CN113647413B - 一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂及其制备方法 - Google Patents

一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂及其制备方法，它由绿色木霉和淡紫拟青霉在含有氯化锌和硫酸锌的液体培养基中发酵并经过超声波破碎后获得的胞内代谢物和2种类型纳米锌、以及萃取的胞外代谢物、植物生长调节剂、成膜剂混匀制成的制剂。该制剂含有可杀灭黄皮梢腐病和炭疽病病原菌生长的纳米锌和绿色木霉及淡紫拟青霉的胞内外代谢产物，也具有提高黄皮果实抗逆性和抑制果实熟化的植物生长调节剂乙二醇缩糠醛和苯肽胺酸，同时该菌剂具有成膜能力，喷施后能在果实表面形成维持25天以上的保护膜，该膜能保持菌剂中的内含物质长期附着在果实表面，对内杀灭果实表面病原菌对外阻隔病原菌侵染。

Description

一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生 物制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，特别涉及一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂及其制备方法。
背景技术
黄皮梢腐病和炭疽病均能造成黄皮果实腐烂，病原菌分别为黄皮砖红镰孢长孢变种(Fusarium lateritium Nees ex LK.Var.Longum Wollenw)和胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。这两种病害在果实生长期和储存期均能发生，一旦显症则难于防治，给黄皮产业带来巨大的威胁。高温多雨季节，这两种病害发生发展迅速，造成农户在生产过程中过量使用化学农药，并且加上黄皮果实小，食用时嘴巴不可避免会接触果皮，因此更容易造成化学农药中毒。因此，使用生态友好型制剂防治黄皮果实病害是大势所趋，能为该产业可持续发展提供保障。
纳米锌(ZnO-NPs、ZnS-NPs)为1～100nm粒径的纳米颗粒，具有广谱抗菌能力，具有小尺寸效应、表面效应和体积效应等特有性质使其性能远优于传统锌材料，对细菌、真菌和病毒等均显示出显著抑制和杀灭能力((纳米锌对杀鲑气单胞菌的灭活效果及其细胞毒性.中国海洋大学学报(自然科学版)刁菁等，2019)。目前认为，纳米锌不仅破坏病原菌细胞形态结构，而且可以穿过细胞膜进入胞体内干扰胞内生物学功能((纳米锌抗菌机理的研究进展.口腔医学研究)孙千月等，2015)。纳米锌具有良好的生物相容性和对环境友好等优良特性，目前已逐渐推广应用于医疗和卫生等领域。相比于物理和化学合成纳米锌，利用微生物合成纳米锌具有反应条件温和、价格低廉和环境友好等特点。利用微生物合成的纳米锌表面包被有微生物分泌的蛋白质，可提高纳米锌颗粒的稳定性和分散性。由于纳米锌具有杀菌作用，所以对多数微生物细胞具有毒害作用，因此寻找或选育具有耐受性的菌株才能进行生物合成纳米锌。
木霉和淡紫拟青霉是目前广泛应用的生防菌，木霉分泌的代谢物具有优良的拮抗植物病原物和诱导植物产生抗病性的能力，已经成功的用于防治多种植物病害。淡紫拟青霉基本用于防治植物根节线虫，但也有研究论文表明其对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)具有拮抗作用。前人研究表明，复合使用产生不同拮抗代谢物的不同生防微生物防治病害比用单一生防菌的防治效果要高。这可能的原因是，具有协同作用的不同种类生防菌产生的拮抗代谢物互补，不同种类菌株在共同存在条件下诱导产生新的抗性物质。然而，不是菌株间的随意组合就能产生协同作用，多数菌种在共存是具有相互拮抗和排斥现象，造成菌株无法增值甚至死亡，从而导致丧失生防能力或者抑菌能力比单一菌低((四株生防菌对大豆根腐尖镰孢菌及根腐病的作用效果，黑龙江农业科学)杨帆等2021；(几种生防细菌对尖孢镰刀菌的抑菌效果及其相互间包容性生长的快速检测,热带农业科学)孙茜茜等2019)。
乙二醇缩糠醛和苯肽胺酸能诱导植物抗逆性，但是未见报道其在黄皮果实上应用。本专利发现两者按一定比例混合后能提高果实抗性相关酶和抑制果实熟化。
海藻酸钠和明胶是常用的成膜基质，但是明胶没有保鲜作用，海藻酸钠干燥成膜后质地变脆，耐水性和强度差，弹性强度以及耐水性均不太理想。脂肪醇聚氧乙烯醚是常用的表面活性剂，甘油具有优良的乳化性能，常作为乳化稳定剂。利用海藻酸钠、明胶、脂肪醇聚氧乙烯醚和甘油按一定比例配置后可得到性能优良的成膜剂。
