CN111601879A - 微生物菌株布氏乳杆菌biocc 203 dsm 32650和布氏乳杆菌biocc 228 dsm 32651及其用途 - Google Patents

微生物菌株布氏乳杆菌biocc 203 dsm 32650和布氏乳杆菌biocc 228 dsm 32651及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了分离的微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651及其作为微生物饲料添加剂的用途。所述菌株用于确保具有低干物质含量(≤20%)的饲料的有氧稳定性和提高饲料的发酵，增加饲料中的乳酸和乙酸的浓度和降低pH，因此减少饲料中的营养物的损失。在青贮饲料贮存中使用微生物抑制饲料中的致病性微生物(肠病原体)和酵母的功能。所述菌株可用于延长由难以发酵的新鲜材料制成的饲料的贮存寿命。

Description

微生物菌株布氏乳杆菌BIOCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌 BIOCC 228 DSM 32651及其用途
技术领域
本发明属于生物技术的领域，并且应用于饲料制造。本发明涵盖微生物青贮饲料(silage)添加剂及其在饲料发酵中确保饲料的有氧稳定性、发酵质量的用途。
背景技术
有必要从饲料的收获和贮存直至动物食用饲料保持青贮饲料的营养物含量。
青贮饲料是通过对高水分含量的作物进行受控发酵而产生的材料(McDonald,P., Henderson, A. R., Heron, S.J.E. 1991. The biochemistry of silage. 第2版Chalcombe Publications, Marlow, Bucks UK, p. 340)。
青贮饲料贮存(ensiling)是一种基于植物的动物饲料的贮存方法，其依靠厌氧条件下的乳酸发酵(Rooke, J., A.和Hatfield, G., D., 2003. Biochemistry ofEnsiling. 于: Silage Science and Technology. D. R. Buxton, R. E. Muck,和J. H.Harrison, 编 American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA. pp. 95-139)。青贮饲料的发酵可分为四个阶段：(1)收获后的窖仓(silo)中的厌氧阶段；(2)发酵阶段；(3)稳定的贮存阶段；和(4)青贮饲料卸载阶段，其中打开窖仓，并且青贮饲料暴露于空气。为了生产高质量青贮饲料，待青贮饲料贮存的材料必须经历正确的微生物发酵。成功的发酵还取决于草类植物的类型和质量、青贮饲料贮存过程中使用的技术、气候、不期望的微生物(例如梭菌、肠病原体、李斯特菌、杆菌)和真菌(酵母和霉菌)的发展以及待青贮饲料贮存的材料的干物质含量。
难以控制饲料的自然发酵，因为青贮饲料的发酵是几种不同化学和微生物过程及其相互作用的复杂组合。
大部分青贮饲料以200...500 g/kg的干物质含量产生。在此类水平下，许多植物酶在青贮饲料贮存过程期间是有活性的，并且在此类条件下，许多期望的和不期望的微生物、酵母和霉菌可以在青贮饲料中生长。因此，使整个生物活性处于控制下构成显著的挑战，并且仅可以通过良好管理的青贮饲料贮存过程的方式来实现(Muck, R. E. 2010.Silage microbiology and its control through additives. R. Bras. Zootec. Vol.39. July)。
在受控的青贮饲料贮存过程中，水溶性碳水化合物被乳酸细菌发酵成乳酸。作为结果，待青贮饲料贮存的材料的pH水平下降(青贮饲料贮存量被酸化)，其进而抑制腐败微生物的活性(Oude Elferink, S. J. W. H., Driehuis, F., Gottschal, J. C.,Spoelstra, S. F. 2000. Silage fermentation processes and their manipulation.– Journal FAO Plant Production and Protection No 161, pp 17–30)。青贮饲料的酸度越快下降至pH 4，酶促和微生物活性停止越快，饲料变得稳定，并且保留更多的营养物。
已报道，青贮饲料的发酵质量可以通过含有乳酸细菌的添加剂的方式而得到显著提高(McDonald, P., Henderson, A. R., Heron, S.J.E. 1991. The biochemistry ofsilage. 第2版 Chalcombe Publications, Marlow, Bucks UK, p. 340)。
与青贮饲料的发酵和贮存阶段中的营养物的保存同样重要的是，在打开窖仓后，青贮饲料中的营养物的保存。当打开窖仓用于饲喂时以及由于窖仓的覆盖率不足，青贮饲料均可能变得暴露于氧气。
由于有氧微生物的活性，任何暴露于空气的青贮饲料迟早都腐败。青贮饲料的有氧稳定性还取决于待青贮饲料贮存的青贮饲料作物，其在收获时的生长阶段，发酵的生物化学和微生物因素，青贮饲料材料的物理特征，青贮饲料管理的组织，温度以及青贮饲料添加剂的选择。青贮饲料的有氧稳定性指标是青贮饲料可以抵抗有氧腐败过程的时间长度，即其在暴露于空气后保留其质量的时间长度。青贮饲料的有氧稳定性基于青贮饲料的温度升高的速率估算。青贮饲料的温度保持稳定的时间越长，即它不比环境温度高出超过3℃的时间越长(Commission Regulation (EC) No. 429/2008; DLG-Richtlinienfür die Prüfung von Siliermitteln auf DLG-Gütezeichen-Fähigkeit, DLG Oktober 2013))，青贮饲料的有氧稳定性和质量越高。在大多数有氧易腐烂的青贮饲料中，在酸和水溶性碳水化合物被微生物氧化为二氧化碳和水后，温度升高到环境温度之上。
