KR102007192B1 - 금 나노입자 생성을 위한 보트리티스 시네레아의 용도 - Google Patents

금 나노입자 생성을 위한 보트리티스 시네레아의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노입자(AuNp)의 생합성을 위한, 보트리티스 시네레아의 균주, 그의 포자, 균사, 균사체, 균핵, 세포내 및/또는 세포외 유기체 분자(예를 들어 단백질, 핵산, 폴리사카라이드, 지질 및 이차 대사물)의 용도에 관한 것이다. 일반적인 용어로, 본 발명은 AuNp의 생물학적 합성을 위한, 비. 시네레아(B. cinerea) 균주 및/또는 이 유기체에 의해 생성된 분자의 용도에 초점을 맞추고 있으며, 그러므로, 본 출원의 적용 분야는 식물병원성 진균 비. 시네레아(B. cinerea) 및/또는 이의 정제된 세포내 또는 세포외 단백질 단독 또는 이 유기체에 의해 생성된 임의의 세포내 및/또는 세포외 분자와의 조합물을 생물학적 합성 시스템으로서 이용한 나노물질, 구체적으로는 AuNp의 합성을 중점으로 한다. 이러한 금속 나노입자는 반도체, 광발광, 생물의약, 의료 진단용 영상화, 촉매(분산 및 지지) 및 신생물(암)의 몇몇 유형에 대한 치료 등의 다양한 적용 분야에 이용된다.

Description

금 나노입자 생성을 위한 보트리티스 시네레아의 용도{USE OF BOTRYTIS CINEREA FOR OBTAINING GOLD NANOPARTICLES}
본 발명은 금 나노입자(AuNp)의 생합성을 위한, 보트리티스 시네레아(Botrytis Cinerea) 균주, 그의 포자, 균사, 균사체 및/또는 균핵 및/또는 이 유기체에 의해 생성된 분자, 예를 들어 단백질, 핵산, 폴리사카라이드, 지질 및 이차 대사물의 용도에 관한 것이다. 일반적인 용어로, 본 발명은 AuNp의 생물학적 합성을 위한, 비. 시네레아(B. cinerea) 균주 및/또는 이 유기체에 의해 생성된 분자의 용도에 초점을 맞추고 있다. 그러므로, 본 출원의 적용 분야는 식물병원성 진균 비. 시네레아(B. cinerea) 및/또는 이의 정제된 세포내 또는 세포외 단백질 단독 또는 이 유기체에 의해 생성된 임의의 다른 분자와의 조합물을 생물학적 합성 시스템으로서 이용한 나노물질, 구체적으로는 AuNp의 합성을 중점으로 한다.
이러한 금속 나노입자는 반도체, 광발광, 생물의약, 의료 진단용 영상화, 촉매(분산 및 지지) 및 신생물(암)의 몇몇 유형에 대한 치료 등의 다양한 적용 분야에 이용된다.
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나노입자란 1 내지 100 나노미터 범위의 크기를 갖는 구조물이며 이들은 특히 이들의 광학, 화학, 광전기화학적 및 전기적 성질 때문에 특히 매력적이다(문헌[Wilson M., Kannangara K., Smith G, Simmons M., Raguse B. Nanotechnology: Basic Science and Emerging Technologies. Chapman and Hall/CRC 2002; Jain, P.K., Huang, X., El-Sayed, I.H. El-Sayed, M.A. 2008. Noble metals on the nanoscale: optical and photothermal properties and some applications in imaging, sensing, biology and medicine. A of Chem Res. 41:1578-1586] 참조).
