CN107893038A

CN107893038A - 一种白蚁菌及其合成纳米银的方法

Info

Publication number: CN107893038A
Application number: CN201711146282.6A
Authority: CN
Inventors: 李文均; 董周焱; 迈尼克
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2018-04-10

Abstract

本发明公开了一种白蚁菌及其合成纳米银的方法。该菌株为白蚁菌（Isoptericolasp.）菌株SYSUZL‑3，已于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：2017006。该菌株具有产生硝酸还原酶，还原银离子，进而合成纳米银的能力。将菌株SYSUZL‑3通过活化、培养、离心获得上清液，向其上清液中加入硝酸银溶液，再经光照反应即可获得纳米银。该纳米银粒子尺寸较小，产量较高，对瓦氏葡萄球菌等病原菌的生长具有明显的抑制作用，且本发明利用阳光对反应进行催化，大大提高了合成效率。本发明的合成方法生产成本低廉，操作简单，对环境绿色无污染，具有良好的应用前景。

Description

一种白蚁菌及其合成纳米银的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵及其应用技术领域，更具体地，涉及一种白蚁菌及其合成纳米银的方法。

背景技术

纳米粒子是指粒度在1～100nm之间的粒子（纳米粒子又称超细微粒），属于胶体粒子大小的范畴。它们处于原子簇和宏观物体之间的过渡区，在微观体系和宏观体系之间，具有独特的光电子、化学特性。目前已有大量研究证明，纳米粒子具有良好的抗菌性能，现已广泛应用于医药载体、水质净化、抗菌涂料、催化等领域。银作为传统杀菌剂，具有高效、安全无毒、抗菌谱广、无耐药性等优点，但由于银离子化学性质活泼，在光照、受热等作用下容易被氧化，且易与卤族元素的阳离子形成卤化银沉淀，从而导致其抗菌性能的下降。而纳米银具备纳米材料的单分散性、粒径小等特殊性质，它的抑菌或杀菌效果要比传统的银离子更好，并且纳米银具有良好的稳定性，能够使其在很长的一段时间内都可以保持很强的杀菌性能。

目前纳米银的制备主要采用液相化学还原法、光化学还原法、微乳液法等化学方法和高能球磨、激光溅射、激光烧蚀等物理方法。物理方法所得产品质量高，但对设备要求和能耗较高，且对纳米颗粒形貌的调控能力有限，不利于工业化生产；化学方法由于其工艺相对简单，操作相对容易，生产成本较低，是较常采用的方法，但需要使用既昂贵又具有毒性的试剂作为还原剂和稳定剂，并有大量未反应的试剂残留在溶液中，容易污染环境，得到的纳米银粒子对食品检测、生物医学等领域的应用有不良影响。

基于上述原因，纳米银技术研究的重点就是寻找到一种绿色、经济、简便的纳米银粒子合成方法。微生物合成法的反应条件温和，在常温常压下就可进行反应，经济、简便，合成的金属纳米粒子有良好的生物相容性，具备特定形状和形态（包括球形、六边形、三角形、杆状、扁平状、树枝状、十面体、二十面体和一些不规则形状），能够控制其合成粒子的尺寸、组成和结晶度，而且合成材料可选择范围广，可以充分利用生物资源。因此，微生物合成法相比于物理、化学法更有优势。但是，目前以生物合成法制备得的纳米银的产量和产率都比较低，不能满足纳米银的实际需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种具有合成纳米银粒子的能力的白蚁菌（Isoptericola），其产量较高，而且合成的纳米银粒子对瓦氏葡萄球菌等病原菌的生长具有明显的抑制作用，并且该合成方法简单，效率高，成本低，对环境绿色无污染。

本发明的目的是提供一种可高效合成纳米银的白蚁菌（Isoptericola）菌株SYSUZL-3。

本发明的另一目的是提供所述菌株SYSUZL-3在还原银离子及合成纳米银方面的应用。

本发明的再一目的是提供利用所述菌株SYSUZL-3合成纳米银的方法。

本发明的再一目的是提供一种利用所述菌株SYSUZL-3合成的纳米银及该纳米银在作为或制备杀菌剂方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株白蚁菌（Isoptericola）菌株SYSUZL-3，该菌株已于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：2017006；保藏地址：中国武汉，武汉大学。

