JP2012504951A - 黄色ブドウ球菌バクテリア用の反応培地 - Google Patents
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Abstract
Description
コアグラーゼ陽性の種は、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・インターメディウス、スタフィロコッカス・ヒイカス、スタフィロコッカス・デルフィニス、スタフィロコッカス・ルトラエ及びスタフィロコッカス・シュライフェリである。
黄色ブドウ球菌の存在を評価することができる選択培地の培養技術が存在する。関係する培地は、以下である:
*チャップマン高塩濃度培地(75%NaClを含む)は、通常は黄色ブドウ球菌とマンニトールを加水分解するブドウ球菌について選択性である。これらのバクテリアは、培地を赤色から黄色に変化させる。特定の微生物とD群腸球菌は、特に、培地上で同じ反応を産生できる;従って、次に(連鎖球菌が陰性の)カタラーゼを確認する必要である。
*ベアードパーカー卵黄培地(選択剤として亜テルル酸カリウムと塩化リチウムを含有)が、食品のコアグラーゼ陽性のブドウ球菌を分離して計数するために使用され、レシチナーゼ活性を示すことを可能にする。この培地上で、黄色ブドウ球菌と他のコアグラーゼ陽性の種のコロニーは、不透明なハロによって囲まれた黒い中心と共に現れる。その他の微生物がこの培地上で生育することができる。これらは、主に以下のグループである:
・グラム+球菌:エンテロコッカス属及びリステリア属のもの。
・グラム−細菌:プロテウス属及びシュードモナス属のもの。
*ベアードパーカー培地+RPF(ウサギ血漿+ウシ・フィブリノーゲン)が、食品中のコアグラーゼ陽性のブドウ球菌を分離して計数するために使用され(ISO標準6888−1と6888−2による対照標準培地)、コアグラーゼ活性を示すことを可能にする。この培地上で、黄色ブドウ球菌及びその他のコアグラーゼ陽性の種は、不透明なハロによって囲まれる黒い中心と共に現れる。実際には、チャップマン高塩濃度培地技術を使用する黄色ブドウ球菌の確認は、感受性(後者が生物学的試験試料の少量に存在する場合に捜している種を明らかにする能力)と特に特異性(他の種を含む生物学的試験試料において捜している種を検出する能力)を欠いている。
従って、ベアードパーカー、ベアードパーカー+RPF及びチャップマン培地での検出は、推定的な診断でしかなく、他の確認テストを必要とすると理解される。しかしながら、黄色ブドウ球菌を同定するために必要な追加的な処理は、解析の時間とコストを増大させる。それらは、資格を有するスタッフの参加と多数の試薬を必要とする。
O.Gaillot et al. 2000(J. Clin. Microbiol. 38, 4, 1587-1591)の論文「Evaluation of CHROMagar Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of S.aureus from human clinical specimens」は、ブドウ球菌の分離と黄色ブドウ球菌の同定のための発色性培地のCHROMagar(登録商標)Staph. aureusを記載し、評価しており、それは後者の種に藤色の呈色を与える発色性基質を使用している。そして、同属の他種は、理論的には、青色か無色によって検出される。β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びホスファターゼ活性は、インヒビターであるデフェロキサミンと共に本質的に使用され、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスとを区別することができる。しかしながら、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスとを区別することは難しく、2種はCHROMagar(登録された商標)培地上に同色のコロニーを産生するためである。これは、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスについて陽性であるホスファターゼ基質の特異性の欠如のためであり、デフェロキサミンによる後者の阻害が部分的であるという事実のためでる。
更に、さまざまなブドウ球菌種を同定するためのα-グルコシド基質の使用を記載する出願WO02079486を挙げることができ、別の酵素活性のための基質と組合わせてもよい。しかしながら、特定の条件下で、例えば、弱いα-グルコシダーゼ活性を有しており、少量(2〜50コロニー形成単位)に存在する菌株については、活性の検出は遅い可能性があり、24時間以上のインキュベーションを必要とする。
本発明は、黄色ぶどう球菌を分離して同定するために、感受性が高く、特異的であり、迅速な新規の検出培地を提供することによって、従来技術の隙間を埋めることを目的とする。
本発明のために、反応培地なる用語は、微生物(例えば黄色ブドウ球菌)の生存及び/又は増殖のために必要な成分の全てを含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、検出(revealing)培地のみとしても、あるいは培養且つ検出培地としても用いられる。前者の場合は、微生物は接種前に培養され、後者の場合は反応培地は更に培養培地を構成する。反応培地は、固体、半固体または液体であってもよい。