서로 다른 조성 및 크기의 나노입자의 합성은 지난 몇년간 큰 이목을 집중시키는 조사 분야였다. 현재, AuNp의 대규모 생산이 화학적 방법에 의해 수행되는데, 이는 가용성 금 염으로부터 입자를 생성하는 데 환원제의 이용을 필요로 한다. 물리적 방법도 또한 존재하는데, 이는 감소된 압력 및 높은 온도에서 작업될 것을 요구한다. AuNp 생산과 연관된 둘 다의 경우에서, 반응성 높은 작용제 및 지시된 시스템의 작업 조건으로 인해 화학적 독성 화합물이 생성되는데; 이는 생성된 나노입자의 안정성, 응집 및 바람직한 크기의 조절과 관련된 문제를 나타낸다(문헌[Sau T.K., Murphy C.J. 2004. Room temperature, high-yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticles in aqueous solution. J Am Chem Soc 126:8648-8649]).
이 주제와 관련하여, 전세계적으로 금속 나노입자를 다량의 에너지를 요구하지 않고 "환경 친화적으로" 얻는 대안적이고 효율적인 방법을 시행해야 할 필요성이 필수적이다. 이와 관련하여, 생물학적 시스템은 이를 위한 좋은 후보군이 된다. 현재, 이 주제에 대한, 구체적으로는 박테리아 및 진균을 포함하는 몇몇 유기체가 이러한 구조물을 생성하는 능력에 관한 다양한 공개문헌이 존재한다(문헌[Brown S, Sarikaya M, Johnson EA. 2000. Genetic analysis of crystal growth. J Mol Biol 299: 725-735; Nair B, Pradeep T. 2002. Coalescence of nanoclusters and formation of submicron crystallites assisted by Lactobacillus strains. Cryst Growth Des 2: 293-298; Husseiny MI, Abd El-Aziz M, Badr Y, Mahmoud MA. 2007. Biosynthesis of gold nanoparticles using Pseudomonas aeruginosa. Spectrochimica Acta Part A 67: 1003-1006; Narayanan KB, Sakthivel N. 2010. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Adv Colloid Interface Sci 156: 1-13; Thirumurugan G, Veni VS, Ramachandran S, Rao JV, Dhanaraju MD. 2011. Superior wound healing effect of topically delivered silver nanoparticle formulation using eco-friendly potato plant pathogenic fungus: synthesis and characterization. J Biomed Nanotechnol. 7: 659-66; Mourato A, Gadanho M, Lino AR, Tenreiro R. 2011. Biosynthesis of crystalline silver and gold nanoparticles by extremophilic yeasts. Bioinorg Chem Appl. 2011: 546074; Balagurunathan R, Radhakrishnan M, Rajendran RB, Velmurugan D. 2011. Biosynthesis of gold nanoparticles by actinomycete Streptomyces viridogens strain HM10. Indian J Biochem Biophys 48: 331-335; Tikariha, S.; Singh, S.; Banerjee, S.; Vidyarthi, A. S. 2012. Biosynthesis of gold nanoparticles, scope and application: A review. IJPSR 3: 1603-1615]).
펩티드, 박테리아, 진균 및 식물에서 금속 나노입자의 세포외 합성을 촉진시키는 것이 가능한 메커니즘들이 최근에 검토되었다(문헌[Duran N, Marcato PD, Duran M, Yadav A, Gade A, Rai M. 2011. Mechanistic aspects in the biogenic synthesis of extracellular metal nanoparticles by peptides, bacteria, fungi, and plants. Appl Microbiol Biotechnol 90: 1609-1624]).
비. 시네레아(B. cinerea)는 과일나무, 관상용 식물 및 채소를 포함하는 경제적으로 크게 중요한 다수의 식물 종들을 감염시키는 식물병원성 진균이다. 이 진균은, 딸기, 라즈베리, 사과, 배, 밤, 키위 및 포도 등에서 수확 전 및 후에 심각한 문제를 발생시키는 잿빛 곰팡이병으로 알려진 질병을 발생시킨다. 포도덩굴에서, 이 진균은 송이 썩음병을 발생시킨다(문헌[van Kan J. A. 2006. Licensed to kill: the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen. Trends Plant Sci. 11, 247-253; Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski, P. and Delen, N. eds. 2007. Botrytis: Biology, Pathology and Control. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers]).
