KR101840239B1 - 장 염증의 치료에 사용하기 위한 프로바이오틱 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 조성물은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7485, 및 페디오코커스 액시딜락티시 CECT 7483을 유효량으로 포함한다. 상기 조성물은 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군 또는 복부 팽만 및 팽창과 같은 위장 질환 또는 병태를 치료하는데 유용하다.
Description
본 출원은 2010년 1월 28일자 미국 가출원 61/299,116 및 유럽 특허 출원 EP10151998에 대한 우선권을 주장하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 의약, 미생물학 및 영양학 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 새로운 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다. 특히, 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) 및 페디오코커스 액시딜락티시( Pediococcus acidilactici )의 새로운 균주를 분리하고, 이를 장 염증(예, 염증성 장 질환) 및 과민성 장 증후군과 같은 위장 질환의 치료에 유용한 제형으로 조합한다.
궤양성 대장염(UC), 낭염(Pouchitis) 및 크론 질환은 만성적인 장 염증이 특징적인 염증성 장 질환(IBD)의 예이다. 임상 증상은 설사, 복통, 때때로 직장 출혈, 체중 감소, 피로감이며, 간혹 발열이 발생한다. IBD는 모든 연령대에서 발병하지만, 십대와 청소년에서 가장 많이 발병하여, 그로 인해 발달 지연 및 성장 위축을 앓을 수 있다. 질병의 발생 빈도는 유럽 및 미국의 경우 1형 당뇨병과 비슷하다. IBD의 임상 진행은 매우 다양한 편이다. 경도 내지 중도 증상인 환자는 입원하지 않고 치료를 받을 수 있다. 그러나, 환자의 10-15%는 심각한 수준으로 질병이 진행되어, 많은 경우 수술을 동반한다.
IBD는 의학적으로 염증을 완화시켜, 위장 증상을 제어함으로써 치료된다. 그러나, 현재 IBD에 대한 의학적 치료법은 없는 실정이다. 결장 절제술로 UC를 제거할 수는 있지만, 삶의 질을 저하시키고 합병증 위험성을 높일 수 있다. 이용가능한 의학적 치료법은 5-아미노살리실산(5-ASA), 코르티코스테로이드 및 면역조절제의 사용을 포함한다. 경도 내지 중도의 IBD 증상에 대한 장기 치료시에는 5-ASA가 통상적으로 사용되지만, 중증 증상을 치료하는데에는 코르티코스테로이드와 면역조절제가 사용된다. 5-ASA의 부작용은 설사 또는 복통 발생이며, 코르티코스테로이드는 장기간 사용시 흔히 골량 감소, 감염, 당뇨병, 근육 소모증 및 정신 분열을 비롯한 중증 부작용이 나타난다. 면역조절제는 면역계를 억제함으로써 IBD 증상을 제어한다. 그러나, 그 결과로 형성되는 면역-저하 상태로 인해 환자는 여러 질환들에 걸리기 쉬운 상태가 된다.
과민성 장 증후군 (IBS)은 복통 및/또는 변화된 장 거동 또는 배변 습관과 관련된 불편함을 특징으로 하는 증상으로, 이러한 증상은 구조적 또는 생화학적 이상으로는 설명되지 않는다. 긴박뇨, 복부 팽만 및 불완전한 장 운동의 느낌 역시 IBS에서 일반적이다. 그래서, 이 질환은 기능성 팽만감, 비심장성 흉통, 비-궤양성 소화불량 및 만성적인 변비 또는 설사 등의 질환을 포함하는 기능성 위장 장애로 분류된다 (Longstreth G. H. et al., 2006). 특히, IBS는, 관련 증상이 환자의 안녕과 정상적인 기능성 측면 모두에 작용하기 때문에, 복통 및 불편함을 넘어 이환율과 삶의 질에 막대한 영향을 미친다 (Dean B. B. et al., 2005).
IBS를 치료하기 위한 약물 개발 분야에서 막대한 연구들이 수행되고 있다. 이와 관련하여, 다양한 항우울제들이, 임상 실험에서 그 효능은 보통 수준이고 이의 임상적인 활용성은 원하지 않는 부작용으로 인해 제한적임에도 불구하고, 대중화되고 있다. 세로토닌성 제제들에서도 전반적인 IBS 증상들에 대한 효능이 입증되고 있다. 그러나, 최근 안전성에 대한 문제들로 인해 그 적용이 여러가지로 제약 되고 있다. 따라서, IBS에 대한 새로운 치료제를 개발하는데 관심이 크게 증폭되고 있다.
프로바이오틱스는 "특정 개수로 섭취시, 본질적인 기본 영양을 넘어 건강상 이점을 제공하는, 살아있는 미생물들"로 정의된다 (Araya M. et al., 2002; Guarner F. et al.,, 1998). 수종의 유산균과 비피도박테리움 속 유래의 종들이 프로바이오틱스에 해당되는데, 이는 이들 균주가 특이적인 건강 효과를 촉진시키는 것으로 입증되었음을 의미한다. 프로바이오틱 박테리아는 독성 결여, 생존성, 부착성 및 유익한 효과와 관련된 몇가지 요건들을 충족시켜야 한다. 이러한 프로바이오틱 특징들은, 심지어 동일 종의 박테리아들에서도, 균주-의존적이다. 따라서, 모든 프로바이오틱 요건들에 대해 우수한 성능을 가진 그러한 균주들을 발견하는 것이 중요하다. IBD 또는 IBS에 걸린 환자를 치료하거나 또는 이미 치료받은 IBD 환자들을 관해(remission) 상태로 유지하기 위한 균주 및/또는 제형을 동정하기 위해, 프로바이오틱스를 단독으로 또는 항생제와 조합하여 이용한 인간 임상 실험들이 수행되고 있다.
