CN113122611A - 蒙脱石散微生物限度检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蒙脱石散微生物限度检查方法，通过在中国药典2015版的基础上增加了金黄色葡萄球菌、耐胆盐革兰阴性菌的检测方法以及引入菌种API鉴定方法并且调整控制菌的培养时间，大大增加了控制菌的检出率，显著提高了检测结果的准确信和用药的安全性。本发明方法检测的产品已经通过欧盟GMP认证，满足国际市场的需求。
Description
技术领域
本发明涉及药品的微生物限度检查方法，更具体地，涉及一种蒙脱石散微生物限度检查方法。
背景技术
蒙脱石(Montmorillonite)是由颗粒极细的含水铝硅酸盐构成的层状矿物，也称胶岭石、微晶高岭石。它是由火山凝结岩等火成岩在碱性环境中蚀变而成的膨润土的主要组成部分。蒙脱石最早由法国博福-益普生公司开发为蒙脱石散，商品名为思密达，临床用于成人及儿童急、慢性腹泻以及用于食道、胃、十二指肠疾病引起的相关疼痛症状的辅助治疗。
目前，根据中国药典2015版对于矿物质药及口服制剂的要求，蒙脱石散微生物限度需要检验的项目有：需氧菌、霉菌及酵母菌、大肠埃希菌、沙门菌。然而，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌，耐胆盐革兰阴性菌指在胆汁酸中可以存活并繁殖的革兰阴性菌。本发明的蒙脱石散在中国药典2015版的基础上增加了金黄色葡萄球菌、耐胆盐革兰阴性菌的检查，使得控制菌检查项目涵盖了常见的且具有代表性的食源性致病菌，提高了用药安全性，使蒙脱石散的品质更符合市场需求。
CN103073010B公开了蒙脱石的环保生产工艺，其对制备的蒙脱石进行了微生物检测，其中微生物包括细菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌、活螨。该专利并未公开对蒙脱石产品需要进行金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌的限度检查。
本发明提供了一种蒙脱石散微生物限度检查方法，使蒙脱石散在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品安全有效。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种蒙脱石散微生物限度检查方法，该方法检出的微生物种类包括需氧菌、霉菌及酵母菌、大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、耐胆盐革兰阴性菌，弥补了现有技术未检测金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌的缺陷，提高了用药安全性。另外，本发明通过选择菌种的培养时间，大大地增加了控制菌的检出率；为了鉴定培养基上的菌落，本发明引入菌种API鉴定方法进行纯化鉴定以确定其是否属于目标菌，该鉴定试剂能对检出的菌株进行了更深入的鉴定。
本发明的蒙脱石散的微生物限度检验项目有：需氧菌、霉菌及酵母菌、大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌。需氧菌、霉菌及酵母菌的检验方法为平皿法，大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌的检查方法为常规法。
本发明的目的是这样实现的：一种蒙脱石散微生物限度检查方法，包括微生物限度检查步骤，微生物限度检查方法具体为：
(1)需氧菌总数计数
取供试液，置无菌平皿中，注入温度不超过45℃的溶化的胰酪大豆胨琼脂培养基，在30℃～35℃下倒置培养3-5天，每个稀释级分别做2-3个平皿，取平均值计算菌落数。
(2)霉菌及酵母菌计数
取供试液，置无菌平皿中，注入温度不超过45℃的溶化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，在20℃～25℃下倒置培养5-7天，每个稀释级别做2-3个平皿，取平均值计算菌落数。
(3)大肠埃希菌检查
取本品，置胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，即得供试液；取供试液，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，再取胰酪大豆胨液体培养物接种至麦康凯液体中，在42～44℃下培养24～48h，取麦康凯液体培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～72h，优选地，在30～35℃下培养48～72h，更优选地，在30～35℃下培养72h；
若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检查和API鉴定试验，确认是否为大肠希埃菌；若麦康凯琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
(4)金黄色葡萄球菌检查
取本品，置胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，即得供试液，取供试液，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取胰酪大豆胨液体培养物在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～72h，优选地，在30～35℃下培养48～72h，更优选地，在30～35℃下培养72h；
若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外围有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检和API鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上没有形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
(5)沙门菌检查
取供试品，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取胰酪大豆胨液体培养物接种至RV沙门菌增菌液体中，在30～35℃下培养18-24h，取RV沙门菌增菌液体培养物在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～48h，优选地，在30～35℃下培养36～48h，更优选地，在30～35℃下培养48h；
若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检和API鉴定试验，确认是否为沙门菌；若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出沙门菌。