由此，为了绿色无公害防治黄皮果实的两种病害，本发明利用在共同培养时能大量产孢(增值)，且纳米锌产率比单独培养时高，同时它们的胞内外代谢产物能拮抗黄皮砖红镰孢长孢变种和胶胞炭疽菌的绿色木霉和淡紫拟青霉共同合成纳米锌(ZnO-NPs、ZnS-NPs)，并将合成的纳米锌与这两种生防菌的胞内外代谢物、乙二醇缩糠醛和苯肽胺酸，以及成膜剂混合制备一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌的生物制剂。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂及其制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂：包括以下原料：含纳米锌和胞内代谢物的破壁液22～40份、粉状胞外代谢物18～29份、植物生长调节剂0.1～0.5份、成膜剂4～6份、蒸馏水100～150份，所述含纳米锌和胞内代谢物的破壁液是将有机物料、无机物料经种子液发酵，得到的发酵液离心，取沉淀破壁制得，所述粉状胞外代谢物是将粉状胞外代谢物上清液经萃取干燥制得。
优选地，防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂，所述有机物料由以下重量份原料组成：干酪素0.2-0.5份、糖蜜2-2.5份、酵母粉1-1.5份、维生素B12 0.01-0.02份、花生油0.05-0.08份、复合氨基酸0.5-1份、牛肉浸膏0.5-1份、鱼蛋白粉1-1.5份、麦芽浸粉0.5-0.9份。
优选地，防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂，其特征在于：所述无机物料由以下重量份原料组成：磷酸氢二钾1-1.5份、碳酸氢铵0.5-1份，氯化镁0.6-1.5份、钼酸铵0.05-0.1份，氯化钠0.5-1份。
优选地，所述成膜剂由以下重量份原料组成：海藻酸钠1-1.5份、明胶0.5-0.85份、脂肪醇聚氧乙烯醚0.3-0.5份、甘油0.3-0.4份。
优选地，所述植物生长调节剂由以下重量份原料组成：乙二醇缩糠醛0.3-1份、苯肽胺酸1-2份。
进一步的，所述的一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、种子液制备：将绿色木霉在固体培养基(每升含：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g)中，于22-30℃，黑暗条件下静置培养5-9天后刮取孢子，制成孢子悬浮液，配置孢子浓度为1.5-2.5×106个/mL，作为绿色木霉种子液，将淡紫拟青霉在固体培养基中，于22-30℃，黑暗条件下静置培养5-9天后刮取孢子，制成孢子悬浮液，配置孢子浓度为1.5-2.5×106个/mL，作为淡紫拟青霉E16种子液；
S2、发酵：按照上述重量份加入有机物料、无机物料、200～400份水搅拌均匀后经高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，在温度降至27℃以下后，加入3～8份绿色木霉H06种子液，10-15小时后加入2～4份淡紫拟青霉E16种子液，通入无菌空气，通气量为15-18L/min，保压0.01-0.05Mpa，恒温25-29℃，转速150-200rpm，36h后加入3.5～5份ZnSO4和ZnCl2的混合溶液，产生ZnO-NPs和ZnS-NPs两种纳米锌，当两种纳米锌总产率>85％时停止发酵，得到浓度为1-2mmol/L的发酵液，备用；
S3、破壁液制备：将上述发酵液于23-27℃，1000-1500rpm离心10-30min，取上清液，备用，将沉淀加入20倍体积的蒸馏水，制成菌悬液，在功率500-700W，时间18-22s，工作间隔20-40s的条件下用超声波细胞破碎仪对菌悬液进行破壁，破壁时间20-40min，获得含纳米锌和胞内代谢物的破壁液，备用；
S4、粉状胞外代谢物制备：将S3中获得的上清液与乙酸乙酯和水饱和正丁醇按1:1:1的比例混合均匀，萃取，取萃取相蒸发干燥，研磨成粉，得粉状胞外代谢物，备用；
S5、含纳米锌生物制剂制备：将S3得到的破壁液、S4得到的粉状胞外代谢物、成膜剂、植物生长调节剂、蒸馏水，在60-65℃下混合均匀，得到含纳米锌生物制剂。
优选地，所述S2中ZnSO4和ZnCl2按照体积1:1混合制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌的生物制剂含有能抑制病原菌生长的绿色木霉和淡紫拟青霉的胞内外代谢物、2种纳米锌，生防微生物代谢物的抑菌机理和纳米锌不同，由此本发明菌剂具有两种以上的抑菌机制，能更好的抑制病原菌；
2.本发明的菌剂中含有乙二醇缩糠醛和苯肽胺酸，对提高黄皮果实的抗病性和抑制果实熟化有一定作用。
3.本发明菌剂中含有成膜剂(海藻酸钠，明胶，脂肪醇聚氧乙烯醚，甘油)，能使绿色木霉和淡紫拟青霉的胞内外代谢物和纳米锌附着在果实表面长达25天，能有效抑制果皮表面病原菌生长并杀灭，也能隔绝外界病原菌。
4.由于黄皮梢腐病和炭疽病病害发生严重且迅速造成果实腐烂，导致生产中用药过度，容易造成食品安全隐患。使用本发明的菌剂能无公害解决这两种病害，能让农户生产出无公害的绿色黄皮果实。