WO 96/29083와 EP 554418은 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) 299v(DSM 6595) 및 락토바실러스 카세이 ssp. 람노수스(Lactobacillus casei ssp. rhamnosus) 271 (DSM 6594) 등의, 장에서 집락을 이루는 2종의 락토바실러스 균주를 개시하였다. EP 415941에서는 락토바실리와 혼합하기 전에 오트밀 죽(oat gruel)을 효소로 처리하는 것을 포함하는, 영양 조성물의 제조 방법을 개시하였다. 미국 특허 7195906에서는 염증 질환, 특히 IBD 및 IBS와 같은 위장 염증 작용을 치료하기 위해, 절제하여 세정한 인간 위장관에서 분리된 비피도박테리움 균주를 개시하였다.
유망한 잠재성에도 불구하고, 염증성 장 질환(예, IBD) 뿐만 아니라 다른 위장 질환(예, IBS)의 치료에 사용하기 위해, 프로바이오틱의 효과에 상당한 개선이 요구되고 있다.
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본 발명의 발명자들은 락토바실러스 및 페디오코커스 균주를 포함하는 조성물이 장의 염증을 치료하는데 효과적이라는 것을 발견하였다. 특히, 락토바실러스 플란타룸 속 및 페디오코커스 액시딜락티시 속에 속하는 새로운 프로바이오틱 균주 3종을 분리하였으며, 각 균주들은 단일 제형의 형태로 조합하였을 때 장의 염증을 효과적으로 치료할 수 있었다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7485, 및 페디오코커스 액시딜락티시 CECT 7483, 또는 이의 돌연변이 또는 변이체를 유효량으로 포함하는 조성물을 제공한다.
락토바실러스 플란타룸 균주 CECT 7485와 CECT 7484, 및 페디오코커스 액시딜락티시 균주 CECT 7483은 2009년 2월 4일자로 스페인 생물자원센터(Spanish Type Culture Collection, 스페인 발렌시아)에 기탁되었다. 기탁된 균주 3종 모두 생존 상태이며, 기탁과 관련된 모든 특징들을 유지한다.
본원에서, 용어 "유효량"은 바람직한 효과를 전달하기에는 매우 충분하지만 의학적 판단 범위내에서 심각한 부작용을 충분히 방지할 정도로 적은 양을 의미한다.
출발 물질로서 전술한 기탁된 균주를 이용함으로써, 당해 기술 분야의 당업자는, 통상적인 돌연변이 유발 또는 재-분리 기술에 의해, 본 발명의 조성물을 형성하는 균주의 본원에 기술된 관련 특징들과 이점들을 유지 또는 강화하는 추가적인 돌연변이 또는 유도체들을 용이하게 수득할 수 있음은 자명하다. 당해 기술 분야의 당업자는, 균주의 항-염증, 면역조절 또는 항-IBS 또는 항-복부 팽만 활성을 측정하기 위해 사용할 적정 방법을 결정할 것이다. 이러한 활성을 측정하기 위한, 가능한 방법의 예들은 아래 예들에 나타낸다.
일 구현예에서, 돌연변이는 유전자 변형된 돌연변이이다.
본 발명의 제1 측면의 다른 구현예에서, 변이체는 천연 변이체이다.
본 발명의 제1 측면에 따른 조성물의 일부를 구성하는 균주는 살아있는 세포의 형태일 수 있다. 다른 예로, 균주는 비-생존성 세포의 형태일 수 있다.
균주들, 페디오코커스 액시딜락티시 CECT 7483, 뿐만 아니라 락토바실러스 플란타룸 CECT 7484 및 CECT 7485은 살아있는 세포의 형태로 일반적으로 사용된다. 그러나, 사멸된 배양물과 같은 비-생존 세포 또는 페디오코커스 액시딜락티시 CECT 7483, 뿐만 아니라 락토바실러스 플란타룸 CECT 7484 및 CECT 7485에 의해 생산되는 유용 인자를 포함하는 조성물까지 확장될 수 있다. 이는, 열에 의해 사멸된 미생물, 또는 변경된 pH에 노출, 초음파 처리, 방사선 조사 또는 압력 인가에 의해 사멸된 미생물을 포함할 수 있다. 비-생존 세포를 이용한 제품 제조가 더 단순하여, 세포를 약제에 쉽게 통합시킬 수 있으며, 저장 요건은 살아있는 세포 보다 훨씬 덜 제한적일 수 있다.
본 발명의 조성물 형태로 이용하였을 때, 균주들은 바람직하게는 1:1:1의 농도 비로 존재한다.
균주들 CECT 7483, CECT 7484 및 CECT 7485는 몇가지 병원성 및 잠재적인 병원성 박테리아 균주에 대해 유의한 저해 활성을 나타내지만, 인간 위장 미생물총을 이루는 일반적인 공생 균주들에 대한 길항성은 최소 수준이다. 아울러, 이들 3종의 균주들은 서로 간에 유의한 저해 활성을 나타내지 않으며, 따라서, 단일 제형으로 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 점은, 본원의 제1 측면에 따른 조성물이, 3가지 균주들 각각의 "온전한" 효과로 인해, 장에서 유익한 효과를 발휘한다는 의미이기 때문에, 중요하다. 이들 균주를 단일 제형(즉, 본 발명의 조성물)으로 조합하면, 장 염증에 대한 여러가지 동물 모델들에서 임상적인 증상(즉, 체중 감소 및 설사)의 개선 능력이 확인된다. 이러한 결과에 따라, 본 발명의 조성물은 급성(IL-6) 및 만성(IFNγ)의 사이토카인을 현저하게 감소시키는 독특한 효과를 발휘한다.
매우 다양한 유산균 종들이 오랜 기간 매우 안전하게 사용되어 왔다. 유럽 식품 안전국에서는 장기간의 명백한 안전한 사용이 입증된 분류 유닛(taxonomical unit)에 대한 "QPS(Qualified Presumption of Safety)" 등급을 부여하는 시스템을 개발하였다. 균주들 CECT 7483, CECT 7484 및 CECT 7485는 QPS 등급의 박테리아 종에 속한다 (Andreoletti O. et al., 2008).