(6)耐胆盐革兰阴性菌检查
取本品，加入胰酪大豆胨液体培养基中即得供试液，并分别用胰酪大豆胨液体培养基稀释制成供试溶液，在20～25℃培养2-3小时，分别取该胰酪大豆胨液体培养物1ml接种至肠道菌增菌液体中，30～35℃培养24～48小时，再取该肠道菌增菌液体培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24h，优选地，30～35℃培养21～24h，更优选地，30～35℃培养24h；
若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，检测1g或1mL供试品中的肠道菌的最大可能数。
表1肠道菌的可能菌数
进一步地，一种蒙脱石散微生物限度检查方法，优化如下：
步骤一、供试液的制备
配置1:10供试液和1:100供试液。
1:10供试液制备：取样品10g，置pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中使成100mL，混匀，即得；
1:100供试液配制：量取1：10供试液1mL，加进9mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，即得。
步骤二、微生物限度检查方法
(1)需氧菌总数计数
取供试液1mL，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20mL温度不超过45℃的溶化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，在30℃～35℃下倒置培养5天，其中，每个稀释级分别做2个平皿，取平均值计算菌落数；
(2)霉菌及酵母菌计数
取供试液1mL，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20mL温度不超过45℃的溶化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，在20℃～25℃下倒置培养7天，其中，每个稀释级别做2个平皿，取平均值计算菌落数；
(3)大肠埃希菌检查
取本品10g，置胰酪大豆胨液体培养基中使成100mL，混匀，即得1:10供试液。取1:10供试液10mL，直接接种至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时。取1mL胰酪大豆胨液体培养物接种至100mL麦康凯液体中，在42～44℃下培养24～48h。取麦康凯液体培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～72h。
若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检查和API鉴定试验，确认是否为大肠希埃菌。若麦康凯琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；
(4)金黄色葡萄球菌检查
取本品10g，置胰酪大豆胨液体培养基中使成100mL，混匀，即得1:10供试液。取1:10供试液10mL，直接接种至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时。取胰酪大豆胨液体培养物在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～72h；
若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外围有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检和API鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌。若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上没有形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌；
(5)沙门菌检查
取供试品10g，直接接种至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时。取0.1mL胰酪大豆胨液体培养物接种至10mLRV沙门菌增菌液体中，在30～35℃下培养18-24h。取RV沙门菌增菌液体培养物在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～48h；
若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检和API鉴定试验，确认是否为沙门菌。若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出沙门菌；
(6)耐胆盐革兰阴性菌
取本品10g，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中即得1：10的供试液，并分别用胰酪大豆胨液体培养基稀释制成1：100的供试溶液及1：1000的供试溶液，在20～25℃培养2小时，分别取该胰酪大豆胨液体培养物1mL接种至100mL肠道菌增菌液体中，30～35℃培养24～48小时。再取该肠道菌增菌液体培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24h；
若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，按表1报告1g或1mL供试品中的肠道菌的最大可能数。
进一步地，本发明一种蒙脱石散微生物限度检查方法，优化如下：
大肠埃希菌检查时，在麦康凯琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养48～72h；
金黄色葡萄球菌检查时，在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养48～72h；
沙门菌检查时，在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养36～48h；
耐胆盐革兰阴性菌检查时，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养21～24h。
进一步地，本发明一种蒙脱石散微生物限度检查方法，优化如下：
如无特殊情况，大肠埃希菌检查时，在麦康凯琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养72h；
金黄色葡萄球菌检查时，在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养72h；
