CN1746310A - 一种高效固氮工程菌及其构建和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效固氮工程菌及其构建和用途。本发明在联合固氮菌中引入额外拷贝的含有携带四碳二羧酸转运基因的DctBDP片段的质粒，解决菌体能量供应限制问题，从而获得高效固氮的基因工程菌，并用此工程菌生产高效固氮的菌肥。

Description

一种高效固氮工程菌及其构建和用途

技术领域：

本发明涉及一种高效固氮工程菌，特别是利用四碳二羧酸转运基因构建的斯氏假单胞菌高效固氮工程菌；本发明还涉及该工程菌的构建，以及利用该工程菌生产菌肥的用途。

背景技术：

联合固氮菌广泛分布于粮食作物如水稻、小麦、玉米以及各种水果蔬菜植物的根际，作为一种生物肥源具有固氮和分泌植物激素等诸多重要的生物学特性。联合固氮菌主要结合于植物根表，不形成类似根瘤的特异化结构，与共生固氮体系相比，联合固氮效率普遍较低，其固氮活性受外界环境因素影响较大。此外，联合固氮菌田间固氮活性不够稳定，只能为植物提供十分有限的氮素供应。由于联合固氮菌与植物根系的结合松散，以植物根分泌物为碳源，能量来源不稳定。因此，能量限制是导致联合固氮效率低的主要的限制因素之一，解决联合固氮能量限制问题就成为提高联合固氮效率的重中之重。

四碳二羧酸运输系统(C4-dicarxylate transport system，简称dct)是固氮菌固氮过程中的能量运输系统，dct系统将植物根系分泌的四碳二羧酸运入细胞内以维持细胞的基础代谢并进行生物固氮作用。已有人在共生固氮菌中通过引入额外拷贝dct基因提高了二羧酸流入类菌体的速率，从而增强了共生固氮菌的固氮能力。但将四碳二羧酸运输系统的调节基因和结构基因共同引入联合固氮菌，以提高提高联合固氮菌固氮效率的工作尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是在联合固氮菌中引入额外拷贝的dct基因，解决菌体能量供应限制问题，从而获得高效固氮的基因工程菌，并用此工程菌生产高效固氮的菌肥。

本发明构建了含有携带四碳二羧酸转运基因的DctBDP片段的质粒的联合固氮基因工程菌，达到了上述发明目的。

具体的技术方案是：

提取包含dct基因大片段的菌株的质粒，进行质粒酶切，获得包含DctBDP的DNA片段(GeneBank  AJ313422)；将此片段与广寄主范围质粒连接，用连接产物转化大肠杆菌；通过筛选丧失卡那霉素(Km)抗性保留四环素(Tc)抗性的菌株，获得重组质粒；将此重组质粒接合进入联合固氮菌，可获得DctBDP多拷贝菌株。

所述广寄主范围质粒包括质粒pRK290、pRK404、pRK31、pVK100、pLAFR1、pLA2917、RSF1010、pKT212、pGSS8、pAYC30、pKT211、pKT230、pSUP204、pGV1106、pS9152、pSa747；

所述大肠杆菌是可用制备感受态细胞的大肠杆菌，如DH5α、JM109等

所述联合固氮菌包括假单胞菌(pseudomonas)、固氮螺菌(Azospirillum)、固氮弧菌(Azoarcus)、固氮细菌(Azotobacter)、肠细菌(Enterobacter)、草螺菌(Herbaspirillum)、克氏杆菌(Klebsiella)等，其中所述假单胞菌包括斯氏假单胞菌，如斯氏假单胞菌A1501。

所述的转化可采用本领域技术人员熟知的各种转化方法，如电转化方法；所述接合包括本领域技术人员常用的接合方法，如可采用双亲接合法。

本发明的优点

1.基因DctBDP拷贝数的增加，提高了四碳二羧酸的转运能力，经测试工程菌对底物的利用及固氮效率均有提高，固氮效率最高可提高51.6％。

2.本发明采用广宿主质粒使卡那霉素抗性基因失活，为重组子的筛选提供了方便。

具体实施方式：

以下以联合固氮菌斯氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri)为例，详细说明本发明的内容。但本发明的范围并不局限于此。应该说，用本发明的思路和方法可在任何联合固氮菌中实现本发明的目的。

斯氏假单胞菌A1501(以下简称为A1501)是一种联合固氮菌，广泛存在于植物根际、土壤和水中，通过生成植物激素、固定氮素等刺激植物的生长发育。本发明将携带四碳二羧酸转运基因的DctBDP片段(GeneBank  AJ313422)经转化野生型斯氏假单胞菌，得到了具有四环素抗性的目标菌株。