「固形培地」なる用語は、例えばゲル化培地を意味することを目的とする。本発明に係る培地はゲル化培地であることが望ましい。寒天は微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。いくつかの数の製品が市販されており、コロンビア寒天、トリプチカーゼ大豆寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天またはさらに一般的にはthe Handbook of Microbiological Media (CRC Press)に記載されているものである。
本発明による反応培地は、その他の可能な添加物、例えばペプトン、一つ以上の増殖因子、糖質、一つ以上の選択剤、緩衝液、一つ以上のゲル化剤等を含んでもよい。この反応培地は、すぐに使用できる、すなわちチューブ中またはフラスコ中にまたはシャーレ上において、接種する準備ができている液体またはゲルの形態であってもよい。この培地はフラスコ中でゲルの形態で提供され、培地はシャーレに注入される前に(100℃に供して)再生させることが好ましい。好ましくは、本発明の培地は、選択培地、すなわち黄色ブドウ球菌バクテリアの成長を助けるインヒビターを含んでなる培地である。特に塩化リチウム(LiCl)、アジ化ナトリウム(NaN3)、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム(NaCl)、デフェロキサミン及びビブリオ菌増殖阻害化合物O/129を挙げることができる。
*第一世代のセファロスポリン、例えばセファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシネ(Cefrodaxine)、セフテゾール;
*第二世代のセファロスポリン、例えばセフォキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロル、セフォテタン、セフォニシド(Cefonicide)、セフォチアム、ロラカルベフ(Loracarbef)、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド;
*第三世代のセファロスポリン、例えばセフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン(Cefsulodine)、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト(Cefetamet)、セフピラミド、セフォペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セフォペラゾン;
*第四世代のセファロスポリン、例えばセフェピム、セフピロム;
*メロペネム、エルタペネム、イミペネム
天然基質でも合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地の又は生物の細胞の生理化学的性質に変化が生じる。この変化は、物理化学的方法、特に光学的方法、オペーレーターの視覚により、または分光計、電気、磁気等の計測器を使用して検出することができる。それは、吸収、蛍光または発光の変化のような光学的性質の変異であることが望ましい。
発色性基質として、インドキシル、フラボン、アリザリン、ナフトールベンゼイン、ニトロフェノール、ナフトール、カテコール、ヒドロキシキノリンまたはクマリン系の基質を挙げることができる。本発明で使用する基質は、インドキシル系であることが好ましい。
蛍光性の基質として、ウンベリフェロン系またはクマリン系基質、レゾルフィン系、フェノキサジン系、ナフトール系、ナフチルアミン系、2'-ヒドロキシフェニル-ヘテロ環系基質、あるいは他にフルオレセイン系を挙げることができる。
α-グルコシダーゼ酵素活性のための基質として、特に基質5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド;ジヒドロキシフラボン-α-グルコシド; 3,4-シクロヘキセノエスクレチン-α-グルコシド; 8-ヒドロキシキノリン-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド; 6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ヨード-3-インドキシル-α-グルコシド; 6-フルオロ-3-インドキシル-α-グルコシド;アリザリン-α-グルコシド;ニトロフェニル-α-グルコシド; 4-メチルウンベリフェリル-α-グルコシド;ナフトールベンゼイン-α-グルコシド;インドキシル-Nメチル-α-グルコシド;ナフチル-α-グルコシド;アミノフェニル-α-グルコシド;ジクロロ・アミノフェニル-α-グルコシド;レゾルフィン-α-グルコシドを挙げることができる。
本発明において使用する基質は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと組合わせた5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドが好ましい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、2つの基質のうちの1つは、インドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド(X-N-メチル-α-グルコシド)または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド(X-α-グルコシド)である。