该菌株分离自新疆盐生植物异子蓬根部的放线菌，根据形态学特征与生理生化特性鉴定为白蚁菌属（Isoptericola sp.）。该菌株分类命名为白蚁菌属（Isoptericola sp.）SYSUZL-3。

本发明提供的白蚁菌SYSUZL-3的形态特征与生理生化特征如下：

pH耐受范围：6～8；

适宜生长温度：28℃～32℃；

可利用碳氮源：糊精，D-麦芽糖，D-海藻糖，D-纤维二糖，龙胆二糖，蔗糖，D-松二糖，水苏糖，蜜三糖,棉子糖，α-D-乳糖，蜜二糖，β-甲酰-D-葡糖苷，D-水杨苷，α-D-葡糖，D-甘露糖，D-果糖，D-半乳糖，D-山梨醇，甘油，D-葡糖-6-磷酸，明胶，L-谷氨酸，果胶，D-葡糖酸，D-葡糖醛酸，p-羟基-苯乙酸，吐温40，γ-氨基-丁酸，β-羟基-D,L丁酸，乙酰乙酸，乙酸；

可耐受抗生素：萘啶酮酸，氨曲南。

该白蚁菌能够产生硝酸还原酶，具有显著的还原银离子、合成纳米银的能力。因此，该白蚁菌在生产硝酸还原酶、还原银离子方面的应用，以及在制备纳米银方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

一种由上述白蚁菌生产的硝酸还原酶，以及由上述白蚁菌制备的纳米银，也在本发明的保护范围之内。

具体地，一种硝酸还原酶，由白蚁菌发酵生产得到；一种纳米银，由白蚁菌发酵生产得到。

优选地，所述白蚁菌为白蚁菌菌株SYSUZL-3。

一种合成纳米银的方法，是由白蚁菌与硝酸银混合培养，合成得到纳米银。

优选地，所述白蚁菌为上述白蚁菌属菌株SYSUZL-3。

更优选地，所述纳米银的合成方法，包括以下步骤：

S1. 白蚁菌发酵：将白蚁菌发酵培养，分别得到发酵上清液和菌体；

S2. 将步骤S1的上清液和/或菌体加入硝酸银溶液中混合后培养，即获得纳米银。

其中，步骤S2所述上清液和/或菌体包括三个方案：上清液和菌体（即发酵液）、上清液、菌体；最优选为上清液。

优选地，步骤S1所述发酵培养所用的培养基为TSB液体培养基。

更优选地，所述TSB液体培养基的配方为：每1L蒸馏水中含有如下组分：胰蛋白胨10～20 g，大豆蛋白胨3～8 g，NaCl 3～8 g。需经高压灭菌。

更优选地，所述TSB液体培养基的pH为7.2～7.5。

更优选地，所述TSB液体培养基的pH为7.5。

优选地，步骤S1中发酵培养的条件为：pH 7.2～8.0，25～37℃、160～200 rpm培养1～3 d。

更优选地，步骤S1中发酵培养的条件为：初始pH 7.5，28℃、180 rpm培养24h。

优选地，步骤S1中白蚁菌发酵培养后，4000～18000 rpm离心1～20 min（更优选为10000 rpm离心10 min），分别得到发酵上清液和菌体。

优选地，步骤S2所述硝酸银溶液的浓度为0.01～0.02 mol/L。

更优选地，步骤S2所述硝酸银溶液的浓度为0.01 mol/L。

优选地，步骤S2中上清液和/或菌体与硝酸银溶液的体积比为1：1～50（优选1：10～20）。

更优选地，步骤S2中上清液和/或菌体与硝酸银溶液的体积比为1：20。

优选地，步骤S2所述培养是在光照条件下静置培养1～30 min，或在25～30℃、160～200 rpm下培养20～30 h。

更优选地，步骤S2所述培养是在光照条件下静置培养4～25 min，或在28℃、180rpm下培养24 h。

更优选地，步骤S2所述培养是在光照条件下静置培养4 min。

更优选地，所述光照条件为：日光照射，光照强度在800 μmol·m^-2·s^-1以上。

更优选地，所述光照条件为阳光照射，即最佳为在阳光下静置培养4 min。

优选地，步骤S2所述培养后的溶液在500～2000 rpm下离心5～15 min （更优选为1000 rpm下离心10 min），并用去离子水清洗1～3次（最优选2次），获得的产物即为纳米银溶胶。