尽管青贮饲料的低pH水平抑制不期望的微生物在厌氧条件下的生长，但低pH本身不足以防止有氧腐败。有氧条件下的青贮饲料的腐败大多数始于酵母，甚至在相对低的pH水平下，酵母也可以生长。酵母可以在宽pH范围(pH 3...8)内生长。大多数酵母的生长的最佳pH为3.5...6.5。当青贮饲料在打开窖仓后暴露于空气时，在发酵期间已形成的酸和其他化合物被有氧细菌、酵母和霉菌氧化。酵母的活性导致产生二氧化碳，其使青贮饲料变热 -这进而是干物质损失的直接原因(McDonald, P., Henderson, A. R., Heron, S.J.E.1991. The biochemistry of silage. 第2版 Chalcombe Publications, Marlow, BucksUK, p. 340)。
酵母利用青贮饲料中含有的残余糖作为能量来源；然而，它们的第一优选项是乳酸。作为结果，具有高乳酸含量的良好发酵的青贮饲料特别易于有氧腐败。酵母的活性引起青贮饲料的pH水平升高，使得许多其他有氧微生物和霉菌能够变得活跃。青贮饲料的温度的增加揭示良好发酵、营养丰富的青贮饲料中的高微生物活性。
已经报道(Ohyama, Y., Hara, S.和Masaki, S. (1980) Analysis of thefactors affecting aerobic deterioration of grass silages. 于Thomas, C. (编)Forage conservation in the 80s. BGS Occasional Symposium No. 11, pp. 257-261.Reading, UK: British Grassland Society)，打开窖仓后的青贮饲料中的干物质、乙酸和丙酸含量以及酵母和霉菌的数量是青贮饲料的有氧稳定性的重要决定因素。关于干物质含量和酵母的负相关表明，更高的浓度导致青贮饲料在暴露于空气后的温度的更快升高。另一方面，用乙酸和丁酸，这些发酵产物的更高浓度与更稳定的青贮饲料相关。
如所示，青贮饲料的低pH水平对引起有氧腐败的微生物没有直接影响；然而，在青贮饲料的发酵期间产生的酸具有可变的重要性。酵母的生长被未解离的短链脂肪酸抑制(Pahlow G., Muck R.E., Driehuis F., Oude Elferink S.J.W.H.和Spoelstra S.F.(2003) Microbiology of ensiling. 于: Buxton D.R., Muck R.E.和Harrison J.H.(编) Silage science and technology, pp. 31–93. Madison, WI, USA: AgronomyPublication No. 42, American Society of Agronomy)。未解离的酸分子可以通过被动扩散的方式穿透微生物的细胞膜，其导致H+离子的释放。这降低细胞内的pH水平，引起细胞死亡。青贮饲料中的酸的解离速率取决于酸的解离常数(pKa)和青贮饲料的pH水平(Zirchrom (2011) Dissociation constants oforganic acids and bases. 可得自:http://www.zirchrom.com/organic.htm (在2011年11月3日访问))。乙酸和丙酸比乳酸更不易于解离，这解释了具有高乳酸含量的良好发酵的青贮饲料对有氧腐败的敏感性。另一方面，乙酸和丙酸有效地抑制酵母和霉菌的生长。丁酸具有类似的作用。具有高丁酸含量的青贮饲料具有良好的有氧稳定性；然而，这指示引起腐败的梭菌的活性。这种青贮饲料表现出大量的营养物损失，并且高丁酸含量可以引起动物中的健康问题。青贮饲料中的丙酸含量稀少且小；青贮饲料作物中产生丙酸的微生物的浓度低，且其竞争力差。
青贮饲料中的乙酸含量是异型发酵的指标；因为乙酸对酵母是高度毒性的；此类青贮饲料通常展示大的有氧稳定性。
理想的青贮饲料发酵减少发酵损失，并且在饲料的贮存和将其从窖仓卸载用于饲喂期间确保足够的稳定性。有效的青贮饲料添加剂以及青贮饲料的生产和使用的正确组织在这些目标的实现中发挥关键作用。已经开发了大多数青贮饲料添加剂来改进青贮饲料贮存过程和青贮饲料贮存的饲料的营养价值。然而，除了确保快速发酵并提高青贮饲料的质量以外，还期望青贮饲料添加剂抑制腐败(包括有氧腐败)生物的生长。使用青贮饲料添加剂来提高青贮饲料的有氧稳定性的主要原因是防止青贮饲料的变热，营养物的损失以及由于食用腐败的青贮饲料而导致的动物的性能下降。
青贮饲料添加剂经常采用酶；然而，这些不抑制酵母或霉菌，意味着用酶制备的青贮饲料具有非常适度的有氧稳定性。
有机酸，诸如丙酸、乙酸和苯甲酸等，对于提高青贮饲料的有氧稳定性是有效的。这些以大量(以便达到所谓的饲料的最终保存)或少量添加。在后一种情况下，酵母的活性被抑制，但不保证完全的保存，并且青贮饲料贮存继续取决于自然发酵。还已经报道氨对细菌、酵母和霉菌具有抑制作用。不幸的是，有机酸和其他化学物对青贮饲料设备是侵袭性和损害性的；严格的安全要求应用于其处理和贮存。
基于乳酸细菌的生物青贮饲料添加剂被视为天然产物；它们的优势包括其缺乏毒性，缺乏对设备的腐蚀作用以及缺乏环境风险。
通过乳酸细菌的方式降低青贮饲料的pH水平的目的是使发酵损失最小化。基于葡萄糖发酵，乳酸细菌被分为两组：同型发酵和异型发酵物种。同型发酵乳酸细菌从一摩尔葡萄糖产生两摩尔乳酸，而异型发酵细菌产生一摩尔乳酸、一摩尔二氧化碳和一摩尔乙醇或乙酸。众所周知的是，在发酵过程开始时，同型发酵物种占优势，但后来，随着环境变得更加酸性，异型发酵细菌变得流行(Muck, R. E. 2010. Silage microbiology and itscontrol through additives. R. Bras. Zootec. Vol. 39. July)。
基于同型发酵乳酸细菌的青贮饲料添加剂改进青贮饲料的发酵过程；然而，大多数此类起始剂(starter)细菌几乎不抑制酵母和霉菌的生长。使用这种青贮饲料添加剂，青贮饲料的有氧稳定性可能比没有任何青贮饲料添加剂的情况下更低，并且其甚至可能增加青贮饲料的变热风险。
一些青贮饲料起始剂含有产生丙酸的细菌(例如，丙酸细菌)。不幸的是，这并不提高青贮饲料的有氧稳定性，因为这些微生物通常不耐酸，并且它们的生长缓慢。然而，除了乳酸以外还产生大量乙酸的起始剂(布氏乳杆菌)的确抑制引起青贮饲料的有氧腐败的微生物(酵母、霉菌等)，即它们提高青贮饲料的有氧稳定性并防止在打开窖仓后或其他类型的对空气的暴露后的青贮饲料的腐败。
