形點線)的吸附曲線圖；圖17是本發明的SBA-15_Lyz複合材料(斜線標示柱)，、SBA-15_Hy_Lyz複合材料(水平線標示柱)和MSN_Ex_Lyz複合材料(方格線標示柱)的溶菌酶承載能力(loading capacity)圖；圖18是本發明的SBA-15_Lyz複合材料(三角形點線)，、SBA-15_Hy_Lyz複合材料(圓形點線)和MSN_Ex_Lyz複合材料(正方形點線)的氮氣吸附-脫附等溫線圖(內插圖是相對應的材料之孔徑分佈圖)；圖19是本發明的SBA-15_Lyz複合材料(三角形點線)，、SBA-15_Hy_Lyz複合材料(圓形點線)和MSN_Ex_Lyz複合材料(正方形點線)的時間和溶菌酶溶出量的關係圖；圖20(a)是菌株以SBA-15_Hy中尺寸多孔性矽材處理後再使用SYTO 9染色(綠色)後的螢光顯微鏡影像圖；圖20(b)是菌株以SBA-15_Hy中尺寸多孔性矽材處 理後再使用PI染色(紅色)後的螢光顯微鏡影像圖；圖20(c)是菌株以本發明的SBA-15_Hy_Lyz複合材料處理後再使用SYTO 9染色(綠色)後的螢光顯微鏡影像圖；圖20(d)是菌株以本發明的SBA-15_Hy_Lyz複合材料處理後再使用PI染色(紅色)後的螢光顯微鏡影像圖；和圖21是本發明的SBA-15_Hy_Lyz複合材料(編號1)和SBA-15_Hy複合材料(編號2)經過細菌培養後的試管實體對照相片圖。

Claims (13)

  1. 一種抗菌複合材料的製備方法，其包含如下步驟：(1)提供一中尺寸多孔性矽材，該中尺寸多孔性矽材包含一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子；(2)使上述之中尺寸多孔性矽材和一矽烷反應得到一胺基化的矽材，該矽烷在該中尺寸多孔性矽材上形成一矽氧(Si-O)鍵結；(3)加入一銀離子前驅物到一包含上述之胺基化矽材的溶媒；和(4)加入一還原劑至上述的溶媒中使上述的銀離子前驅物形成複數個銀奈米粒子，該複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述之胺基化矽材的表面上形成一抗菌複合材料，該抗菌複合材料的表面上之銀奈米粒子分布密度是107-1013number/cm2。
  2. 如申請專利範圍1所述之抗菌複合材料的製備方法，其中上述之矽烷包括3-氨基丙基三甲氧基矽烷和N-[(3-三甲氧基矽基)丙基]乙二胺。
  3. 如申請專利範圍1所述之抗菌複合材料的製備方法，其中上述之銀離子前驅物是硝酸銀。
  4. 如申請專利範圍3所述之抗菌複合材料的製備方法，其中上述之硝酸銀的使用濃度是0.1~3.0mM。
  5. 如申請專利範圍1所述之抗菌複合材料的製備方法，其中上述之還原劑是濃度0.1-10mM的硼氫化鈉。
  6. 一種抑制細菌在物體表面生長的方法，該方法包含：(1)提供一組成物，該組成物包含一有效濃度的複合材料，該複合材料是選自下列群組之一及其組合：抗菌酶-矽複合材料和銀-矽複合材料；和(2)塗佈上述之組成物在一物體表面，借以抑制細菌在該物體表面生長。
  7. 如申請專利範圍6所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述之抗菌酶-矽複合材料係由一溶菌酶和一中尺寸多孔性矽材所組成，該中尺寸多孔性矽材係選自一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，且該中尺寸多孔性矽材的平均孔洞直徑是1~15nm。
  8. 如申請專利範圍6所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述每公克之抗菌酶-矽複合材料含有50-3000毫克的溶菌酶。
  9. 如申請專利範圍6所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述之銀-矽複合材料的銀離子釋放濃度小於0.6ppm。
  10. 如申請專利範圍6所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述之銀-矽複合材料係由複數個銀奈米粒子和一中尺寸多孔性矽材所組成，該中尺寸多孔性矽材係選自一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽薄膜和一表面具有垂直奈米管道的中尺寸多孔性矽奈米粒子，且該中尺寸多孔性矽材的平均孔洞直徑是1~15nm。
  11. 如申請專利範圍10所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述之複數個銀奈米粒子以非共價鍵結錨定在上述的中尺寸多孔性矽材的表面，該銀奈米粒子的表面分布密度是107-1013number/cm2且平均直徑小於20nm。
  12. 如申請專利範圍10所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述之中尺寸多孔性矽材的表面具有胺基。
  13. 如申請專利範圍10所述之抑制細菌在物體表面生長的方法，其中上述之物體包括塑膠、橡膠、金屬、陶瓷、玻璃、紗布、棉花和纖維。
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