본 발명의 균주는, 특히 프로바이오틱으로서 이용가능하다는 이점이 있다. 전술한 바와 같이, 프로바이오틱 박테리아는 독성 결핍, 생존성, 부착성 및 유용 효과들과 관련된 몇가지 요건들을 충족하여야 한다. 이러한 프로바이오틱 특징들은 동일 종의 박테리아들에서도 균주-의존적이다. 따라서, 모든 프로바이오틱 요건들에 대해 우수한 성능을 나타내는 균주를 발굴하는 것이 중요하다. 아래 실시예에서는 (예로) 프로바이오틱 특징들 각각을 측정하기 위한 프로토콜을 제공하며, 또한 상기 균주가 우수한 프로바이오틱 특징들을 가지고 있음을 입증한다.
박테리아에서의 항미생물제에 대한 내성의 발현과 확산은 인간과 동물의 건강에 위협이 되며, 막대한 재정적 및 사회적 비용을 발생시킨다. 항미생물제에 대한 내성이 박테리아 종들에 선천적인 것이라면, 이를 일반적으로 '선천적 내성(intrinsic resistance)'(때로는 '자연 내성'이라고도 함)이라고 한다. 선천적 내성은 수평적인 전파 가능성이 매우 낮은 것으로 추측되지만, 부가된 유전자에 의해 매개되는 후천적 내성은 수평적 전파 가능성이 매우 높은 것으로 간주된다. 본 발명의 발명자들은, 유럽 식품 안전국의 가이드라인(Anadon A. et al., 2005; Bories G. et al., 2008)에 따르면, 본 발명의 조성물을 구성하는 균주들이 인간 및/또는 수의학상 중요한 항생제(암피실린, 젠타마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 클린다마이신 및 클로람페니콜)에 대해 어떠한 유의한 내성도 나타내지 않으며, 따라서 항생제 내성을 병원성 종들에 전달할 잠재적인 위험성이 없다는 것을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 발명자들은, 균주들 CECT 7483, CECT 7484, 및 CECT 7485는 IBD 치료에 사용되는 다른 약제(예, 메살라진)와의 병용-투여(co-administration)가 가능하다는 것을 확인하였다. 아래에 나타낸 바와 같이, 상기 균주들은 메살라진을 포화 농도로 사용하더라도 생육이 완전히 저해되지 않는다. 다시 말해, 메살라진을 고농도로 사용하더라도, 상기 프로바이오틱 균주를 포함하는 본 발명의 조성물의 효능은 약화되지 않으며, 따라서 프로바이오틱 기능과 항-염증 기능 둘다를 발휘할 수 있다.
본 발명의 균주들은 포유류의 위장 환경의 조건들(산성 환성, 담즙산염, 리소자임과 산소 퍼옥사이드의 고 농도)에 대해 내성이 높아, 위장관(또한, 이하 "GIT"라 함)을 통한 이동에서 생존할 수 있는 것으로 입증되었다. 또한, 균주들은 장 상피에 대한 부착성이 우수하며, 장관에서 체류하여 프로바이오틱 효과를 발휘할 수 있다.
나아가, 본 균주들은 숙주에 대한 몇가지 유용한 이점을 가지고 있다. 균주는, 장에서의 항염증성 활성 외에도, 길항 활성으로 인해 장의 미생물총 균형에 이득이 된다. 용어 "길항 활성"은 프로바이오틱 박테리아의 활성에 의해 위장의 비-유용 박테리아의 생육을 저해하는 것을 지칭한다. 위장내 미생물 균형이 부적절하게 형성된 상태를 장내 세균 불균형(disbiosis)이라고 하며, 인간의 안녕에 몇가지 부정적인 결과를 초래한다. 본 균주들은, 다른 상업 균주들과 비교하여, 병원성 균주에 대한 증식 저해력이 높다는 것이, 하기 설명에서 입증될 것이다. 또한, 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 신규 균주들이 서로 유의한 저해 활성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다.
추가적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 구성하는 균주들은 단쇄 지방산(SCFA)을 다량으로 생산하는 것으로 확인되었다. 소화되지 않는 섬유질로부터 SCFA를 생산하는 것은 흥미로운 프로바이오틱 형질이다. 이러한 형질은, 생산된 SCFA가 숙주에서 몇가지 유용한 특성을 나타내기 때문에, 프로바이오틱에 바람직하다. 균주들의 다양한 특성들 중에서도, SCFA, 특히 부티르산은 장 점막에 의해 쉽게 흡수되며, 대장에서의 나트륨 및 물의 흡수를 자극하고, 장 점막의 영양소이다 (D'Argenio G. et al., 1999; Tedelind S. et al., 2007). 더욱이, 부티르산은 대장 세포(colonocyte)의 연료로 사용된다. 제형에서 각 균주는 여러가지 SCFA, 아세트산, 프로피온산 또는 부티르산의 강력한 생산체로서, 이들 3종의 주요 SCFA들이 장에서 발견된다. 단쇄 지방산이 염증 과정에 작용하는 방법에 대한 보다 나은 이해를 통해 현행 장 염증 치료제의 효능을 개선시키는데 도움이 될 수 있다. 이와 관련하여, SCFA와 G 단백질-커플링된 수용체를 통한 염증 병태의 조절 간의 관련성이 보고되었다 (Maslowski K. M. et al., 2009).