在青贮饲料贮存过程期间异型发酵乳酸细菌的添加降低pH水平并减少干物质损失。此外，这些菌株中的一些被报道为对酵母和霉菌的生长具有强抑制作用，由此提高青贮饲料的有氧稳定性(Jatkauskas, J., Vrotniakiene, V., Ohlsson, C., Lund, B.2013. The effect of three silage inoculants on aerobic stability in grass,clover-grass, lucerne and maize silage. Agricultural and Food Science. 22:137-144)。
然而，相同物种的不同菌株不具有相同的特性，因为由于遗传变异，发生物种间差异，即菌株特异性特性。
本发明的目的是提供新菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651，其用于提高饲料发酵质量并延长青贮饲料的有氧稳定性和贮存时间。
发明公开内容
本发明公开了分离的微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651，以及包含一种或两种所述菌株的饲料、饲料添加剂和组合物。所述饲料可以是发酵饲料，例如，青贮饲料。所述饲料添加剂可以是青贮饲料添加剂。合适的赋形剂可以作为其他成分包括在添加剂产品的组合物中。所述微生物可以冻干形式使用。
微生物布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651确保饲料(包括难以发酵的饲料，例如具有低(≤20%)干物质含量的饲料)的有氧稳定性。
本发明的下一个目的是命名的微生物在以下中的用途：加速饲料的发酵，增加乳酸的浓度，降低pH，和减少饲料中的营养物的损失以及饲料中的氨氮和丁酸的浓度。
所述微生物(一起或分开)用于发酵饲料和提高发酵，增加饲料中的乳酸和乙酸的浓度，降低pH水平，且由此减少饲料中的营养物损失。
基于对抗微生物特性的研究，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651抑制不期望的微生物(致病性微生物、酵母和霉菌)的生长和作用。所述病原体是金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清变种、粪肠球菌、大肠杆菌等。
本发明还涉及用于延长饲料的保存的方法，其中在发酵期间将微生物布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651中的一种或两种添加至饲料中。在使用上述菌株之一添加至饲料的情况下，其比率为1x105...1x106 CFU/g发酵饲料。
菌株的描述
微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651是在爱沙尼亚在不使用青贮饲料添加剂高品质玉米(玉米(Zea mays) L.)青贮饲料的情况下自然青贮饲料贮存的分离形式。为了确定青贮饲料样品中乳杆菌的定量含量，使用十进制稀释方法，在蛋白胨水(Sigma-Aldrich, France)中，由溶液制成悬浮液(浓度递减)；并接种在MRS (de Man Rogosa Sharpe)琼脂(Biolife, Italy)上，将其在37℃下在微好氧(10%CO2)环境(恒温器„MCO-18AIC UV“ Sanyo Electronic Co, Ltd, Japan)中孵育48小时。将发展的菌落描述，计数，并确定微生物的总计数。为了描述微生物的形态，使用革兰氏染色方法进行制备，并进行显微镜检查。基于对于乳杆菌属物种特异性的菌落和细胞形态，分离菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651。随后是临时和详细的鉴定，下面对此进行描述。
在MRS琼脂和液体培养基(Biolife, Italy)中生长之后，确定布氏乳杆菌BioCC203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的培养物的形态学特征。
布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650是革兰氏阳性的规则杆状，非运动性，不形成孢子的细菌，其单独且以短链出现。在MRS液体培养基中培养期间出现伸长的细胞。
布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651是革兰氏阳性的规则杆状，非运动性，不形成孢子的细菌，其单独且以短链出现。在MRS液体培养基中培养期间出现长且细长的细胞。
生理-生物化学特征
MRS液体培养基(持续48-72小时)适合于微好氧或厌氧培养微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650，此后出现均匀的混浊生长。在37度在微好氧(10% CO2)或厌氧(CO2/N2/H2：5/90/5%)环境中培养48小时之后，菌落为灰白色，1.5-2毫米，扁平，发亮，半透明，其中质地粗糙且为凸形的。
微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650是专性异型发酵的，过氧化氢酶和氧化酶阴性的，水解精氨酸并在发酵葡萄糖期间产生二氧化碳。
菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650的最佳生长温度为37度；所述菌株也在15度复制。在很小程度上，也可以在45度观察到生长。使所述菌株生长的最佳pH范围为5.7-6.2。
MRS液体培养基(持续48-72小时)适合于微好氧培养布氏乳杆菌BioCC 228 DSM32651的微生物菌株，此后出现均匀的混浊生长。在37度在微好氧(10% CO2)或厌氧(CO2/N2/H2：5/90/5%)环境中培养48小时之后，菌落为灰白色，1.5-2毫米，扁平，发亮，半透明，其中质地粗糙且为凸形的。
微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651是专性异型发酵的，过氧化氢酶和氧化酶阴性的，水解精氨酸并在发酵葡萄糖期间产生二氧化碳。
菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的最佳生长温度为37度；所述菌株也在15度复制。在很小程度上，也可以在45度观察到生长。使所述菌株生长的最佳pH范围为5.7-6.2。
使用MALDI Biotyper (Bruker Daltonik)，将微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203DSM 32650鉴定为布氏乳杆菌。
使用MALDI Biotyper (Bruker Daltonik)，将微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 228DSM 32651鉴定为布氏乳杆菌。
布氏乳杆菌菌株BioCC 203在2017年9月25日根据关于国际承认用于专利程序的目的的微生物保藏的布达佩斯条约(the Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)以编号DSM 32650保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH。
DSMZ的地址：Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig，德国。
布氏乳杆菌菌株BioCC 228在2017年9月25日根据关于国际承认用于专利程序的目的的微生物保藏的布达佩斯条约(the Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)以编号DSM 32651保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH。
DSMZ的地址：Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig，德国。
对抗生素的抗性
方法：根据ISO10932:2010标准，用VetMIC Lact-1和VetMIC Lact-2板(SVA NationalVeterinary Institute, Uppsala, Sweden)在厌氧(CO2/N2/H2:5/90/5%)条件下在+ 37度分析布氏乳杆菌菌株BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的抗生素敏感性48小时。将最低抑制浓度(MIC)与由EFSA报告的MIC截止值进行比较。
表1. 布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的抗生素的最低抑制浓度(MIC)-值(mg/L)。
Figure 163998DEST_PATH_IMAGE001
*EFSA 2012. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility toantimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal 2012, 10(6),2740。
为了评价用作饲料添加剂的细菌，可以将菌株归类为对抗微生物剂敏感或抗性的：
敏感的(S)：当细菌菌株在等于或低于确立的截止值的特定抗微生物剂浓度(S ≤ xmg/L)被抑制时，其被定义为敏感的。
抗性的(R)：当细菌菌株在高于确立的截止值的特定抗微生物剂浓度(R > x mg/L)未被抑制时，其被定义为抗性的。
菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的抗生素敏感性的结果呈现于表1中。布氏乳杆菌菌株BioCC 203 DSM 32650和BioCC 228 DSM32651的最低抑制浓度未超过由EFSA提出的对于专性异型发酵乳杆菌提出的MIC截止值。
菌株的功能特性
在各种糖存在的情况下的生长
该实验的目的是研究菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228DSM 32651在各种糖存在的情况下生长和酸化培养基的能力。
方法：将在MRS琼脂上培养的布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的24h旧培养物根据McFarland浊度标准No 5 (1.5x 109微生物/ml)悬浮于蛋白胨水中，以1.5 x 106微生物/ml的最终密度接种至含有20 g/L葡萄糖、果糖、海藻糖、木糖或麦芽糖中的任一种或葡萄糖、果糖、海藻糖的混合物(比率为1:1:1，其中最终浓度也是20 g/L)的改良MRS液体培养基中。将悬浮液在恒温器中在25度微好氧(10%CO2)和厌氧(CO2 / N2 / H2:5/90/5%)孵育24、48和72小时。在厌氧环境的情况下，预先将培养基在24小时期间(guring)还原。登记两种菌株的存活计数，如下计算产率、世代数(n)和生长速率(V)：
产率 = log N1-log N0，其中N1是在任何给定时间的细胞浓度；N0是初始细胞浓度
n = log N1-log N0 / log 2，其中N1是在任何给定时间的细胞浓度；N0是初始细胞浓度
V = log N1-log N0 / 0.301 x t，其中N1是在任何给定时间的细胞浓度；N0是初始细胞浓度，且t是以小时计的指定时间段。
在含有葡萄糖、果糖、木糖或葡萄糖、果糖和海藻糖的混合物的培养基中，在微好氧培养的前24小时期间，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650的菌株的生长比菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的生长快一代(表2)。
表2. 不同的糖对在25度微好氧(10% CO2)培养24、48和72小时期间的布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的生长动力学的影响。
Figure 81138DEST_PATH_IMAGE002
N - n世代数；V – 生长速率；G – 具有葡萄糖的MRS液体培养基；F - 具有果糖的MRS液体培养基；T - 具有海藻糖的MRS液体培养基；M - 具有葡萄糖-果糖-海藻糖的混合物的MRS液体培养基；X - 具有木糖的MRS液体培养基；Ma - 具有麦芽糖的MRS液体培养基。
与菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651相比，在厌氧培养的前24小时期间，在含有果糖，或含有葡萄糖、果糖和海藻糖的混合物的培养基中，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM32650的生长平均快两代；在48小时内，在含有葡萄糖的培养基中快三代，且在含有果糖和木糖的培养基中快约1.5代(表3)。
布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651生长较慢，在含有果糖或木糖的培养基中以及在含有葡萄糖、果糖和海藻糖的混合物的培养基中培养48小时后能够超过布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650。
表3. 不同的糖对在25度厌氧(CO2/N2/H2:5/90/5%)培养24、48和72小时期间的布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的生长动力学的影响。
Figure 985509DEST_PATH_IMAGE003
N - n世代数；V – 生长速率；G – 具有葡萄糖的MRS液体培养基；F - 具有果糖的MRS液体培养基；T - 具有海藻糖的MRS液体培养基；M - 具有葡萄糖-果糖-海藻糖的混合物的MRS液体培养基；X - 具有木糖的MRS液体培养基；Ma - 具有麦芽糖的MRS液体培养基。
实施例1. 有机酸和醇概况
该实验的目的是确定在微好氧和厌氧培养期间菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的有机酸和醇的概况。
方法：将在MRS琼脂(Biolife.Italy)上培养的布氏乳杆菌BioCC 203和布氏乳杆菌BioCC 228的24h旧培养物根据McFarland浊度标准No 5 (1.5x 109微生物/ml)悬浮于蛋白胨水中，以1.5 x 106微生物/ml的最终密度接种至MRS液体培养基(Biolife.Italy)中，并在恒温器中在25度微好氧(10% CO2)和厌氧(CO2/N2/H2:5/90/5%)孵育24、48和72小时。
通过气相色谱仪Agilent 6890A毛细管柱CP-Wax 52 CB (30 m x 0.25 mm 0.25μm)气相色谱法确定有机酸和醇概况。柱温程序：75度保持1 min。10度/min至115度，保持3min。20度/min至190度，保持5 min。检测器(FID) 280度。
在Shimadzu Prominence HPLC系统上液相色谱法测定有机酸。在Aminex HPX-87H离子-排斥柱(300 mm x 7.8 mm)上分离样品。将柱温恒温在60度，流速为0.6 ml/min，并用PDA检测器在210 nm处检测有机酸。分析时间为26 min。
在有机酸和醇的概况中，菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和BioCC 228 DSM32651的菌株特异性特征是显而易见的(表4)。在微好氧环境和厌氧环境两者中的培养期间，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650是乙醇、乙酸和乳酸的显著更强的生产者。布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651能够在厌氧环境中产生丙酮酸(表4)。
在微好氧和厌氧培养的前24小时期间，菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650分别利用培养基中最初存在的柠檬酸盐的近似99.5%和97.8%。
在厌氧培养期间，布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651消耗培养基中最初存在的柠檬酸盐的4.8%。与布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650不同，菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM32651能够在72小时的微好氧培养期间产生5.9%柠檬酸盐。
表4. 布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651在25度微好氧(10% CO2)和厌氧(CO2/N2/H2:5/90/5%)培养24 h、48 h和72 h的MRS液体培养基中的有机酸和醇概况(mg/m)
Figure 567669DEST_PATH_IMAGE004
。
实施例2. 玉米植物上清液中的有机酸和醇概况
该实验的目的是确定在植物材料发酵期间菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的有机酸和醇的概况。
方法：将226 g营养生长阶段(V6-V8)的玉米(玉米(Zea mays) L.)植物切碎，在实验室搅拌机Bagmixer 400 (Interscience.France)中用水均质化6分钟，过滤，离心(在室温下，5000 rpm，10分钟)，并在121度灭菌5分钟。
将在MRS琼脂(Biolife.Italy)上培养的布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的24h旧培养物根据McFarland浊度标准No 5 (1.5x 109微生物/ml)悬浮于蛋白胨水中，以1.5 x 106微生物/ml的最终密度接种至玉米植物上清液中，并在恒温器中在25度微好氧(10% CO2)和厌氧(CO2/N2/H2:5/90/5%)孵育24 h、48 h和72 h。
通过气相色谱仪Agilent 6890A毛细管柱CP-Wax 52 CB (30 m x 0.25 mm, 0.25μm)气相色谱法确定有机酸和醇概况。柱温程序：75度保持1 min。10度/min至115度，保持3min。20度/min至190度，保持5 min。检测器(FID) 280度。