在以下的实施例中，将C1提质粒用BamHI完全酶切，得到了7.2k，4.8k两个DNA片段，回收含有调控基因dctBDP的7.2k的片段，与经过BglII酶切的线性质粒载体pLA2917用T4DNA连接酶进行体外连接反应。连接体系转化大肠杆菌Jm109；筛选具Tc有抗性Km消失的重组子；通过接合实验将该重组质粒接合进入一种联合固氮菌-斯氏假单胞菌A1501中，获得DctBDP多拷贝菌株。在含有Tc的A15培养基上筛选接合子，并用PCR进行验证。通过测试菌株生长曲线及对各种四碳二羧酸的利用能力与固氮酶活性，证明所得到的联合固氮工程菌可提高固氮效率。

以下实施例所用的实验材料：

1.菌株

Pseudomonas stutzeri A1501：分离自中国南方水稻田的一种联合固氮菌，具有较高固氮活性，和较强的水稻根系定殖能力，并有分泌植物促生长激素等重要的生理功能，在水稻、小麦、玉米等粮食作物根部都有一定的定殖能力，对作物的植株和根系生长发育有促进作用。

C1：大肠杆菌，含有pBS载体上插入约10kb的dct基因大片段的质粒。

JM109：大肠杆菌，在本实验中用于制备电转化感受态细胞。

pLA2917：大肠杆菌，含有广宿主范围的可转移载体。卡那霉素(Km)，四环素(Tc)抗性。

2.培养基

LB培养基：1000ml pH7.0

胰蛋白胨         10g

酵母抽提物        5g

NaCl             10g

A15限制性培养基：1000ml pH6.8

KH₂PO₄              0.4g

K₂HPO₄              0.1g

NaCl                   0.1g

MgSO₄.7H₂O          0.01g

MnSO₄.H₂O           0.01g

Fe₂(SO₄)₃.H₂O     0.01g

Na₂MoO₄.H₂O        0.01g

C₃H₅NaO₃           6ml

(NH₄)₂SO₄          0.01g

无氮培养基：1000ml pH6.8

不含(NH₄)₂SO₄的A15限制性培养基，其中碳源物质有三种分别为：

碳源	终浓度
				5mM	10mM	20mM
	琥珀酸(Succinate)苹果酸(malate)延胡索酸(fumarate)	0.59g0.67g0.58g	1.18g1.34g1.16g				2.36g2.68g2.32g

无氮半固体培养基：

液体无氮培养基中加入0.1％-0.2％的琼脂

3.抗生素

卡那霉素(Km)：50mg/ml水溶液，过滤除菌，-20C保存。

四环素(Tc)：100mg/ml 70％乙醇溶液，过滤除菌，-20C保存。

实施例1高效斯氏假单胞菌的构建

A.碱裂解法提取C-1的质粒DNA

1)取单菌落接种到5ml液体LB培养基中，37℃200rpm振摇过夜。

2)取1.5ml培养液于Eppendorf离心管中，12,000rpm离心2min。

3)完全倒掉上清，用100μl溶液I(50mmol/L蔗糖，10mmol/L EDTA pH8.0，25mmol/L Tris-HCl pH8.0)悬浮沉淀菌体，冰上放置5min。

4)加入现配的200μl溶液II(1％SDS，0.2mol/L NaOH)，上下颠倒数次混匀，冰上放置5min。

5)加入150μl溶液III(5mol/L KAc+11.5ml冰醋酸，补加水至100ml)，上下颠倒数次，冰上放置5min。

6)加入500μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒数次混匀。

7)12,000rpm离心10min，吸取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min。

8)12,000rpm离心15min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀。

9)冷冻抽干后，加入50μlddH₂O溶解质粒DNA。

质粒C1经限制性内切酶BamHI消化(见《分子克隆实验指南》第二版)。

B.DNA片段的回收与纯化

应用QIAEX II DNA Purification试剂盒

1)在长波紫外灯下切下目标条带，称取小于250mg胶条放入1.5ml的Eppendorf管中。

2)加入3倍于胶条质量的缓冲液QX I.

3)将7μl充分悬浮的QIAE II树脂颗粒加到Eppendorf管中，50℃温育10分钟，每隔2分钟充分悬浮树脂颗粒一次直到胶条融化。

4)12,000rpm，离心30秒，移去上清液，加入500μl缓冲液QX I徐缓重悬沉淀。

5)离心去上清液后，加入500μl缓冲液PE重悬沉淀。

6)空气干燥沉淀10-15分钟，加20μl水或TE buffer，50℃温育5分钟。

7)离心30秒，得到含有纯化DNA片段的上清液。

C.酶切片段的连接

按照连接酶的使用说明，在10μl反应体系中，加入约50ng载体DNA和相同摩尔数的酶切DNA片段，1μl连接缓冲液，1U的T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。连接产物用于转化大肠杆菌感受态细胞。

D.感受态细胞制备(所有步骤均在冰浴条件下操作)