또한, 균주들 CECT 7483, CECT 7484 및 CECT 7485는 장 점막으로부터 개선된 사이토카인 패턴을 유도하기 때문에, 숙주에서 면역조절 효과를 촉진시킨다. 이러한 면역조절 효과는, 이들 균주가 질병에 대한 내성 개선 및 알레르기 위험성의 감소에 도움이 되기 때문에, 숙주에 유익하다. 그람 음성 박테리아는 GIT에서 표면에 장 점막 세포에 의한 전염증성 신호 발생을 유도하는 분자 리포폴리사카라이드(LPS)를 제시하는 것으로 알려져 있다. 프로바이오틱을 보충하면, 생태적으로 보다 적합하거나 또는 일부 그람 음성 미생물에 대한 길항 특성을 가진, (유산균 그룹으로 그룹화됨) 그람 양성 박테리아가 GIT에 더 많이 존재하는데 유리하도록, 상황을 바꿀 수 있다. 또한, 일부 프로바이오틱 미생물은 체내 염증 반응과 면역 반응을 조절하는 메신저 분자인 사이토카인들의 생산을 본질적으로 조절하는 능력을 나타낸다. 특히, 일부 프로바이오틱 박테리아는 (그람 음성 박테리아에 대한 효과에도 불구하고) 장 점막에서의 프로-항-염증 시그널링 간에 보다 균형잡힌 패턴이 형성되도록 유도한다. 아래에서 예시하는 바와 같이, 본 발명의 조성물의 균주는 염증성 사이토카인(IFN-γ 및 IL-6)의 수준 감소를 촉진하여, 장 점막에서의 사이토카인 패턴을 개선시키는 것으로 확인되었다. 이러한 면역조절 효과는 GIT내 병원성 그람 음성 박테리아의 존재를 감소시키는 균주의 길항 특성에 의해 보완된다.
생존할 수 없는 박테리아 뿐 아니라 박테리아의 구성 성분들이 그 자체로서 면역조절 효과를 가질 수 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 락토바실리(Lactobacilli) 종의 세포 성분들이 항-염증성 사이토카인을 유도하거나 (Pathmakanthan S. et al., 2004) 또는 전-염증성 사이토카인을 감소시키는 것으로(Zhang L. et al., 2005) 보고되었다. 이러한 구성 성분들이 분리되면, 약제 등급의 조작이 기대된다.
아래 나타낸 결과들을 고려하면, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 구성하는 균주들 CECT 7483, CECT 7484 및 CECT 7485은, 위장 통과시 생존성, 장 점막 부착성, 산화 스트레스에 대한 내성, 항-염증성 활성을 가진 대사산물(단쇄 지방산 또는 상기 활성을 가진 기타 산물)의 생산 및 균주 간의 길항 작용 없음과 같은 특별한 형질들로 특정된다. 본 발명의 조성물과 분리된 균주들은, 복잡한 연구의 성과이며 장 염증 활성과 관련하여 수득한 결과들은 놀라운 정도로 현저한 것이므로, 선행 기술로부터 얻을 수 없는 자명하지 않은 것이다. 각각의 형질을 측정하기 위한 프로토콜에 대해서는 후술한다. 본 출원의 내용으로부터, 당해 기술 분야의 당업자라면 락토바실러스 및 페디오코커스 속에 속하는 다른 균주들, 보다 구체적으로는, 별개로 또는 단일 조성물로 조합하여 투여하였을 때, 본 출원에 기술된 것 이상의, 동일한 프로바이오틱 효과와 치료학적 효과를 구비한, 락토바실러스 플란타룸 또는 페디오코커스 액시딜락티시 종들을 발견할 수 있을 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은, 약제로서 사용하기 위한, 본 발명의 균주 또는 이의 변이체 균주를 유효량으로 포함하는 조성물을 제공한다.
구체적으로, 균주들 CECT 7483, CECT 7484 및 CECT 7485를 포함하는 조성물은 IBD 모델에서 장에 대한 항-염증 활성을 나타내는 것으로 확인된다. 전술한 바와 같이, 장 염증은 IBD의 주요 특징들 중 한가지이다. 따라서, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물은 상기 질환의 예방 또는 치료에 사용가능하다.
따라서, 제3 측면에서, 본 발명은 인간을 포함한 동물에서 장 염증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 정의된 조성물을 제공한다. 이러한 측면은, 다른 예로, 장 염증의 예방 및/또는 치료용 약제 제조에 있어서의 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물의 용도로서 설계될 수 있다. 이는, 다른 예로, 필요로 하는 동물에게 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 포함한 동물에서 장 염증을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서 설계될 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따른 일 구현예에서, 조성물은 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에 사용된다.
실시예들에 기술된 IBD 모델을 이용하여 수득한 결과들로부터(하기 참조), 장 염증 및 설사가 특징적인 병태의 치료에 유용한, 본 발명의 균주 투여는, 또한, 장 점막 또는 점막하 조직의 염증이 특징적이며, 방사선치료 또는 화학요법에 의해 야기되는 장염과 같이 설사가 보편적으로 나타나는 기타 병태들을 치료하는데 유용할 수 있을 것으로 추론된다. 장염은, 복부 및 골반의 방사선치료시 일반적인 부작용으로, 환자의 60-70%에서 발생한다. 장염으로 인한 부작용을 줄이기 위한 방사선치료 요법의 계획 변경이 필요하여, 잠재적으로 차선의 항종양 치료 효과로 이어질 수 있다. 현재는 방사선치료로 유발되는 장염에 대한 예방적 전략은 없는 실정이다. 그러나, 일부 프로바이오틱이 무작위 임상 연구(RCT: randomized clinical trial)에서 유망한 것으로 확인되었다. SCFA 생산, 염증이 생긴 점막에서 확인되는 반응성 산소 종 및 질소 종의 소거력, 및 기회 감염 병원체에 대한 항미생물 활성과 같은 건강-촉진 효과를 겸비한, 본 발명의 조성물과 같은, 프로바이오틱 조성물은, 방사선치료 및 화학요법-유발성 장염을 치료하는데 이용가능할 수 있다.