作为一种最优选的可实施方案，所述纳米银的合成方法，具体包括以下步骤：

S1. 将白蚁菌菌株SYSUZL-3活化两次后，接种于pH 7.5的TSB液体培养基中，pH 7.5、28℃、180 rpm下发酵培养24 h，发酵液经10000 rpm离心10 min后，过滤去除菌体得到上清液；

S2. 按照1：20的体积比，将上清液缓慢加入0.01 mol/L的硝酸银溶液中混合，置于阳光下静置4 min，然后1000 rpm下离心10 min，并用去离子水清洗2次，获得的产物即为纳米银溶胶。

另外，由上述方法合成得到的纳米银，以该纳米银在作为或制备杀菌剂方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述杀菌剂是指针对瓦氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、志贺氏菌属、链球菌、猪链球菌、粪链球菌等多种病原菌的杀菌剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明筛选获得一株可高效合成纳米银的白蚁菌菌株SYSUZL-3，该菌株的发酵液能够产生硝酸还原酶，可以还原银离子，合成具有抗菌、杀菌活性的纳米银。该菌株所合成的纳米银的颗粒尺度在11～40 nm之间，尺寸较小，而且产量能够达到5 g/L，远远高于其他菌种，具有很好的工业化潜力和应用前景；该菌株所合成备的纳米银对瓦氏葡萄球菌等病原菌的生长具有明显的抑制作用。因此，该菌株是一株极具开发研究价值的纳米银的制备菌株。

本发明提供了该菌株合成纳米银的最优工艺条件，利用阳光对制备反应进行催化，大大提高了纳米银的生产效率，缩短了生产时间。在此工艺条件下纳米银的效率和质量均明显提高，而且生产成本低廉，操作简单，相比物理及化学方法，对环境更为友好，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为菌株SYSUZL-3合成的纳米银溶胶的X射线衍射图。

图2为菌株SYSUZL-3合成的纳米银溶胶的扫描电镜图像。

图3为菌株SYSUZL-3上清液（左）与反应后纳米银溶胶（右）的FTIR对比图。

图4为菌株SYSUZL-3合成的纳米银溶胶的抑菌照片。

图5为菌株SYSUZL-3的系统发育树。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 菌株SYSUZL-3的分离与鉴定

1、菌株SYSUZL-3的分离、筛选

菌株SYSUZL-3分离自新疆盐生植物异子蓬（Borszczowia aralocaspica Bge.）根部，经植物表面消毒后，称取1 g经搅拌器打碎后的样品，继续用无菌的研钵进一步充分研磨，然后加入9 mL无菌水至样品中，吸取1 mL组织悬液梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4后，分别取各稀释浓度的悬液涂布分离平板。

将分离平板放置于30℃培养箱进行培养，培养30～50 d。细菌菌落长出后，挑取并接种于1/2 YIM 38#纯化培养基上，用三区划线法进行纯化；根据菌株在1/2 YIM 38#培养基上的培养特征，包括菌落颜色、大小、性状、质地、孢子有无、基内菌丝和气生菌丝的生长情况及颜色、可溶性色素的产生情况及颜色等对分离纯化的细菌株依分离部位（根际、根、茎及叶）进行归类，然后挑取单菌落接种于YIM 38#斜面，编号处理，并于4℃冰箱保藏。

同时挑取纯化的单菌落于灭菌的1.5 mL Eppendorf离心管中，编号处理，放于-20℃冰箱保藏，以便后续用于提取菌株DNA，进行16S rRNA基因测序。

YIM 38#培养基：Glucose：4.0 g；Yeast extract：4.0 g；Malt extract：5.0 g；Trace salt：1.0 mL；复合维生素：少许；水：1000 mL；pH 7.2。