沙门菌检查时，在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养48h；
耐胆盐革兰阴性菌检查时，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养24h。
进一步地，本发明一种蒙脱石散微生物限度检查方法，优化如下：
所述的常规法中，对于培养基上的菌落，采用菌种API鉴定方法。
进一步地，本发明一种蒙脱石散微生物限度检查方法，优化如下：
菌种API鉴定方法具体为：挑取鉴定培养基上的菌落在胰酪大豆胨琼脂平板上分区划线纯化，将接种好的胰酪大豆胨琼脂在35-37℃下培养18-24h(如若该平板上仍然没有分出单个菌落，可从其中挑出菌落形态一致的地方继续纯化，直至分出单个菌落)。挑取分离纯化出来的单个菌落用革兰氏染色液染色，将染色完成的样本玻片在显微镜下观察，如若观察得到革兰阴性菌，则进行氧化酶实验，如若观察得到革兰阳性菌则进行触酶实验。根据触酶和氧化酶实验结果选取具体的API鉴定试剂条。
本发明有如下有益效果：
1、本发明的方法在中国药典2015版的基础上增加了金黄色葡萄球菌、耐胆盐革兰阴性菌的检测方法，使得控制菌检查项目涵盖了常见的且具有代表性的食源性致病菌，大大提高了用药安全性，使用本发明的方法检查后的产品已经通过欧盟GMP认证，满足国际市场的需求。
2、本发明的耐胆盐革兰阴性菌的检查采用了最大可能数的计数方法，每个级别的接种量为1mL，相比于现有技术的接种量0.1mL，本发明所用的方法取样量更大，可有效降低取样时所存在的偶然性，所得到的检测结果更为准确，检出几率更高。
3、由于我们的生活环境中存在的菌株种类是无法计数的，培养基的专属性也无法做到绝对。现有技术中，在选择性培养基不出现异常的情况下就终止了检验程序，如：大肠埃希菌检查时，麦康凯液体不出现变色浑浊等现象时，视为未检出，即停止检验流程，不再进行麦康凯琼脂鉴定。本发明的检验流程比较完整，每种控制菌的检验都会经历富集培养，再接种在选择性培养基，最后划板到对应的鉴定培养基平板。这将降低了样品检验时存在的质量风险，有利于及时发现药品中存在微生物的异常变动。
4、现有技术中，在日常操作时，可能为了减少检验所耗费的时间，在药典要求的范围内选择了较短的培养时间，如：麦康凯琼脂平板的培养，药典要求18-72h，实际培养在18h以后就截止了。本发明的检验程序则在各环节的接种培养时间尽可能的接近最长时间。如无特殊情况，大肠埃希菌检查时，在麦康凯琼脂培养基平板上划线培养72h；金黄色葡萄球菌检查时，在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上划线培养72h；沙门菌检查时，在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上划线进行次代培养48h；耐胆盐革兰阴性菌检查时，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上培养24小时，通过培养时间的选择和调整，大大地增加了控制菌的检出率。
5、对鉴定培养基上的菌落，本发明通过引入菌种API鉴定的方法，进行纯化鉴定以确定其是否属于目标菌，该鉴定试剂能对检出的菌株进行更深入的鉴定，对常见的多种菌株可鉴定到“属”，可鉴定的菌株覆盖较广，是目前较为准确的鉴定手段。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法开发进行详细描述，但下例实施例不应看作对本发明范围的限制。
本发明验证过程中采用的菌种如下为：大肠埃希菌[ATCC 8739]，金黄色葡萄球菌[ATCC 6538]，枯草芽孢杆菌[ATCC 6633]，沙门菌[ATCC 14028]，铜绿假单胞菌[ATCC9027]，白色念株菌[ATCC 10231]，黑曲霉菌[ATCC 16404]。
试验组：在一定量的样品溶液中加入一定体积的适应浓度的菌液作为供试液，取一定体积的供试液通过合适的方法处理后加入培养基中培养。该组用于确定样品是否具有抑菌性。
菌液对照组：取与试验组供试液的相同体积、相同浓度的菌液，并使用相同的方法操作。该组用于与试验组进行比较，得出的比值用以判定该实验数据是否符合规定。
阴性对照组：取与试验组供试液相同体积的样品溶解剂，用与试验组同样的检验条件进行检验。该组用于确定该实验所用的培养基、器具、仪器以及实验人员操作等各个实验环节是否存在问题。
供试品对照组：取与试验组供试液相同体积的样品溶液，用与试验组同样的检验条件进行检验。该组用于确定样品是否本身存在微生物超标，用以剔除样品本身对实验结果造成的影响。
实施例1
针对需氧菌总数的测定，本发明共进行了以下五种菌种的回收比值测定，分别为：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。
1、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值测定:
(1)试验组：取0.1mL菌液同9.9mL的1：10供试液混合制成含菌量不超过100cfu/mL的供试液,取供试液1mL加入平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养3天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(2)菌液组：取0.1mL菌液同9.9mL的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液混合制成含菌量不超过100cfu/mL的供试液,取供试液1mL加入平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养3天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(3)供试液对照组：取0.1mLpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液同9.9mL1:10供试液混合,取混合后的供试液1mL至平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养3天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(4)阴性对照组：取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1mL至平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养3天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
表2铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值测定结果