在Shimadzu Prominence HPLC系统上液相色谱法测定有机酸。在Aminex HPX-87H离子-排斥柱(300mm x 7.8mm)上分离样品。将柱温恒温在60度，流速为0.6 ml/min，并用PDA检测器在210 nm处检测有机酸。分析时间为26 min。
表5. 布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651在25度微好氧(10% CO2)培养24 h、48 h和72 h的玉米植物上清液中的有机酸和醇概况(mg/m)
Figure 382041DEST_PATH_IMAGE005
。
在植物材料的发酵测试中，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650被证明是与布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651相比更强的乙醇和乳酸的生产者(表5)。
实施例3. 对病原体的抗微生物活性
该实验的目的是测试在25度微好氧和厌氧培养期间布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651对肠病原体的抗微生物活性。
为了评估布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651对病原体的抗微生物特性，使用划线(streak-line)程序(Hutt P. Shchepetova J.Loivukene K. Kullisaar T. Mikelsaar M. Antagonistic activity of probioticlactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appl.Microbiol. 2006; 100(6):1324-32))。
为了确定对靶标微生物的生长抑制，以毫米计测量无生长区域。以与Hutt等人(2006)类似的方式，基于样品的结果(表6)，计算算术平均值和标准误差，并且基于其评价拮抗活性(mm)。
表6. 使用划线(streak-line)方法在微好氧(10% CO2)和厌氧(CO2/N2/H2:5/90/5%)环境中的改良的MRS琼脂培养基上布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651针对病原体的抗微生物活性(以mm计的靶标微生物生长抑制区域)
Figure 142187DEST_PATH_IMAGE006
。
微好氧环境中的抑制区域(mm-s)：弱<13.80；平均13.79-17.11；强>17.12。厌氧环境中的抑制区域(mm-s)：弱<10.67；平均10.66-14.94；强>14.95。
在微好氧环境中，两种菌株均表现同样强的抗微生物活性(表6)。在厌氧环境中，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650对测试的致病性微生物具有略微更高的抑制作用。
实施例4. 抗真菌活性
该实验的目的是使用琼脂孔扩散方法评估布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651上清液针对玉米青贮饲料来源的酵母的影响。
根据McFarland浊度标准No. 5 (1.5 x 109微生物/ml)在蛋白胨水中制备48-小时乳杆菌培养物悬浮液，以1.5 x 106微生物/ml的最终体积接种至MRS (Biolife.Italy)液体培养基中，在25度微好氧(10% CO2)和厌氧(CO2 / N2 / H2:5/90/5%)孵育48和72小时。通过离心(4500 rpm, 10 min)除去微生物细胞。将上清液通过过滤灭菌，并通过冷冻-干燥浓缩。将冷冻-干燥的上清液重悬浮至10-倍浓度的10 mM乙酸。将从玉米青贮饲料分离的野生酵母(假丝酵母属物种)的六种菌株铺板于PCA (Plate Count Agar; Liofilchemsrl.Italy)培养基处的均匀层中。在琼脂中无菌切割直径为6-mm的孔，并将100 μl的上清液样品添加至孔中。在25度孵育后，记录抗真菌作用，如下：无抑制；＋ 弱抑制，酵母的生长被干扰；＋＋ 强抑制，酵母的生长被抑制，其具有可检测的清晰区域；＋＋＋ 非常强抑制，酵母的生长被抑制，其具有大的清晰区域。
由布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651产生的抗微生物化合物比菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650的那些更强烈地抑制植物来源的酵母生长。布氏乳杆菌BioCC 228DSM 32651在48小时的培养期间已产生酵母生长抑制化合物，在孔周围的琼脂培养基上产生宽、清晰的生长抑制区域，而菌株BioCC 203 DSM 32650的上清液仅干扰酵母的生长。
实施例5. 植物材料的发酵期间的生长动力学
该实验的目的是评估布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM32651在植物材料的发酵期间的生长动力学的影响。
方法. 将226 g营养生长阶段(V6-V8)的玉米(玉米(Zea mays) L.)植物切碎，用实验室搅拌机Bagmixer 400 (Interscience, France)均质化6分钟，过滤，在室温下以5000 rpm离心10分钟，并在121度灭菌5分钟。
根据McFarland浊度标准No. 5 (1.5 x 109微生物/ml)在蛋白胨水中制备48-小时乳杆菌培养物悬浮液，以1.5 x 106微生物/ml的最终体积接种至MRS (Biolife.Italy)液体培养基中，在25度微好氧(10% CO2)和厌氧(CO2 / N2 / H2:5/90/5%)孵育24、48和72小时。
登记两种菌株的存活计数，如下计算产率、世代数(n)和生长速率(V)：
产率 = log N1-log N0，其中N1是在任何给定时间的细胞浓度；N0是初始细胞浓度
n = log N1-log N0 / log 2，其中N1是在任何给定时间的细胞浓度；N0是初始细胞浓度