2、菌株SYSUZL-3的鉴定

（1）基因组DNA提取

采取酶解法提取SYSUZL-3的基因组DNA，步骤如下：

1）在装有菌体的Eppendorf管中加入480 μL 1×TE缓冲液，及20 μL溶菌酶溶液（溶菌酶的终浓度为2 mg/mL）；

2）将Eppendorf管放入37℃保温1～2 h（或室温过夜），每隔15 min反转混匀一次；

3）加入50 μL 20% SDS和5 μL浓度为20 μg/mL蛋白酶（PK）震荡1 min，混匀，放于55℃保温60 min；

4）加入550 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液，震荡混匀，12,000 r/min低温离心10min，吸取上清液，转管（重复抽提2次）；

5）上清液中加入80 μL 3 M乙酸钠（pH4.8～5.2），混匀后再加入800 μL无水乙醇，室温放置10 min以上；

6）12,000 r/min低温离心10 min，去除上清液，加入200 μL 70%乙醇，轻摇洗盐1～2次，12,000 r/min低温离心10 min，弃乙醇；

7）37℃干燥后加入30 μL 1×TE溶解DNA，-20℃保存备用。

（2）基于16S rRNA基因序列的系统发育分析

将获得的16S rRNA基因序列数据，经人工检验核定后，提交至GenBank数据库中。利用EzTaxon服务器（http://www.eztaxon.org/；Kim et al. 2012）对序列信息进行在线相似性分析。利用BLAST软件在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中进行在线比对；选取同源性高的典型菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象，采用Clustal X软件（Thompson et al. 1997）进行多序列比对以及相似性分析，通过MEGA 5.0软件（Tamura et al. 2011）利用邻近结合法（Neighbour-joining）（Saitou & Nei, 1987），最大简约法（maximum-parsimony）（Fitch, 1971）和最大似然法（maximum-likelihood）（Felsenstein, 1981）构建系统发育树（如附图5所示）。

综上鉴定结果显示，该菌株属于白蚁菌属（Isoptericola），命名为SYSUZL-3，并于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：2017006；保藏地址：中国武汉，武汉大学。

实施例2 白蚁菌菌株SYSUZL-3合成纳米银的工艺条件优化

1、菌株SYSUZL-3的上清液与菌体合成纳米银的效率比较

使用pH为7.5的TSB液体培养基在28℃、180 rpm下培养菌株SYSUZL-3，培养3 d后，在10000 rpm下离心10 min，分别取上清液和菌体5ml加入100ml硝酸银溶液中，在28℃、180rpm下培养24 h，观察溶液的变色情况。

其中，TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 5g，补蒸馏水至1 L，pH 7.5，121℃高压灭菌25 min。

实验结果表明，使用菌株SYSUZL-3的上清液合成纳米银的生产效率更高。

2、菌株SYSUZL-3上清液与硝酸银溶液的体积比对合成纳米银的影响

分别以1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:30、1:50的体积比，将菌株上清液与0.01mol/L硝酸银溶液混合后，在28℃、180 rpm下培养24 h，测量其300～600 nm的吸收光曲线。

实验结果表明，菌株上清液与硝酸银溶液的体积比为1：10～1：20时，其制备纳米银的效率和质量均较高；而菌株上清液与硝酸银溶液的体积比为1：20时，其制备纳米银的效率和质量最高。

3、不同反应条件对菌株SYSUZL-3合成纳米银的影响

实验分两组：将菌株上清液与0.01 mol/L硝酸银溶液以1：20的体积比混合后，一组放置在阳光下静置培养，另一组在28℃、180 rpm条件下培养培养。观察两组不同反应条件对菌株SYSUZL-3合成纳米银的影响。

实验结果表明，在阳光下静置反应可以极大地提高菌株SYSUZL-3合成纳米银的效率。

4、不同反应时间对菌株SYSUZL-3合成纳米银的影响

将菌株上清液与0.01 mol/L硝酸银溶液以1:20的体积比混合后，分别在阳光下放置1min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，取样检测其300～600 nm的吸收光曲线，并分别使用透射电镜观察其产生的纳米银粒子直径。

实验结果表明，在阳光下的放置时间在25 min以内菌株SYSUZL-3合成的纳米银粒子直径都在100 nm以下，符合纳米粒子标准；其中，在阳光下的放置时间为4 min时菌株SYSUZL-3制合成纳米银的效率和质量最高。