한편, 본 발명자들은, 본 발명의 균주들이 IBS의 치료에 유효함을 확인하였다. 아래에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물은, 임의 이중 맹검 위약-대조 중재 시험으로 평가된 바와 같이, IBS 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명의 제4 측면은 IBS의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 제공한다. 이러한 측면은, 다른 예로, IBS의 예방 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물의 용도로서 설계될 수 있다. 이는, 다른 예로, 필요로 하는 동물에게 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 포함한 동물에서 IBS를 예방 및/또는 치료하는 방법으로서 설계될 수 있다.
또한, 본 발명자들은, 균주들의 특징들로 인해, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물이 복부 팽창(abdominal bloating) 및 팽만(distension)의 치료에 유용함을 발견하였다. 아래에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물을 복부 팽만 및 팽창을 앓고 있는 사람에게 투여하였을 때, 현저한 개선이 관찰된다.
따라서, 본 발명은, 제5 측면에서, 복부 팽만 및 팽창의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 제공한다. 이러한 측면은, 다른 예로, 복부 팽만 및 팽창의 예방 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물의 용도로서 설계될 수 있다. 이는, 다른 예로, 필요로 하는 동물에게 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 포함한 동물에서 복부 팽만 및 팽창을 치료하는 방법으로서 설계될 수 있다.
IBS 및/또는 복부 팽만 및 팽창을 앓고 있는 인간에서 관찰되는 놀라운 유용한 효과들은, 본 발명의 균주들 CECT 7483, CECT 7484 및 CECT 7485가 표 6에 열거된 SCFA 생산 능력 및 표 3에 나타낸 길항 활성을 가지고 있기 때문일 수 있다.
당해 기술 분야에서, SCFA가 장 운동성을 조절한다는 것은 널리 공지되어 있다. 특히, SCFA는 랫 대장에서 장 운동성 및 감각을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세로토닌(5-HT)의 분비를 자극하는 것으로 알려져 있다 (Fukumoto S. et al., 2003; Tazoe H. et al., 2008). 마찬가지로, 부티르산은 인간 지원자에서 장의 내장 민감성을 낮추는 것으로 언급되었다 (Vanhoutvin S. A. et al., 2009). 이로부터, 본 발명의 조성물을 구성하는 균주들이, IBS 또는 복통 뿐만 아니라 기능성 변비(functional constipation) 또는 기능성 설사와 같이, 위장 운동성 및/또는 위장 통증과 관련있는 다른 병태들을 치료하는데 유용할 수 있는 것으로, 결론내릴 수 있다.
본 발명의 조성물 및 분리된 균주들은, 복잡한 연구의 성과이며 IBS, 복부 팽창 및 팽만의 치료 효능과 관련하여 수득한 결과들은 놀라울 정도로 현저한 것이므로, 선행 기술로부터 얻을 수 없는 비자명한 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은, 최초로, IBD 및 IBS 치료 능력을 구비한 페디오코커스 액시딜락티시 균주를 발견하였다. 이러한 능력은, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니며, 명세서 전체에서 기술된 분리된 페디오코커스 균주의 특이적인 특성들로 인한 것으로 생각된다. 본 명세서에서 제공되는 교시 및 프로토콜에 비추어, 당해 기술 분야의 당업자는 본 출원의 대상 이외의 동일한 프로바이오틱 특징과 치료학적 특징을 구비한 다른 페디오코커스 액시딜락티시 균주들을 발굴할 수 있을 것이다.
본 발명의 균주 또는 이의 변이체를 유효량으로 포함하는 본 발명에 따른 조성물은, 상기 균주가 단독 활성 성분이거나 또는 하나 이상의 다른 활성 성분과 혼합되거나 및/또는 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 부형제(약제학적 또는 수의학적 제품의 경우) 또는 적절한 첨가제(식용 제품의 경우)와 혼합되는, 식용 약제학적 또는 수의학적 제품으로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 제품은 부가적으로 하나 이상의 다른 활성 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 부가적인 활성 성분 또는 성분들은 본 발명의 조성물을 구성하는 균주에 길항 효과를 나타내지 않는 다른 프로바이오틱 박테리아이다. 제형에 따라, 균주는 정제된 박테리아, 박테리아 배양물, 박테리아 배양물의 일부, 후처리된 박테리아 배양물로서, 단독으로, 또는 적합한 담체 또는 성분들과 함께 첨가될 수 있다. 또한, 프리바이오틱스도 첨가될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 유효량의 조성물을 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 적량의 부형제와 함께 포함하는 약제학적 제품 및 수의학적 제품을 제공한다. 이와 관련하여, 상기 약제학적 제품은 본 발명의 조성물을 구성하는 균주의 생체이용가능성에 부정적인 작용을 하지 않는 모든 적합한 형태로 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 예컨대 동결-건조된 분말, 캡슐제, 액제 조제물 등의 형태로 경구 투여되도록 제형화될 수 있다. 조성물의 특정한 목적 측면에서, 부형제 및 제형화에 가장 적합한 방법의 선택은, 약학 기술 분야의 당업자의 능력내에 속한다. 경구 투여가 바람직하지만, 다른 형태들, 예컨대 주입용, 직장용 또는 국소형도 가능하다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 적절한 의학적 판단 범위내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제나 합병증 없이, 합리적인 이점/위험 비율에 상응하여, 개체(예, 인간)의 조직에 접촉시켜 사용하기 적합한, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태에 적용된다. 각각의 담체, 부형제 등도 제형의 다른 성분들과 혼용가능한 의미에서 "허용가능"하여야 한다. 적정 담체, 부형제 등은 표준 약학 교재에서 확인할 수 있다. 이처럼, 용어 "수의학적으로 허용가능한"은 비-인간 동물의 조직에 접촉시켜 사용하기에 적합하다는 의미이다.