| 平行试验次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 铜绿假单胞菌 | 0.90 | 0.96 | 0.94 |
| 金黄色葡萄球菌 | 0.88 | 0.98 | 0.92 |
| 枯草芽孢杆菌 | 0.91 | 0.93 | 0.92 |
中国药典2015版中规定的接受标准为：(试验组-供试品对照组)/菌液组的比值为0.5-2。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
2、白色念珠菌、黑曲霉菌回收比值测定:
(1)试验组：取0.1mL菌液同9.9mL的1：10供试液混合制成含菌量不超过100cfu/mL的供试液,取供试液1mL加入平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(2)菌液组：取0.1mL菌液同9.9mLpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液混合制成含菌量不超过100cfu/mL的供试液,取供试液1mL加入平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(3)供试液对照组：取0.1mLpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液同9.9mL1:10供试液混合,取混合后的供试液1mL至平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(4)阴性对照组：取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1mL至平皿中,立即倾注15-20mL胰酪大豆胨琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在30℃～35℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
表3白色念株菌、黑曲霉菌回收率测定结果
| 平行试验次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 白色念珠菌 | 0.89 | 0.94 | 0.88 |
| 黑曲霉菌 | 0.91 | 0.95 | 0.84 |
中国药典2015版中规定的接受标准：(试验组-供试品对照组)/菌液组的比值为0.5-2。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
实施例2
对于霉菌及酵母菌的检测，测定了白色念株菌、黑曲霉菌的回收比值。具体方法为：
(1)试验组：取0.1mL菌液同9.9mL1：10供试液混合制成含菌量不超过100cfu/mL的供试液,取供试液1mL加入平皿中,立即倾注15-20mL沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在20℃～25℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(2)菌液组：取0.1mL菌液同9.9mLpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液混合制成含菌量不超过100cfu/mL的供试液，取供试液1mL加入平皿中，立即倾注15-20mL沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养基的温度不得超过45℃，在20℃～25℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(3)供试液对照组：取0.1mLpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液同9.9mL1:10供试液混合,取混合后的供试液1mL至平皿中,立即倾注15-20mL沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养基的温度不得超过45℃，在20℃～25℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
(4)阴性对照组：取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1mL至平皿中,立即倾注15-20mL沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养基的温度不得超过45℃，在20℃～25℃下培养5天观察结果，平行制备2个平皿，取平均值计算菌落数。
表4白色念株菌、黑曲霉菌回收率测定结果
| 平行试验次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 白色念珠菌 | 0.92 | 0.92 | 0.88 |
| 黑曲霉菌 | 0.91 | 0.90 | 0.84 |
中国药典2015版中规定的接受标准：(试验组-供试品对照组)/菌液组的比值为0.5-2。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
实施例3
大肠埃希菌的检验方法如下：
试验组：取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中使成100mL，混匀，作为1：10供试液。取1:10供试液10mL，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，加1mL浓度不大于100cfu/mL的大肠埃希菌菌液，混匀，在30～35℃下培养18h。取1mL胰酪大豆胨液体培养液接种至100mL麦康凯液体中，在42～44℃下培养24h。取麦康凯液体培养液在麦康凯琼脂平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18h。
阴性对照组：取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10mL，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18h。取1mL胰酪大豆胨液体培养基培养液接种至麦康凯液体中，在42～44℃下培养24h。取麦康凯液体培养液在麦康凯琼脂平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18h。
结果判断：阴性对照试验中，在麦康凯琼脂平板上应无菌落生长，若有菌落生产，视为试验失败。应查明原因重新验证。试验组试验在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上应有菌落生长，在胰酪大豆胨琼脂培养基上分离纯化，用API鉴定试剂进行鉴定，结果为沙门菌。应按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。