实施例3 利用白蚁菌菌株SYSUZL-3合成纳米银

1、合成方法

根据实施例2的优化结果，利用白蚁菌菌株SYSUZL-3合成纳米银的最佳方法如下：

（1）获得白蚁菌菌株SYSUZL-3上清液

将白蚁菌菌株SYSUZL-3活化两次后，接种于装有100 mL TSB液体培养的三角瓶中，在28℃、180 rpm下发酵培养24 h，发酵液经10000 rpm离心10 min后过滤去除菌体，即可得到菌株SYSUZL-3上清液。

其中TSB液体培养基为：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 5g，补蒸馏水至1 L，pH为7.5，121℃高压灭菌25 min。

（2）合成纳米银

按照1：20的体积比，将步骤（1）的菌株SYSUZL-3上清液缓慢加入0.01 mol/L硝酸银溶液中，在阳光下静置4 min，可见溶液由无色透明变为红色，将收集到的溶液在1000 rpm下离心10 min，并用去离子水清洗2次，获得的产物即为纳米银溶胶。

2、银溶胶经过烘干后称重，计算纳米银粒子的产量。纳米银粒子产量的计算公式如下：

纳米银粒子产量＝烘干后玻璃皿重量－空玻璃皿重量

实验结果表明，菌株SYSUZL-3制备纳米银粒子的产量为5.3 g/L，该产量显著高于其他文献中以微生物法制备纳米银粒子的产量。

3、纳米银的产品特征及理化性质

所得纳米银溶胶为红色，澄清。通过X射线衍射分析其谱图，如图1所示，衍射峰分别出现在38.3°、44.2°、64.7°和77.4°处，该谱图符合银的特征，说明所生成的粒子为银粒子。

如图2所示，经扫描电镜观察，合成的纳米银颗粒的直径范围在11～40 nm之间。

如图3所示，经FTIR检验，发现在纳米银粒子的合成过程中，OH根和C=O双键发生了改变，通过磺胺比色法分别检测反应前和反应后的溶液，实验结果表明，反应过程中硝酸根被还原。

实施例4 纳米银溶胶的抗菌活性检验

1、以瓦氏葡萄球菌为例，用琼脂孔洞法检测该纳米银溶胶对病原菌的抗菌活性，具体步骤如下：

（1）将瓦氏葡萄球菌接种于100 mL TSB培养基中，经过48h后涂抹于MH平板上；

（2）用打孔器在MH平板上打孔，分别加入a）100 uL 无菌水，b）100 uL纳米银溶胶，c）100 uL菌株SYSUZL-3上清液；

（3）在37℃培养箱中培养48 h，观察无菌水、纳米银溶胶、菌株SYSUZL-3上清液的抑菌圈大小。

2、实验结果如图4所示，该纳米银溶胶对瓦氏葡萄球菌具有显著的抗菌活性，其抑菌圈的直径为6 mm。

另外，经过实验证明，本发明合成的纳米银溶胶对金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、志贺氏菌属、链球菌、猪链球菌、粪链球菌等多种病原菌均具有很好的抗菌活性。

Claims

1.一株白蚁菌（Isoptericola）菌株SYSUZL-3，其特征在于，该菌株于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：2017006。

2.权利要求1所述菌株SYSUZL-3在生产硝酸还原酶、还原银离子或合成纳米银方面的应用。

3.一种合成纳米银的方法，其特征在于，是由白蚁菌与硝酸银混合培养，合成得到纳米银。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述白蚁菌为权利要求1所述的白蚁菌属菌株SYSUZL-3。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中上清液和/或菌体与硝酸银溶液的体积比为1：1～50，所述硝酸银溶液的浓度为0.01～0.02 mol/L。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述培养的条件为：在光照条件下静置培养1～30 min，或25～30℃、160～200 rpm下培养20～30 h。

8.根据权利要求3～7任一所述方法合成得到的纳米银。

9.一种硝酸还原酶，其特征在于，由白蚁菌发酵生产得到。

10.权利要求8所述的纳米银在作为或制备杀菌剂方面的应用。