附图说明
图1为实施例3生物制剂对黄皮病菌的实验验证
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所述绿色木霉(Trichoderma viride)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号CGMCC，No.6229，菌株号H06，其具体性状参见专利CN102839131A；所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC，No.5951，菌株号E16，其具体性状参见专利CN102851219A。
实施例1
一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂：包括以下原料：含纳米锌和胞内代谢物的破壁液22份、粉状胞外代谢物18份、植物生长调节剂0.1份、成膜剂4份、蒸馏水100份；
所述有机物料由以下重量份原料组成：干酪素0.2份、糖蜜2份、酵母粉1份、维生素B12 0.01份、花生油0.05份、复合氨基酸0.5份、牛肉浸膏0.5份、鱼蛋白粉1份、麦芽浸粉0.5份；
所述无机物料由以下重量份原料组成：磷酸氢二钾1份、碳酸氢铵0.5份，氯化镁0.6份、钼酸铵0.05份，氯化钠0.5份；
所述成膜剂由以下重量份原料组成：海藻酸钠1份、明胶0.5份、脂肪醇聚氧乙烯醚0.3份、甘油0.3份；
所述植物生长调节剂由以下重量份原料组成：乙二醇缩糠醛0.3-1份、苯肽胺酸1-2份。
实施例2
一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂：包括以下原料：含纳米锌和胞内代谢物的破壁液40份、粉状胞外代谢物29份、植物生长调节剂0.5份、成膜剂6份、蒸馏水150份；
所述有机物料由以下重量份原料组成：干酪素0.5份、糖蜜2.5份、酵母粉1.5份、维生素B12-0.02份、花生油0.08份、复合氨基酸1份、牛肉浸膏1份、鱼蛋白粉1.5份、麦芽浸粉0.9份；
所述无机物料由以下重量份原料组成：磷酸氢二钾1.5份、碳酸氢铵1份，氯化镁1.5份、钼酸铵0.1份，氯化钠1份；
所述成膜剂由以下重量份原料组成：海藻酸钠1.5份、明胶0.85份、脂肪醇聚氧乙烯醚0.5份、甘油0.4份；
所述植物生长调节剂由以下重量份原料组成：乙二醇缩糠醛1份、苯肽胺酸1-2份。
实施例3
一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂：包括以下原料：含纳米锌和胞内代谢物的破壁液31份、粉状胞外代谢物25份、植物生长调节剂0.3份、成膜剂5份、蒸馏水125份；
所述有机物料由以下重量份原料组成：干酪素0.3份、糖蜜2-2.5份、酵母粉1.3份、维生素B12 0.01份、花生油0.07份、复合氨基酸0.7份、牛肉浸膏0.7份、鱼蛋白粉1.2份、麦芽浸粉0.7份；
所述无机物料由以下重量份原料组成：磷酸氢二钾1.3份、碳酸氢铵0.7份，氯化镁1.3份、钼酸铵0.08份，氯化钠0.8份；
所述成膜剂由以下重量份原料组成：海藻酸钠1.2份、明胶0.7份、脂肪醇聚氧乙烯醚0.4份、甘油0.35份；
所述植物生长调节剂由以下重量份原料组成：乙二醇缩糠醛0.8份、苯肽胺酸1.5份。
上述实施例1～3采用以下制备方法：
S1、种子液制备：将绿色木霉在固体培养基(每升含：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g)中，于26℃，黑暗条件下静置培养7天后刮取孢子，制成孢子悬浮液，配置孢子浓度为2.0×106个/mL，作为绿色木霉种子液，将淡紫拟青霉在固体培养基中，于26℃，黑暗条件下静置培养7天后刮取孢子，制成孢子悬浮液，配置孢子浓度为2.0×106个/mL，作为淡紫拟青霉E16种子液；
S2、发酵：按照上述重量份加入有机物料、无机物料、300份水搅拌均匀后经高压蒸汽灭菌，在温度降至27℃以下后，加入5份绿色木霉H06种子液，12小时后加入3份淡紫拟青霉E16种子液，通入无菌空气，通气量为16L/min，保压0.03Mpa，恒温27℃，转速180rpm，36h后加入4份体积比为1:1的ZnSO4和ZnCl2的混合溶液，产生ZnO-NPs和ZnS-NPs两种纳米锌，当两种纳米锌总产率>85％时停止发酵，得到浓度为2mmol/L的发酵液，备用；
S3、破壁液制备：将上述发酵液于25℃，1200rpm离心15min，取上清液，备用，将沉淀加入20倍体积的蒸馏水，制成菌悬液，在功率600W，时间20s，工作间隔30s的条件下用超声波细胞破碎仪对菌悬液进行破壁，破壁时间30min，获得含纳米锌和胞内代谢物的破壁液，备用；
S4、粉状胞外代谢物制备：将S3中获得的上清液与乙酸乙酯和水饱和正丁醇按1:1:1的比例混合均匀，萃取，取萃取相蒸发干燥，研磨成粉，得粉状胞外代谢物，备用；