表5大肠埃希菌的检验方法
| 平行试验次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 试验组 | 检出大肠埃希菌 | 检出大肠埃希菌 | 检出大肠埃希菌 |
| 阴性对照组 | 未检出大肠埃希菌 | 未检出大肠埃希菌 | 未检出大肠埃希菌 |
中国药典2015版中规定的接受标准：阴性对照组不得检出大肠埃希菌、试验组应检出大肠埃希菌。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
实施例4
金黄色葡萄球菌的检验方法如下：
试验组试验：取本品10g，加入胰酪大豆胨液体培养基中使成100mL，混匀，作为1：10供试液。取1:10供试液10mL，加胰酪大豆胨液体培养基100mL，加1mL浓度不大于100cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液，混匀，在30～35℃下培养18h。取胰酪大豆胨液体培养液在甘露醇氯化钠琼脂平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18h。
阴性对照试验：取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10mL，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18h。取胰酪大豆胨液体培养液在甘露醇氯化钠琼脂平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18h。
结果判断：阴性对照试验中，在甘露醇氯化钠琼脂平板上应无菌落生长，若有菌落生长，视为试验失败。应查明原因重新验证。试验组试验在甘露醇氯化钠琼脂上应有菌落生长，在大豆胰蛋白胨琼脂培养基平板上分离纯化，用API鉴定试剂进行鉴定，结果为金黄色葡萄球菌。应按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。
表5金黄色葡萄球菌的检验方法
| 平行试验次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 试验组 | 检出金黄色葡萄球菌 | 检出金黄色葡萄球菌 | 检出金黄色葡萄球菌 |
| 阴性对照组 | 未检出金黄色葡萄球菌 | 未检出金黄色葡萄球菌 | 未检出金黄色葡萄球菌 |
中国药典2015版中规定的接受标准：阴性对照组不得检出金黄色葡萄球菌、试验组应检出金黄色葡萄球菌。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
实施例5
沙门菌的检验使用的是RV沙门菌，具体步骤如下：
试验组：取本品10g，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，加1mL浓度不大于100cfu的RV沙门菌菌液，混匀，30～35℃下培养18h。取0.1mL该胰酪大豆胨液体预培养物接种至10mLRV沙门菌增菌液体中，30～35℃下培养18h。取RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，30～35℃培养18h。
阴性对照组：取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10mL，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18h。取0.1mL该胰酪大豆胨液体预培养物接种至10mLRV沙门菌增菌液体中，30～35℃下培养18h。取RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，30～35℃培养18h。
结果判断：阴性对照试验中，在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上应无菌落生长，若有菌落生产，视为试验失败。应查明原因重新验证。试验组试验在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上应有菌落生长，在胰酪大豆胨琼脂培养基上分离纯化，用API鉴定试剂进行鉴定，结果为沙门菌。应按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。
表6沙门菌的检验方法
| 平行试验次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 |
| 试验组 | 检出沙门菌 | 检出沙门菌 | 检出沙门菌 |
| 阴性对照组 | 未检出沙门菌 | 未检出沙门菌 | 未检出沙门菌 |
中国药典2015版中规定的接受标准：阴性对照组不得检出沙门菌、试验组应检出沙门菌。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
实施例6
耐胆盐革兰阴性菌的检验方法为：
试验组试验：
试验组1：取本品10g，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，加1mL浓度不大于100cfu的大肠埃希菌菌液，混匀，20～25℃下培养2h。取1mL该胰酪大豆胨液体培养物接种至100mL肠道菌增菌液体中，30～35℃下培养24h。取该肠道菌增菌液体培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18h。
试验组2：取本品10g，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，加1mL浓度不大于100cfu的铜绿假单胞菌菌液，混匀，20～25℃下培养2h。取1mL该胰酪大豆胨液体培养物接种至100mL肠道菌增菌液体中，30～35℃下培养24h。取该肠道菌增菌液体培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18h。
阴性对照试验：取胰酪大豆胨液体培养基100mL，在20～25℃培养2小时，取1mL该胰酪大豆胨液体培养物接种至100mL肠道菌增菌液体中，30～35℃下培养24h。取该肠道菌增菌液体培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18h。
表7胆汁耐受革兰氏阴性菌的检验方法
中国药典2015版中规定的接受标准：阴性对照组不得检出沙门菌、铜绿假单胞菌，试验组1应检出大肠埃希菌，试验组2应检出铜绿假单胞菌。因此，本发明方法检测的产品符合规定。