(1)振荡过夜的大肠杆菌JM109以2％(v/v)比例接种于20ml LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养至菌液OD600值达到0.5-0.6，冰上冷却培养物至0℃。

(2)将菌液转入灭菌离心管，4℃4000g离心15分钟，收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。

(3)加入20ml的预冷10％甘油，置于冰上，不时轻轻颠倒离心管，将菌体泡溶。

(4)4℃4000g 15分钟收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。

(5)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌体泡溶。

(6)重复步骤(4)

(7)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌液泡溶。

(8)重复步骤(4)。

(9)加入200μl的预冷10％甘油，溶解菌体，分装成50μl/1.5ml离心管。

E.质粒的接合转移

1)将供体菌JM109(pLL2922)、受体菌A1501分别少量培养在LB(Tc)和A15培养基中，过夜培养。

2)次日以2％比例转接入5ml LB培养基中培养至OD600＝0.4～0.6，分别取出1.5ml菌液离心，弃上清，用生理盐水悬浮沉淀并离心，重复一次，将离心后的菌体悬浮于100ul生理盐水中。

3)用移液器滴加15ul供体菌于LB平板上，风干后再滴加15ul受体菌，受体菌要全部掩盖供体菌。

4)风干后分别再滴加一次供体菌和受体菌。

5)30℃培养6小时后，用接种针刮下菌膜放入1ml无菌水中，悬浮并摇匀，倍比稀释到10^-5。

6)分别把稀释倍数为10^-1、10^-3、10^-5的菌液100ul涂于含有Tc的A15平板上，30℃培养36个小时。

7)将筛选得到的接合子再转接纯化一次，并做Tc抗性鉴定。

在含有Tc的A15平板上建立了固氮斯氏假单胞菌A1501带有质粒pLL2922的工程菌。

实施例2菌株固氮活性测定

采用乙炔还原法(ARA)测定。

利用SP-2305型气相色谱仪进行ARA测定。

1)挑取单菌落，置于含相应抗生素的LB液体培养基中过夜培养。

2)取适量菌液离心，无菌水洗两次后用无菌水重新悬浮菌体，使菌液OD₆₀₀值约为0.6。

3)取10ul菌液接种于装有3ml无氮A15半固体培养基的7ml青霉素小瓶，加胶塞。

4)30℃静置培养24小时后注入乙炔气体，体积为瓶中气体的10％，继续培养。

5)在培养时间为24hr测乙炔还原活性。

用以下公式计算菌体乙炔还原活性：

单位：nmol乙烯/小时/小瓶；C：注入乙炔体积(ml)；T：反应时间(小时)

          固氮菌的乙炔还原活性测定(24hr)

	琥珀酸	延胡索酸	苹果酸
				A1501	46.38±1.66	53.09±1.95	62.25±2.51
接合子1	65.31±2.11	76.31±2.57	79.37±2.56
				接合子2	70.31±2.50	63.59±4.90	72.52±3.84

在不同四碳二羧酸：琥珀酸、延胡索酸、苹果酸为唯一碳源的A15无氮半固体培养基上生长时，固氮菌的乙炔还原活性(μmol acetylene/ml/h)。

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征是包含GeneBank AJ313422的DNA片段。

2.权利要求1所述的重组质粒，是含所述DNA片段的广寄主范围质粒。

3.权利要求2所述的重组质粒，所述广寄主范围质粒包括质粒pRK290、pRK404、pRK31、pVK100、pLAFR1、pLA2917、RSF1010、pKT212、pGSS8，pAYC30、pKT211、pKT230、pSUP204、pGV1106、pS9152和pSa747。

4.一种高效固氮工程菌，含有权利要求1、2或3所述的重组质粒的联合固氮菌。

5.权利要求4所述的高效固氮工程菌，所述联合固氮菌是假单胞菌(pseudomonas)、固氮螺菌(Azospirillum)、固氮弧菌(Azoarcus)、固氮细菌(Azotobacter)、肠细菌(Enterobacter)、草螺菌(Herbaspirillum)、克氏杆菌(Klebsiella)。

6.权利要求4所述的高效固氮工程菌，所述联合固氮菌是斯氏假单胞菌。

7.权利要求4所述的高效固氮工程菌的构建方法，是用权利要求1的重组质粒转化大肠杆菌；通过筛选丧失卡那霉素(Km)抗性保留四环素(Tc)抗性的菌株，获得重组质粒；将此重组质粒接合进入联合固氮菌，获得DctBDP多拷贝菌株。

8.权利要求7所述的高效固氮工程菌的构建方法，所述的联合固氮菌是斯氏假单胞菌A1501。

9.权利要求7所述的高效固氮工程菌的构建方法，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α和大肠杆菌JM109。

10.权利要求4所述的高效固氮工程菌的用途，是利用该工程菌生产菌肥。