전통적으로, 비. 시네레아(B. cinerea)는 이를 조절하여, 이 진균에 의해 발생된 감염과 연관된 경제적 손실을 감소시킬 전략을 생성하는 것을 목표로 연구되어 왔다. 오늘날까지, 금속 나노입자의 합성 방법에서 비. 시네레아(B. cinerea)의 배양물, 번식체 또는 분자를 이용하는 나노기술 분야의 연구는 존재하지 않았다. 본 발명자들의 결과는 액체 배지 내의 비. 시네레아(B. cinerea)가 실온에서 HAuCl4 용액으로부터 금 나노입자의 합성을 촉진할 수 있다는 것을 보여준다. 나노입자의 형성은 반응 용액의 색깔이 옅은 노란색으로부터 붉은색 또는 자주색으로 변화되는 것으로부터 확인할 수 있다. 게다가, 나노입자를 함유하는 용액은 540 nm에서 최대 흡광도를 갖는데, 이는 이 구조의 유형이 존재하는 경우에 나타나는 특징이다(문헌[Castro ME, Bravo M, Castillo A. 2012. Biosintesis de nanoparticulas de plata y oro por el hongo fitopatogeno Botrytis cinerea. XXI Congreso Latinoamericano de Microbiologia. Santos, Brasil. 28 de Octubre - 1 de Noviembre]).
지식 재산권과 관련하여, 금속 나노입자의 합성에 관한 특허들은 대부분 이러한 구조의 합성을 위한 화학적 방법의 용도로 구성되어 있고, 이들 중 일부는 특정 크기 및 형태를 갖는 입자의 생성을 가능케 한다. 특허 US 6.929.675의 경우에는 구리, 은 및 금 나노입자의 생성을 위한 화학 시스템을 기술한다. AuNp와의 구체적인 관계에 있어서, 아크릴산 나트륨을 함유하는 수성 배지를 이용한 30 내지 90 nm 범위 크기의 AuNp의 합성을 개시하는 특허 US 20070125196 및 또한 생성된 입자의 균일성을 조절하는 화학적 방법을 기술하는 공개 US 20060021468과 같은 몇몇 공개 문헌을 찾는 것도 또한 가능했다.
마지막으로, AuNp의 합성을 위한 생물학적 시스템의 용도와 관련된 특허가 있음에도 불구하고, 현재 비. 시네레아(B. cinerea) 또는 상기 진균에 의해 생산된 분자의 이러한 목적을 위한 용도를 기술한 특허는 없다는 것에 주목해야 한다. 이러한 맥락에서, 가장 유사한 특허는 2010년에 일리노이 대학교의 연구원에 의해 공개된, AuNp의 합성을 위한 진균 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)의 용도를 기술한 특허이다(공개 US 20100055199).
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<발명의 요약>
본 발명은 섬유질 자낭균 비. 시네레아(B. cinerea) 및/또는 진균 균사체에 의해 분비된 분자에 의해 매개되는 AuNp의 합성에 관한 것이다. 상술된 바로 인해, 이 방법은 진균 또는 이의 분자를 직접 이용하여 단리된 방법으로 수행될 수 있다.
도 1. 비. 시네레아(B. cinerea)에 의한 세포외 AuNp의 합성. ELISA 마이크로판의 서로 다른 웰(well)에서 HAuCl4와 함께 인큐베이션된 비. 시네레아(B. cinerea) 배양 상등액 (a) 접종하지 않은 배양 배지, (b) 비. 시네레아(B. cinerea) 배양물로부터 얻은 배양 배지, (1, 5 및 10) 각각 1, 5 및 10 mM의 HAuCl4 존재 하에서의 비. 시네레아(B. cinerea)의 배양물로부터 얻어진 배양 배지.
도 2. 비. 시네레아(B. cinerea) 배양 상등액으로부터 생성된 AuNp의 흡수 스펙트럼. 흡수 최대치는 대략 550 nm에서 관찰되었다.
도 3. 비. 시네레아(B. cinerea)로부터 생성된 금 입자의 EDS 스펙트럼. 나노입자의 구성성분으로서의 금 원소의 존재에 해당하는 신호가 관찰되었다.