V = log N1-log N0 / 0.301 x t，其中N1是在任何给定时间的细胞浓度；N0是初始细胞浓度，且t是以小时计的指定时间段。
表7. 在25度微好氧(10% CO2)培养24、48和72小时期间的布氏乳杆菌BioCC 203DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的生长动力学。
Figure 409220DEST_PATH_IMAGE007
n –世代数；V - 生长速率。
与菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651相比，在微好氧培养的前24小时期间，菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650快四代，并且在48小时中快2.4倍(表7)。
实施例6. 青贮饲料添加剂布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC228 DSM 32651对易于发酵的新鲜材料培养基的影响的研究。
研究的目的是确定青贮饲料添加剂布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651对玉米(玉米，玉米品种’Cathy’)青贮饲料(干物质含量≥30%)的有氧稳定性和发酵质量的影响。
青贮饲料试验在1.5 l实验室规模的窖仓中用新鲜切碎的成熟的蜡熟期(doughstage)的玉米进行。
进行以下研究：在第90天测定pH-值和发酵质量。
实施有氧稳定性的两种测试。在49天的贮存时段之后用两次空气压力(stress)(24小时；在第28天和第42天)进行第一次测试。
有氧稳定性的测试在近似20度的温控室中实施。每四小时用PS-ES数据记录系统记录温度。
新鲜材料的化学组成呈现于表8中。
表8. 新鲜材料的化学组成
指标 <i>玉米品种`Cathy </i>09.10.2017
干物质(DM)，g/kg 339
粗灰分，g/kg DM 30
粗蛋白，g/kg DM 71
粗脂肪，g/kg DM 25
粗纤维，g/kg DM 181
粗淀粉，g/kg DM 328
水溶性碳水化合物(WSC)，g/kg DM 87
硝酸盐，mg/kg DM 587
缓冲容量(BC)，g乳酸/kg DM 23
发酵系数* 64
* DM (以百分比计) + (8x(WSC/BC))。
布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的应用导致乙酸和1,2-丙二醇与未处理者相比显著增加(表9)。
表9. 90天的贮存时段后，使用微生物布氏乳杆菌的来自玉米品种’Cathy’的玉米青贮饲料的化学组成、营养价值和发酵质量指标，
Figure 795071DEST_PATH_IMAGE008
n.d.- 未检测到。
49天的贮存时段后进行的有氧稳定性测试显示，与未处理对照相比，布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651处理的青贮饲料的有氧稳定性显著增加近2至2.5天(对照：3.9天 vs. 布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650：6.3天，和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651：5.8天)。
将贮存时间延长直至90天导致未处理对照(7.9天)、布氏乳杆菌BioCC 203 DSM32650处理的青贮饲料(10.6天)和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651处理的青贮饲料(11.4天)的有氧稳定性均增加。发现布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650的少于三天和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的超过三天的这种差异是统计学显著的。
实施例7. 青贮饲料添加剂布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC228 DSM 32651对难以发酵的新鲜材料的影响的研究。
该实验的目的是使用微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651评估具有低干物质含量(≤20%)的从新鲜切碎的完整植物玉米(玉米，玉米品种’Dorka’)制成的青贮饲料的发酵质量和有氧稳定性。
以水溶液的形式将菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC228 DSM 32651以1x105 CFU/1g青贮饲料贮存的植物材料(饲料)的浓度添加至青贮饲料贮存的材料中。以五次重复制备所有测试变体(对照青贮饲料，用乳酸细菌菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651制成的青贮饲料，以及没有青贮饲料添加剂的情况下制成的对照青贮饲料)。所有测试青贮饲料在青贮饲料贮存90天后打开。
新鲜材料的化学组成呈现于表10中。
根据Honig (Honig, H., 1990: Evaluation of the aerobic stability. In:Proceedings of the Eurobac Conference, Swedish University of AgriculturalSciences, Uppsala/Sweden, Special Issue)描述的方法，在90天的贮存时段后测试青贮饲料的有氧稳定性。如果在青贮饲料的几何中心测量的温度超过环境温度3度，则其被认为是有氧不稳定的。持续9天(217小时)测量温度随时间的变化。使用Comet TemperatureData Logger S0141装置每小时一次记录环境温度和测试青贮饲料温度。
使用良好确立的方法分析青贮饲料样品(AOAC. 2005. Official methods ofanalysis of AOAC International, 第18版 Association of Official AnalyticalChemists International, Gaithersburg, MD, USA)。