S5、含纳米锌生物制剂制备：将S3得到的破壁液、S4得到的粉状胞外代谢物、成膜剂、植物生长调节剂、蒸馏水，在63℃下按不同实施例所用比例混合均匀，得到含纳米锌生物制剂。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于，H06处理：用本发明实施例3所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)的胞内胞外代谢物，并按与实施例3同样的制备流程和比例混合。此处理不添加ZnSO4、ZnCl2，故不产生纳米锌。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，E16处理：用本发明实施例3所用的有机物料、无机物料、淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理不添加ZnSO4、ZnCl2，故不产生纳米锌。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，H06+E16处理：用本发明实施例3所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)和淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理不添加ZnSO4、ZnCl2，故不含纳米锌。
对比例4
本对比例与实施例3的区别在于，H06+ZnSO4处理：用本发明实施例3所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)的胞内胞外代谢物、ZnSO4，并按与本发明实施例3同样的制备流程和比例混合。此处理只添加ZnSO4，故只产生ZnS-NPs类型纳米锌。
对比例5
本对比例与实施例3的区别在于，H06+ZnCl2处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)的胞内胞外代谢物、ZnSO4，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理只添加ZnCl2，故只产生ZnO-NPs类型纳米锌。
对比例6
本对比例与实施例3的区别在于，H06+ZnSO4+ZnCl2处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)的胞内胞外代谢物、ZnSO4、ZnCl2，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理产生ZnO-NPs和ZnS-NPs两种类型纳米锌。
对比例7
本对比例与实施例3的区别在于，E16+ZnSO4处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物、ZnSO4，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理产生ZnS-NPs类型纳米锌。
对比例8
本对比例与实施例3的区别在于，E16+ZnCl2处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物、ZnCl2，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理产生ZnO-NPs类型纳米锌。
对比例9
本对比例与实施例3的区别在于，E16+ZnSO4+ZnCl2处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物、ZnSO4、ZnCl2，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理产生ZnO-NPs和ZnS-NPs两种类型纳米锌。
对比例10
本对比例与实施例3的区别在于，H06+E16+ZnSO4处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)、淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物、ZnSO4，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理产生ZnS-NPs类型纳米锌。
对比例11
本对比例与实施例3的区别在于，H06+E16+ZnCl2处理：用本发明所用的有机物料、无机物料、绿色木霉(H06)、淡紫拟青霉(E16)的胞内胞外代谢物、ZnCl2，并按与本发明同样的制备流程和比例混合。此处理产生ZnO-NPs类型纳米锌。
一、病原菌生长的抑制效果
将上述实施例3和对比例1～11制得的生物制剂对病原菌生长的抑制效果，结果如下表1.