또한, 본 발명의 균주는 유제품, 요구르트, 커드(curd), 치즈(예, 쿼크, 크림, 가공, 연질 및 경질), 발효유, 분유, 우유 기재의 발효 제품, 아이스크림, 발효 곡물 제품(fermented cereal based product), 조제 분유(milk based powder), 음료, 드레싱 및 애완동물 사료와 같은 다양한 식용 제품에 함유될 수 있다. 용어 "식용 제품"은 본원에서 약제학적 제품 및 수의학적 제품을 제외한, 동물이 섭취할 수 있는, 모든 제공 형태의, 모든 타입의 제품을 비롯한, 가장 광의적인 의미이다. 다른 식용 제품의 예로는 육류 제품(예, 간 페이스트, 프랑크푸르트 소세지, 살라미 소세지 또는 육류 스프레드), 초콜렛 스프레드, 속 재료(예, 트뤼플, 크림) 및 프로스팅(frosting), 초콜렛, 과자류(예, 카라멜, 퐁당(fondant) 또는 토피(toffee)), 구워낸 제과류(baked good)(케익, 패스트리), 소스 및 스프, 과일 쥬스 및 커피 프림(coffee whitener)가 있다. 특히 흥미로운 식용 제품은 식이 보조제(dietary supplement)와 이유식(infant formula)이다. 본 발명의 측면에서, 식이 보조제는 또한 인간의 건강에 의약적 효능을 가진 식품 추출물로 공지된 기능 식품(nutraceutical)을 포함한다. 동물 식이용 사료 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 조성물은 기타 식품 제품의 성분으로도 이용될 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 조성물과 적량의 식용 성분을 포함하는 식용 제품을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 식이 보조제이다.
본 조성물에서, 각 균주의 유효량의 콜로니 형성 단위(CFU)는 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 것이며, 최종 제형에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 식용 제품의 경우, 균주 또는 균주들은, 현행법에 따라, 약 105 cfu/g 내지 약 1012 cfu/g, 바람직하게는 약 107 cfu/g 내지 약 1012 cfu/g의 양으로 존재한다. 용어 "콜로니 형성 단위(CFU)"는 아가 플레이트 상에서의 미생물 수로 나타낸 박테리아 세포의 수이다.
식이 보조제는 통상적으로 107 - 1012 cfu/g 범위의 양으로 프로바이오틱 균주를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 109 - 1011 cfu/g를 포함하는 식이 보조제이다.
본 발명의 균주는 적정 배지에서 적정 조건하에 박테리아를 배양함으로써 제조된다. 균주는 단독으로 배양하여 순수한 배양물을 형성하거나 또는 다른 미생물과 함께 혼성 배양물로서 배양하거나, 또는 여러가지 타입의 박테리아를 각각 배양한 다음 이를 원하는 비율로 조합할 수 있다. 배양 후, 세포 현탁물을 회수하여, 이를 그대로 사용하거나 또는 예컨대 농축 또는 동결-건조함으로써 원하는 수단으로 처리하여, 약제학적 또는 식용 제품의 제조에 추가로 사용한다. 때로는, 프로바이오틱 조제물은 수명을 개선시키기 위해 고정화 또는 캡슐화 공정을 거친다. 몇가지 박테리아 고정화 또는 캡슐화 기술들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 조성물이 식이 보조제로 사용되는 경우, 그대로 투여하거나, 물, 요구르트, 우유 또는 과일 쥬스 등의 적정 음용가능한 액체와 혼합하거나, 또는 고형 또는 액형 식품과 혼합할 수 있다. 이러한 측면에서, 식이 보조제는 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 산제, 현탁제, 샤셋제(sachet), 패스틸(pastille), 스위트(sweet), 바(bar), 시럽제 및 대응되는 투여 형태들, 일반적으로 단위 투약(unit dose) 형태일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 약제학적 제품의 일반적인 제조 공정으로 제조된 정제, 캡슐제 또는 산제 형태로 투여된다.
명세서와 청구항에서, 용어 "포함한다" 및 이의 변형어는 다른 기술적 특징들, 첨가제, 구성 성분 또는 단계를 배제하고자 하는 의도가 아니다. 본 발명의 내용 검토시 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 다른 과제들, 효과 및 특징들을 명확하게 인지하게 되거나, 본 발명의 실시를 통해 습득할 수 있다. 아울러, 본 발명은 본원에 기술된 특정한 바람직한 구현예들의 모든 가능한 조합을 포괄한다.
도 1은 1, 페디오코커스 액시딜락티시 CECT 7483; 2, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7484; 3, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7485의 게놈 DNA의 제한효소 Not-I 또는 Sfi-I (좌) 및 Sma-I (우)로 절단한 펄스 장 겔 전기영동 패턴을 나타낸 것이다. 대조군: 4, 통상의 균주 페디오코커스 액시딜락티시 Rossell1001 (Institut Rossell, Canada); 5, 락토바실러스 플란타룸 299v (Probi AB, Sweden); 및 6, 시판 제품 VSL#3 (VSL Pharmaceuticals, USA)에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주. 도 1은 "균주 유전자형 분석" 섹션에서 언급된다.
도 2는 DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 질환 활성 지수(Y 축)를 나타낸 것이다. X 축은, a, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 시판 프로바이오틱 제형(VSL#3); c, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 비히클; 및 d, 건강한 대조군에서의 비히클의 투여이다. 도 2는 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 3은 DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 IL-6 수준 (Y 축)을 나타낸 것이다. X 축은, a, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에 투여된 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에 투여된 시판 프로바이오틱 제형(VSL#3); c, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에 투여된 비히클; 및 d, 건강한 대조군에 투여된 비히클이다. 도 3은 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 4는 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서 무증상인 주의 수(즉, 1차 증상이 개시되기 전의 주의 수, 즉 질환 활성 지수가 0임)(Y 축)를 도시한 것이다. X 축은, a, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 투여된 본 발명의 프로바이오틱 조성물; b, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 투여된 시판 프로바이오틱 제형 VSL#3; c, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 투여된 PBS; 및 d, 건강한 대조군에 투여된 비히클이다. 도 4는 "자발적인 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 5는 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서의 IFN-γ 수준 (Y 축)을 나타낸 것이다. X 축은 a, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 시판 프로바이오틱 제형 (VSL#3); c, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 비히클; 및 d, 건강한 대조군에 대한 비히클이다. 도 5는 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 6은 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서의 IL-6 수준 (Y 축)을 나타낸 것이다. X 축은 a, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 시판 프로바이오틱 제형 (VSL#3); c, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 비히클; 및 d, 건강한 대조군에 대한 비히클이다. 도 6은 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 7은 조성물(검정 막대) 또는 위약(백색 막대)이 든 캡슐제를 처리한 지원자의 베이스라인(Y 축) 대비 IBSQoL 스코어의 변화를 나타낸 것이다. X 축은 처리 21일 후 및 42일 후의 스코어 변화를 나타낸다. 도 7은 "IBS 개체에 대한 생체내 효능" 섹션에서 "건강 관련 삶의 질 개선"에서 언급된다.