为了测定干物质含量，将青贮饲料样品在恒温器中在130度干燥至恒重。为了确立粗灰分含量，将青贮饲料样品在马弗炉中在550度焚烧6小时。使用KjeltecTM 2300分析仪，遵循Kjeldahl方法(Nx6.25)测定蛋白含量。根据W.Henneberg和F. Stohmann方法测定粗纤维。使用Agilent 7890A气相色谱仪用于测定青贮饲料的酸和乙醇含量。用KjeltecTM 2300分析仪确立氨氮在总氮中的比例。使用Hanna Instruments HI 2210 pH-计测定青贮饲料的酸度。
表10. 新鲜材料的化学组成
Figure 463950DEST_PATH_IMAGE009
。
所有青贮饲料的干物质含量都保持≤18%(表11)。然而，来自玉米品种’Dorka’且用布氏乳杆菌菌株BioCC 203 DSM 32650或布氏乳杆菌菌株BioCC 228 DSM 32651处理的青贮饲料具有良好的发酵特征(表11)。乳酸是所有青贮饲料中的占优势的酸。与用布氏乳杆菌菌株BioCC 228 DSM 32651制备的青贮饲料和对照相比，用布氏乳杆菌菌株BioCC 203DSM 32650处理的青贮饲料具有更高浓度的乙酸和1,2-丙二醇。
乙醇含量在所有青贮饲料中都是低的(范围为4.1至8.6 g/kg)。
表11. 90天的贮存时段后，使用微生物布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的来自玉米品种’Dorka’的玉米青贮饲料的化学组成、营养价值和发酵质量指标，
Figure 605385DEST_PATH_IMAGE010
。
青贮饲料贮存的材料和玉米青贮饲料的发酵质量的微生物指标呈现于表11中。在青贮饲料贮存的材料中，霉菌的数量相对高，梭菌和酵母低于检测限值。用菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650或布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651处理的青贮饲料样品含有非常大量的乳酸细菌(＞8.0 log10 CFU / g青贮饲料)，并且添加的菌株相比于内源性乳酸生物群(lactobiota)占优势。未处理的对照青贮饲料中的乳酸细菌计数的量为4.56 log10 CFU/ g青贮饲料。
表11. 新鲜原料和用微生物布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650或布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651处理的来自玉米品种’Dorka’的玉米青贮饲料的发酵质量的微生物指标。
Figure 359714DEST_PATH_IMAGE011
*- 低于检测限值
**- 无法计算。
在有氧稳定性测试中，未处理的青贮饲料的五个重复中的四个变热。对照青贮饲料的平均有氧稳定性结果是149小时(即6.2天)。用菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651处理的青贮饲料是有氧稳定的，直至测试结束，即直至217小时(即9.04天)。因此，用菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC228 DSM 32651处理新鲜材料将青贮饲料的有氧稳定性增加2.84天。
结论：菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651在由难以发酵的新鲜材料制成的青贮饲料中令人惊讶地表现非常有力的生长。布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650和布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651的使用增加由低干物质(≤20%)青贮饲料贮存材料制成的青贮饲料的乳酸和乙酸含量，抑制微生物和酵母的活性，由此防止青贮饲料变热，其确保青贮饲料在打开窖仓后的有氧稳定性的提高，且因此延长青贮饲料的贮存时间。

Claims (14)

1.分离的微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 203 DSM 32650。
2.分离的微生物菌株布氏乳杆菌BioCC 228 DSM 32651。
3.权利要求1或权利要求2的微生物菌株，其呈冻干形式。
4.组合物，其包含一种或多种根据权利要求1至3中任一项所述的微生物。
5.饲料，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的微生物菌株。
6.根据权利要求5所述的饲料，其为发酵的饲料，例如青贮饲料。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物作为饲料添加剂的用途。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物支持青贮饲料的有氧稳定性的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中青贮饲料由低干物质含量(≤20%)的饲料制成。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物用于发酵饲料的用途。
11.包含一种或多种根据权利要求1至3中任一项所述的微生物的组合物，其用于加速饲料的发酵，增加饲料中的乳酸和乙酸的浓度，降低pH，且因此降低饲料中的营养物的损失。
12.根据权利要求1至3中任一项的微生物通过将根据权利要求1至3中任一项所述的微生物菌株添加至待发酵的饲料中来抑制致病性微生物的作用和抑制酵母生长的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中致病性微生物是肠病原体。
14.用于延长饲料的保存的方法，其中在发酵之前将根据权利要求1至3中任一项所述的微生物添加至饲料中。
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