表1不同处理发酵液对病原菌生长的抑制效果(％)
Figure BDA0003220370990000091
Figure BDA0003220370990000101
注：Colletotrichum gloeosporioides为炭疽病菌，Fusarium lateritium为黄皮梢腐病
由表1结果表明，对比例10、对比例11、实施例3三个处理在第3d和第5d时对两种病原菌的抑制率在12个处理中位列前三。其中，实施例3抑制病原菌能力最高，其在第5d时对炭疽病菌的抑制率高达49.80(±0.50)％，对黄皮梢腐病菌抑制率高达53.14(±0.13)％。这说明H06和E16共同转化得到的两种纳米锌可以增强整体发酵液的抑菌能力。
二、生物制剂对果实腐烂率和生理指标的影响
将病原菌Colletotrichum gloeosporioides和Fusarium lateritium分别在PDA固体培养基(每升含：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g)培养，于26℃，黑暗条件下静止培养7天后刮取孢子制成孢子悬浮液，分别将孢子浓度配置为1.0×103个/mL，然后将两种病原菌的孢子悬浮液按1:1的比例混合后在果实表面均匀喷施，然后将果实放在在超净工作台上以弱风吹至半干。立即按以下处理方式处理果实：
处理1：喷施300倍溶液本发明的防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌的生物制剂；
处理2：喷施本发明所用的有机物料、无机物料、ZnSO4、ZnCl2、绿色木霉和淡紫拟青霉的胞内胞外代谢物、成膜剂，并按与本发明同样的制备流程和比例混合，但不含有植物生长调节剂，该制剂与本发明的制剂不同之处在于，即在步骤S5中不加入植物生长调节剂。喷施300倍溶液。
处理3：喷施本发明所用的植物生长调节剂、成膜剂，并按与本发明同样的比例混合，该制剂与本发明的制剂不同之处在于，即在步骤S5中只使用植物生长调节剂和成膜剂。喷施300倍溶液。
处理4：喷施本发明所用的成膜剂，并按与本发明同样的成膜剂比例混合，即在步骤S5中只使用成膜剂。喷施300倍溶液。
CK：喷施无菌蒸馏水。
试验用果实均为同一棵树同一时间采摘且成熟度一致的表面无损伤果实，试验果实放置在20℃，湿度为85％，12小时光照12小时黑暗的培养条件中。每个重复含50个果实，CK和处理各3个重复。维生素C(Vc)、果实硬度、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)均随机取6份样品进行试验，每份样品进行三次平行试验。果实腐烂率取三个重复平均值，腐烂部位大于整果10％以上记为腐烂，腐烂率＝腐烂果实/50*100。
表2纳米银复合芽孢杆菌菌剂对果实腐烂率和生理指标的影响
Figure BDA0003220370990000111
由表2可知，接种病原菌5天后，CK果实大规模出现Vc含量下降、硬度下降和腐烂情况，但处理1果实Vc含量和硬度为最高，且腐烂率最低，处理2次之。
MDA是细胞膜脂过氧化产物之一。逆境情况下植物MDA含量增高，所以利用它的含量间接地反映植物细胞受损程度。结果表明，处理1明显降低果实的MDA含量，这说明处理1(也即本发明制剂)能保护果实细胞的质膜结构和功能。
SOD是植物细胞内防御酶系统的重要成员之一，它催化超氧化阴离子歧化为H2O2和O2，再由CAT进一步催化生成H2O和O2，从而提高植物组织抗氧化能力。SOD活性高则植物体抗逆性强。结果表明，处理1果实的SOD酶明显比其它处理高，这表明处理1能诱导高活性的SOD酶来提高黄皮果实的抗逆性。
三、生物制剂对黄皮病菌的实验验证
将本方实施例3的生物制剂和市售特效药进行对比，试验用果实均为同一棵树同一时间采摘且成熟度一致的表面无损伤果实，试验果实放置在20℃，湿度为85％，喷施量均为100mL/m3，12小时光照12小时黑暗培养，培养14天后，观察果实的形态。
处理1：喷施300倍溶液本发明的防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌的生物制剂；
