WO2013143017A1 - Uso de botrytis cinerea para la obtención de nanopartículas de oro - Google Patents

Uso de botrytis cinerea para la obtención de nanopartículas de oro Download PDF

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Miguel CASTRO RETAMAL
Antonio Castillo Nara
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Universidad De Santiago De Chile
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi

Definitions

  • the present invention relates to the use of strains of Botrytis cinerea, its spores, hyphae, mycelium, sclerotia, intra and / or extracellular molecules of organic nature, such as proteins, nucleic acids, polysaccharides, lipids and secondary metabolites for the biosynthesis of nanoparticles. of gold (AuNps).
  • the present invention is directed to use strains of B. cinerea and / or molecules generated by this organism for the biological synthesis of AuNps. Therefore, the field of application focuses on the synthesis of nanomaterials, specifically AuNps using the phytopathogenic fungus B. cinerea and / or its intra or extracellular proteins purified individually or in combination or any other intra and / or extracellular molecule produced by this organism as a biological synthesis system.
  • Metal nanoparticles are used in various applications including: semiconductors, photoluminescence, biomedicine, images for medical diagnosis, catalysts (dispersed and supported) and in therapies against some types of neoplasms (cancer), among others.
  • Nanoparticles are structures of a size in the range of 1 to 100 nanometers and are especially attractive due to their optical, chemical, photoelectrochemical and electronic properties (Wilson M., Kannangara, Smith G, Simmons M., Raguse B. Nanotechnology: Basic Science and Emerging Technologies, Chapman and Hall / CRC 2002, Jain, PK, Huang, X., El-Sayed, IH El-Sayed, MA 2008. Noble metais on the nanoscale: optical and photothermal properties and some applications in imaging, sensing, biology and medicine, A of Chem Res. 41: 1578-1586).
  • B. cinerea is a phytopathogenic fungus that infects a large number of plant species of great economic importance including fruit trees, ornamental plants and vegetables. This fungus produces a disease known as gray rot generating a serious pre- and post-harvest problem in strawberries, raspberries, apples, pears, chestnuts, kiwi and grapes among others. In grapevine this fungus produces cluster rot, (van Kan JA 2006. Licensed to kill: the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen Trends Plant Sci. 11, 247-253; Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski , P. and Delen, N. eds, 2007. Botrytis: Biology, Pathotogy and Control, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers).
  • the present invention corresponds to the synthesis of AuNps mediated by the filamentous ascomycete B. cinerea and / or molecules secreted by the fungal mycelium. Therefore, the process can be carried out using directly the fungus or its molecules in isolation.
  • FIG. 1 Synthesis of extracellular AuNps by B. cinerea. Culture supernatant of B. cinema incubated with HAuCI 4 in different wells of ELISA microplates, (a) Culture medium without inoculation, (b) culture medium obtained from cultures of B. cinerea, (1, 5 and 10) medium of culture obtained from cultures of B. cinerea in the presence of HAuCI 4 , 5 and 10 mM "respectively.
  • Figure 4 Transmission electron microscopy of the gold particles generated by B. cinerea. A great diversity of sizes and particle morphology is observed.
  • the bar at the bottom right corresponds to 100 nm.
  • the fungal mycelium It is cultivated in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 50 ml of a nutritive medium containing between 0.1-1% of malt extract and 0.1-1% of yeast extract. The fungus was cultivated at 20 ° C in darkness, for this the flasks were kept in a dark room for 10 days.
  • the material was characterized by: i) absorption spectrum where a maximum is observed approximately at 550 nm. ii) Electron microscopy of transmission of gold particles generated by B. cinerea. A great diversity is observed both in sizes (between 10-300 nm) as well as in the morphology of the particles (spherical, hexagonal, triangular and polyhedral).