前記インドキシル-α-グルコシド基質は0.01〜2g/l、好ましくは0.05〜0.3g/lの濃度で培地に存在することが好ましい。
α-グルコシダーゼのための2つの酵素基質の前記組合せは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことが好ましい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、培地は、ブドウ球菌属のバクテリアの増殖を助ける4つのインヒビターのインヒビター混合物を更に含んでおり、前記インヒビターはLiCl、ビブリオ菌増殖阻害化合物O/129、アズトレオナム及びアンフォテリシンである。
最後に、本発明は、生物学的試料において、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および/または同定する方法であって、
a)上記の反応培地に、黄色ブドウ球菌バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること;
b)インキュベートすること;
c)黄色ブドウ球菌コロニーを同定すること;
d)MRSAコロニーを同定することを含む方法に関する。
本発明は、MRSAバクテリアを検出および/または同定するための反応培地であって、α−グルコシダーゼのための2つの酵素基質の組合せと、MRSAが耐性化している抗生物質、好ましくはセファロスポリン、例えばセホキシチンを含む反応培地にも関する。この抗生物質が、他の抗生物質と組合わせてもよい。上記の組合せは、好ましくは、セホキシチン/セフォタキシムまたはセホキシチン/エルタペネムから選択される。上記の培地は、特にMRSAの検出に適している。
本発明の好ましい一実施形態によれば、2つの基質のうちの1つは、インドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド(X-N-メチル-α-グルコシド)または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド(X-α-グルコシド)である。
前記インドキシル−α−グルコシド基質は0.01〜2g/l、好ましくは0.05〜0.3g/lの濃度で培地に存在することが好ましい。
α-グルコシダーゼのための2つの酵素基質の前記組合せは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことが好ましい。
更に、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを分離して同定するための、上記の通り反応培地のインビトロ使用にも関する。
最後に、本発明は、生物学的試料中のMRSAバクテリアを検出および/または同定する方法であって、
a) 上記の反応培地に、MRSAバクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること;
b) インキュベートすること;
c) MRSAコロニーを同定することを含む方法に関する。
MRSAは、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の種は、無色に見えるかまたはMRSAコロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。
以下に実験において試験される培地は、基本培地としてchromID MRSA培地(ビオメリューref. 43 451)を含み、以下の成分を含んでなる培地である:
培地T:chromID MRSAコントロール培地(ref. 43 451)に、特にX−N−メチル−α−グルコシド基質を濃度0.1g/lで、セフォキシチンを4mg/lで含む。
培地S:培地Tに、25、37、45又は50mg/lの濃度の、X−α−グルコシド基質を更に含む。
培地F:培地S(X−α−グルコシド濃度:45mg/l)で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン/セフォタキシムの組合せと置換されている:
培地G:培地S(X−α−グルコシド濃度:45mg/l)で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン/セフトリアキソンの組合せと置換されている:
培地H:培地S(X−α−グルコシド濃度:45mg/l)で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン/エルタペネムの組合せと置換されている:
培地I:培地S(X−α−グルコシド濃度:45mg/l)で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン/セフポドキシムの組合せと置換されている:
培地J:培地S(X−α−グルコシド濃度:45mg/l)で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン/セフォペラゾンの組合せと置換されている:
培地K:培地S(X−α−グルコシド濃度:45mg/l)で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン/セフォタキシムの組合せと置換され、更にブドウ球菌属に属さない微生物のインヒビターの混合物であって、黄色ブドウ球菌の成長を助けるものを含む。