도 4. 비. 시네레아(B. cinerea)에 의해 생성된 금 입자의 투과 전자 현미경검사. 입자의 크기 및 형태에 있어 큰 다양성이 관찰되었다. 하단부 우측의 바는 100 nm에 해당된다.
<발명의 바람직한 실시양태의 설명>
사상 진균으로부터 금 나노입자를 생성하기 위해 특별하게 설계된 방법. 이 방법은 이하의 단계를 포함한다:
1. 진균 균사체의 성장: 0.1-1 % 맥아 추출물 및 0.1-1 % 효모 추출물을 함유하는 영양 배지 50 mL를 함유하는 250 mL 에를렌마이어 플라스크에서 배양하였다. 진균을 어둠 속에서 20 ℃에서 배양하였고 이를 위해 플라스크를 암실에 10 일간 유지시켰다.
2. 금속 나노입자의 생성: 진균 성장으로부터 얻은 상등액 액체 대략 100 mL를 500 mL 에를렌마이어 플라스크에 취하였고 HAuCl4·3H2O와 함께 인큐베이션시켰다(최종 농도 0.5-10 mM). 이를 위해, 100 mM의 HAuCl4·3H2O 용액의 상등액 0.5-10 mL를 첨가하고 500 mL 에를렌마이어 플라스크를 0.5 내지 12 시간 범위의 기간 동안 25-27 ℃ 범위의 온도에서 인큐베이션시켰다. 입자를 저속 원심분리(6,000-8,000 rpm)에 의해 또는 1 시간 이상 동안 튜브에 정치 후 자발적 침강에 의해 회수하였다.
물질은 ⅰ) 최대치가 대략 550 nm에서 관찰되는 흡수 스펙트럼 ⅱ) 비. 시네레아(B. cinerea)에 의해 생성된 금 입자의 투과 전자 현미경검사에 의해 특성화된다. 입자의 다양한 크기(10-300 nm) 뿐만 아니라 다양한 형태(구형, 육각형, 삼각형 및 다면체형)가 관찰되었다.
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Claims (3)

  1. a) 0.1-1 % 맥아 추출물 및 0.1-1 % 효모 추출물을 함유하는 영양 배지에서 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 진균을 어둠 속에서 20 ℃에서 10 일 이상 동안 균사체 배양하는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 얻어진 상등액을 취하고 이를 0.5 내지 12 시간 범위의 기간 동안 25-27 ℃ 범위의 온도에서 HAuCl4·3H2O와 함께 인큐베이션시키고, 나노입자를 저속 원심분리에 의해 또는 1 시간 이상 동안 정치 후 자발적 침강에 의해 회수하는, 금 나노입자(AuNp)를 발생시키는 단계
    를 포함하며, 여기서, 상기 상등액은 보트리티스 시네레아 균주, 그의 포자, 균사, 균사체, 균핵 및/또는 이 유기체에 의해 생성된 세포내 및/또는 세포외 유기체 분자를 포함하며, 여기서 상기 세포내 및/또는 세포외 유기체 분자는 단백질, 핵산, 폴리사카라이드, 지질 및 이차 대사물로부터 선택되는 것인, 금 나노입자(AuNp)의 생물학적 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 단계 a)로부터 얻어진 상등액을 취하고 이를 HAuCl4·3H2O와 함께 인큐베이션시키는 것이 상등액으로부터 비. 시네레아(B. cinerea)에 의해 생성된 분자를 추출하고 이러한 분자를 함유하는 현탁액을 HAuCl4·3H2O와 함께 인큐베이션시키는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  3. 금 나노입자(AuNp)의 생물학적 합성을 위한, 보트리티스 시네레아 균주, 포자, 균사, 균사체, 균핵 및/또는 이러한 유기체에 의해 생성된 분자를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 이러한 유기체에 의해 생성된 분자는 단백질, 핵산, 폴리사카라이드, 지질 및 이차 대사물로부터 선택되는 것인 조성물.
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