处理2：50％多菌灵可湿性粉剂500倍液；
处理3：无菌水
如图1所示，左为处理1后的黄皮果实，中间为处理2，右为无菌水；可知，使用本发明的生物制剂，黄皮果果实坚硬，形态饱满，有光泽；中间黄皮果出现皱缩，个别出现白霉斑，右使用无菌水处理，黄皮皱缩严重，出现白霉斑。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂，其特征在于：包括以下重量份原料：含纳米锌和胞内代谢物的破壁液22~40份、粉状胞外代谢物18~29份、植物生长调节剂0.1~0.5份、成膜剂4~6份、蒸馏水100~150份，所述含纳米锌和胞内代谢物的破壁液是将有机物料、无机物料经种子液发酵，得到的发酵液离心，取沉淀破壁制得，所述粉状胞外代谢物是将粉状胞外代谢物上清液经萃取干燥制得；所述有机物料由以下重量份原料组成：干酪素0.2-0.5份、糖蜜2-2.5份、酵母粉1-1.5份、维生素B12 0.01-0.02份、花生油0.05-0.08份、复合氨基酸0.5-1份、牛肉浸膏0.5-1份、鱼蛋白粉1-1.5份、麦芽浸粉0.5-0.9份；所述无机物料由以下重量份原料组成：磷酸氢二钾1-1.5份、碳酸氢铵0.5-1份，氯化镁0.6-1.5份、钼酸铵0.05-0.1份，氯化钠 0.5-1份；所述成膜剂由以下重量份原料组成：海藻酸钠1-1.5份、明胶0.5-0.85份、脂肪醇聚氧乙烯醚0.3-0.5份、甘油0.3-0.4份；所述植物生长调节剂由以下重量份原料组成：乙二醇缩糠醛0.3-1份、苯肽胺酸1-2份；
所述的一种防治造成果实腐烂的黄皮梢腐病和炭疽病的含纳米锌生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、种子液制备：将绿色木霉（Trichoderma viride）在固体培养基中，于22-30℃，黑暗条件下静置培养5-9天后刮取孢子，制成孢子悬浮液，配置孢子浓度为1.5-2.5×106个/mL，作为绿色木霉H06种子液，将淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）在固体培养基中，于22-30℃，黑暗条件下静置培养5-9天后刮取孢子，制成孢子悬浮液，配置孢子浓度为1.5-2.5×106个/mL，作为淡紫拟青霉E16种子液；
S2、发酵：按照上述重量份加入有机物料、无机物料、200~400份水搅拌均匀后经高压蒸汽灭菌，在温度降至27℃以下后，加入3~8份绿色木霉H06种子液，10-15小时后加入2~4份淡紫拟青霉E16种子液，通入无菌空气，通气量为15-18L/min，保压0.01-0.05Mpa，恒温25-29℃，转速150-200rpm，36h后加入3.5~5份ZnSO4和ZnCl2的混合溶液，ZnSO4和ZnCl2按照体积1:1混合制得，产生ZnO-NPs和ZnS-NPs两种纳米锌，当两种纳米锌总产率>85%时停止发酵，得到浓度为1-2mmol/L的发酵液，备用；所述绿色木霉保藏编号CGMCC，No.6229，菌株号H06；所述淡紫拟青霉保藏编号CGMCC，No.5951，菌株号 E16；
S3、破壁液制备：将上述发酵液于23-27℃，1000-1500rpm离心10-30min，取上清液，备用，将沉淀加入20倍体积的蒸馏水，制成菌悬液，在功率500-700W，时间18-22s，工作间隔20-40s的条件下用超声波细胞破碎仪对菌悬液进行破壁，破壁时间20-40min，获得含纳米锌和胞内代谢物的破壁液，备用；
S4、粉状胞外代谢物制备：将S3中获得的上清液与乙酸乙酯和水饱和正丁醇按1:1:1的比例混合均匀，萃取，取萃取相蒸发干燥，研磨成粉，得粉状胞外代谢物，备用；
S5、含纳米锌生物制剂制备：将S3得到的破壁液、S4得到的粉状胞外代谢物、成膜剂、植物生长调节剂、蒸馏水，在60-65℃下混合均匀，得到含纳米锌生物制剂。
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