도 8은 조성물(검정 막대) 또는 위약(백색 막대)이 든 캡슐제를 처리한 지원자의 베이스라인(Y 축) 대비 VSI 스코어의 변화를 나타낸 것이다. X 축은 처리 3주 후 및 6주 후의 스코어 변화를 나타낸다. 도 8은 "IBS 개체에 대한 생체내 효능" 섹션에서 "내장 과민성의 개선"에서 언급된다.
도 2는 DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 질환 활성 지수(Y 축)를 나타낸 것이다. X 축은, a, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 시판 프로바이오틱 제형(VSL#3); c, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 비히클; 및 d, 건강한 대조군에서의 비히클의 투여이다. 도 2는 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 3은 DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에서의 IL-6 수준 (Y 축)을 나타낸 것이다. X 축은, a, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에 투여된 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에 투여된 시판 프로바이오틱 제형(VSL#3); c, DSS-유발성 장 염증을 앓고 있는 마우스 그룹에 투여된 비히클; 및 d, 건강한 대조군에 투여된 비히클이다. 도 3은 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 4는 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서 무증상인 주의 수(즉, 1차 증상이 개시되기 전의 주의 수, 즉 질환 활성 지수가 0임)(Y 축)를 도시한 것이다. X 축은, a, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 투여된 본 발명의 프로바이오틱 조성물; b, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 투여된 시판 프로바이오틱 제형 VSL#3; c, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 투여된 PBS; 및 d, 건강한 대조군에 투여된 비히클이다. 도 4는 "자발적인 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 5는 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서의 IFN-γ 수준 (Y 축)을 나타낸 것이다. X 축은 a, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 시판 프로바이오틱 제형 (VSL#3); c, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 비히클; 및 d, 건강한 대조군에 대한 비히클이다. 도 5는 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 6은 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서의 IL-6 수준 (Y 축)을 나타낸 것이다. X 축은 a, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 본 발명의 프로바이오틱 제형; b, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 시판 프로바이오틱 제형 (VSL#3); c, IL-10 낫아웃 마우스 그룹에 대한 비히클; 및 d, 건강한 대조군에 대한 비히클이다. 도 6은 "화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과" 섹션에서 언급된다.
도 7은 조성물(검정 막대) 또는 위약(백색 막대)이 든 캡슐제를 처리한 지원자의 베이스라인(Y 축) 대비 IBSQoL 스코어의 변화를 나타낸 것이다. X 축은 처리 21일 후 및 42일 후의 스코어 변화를 나타낸다. 도 7은 "IBS 개체에 대한 생체내 효능" 섹션에서 "건강 관련 삶의 질 개선"에서 언급된다.
도 8은 조성물(검정 막대) 또는 위약(백색 막대)이 든 캡슐제를 처리한 지원자의 베이스라인(Y 축) 대비 VSI 스코어의 변화를 나타낸 것이다. X 축은 처리 3주 후 및 6주 후의 스코어 변화를 나타낸다. 도 8은 "IBS 개체에 대한 생체내 효능" 섹션에서 "내장 과민성의 개선"에서 언급된다.
실시예
아래 섹션들에서는 본 발명의 균주들의 특징, 이들의 특이적인 프로바이오틱 특징들 및 위장계와 면역계에 대한 이들의 생리학적 효과를 기술한다. 이하, 균주 F1033은 페디오코커스 액시딜락티시 CETC 7483을, 균주 F2064는 락토바실러스 플란타룸 CECT 7484를, 균주 F2076은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7485에 해당된다.
1. 미생물의 분리
A) 방법
미생물을 분리하기 위해, 신선한 변과 타액 (Daniel C. et al., 2006)을 0-5세 어린 아이들로부터 채집하여, PBS 완충액(pH 7.4)에 용해하고, 이를 분액하여 다양한 항생제 조합이 첨가된 MRS 상에 도말하였다. 균주를 미세호기 조건(5% CO2) 하에 37℃에서 배양하였다. 배양 시간은 증식율에 따라 결정되지만, 통상적으로는 24시간 내지 3일간 수행한다. 1차 동정을 위해 그람 염색을 수행하였다. 증식되면, 분리된 균주를 15% 탈지유 분말이 첨가된 PBS 0.1X에서 동결건조하여 보관하였다.
B) 결과
새로운 균주들 F2064, F2076 및 F1033을 10 ㎍/ml 반코마이신이 첨가된 MRS 아가에서 배양하였다. 현미경 검경으로, 균주들 F2064와 F2076은 그람 양성의 바실러스이고, 균주 F1033은 구균 형태의 그람 양성인 것으로 확인되었다.