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de cepas de Botrytís cinérea, sus esporas, hifas, micelio, esclerocios, moléculas intra y/o extracelulares de naturaleza orgánica, tales como proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y metabolitos secundarios para la biosíntesis de nanopartículas de oro (AuNps). En términos generales, la presente invención está dirigida a utilizar cepas de B. cinérea y/o moléculas generadas por este organismo para la síntesis biológica de AuNps, siendo entonces el campo de aplicación, la síntesis de nanomateriales, específicamente AuNps utilizando el hongo fitopatógeno B. cinérea y/o sus proteínas intra o extracelulares purificadas en forma individual o combinación de ellas o cualquier otra molécula intra y/o extracelular producida por este organismo como sistema biológico de síntesis. Las nanopartículas metálicas se utilizan en diversas aplicaciones incluyendo: semiconductores, fotoluminiscencia, biomedicina, imágenes para el diagnóstico médico, catalizadores (dispersados y soportados) y en terapias contra algunos tipos de neoplasias (cáncer), entre otras.

Description

BIOLOGICAL PREPARATION OF GOLD NANOPARTICLES
Campo de aplicación de la invenció
La presente invención se refiere al uso de cepas de Botrytis cinérea, sus esporas, hifas, micelio, esclerocios, moléculas intra y/o extracelulares de naturaleza orgánica, tales como proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y metabolitos secundarios para la biosíntesis de nanopartículas de oro (AuNps). En términos generales, la presente invención está dirigida a utilizar cepas de B. cinérea y/o moléculas generadas por este organismo para la síntesis biológica de AuNps. Por lo tanto, el campo de aplicación se centra en la síntesis de nanomateriales, específicamente AuNps utilizando el hongo fitopatógeno B. cinérea y/o sus proteínas intra o extracelulares purificadas en forma individual o combinación de ellas o cualquier otra molécula intra y/o extracelular producida por este organismo como sistema biológico de síntesis.
Las nanopartículas metálicas se utilizan en diversas aplicaciones incluyendo: semiconductores, fotoluminiscencia, biomedicina, imágenes para el diagnóstico médico, catalizadores (dispersados y soportados) y en terapias contra algunos tipos de neoplasias (cáncer), entre otras.
Estado de la técnica relacionado con la invención
Las nanopartículas son estructuras de un tamaño en el rango de 1 a 100 nanómetros y son de especial atractivo debido a sus propiedades ópticas, químicas, fotoelectroquímicas y electrónicas (Wilson M., Kannangara , Smith G, Simmons M., Raguse B. Nanotechnology: Basic Science and Emerging Technologies. Chapman and Hall/CRC 2002; Jain, P.K., Huang, X., El-Sayed, I.H. El-Sayed, M.A. 2008. Noble metáis on the nanoscale: optical and photothermal properties and some applications in imaging, sensing, biology and medicine. A of Chem Res. 41:1578-1586).
La síntesis de nanopartículas de diferente composición y tamaño es un área de investigación de gran interés en los últimos años. Actualmente la obtención de AuNPs a ,
gran escala se realiza por métodos químicos, que requieren la utilización de agentes reductores para generar las partículas a partir de sales de oro solubles. También existen métodos físicos, en los que se requiere operar a presiones reducidas y altas temperaturas. En ambos casos asociados a la formación de AuNPs, se producen compuestos químicos tóxicos, debido a los reactivos y condiciones de operación, de los sistemas señalados; los cuales también presentan problemas relacionados con la estabilidad, agregación y control del tamaño deseado de las nanopartículas generadas (Sau T.K., Murphy C.J. 2004. Room temperature, hígh-yield synthesís of múltiple shapes of gold nanopartícles 1n aqueous solution. J Am Chem Soc 126:8648-8649).