综上所述，本发明的蒙脱石散微生物限度检查方法的控制菌检查项目涵盖了常见的且具有代表性的食源性致病菌，大大提高了用药安全性和检测结果的准确性，本发明方法检测的产品已经通过欧盟GMP认证，满足国际市场的需求。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蒙脱石散微生物限度检查方法，包括微生物限度检查步骤，其特征在于：所述的微生物限度检查项目有需氧菌、霉菌及酵母菌、大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌，具体试验方法为：所述的需氧菌总数计数采用平皿法，所述的霉菌及酵母菌计数采用平皿法，所述的大肠埃希菌检查采用常规法，所述的沙门菌检查采用常规法，所述的金黄色葡萄球菌检查采用常规法，所述的耐胆盐革兰阴性菌检查采用常规法。
2.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的常规法中，对于培养基上的菌落，采用菌种API鉴定方法。
3.根据权利要求2所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的菌种API鉴定方法具体为：挑取鉴定培养基上的菌落在胰酪大豆胨琼脂平板上分区划线纯化，将接种好的胰酪大豆胨琼脂在35-37℃下培养18-24h；挑取分离纯化出来的单个菌落用革兰氏染色液染色，将染色完成的样本玻片在显微镜下观察，如若观察得到革兰阴性菌，则进行氧化酶实验，如若观察得到革兰阳性菌则进行触酶实验，所述的菌种API鉴定方法根据触酶和氧化酶实验结果选取具体的API鉴定试剂条。
4.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的耐胆盐革兰阴性菌的检查采用最大可能数的计数方法，每个级别的接种量为1g或1mL。
5.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的需氧菌总数计数方法为：取供试液，置无菌平皿中，注入温度不超过45℃的溶化的胰酪大豆胨琼脂培养基，在30℃～35℃下倒置培养3-5天，每个稀释级分别做2-3个平皿，取平均值计算菌落数。
6.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的霉菌及酵母菌计数方法为：取供试液，置无菌平皿中，注入温度不超过45℃的溶化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，在20℃～25℃下倒置培养5-7天，每个稀释级别做2-3个平皿，取平均值计算菌落数。
7.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的大肠埃希菌检查方法为：取本品，置胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，即得供试液；取供试液，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，再取胰酪大豆胨液体培养物接种至麦康凯液体中，在42～44℃下培养24～48h，取麦康凯液体培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～72h，优选地，在30～35℃下培养48～72h，更优选地，在30～35℃下培养72h；
若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检查和API鉴定试验，确认是否为大肠希埃菌；若麦康凯琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
8.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的金黄色葡萄球菌检查方法为：取本品，置胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，即得供试液，取供试液，直接接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取胰酪大豆胨液体培养物在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～72h，优选地，在30～35℃下培养48～72h，更优选地，在30～35℃下培养72h；
若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外围有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检和API鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上没有形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
9.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的沙门菌检查方法为：取供试品，直接接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取胰酪大豆胨液体培养物接种至RV沙门菌增菌液体中，在30～35℃下培养18-24h，取RV沙门菌增菌液体培养物在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上划线进行次代培养，在30～35℃下培养18～48h，优选地，在30～35℃下培养36～48h，更优选地，在30～35℃下培养48h；
若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化、染色镜检和API鉴定试验，确认是否为沙门菌；若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出沙门菌。
10.根据权利要求1所述的蒙脱石散微生物限度检查方法，其特征在于，所述的耐胆盐革兰阴性菌方法为：取本品，加入胰酪大豆胨液体培养基中即得供试液，并分别用胰酪大豆胨液体培养基稀释制成供试溶液，在20～25℃培养2-3小时，分别取该胰酪大豆胨液体培养物1ml接种至肠道菌增菌液体中，30～35℃培养24～48小时，再取该肠道菌增菌液体培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24h，优选地，30～35℃培养21～24h，更优选地，30～35℃培养24h；
若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性，根据各培养管检查结果，检测1g或1mL供试品中的肠道菌的最大可能数。
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