菌株(全て出願人のコレクションに由来するもの)のさまざまなセットは、生理食塩液に懸濁されて、分離したコロニーを得るために、培地上に接種された。皿は、48時間、37℃でインキュベートされた。形成されたコロニーは、インキュベーションの18時間または24時間後に、視覚的に調べられた。更に、呈色強度は、0〜4のスケールに従って観察された(0:呈色反応なし、4:非常に強度の呈色)。
検出された菌株は、培地の上に有色のコロニーを形成している菌株に対応する。
3.1 − 2つのα−グルコシダーゼ基質を含むMRSAを検出するための培地
1又は2つのα−グルコシダーゼ基質の使用で得られた結果を表1に示す。
表1 − 2つのα−グルコシダーゼ基質の使用によるコロニーの呈色反応の強度
第2のα-グルコシダーゼ基質の添加は、コロニーの呈色反応を強力に増大することを可能にし、従ってMRSAコロニーをよりよく正確に指摘することを可能にする。
抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表2に示す。
表2−抗生物質の組合せを使用した場合のMRSAコロニーの検出(全菌種の数につき検出された菌種数として表示された検出)
上記の抗生物質の組合せは、4mg/lのセホキシチンを単独で有する培地よりも、良いパフォーマンス・レベルを得ることができた。
抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表3に示す。
表3 − インヒビター混合物と、セホキシチン/セフォタキシム抗生物質の組合せが使われた場合のMRSAコロニーの検出(全菌種の数につき検出された菌種の数として表示された検出)
黄色ブドウ球菌の増殖を促進するインヒビター混合物と組合わせた、セホキシチン/セフォタキシム抗生物質の組合せは、特に濃度0.75mg/lのセホキシチンとセフォタキシムを使用した場合に、優れた特異性と感受性を得ることができた。
Claims (15)
- α-グルコシダーゼのための2つの酵素基質の組合せを含む、黄色ブドウ球菌(スタフィロコッカス・アウレウス)バクテリアを検出および/または同定するための反応培地。
- 2つの基質のうちの1つがインドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項1に記載の反応培地。
- 前記インドキシル-α-グルコシド基質が0.01〜2g/l、好ましくは0.05〜0.3g/lの濃度で培地に存在するということを特徴とする、請求項2に記載の反応培地。
- α-グルコシダーゼのための2つの酵素基質の前記組合せが5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の反応培地。
- 黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を促進するインヒビターの混合物を更に含む、請求項1から4の何れか一項に記載の反応培地。
- 黄色ブドウ球菌バクテリアを分離して同定するための請求項1から5の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
- 生物学的試料において、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および/または同定する方法であって、
a)請求項1から6の何れか一項に記載の反応培地に、黄色ぶどう球菌バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること;
b)インキュベートすること;
c)黄色ブドウ球菌コロニーを同定することを含む方法。 - α-グルコシダーゼのための2つの酵素基質の組合せ及びMRSAが耐性化している抗生物質を含む、MRSAバクテリアを検出および/または同定するための反応培地であって、前記抗生物質が好ましくはセファロスポリン、例えばセホキシチンである、反応培地。
- MRSAが耐性化している第2の抗生物質を含むことを特徴とする、請求項8に記載の反応培地。
- 2つの基質のうち1つがインドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項8または9に記載の反応培地。
- 前記インドキシル-α-グルコシド基質が0.01〜2g/l、好ましくは0.02から0.3g/lの濃度で培地に存在することを特徴とする、請求項10に記載の反応培地。
- α-グルコシダーゼのための2つの酵素基質の前記組合せが5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことを特徴とする、請求項8から11の何れか一項に記載の反応培地。
- 黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を促進するインヒビターの混合物、好ましくはLiCl、ビブリオ菌増殖阻害化合物O/129、アズトレオナム及びアンフォテリシンを更に含む、請求項8から12の何れか一項に記載の反応培地。
- MRSAバクテリアを分離して同定するための請求項8から13の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
- 生物学的試料中のMRSAバクテリアを検出および/または同定する方法であって、
a)請求項8から13の何れか一項に記載の反応培地に、MRSAバクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること;
b)インキュベートすること;
c)MRSAコロニーを同定することを含む方法。
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