Dada la relevancia del tema a nivel mundial, se hace imprescindible la necesidad de implementar procesos alternativos eficientes para la obtención de nanopartículas metálicas que sean "amigables con el medio ambiente" y no requieran grandes cantidades de energía. En este sentido, los sistemas biológicos son buenos candidatos para ello. Actualmente, existen varias publicaciones sobre el tema, relacionadas específicamente con la capacidad de algunos organismos para generar estas estructuras entre los que incluyen bacterias y hongos (Brown S., Sarikaya M., Johnson E.A. 2000. Genetic analysis of crystal growth. J Mol Biol 299:725-735; Nair B., Pradeep T. 2002. Coalescence of nanoclusters and formation of submicron crystallites assisted by Lactobacillus strains. Cryst Growth Des 2:293-298; - Husseiny M.I., Abd El-Aziz M., Badr Y., Mahmoud M.A. 2007. Biosynthesis of gold nanopartícles using Pseudomonas aeruginosa. Spectrochimica Acta Part A. 67: 1003-1006; Thirumurugan G, Veni VS, Ramachandran S, Rao JV, Dhanaraju MD. 2011. Superior wound healing effect of topically delivered silver nanoparticle formulation using eco-friendly potato plant pathogenic fungus: synthesis and characterization. J Biomed Nanotechnol. 7: 659-66).
B. cinérea es un hongo fitopatógeno que infecta a un gran número de especies vegetales de gran importancia económica incluyendo árboles frutales, plantas ornamentales y hortalizas. Este hongo produce una enfermedad conocida como pudrición gris generando un grave problema pre- y postcosecha en frutillas, frambuesas, manzanas, peras, castañas, kiwi y uvas entre otras. En ta vid este hongo produce la pudrición del racimo, (van Kan J. A. 2006. Licensed to kill: the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen. Trends Plant Sci. 11 , 247-253; Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski, P. and Delen, N. eds. 2007. Botrytis: Biology, Pathotogy and Control. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers).
Tradicionalmente se ha estudiado B. cinérea con la finalidad de generar estrategias que permitan su control, y con ello, disminuir las pérdidas económicas asociadas a las infecciones generadás por el hongo. A la fecha no existen estudios en el área de la nanotecnología donde se utilicen cultivos, propágulos o moléculas de B. cinérea en el proceso de síntesis de nanopartículas metálicas. Nuestros resultados muestran que β. cinérea en medio líquido es capaz de catalizar la síntesis de nanopartículas de oro a temperatura ambiente a partir de una solución de HAuCI4. La formación de nanopartículas se verificó siguiendo el cambio de color de la solución desde amarillo pálido a rojizo o púrpura. Además, las soluciones que contienen las nanopartículas presentan un máximo de densidad óptica a 540 nm, característico de la presencia de este tipo de estructuras.
A nivel de propiedad intelectual, las patentes relacionadas con síntesis de nanopartículas metálicas, en su mayoría consisten en la utilización de métodos químicos para la síntesis de estas estructuras, algunos de los cuales permiten la obtención de partículas de cierto tamaño y morfología. Este es el caso de la patente USNo.6.929.675 en la que se describe un sistema químico para la generación de nanopartículas de cobre, plata y oro. En relación específica a las AuNps, también es posible encontrar algunas publicaciones, como la patente US 20070125196 en la que se divulga la síntesis de AuNPs de un rango de tamaño desde 30 a 90 nm utilizando un medio acuoso que contiene acriiato de sodio y también la publicación US 20060021468 en la que se describe un método químico para controlar la uniformidad de las partículas generadas. Finalmente cabe señalar que si bien aunque existen patentes relacionadas con el uso de sistemas biológicos para la síntesis de AuNps, actualmente no existe ninguna en la que se describa el uso B. cinérea ni de moléculas producidas por dicho hongo para tales efectos. En este contexto, la patente de mayor similitud es la publicada por un investigador de la Universidad de Illinois el año 2010 (Publicación USNo.20100055199), en la que se describe el uso del hongo Trichoderma reesei para la síntesis de AuNps.
Reseña de la invención
La presente invención corresponde a la síntesis de AuNps mediada por el ascomicete filamentoso B. cinérea y/o moléculas secretadas por el micelio fúngico. Es por lo anterior que el proceso puede realizarse utilizando directamente el hongo o sus moléculas en forma aislada.
Breve Descripción de las figuras
Figura 1. Síntesis de AuNps extracelulares por B. cinérea. Sobrenadante de cultivo de B. cinema incubado con HAuCI4 en distintos pocilios de microplacas de ELISA, (a) Medio de cultivo sin inocular, (b) medio de cultivo obtenido desde cultivos de B. cinérea, (1, 5 y 10) medio de cultivo obtenido desde cultivos de B. cinérea en presencia de HAuCI4 , 5 y 10 mM„ respectivamente.
Figura 2. Espectro de absorción de las AuNps generadas por sobrenadantes de cultivos de β. cinérea. Se observa un máximo de absorción aproximadamente a 550 nm.
Figura 3. Espectro EDS de las partículas de oro generadas por B. cinérea. Se observan señales correspondientes a la presencia del elemento oro como constituyente de las nanopartículas.
Figura 4. Microscopía electrónica de transmisión de las partículas de oro generadas por B. cinérea. Se observa una gran diversidad de tamaños y morfología de partículas. La barra abajo a la derecha corresponde a 100 nm.
Descripción de una realización preferida de este invento Proceso específicamente diseñado para producir nanopartículas de oro a partir de hongos filamentosos. Este proceso comprende las siguientes etapas:
1. - Crecimiento del micelio fúngico: Se cultiva en matraces Erlenmeyer de 250 mi conteniendo 50 mi de un medio nutritivo que contiene entre 0,1-1% de extracto de malta y 0,1-1% de extracto de levaduras. El hongo fue cultivado a 20°C en oscuridad, para ello los matraces fueron mantenidos en un cuarto oscuro por 10 días.
2. - Generación de nanopartículas metálicas: En un matraz Erlenmeyer de 500 mL se colectó aproximadamente 100 mL del líquido sobrenadante obtenido del crecimiento del hongo y se incubó con HAuCI4 «3H20 (concentración final 0,5-10 mM). Para ello se agregó al sobrenadante 0,5-10 mL de una solución de HAuCI4 «3H20 100mM y el matraz Erlenmeyer de 500 mL se incubó a una temperatura entre 25-27°C por un período de tiempo de 0,5 a 12 horas. Las partículas se recuperaron por centrifugación a baja velocidad (6.000-8.000 rpm) o por sedimentación espontánea dejando los tubos en reposo por al menos 1 hora.
El material fue caracterizado por: i) espectro de absorción donde se observa un máximo aproximadamente a 550 nm. ii) Microscopía electrónica de transmisión de las partículas de oro generadas por B. cinérea. Se observa una gran diversidad tanto de tamaños (entre 10-300 nm) así como de morfología de las partículas (esféricas, hexagonales, triangulares y poliédricas).

Claims

REIVINDICACIONES
Método para la síntesis de nanopartículas de oro que comprende:
a) hacer crecer micelio fúngico al cultivar en un medio nutritivo que contiene entre 0,1-1% de extracto de malta y 0,1-1% de extracto de levaduras, Botytris cinérea, el que se hace crecer a 20°C en oscuridad por 10 días; y
b) generar nanopartículas de oro, tomando el sobrenadante obtenido del crecimiento del hongo incubado con HAuCI4 »3H20, manteniéndolo por un período de tiempo de 0,5 a 12 horas, a una temperatura entre 25-27°C, y recuperando las partículas por centrifugación a baja velocidad o por sedimentación espontánea después de un reposo de al menos 1 hora.
El método de la reivindicación 1, en donde la etapa b) comprende opcionalmente extraer del sobrenadante moléculas intra y extracelulares generadas por B. cinérea, y mantener una suspensión conteniéndolas por un período de 0,5 a 12 horas, a una temperatura entre 25-27°C, y recuperando las partículas por centrifugación a baja velocidad o por sedimentación espontánea después de un reposo de al menos 1 hora.
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