2. 동정
A) 방법
게놈 DNA를 Wizard 게놈 DNA 정제 키트 (Promega)를 이용하여 추출하였다. 각 분리된 균주에 대해, 16S 유전자를 유니버셜 프라이머 27f, 357f, 907r 및 1492r (Weisburg W. G. et al., 1991)로 PCR에 의해 증폭시켜, 거의 전장의 16S rRNA 단편 (1465 bp)을 제조하였다. DNA를 Quiaquick 키트 (Quiagene, GmbH, Hilden, Germany)로 헹군 후, 샘플 당 4번의 서열분석 반응을 Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems)에서 BigDye v.3.1 키트를 이용하여 수행하였다. 선택된 서열분석 프라이머 DNA 서열 분석 v.5.2 (Applied Biosystems) 소프트웨어를 사용하여 데이트를 수집하고, 크로마토그램을 구축하였고, Chromas (Technelysium Pty Ltd.)와 BioEdit (Ibis Biosciencies) 소프트웨어로 분석하였다. 속 및 종의 동정은 BLASTN 검색 (Altschul S. F. et al., 1990)을 이용한 RefSeq 데이타베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)와 리보좀 데이타베이스 프로젝트 (Wang Q. et al., 2007) 2가지로 수득한 서열을 비교함으로써, 수행하였다.
표 1: 16S 유전자의 증폭 및 서열분석에 사용된 프라이머
| 단계 | 프라이머 | 방향 | 5'→3' 서열 |
| 증폭 | 27f | 정방향 | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (서열번호 1) |
| 1492r | 역방향 | GGTTACCTTGTTACGACTT (서열번호 2) | |
| 서열분석 | 27f | 정방향 | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (서열번호 1) |
| 357f | 정방향 | CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG (서열번호 3) | |
| 907r | 역방향 | CCGTCAATTCCTTTGAGTTT (서열번호 4) | |
| 1492r | 역방향 | GGTTACCTTGTTACGACTT (서열번호 2) |
B) 결과
균주 F2064와 F2076은 락토바실러스 플란타룸으로 동정되었다. 균주 F1033은 페디오코커스 액시딜락티시로 동정되었다.
3. GI 관까지의 생존성
A) 방법
산성 환경에 대한 관용성을 평가하기 위해, 각 박테리아 균주 배양액 20 ㎕ 분액을 96웰 플레이트에 HCl로 pH2 및 pH3(Panreac)으로 적정한 MRS 배지 200 ㎕와 함께 넣었다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 유지시키고, 620 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 마지막으로, 생존 세포를 플레이트 카운팅에 의해 측정하고, 접종원내 생존 세포의 수를 비교하였다.
담즙산염에 대한 관용성을 평가하기 위해, 각 박테리아 균주 배양액 20 ㎕ 분액을 96웰 플레이트에 0.5% Oxgall (Sigma)이 첨가된 MRS 배지 200 ㎕와 함께 넣었다. 플레이트를 3시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양하고, 광학 밀도를 측정하였다. 마지막으로, 생존 세포를 플레이트 카운팅에 의해 측정하고, 접종원내 생존 세포의 수를 비교하였다.
B) 결과
3종의 균주 모두 산성 환경에서 우수한 생존성을 나타내었으며, pH= 2 또는 pH= 3의 MRS에서 1시간 배양한 후 생존 세포의 수적 감소는 1 log 미만이었다. 또한, 균주들은 담즙산염에 대해 현저한 내성을 보이며, 0.5% 담즙산염이 보충된 MRS에서 3시간 배양 후 생존 세포의 수적 감소는 50% 미만이었다.
4. 부착성
A) 방법
돼지 소장을 0.01% 젤라틴 및 프로테아제 저해제 칵테일 (Complete®, Sigma)이 함유된 PBS pH 7.4로 헹구었다. 점막을 긁어, 상기 저해제가 첨가된 HEPES-Hank 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4) (Collado M. et al., 2007)에 용해하였다. 그런 후, 점액을 동일 완충액을 이용하여 10분간 13000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 회수하여, 브래드포드 프로토콜에 의해 단백질 함량을 측정하였다. 분석하기 24시간 전에, 0.5 mg/ml의 점액 1 ml를 24웰 ELISA 플레이트의 웰에서 인큐베이션하였다.
테스트할 각 균주를 삼중 수소-표지된 티미딘(MRS 3 ml 중 5 ㎕)이 첨가된 MRS 배지에서 밤새 배양하였다. 배양물을 원심분리하고, Neubauer 챔버에서 카운팅하여 PBS 중에 108 cfu/ml로 조절하고, 각 배양물의 샘플을 취하여, 신틸레이션 리더를 이용하여 혼입된 삼중 수소-표지된 티미딘의 양을 측정하였다. 그런 후, 0.5 ml을 24웰 플레이트의 점액이 든 웰들에 첨가하여, 60분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 각 웰의 상층액을 버리고, 웰을 MEM 알파 배지(Gibco)로 2번 헹궈, 약하게 부착된 박테리아를 제거하였다. 마지막으로, 웰을 긁어 부착되어 있는 박테리아와 함께 점액을 회수하여, 방사성을 측정하였다. 각 배양물의 비활성(cpm/CFU)을 108 cfu/ml로 적정한 PBS 현탁물에 혼입된 총 방사성으로부터 구하였다. 락토바실러스 람노수스 GG (Valio Ltd, Finland)는 장의 상피에 대한 부착성이 매우 높아, 양성 대조군으로 사용하였다 (Jacobsen C. N. et al., 1999).
Caco-2 세포를 ATCC (ECACC No. 86010202)로부터 입수하였다. 세포를 34웰 플레이트에 접종하여, 컨플루언스가 될 때까지 DMEM에서 배양시켰다 (37 ℃, 5% CO2). caco-2 세포 면적 단위 당 부착되는 박테리아의 수를 구하기 위한 실험 공정은 기본적으로 점막 유착에 대한 전술한 바와 동일하다.
B) 결과
균주들 F1033, F2064 및 F2076의 부착력을 삼중 수소-표지된 티미딘의 신틸레이션으로부터 측정하여, 시판 균주 락토바실러스 람노수스 GG의 결과와 비교하였다. Caco-2 모델을 이용한 상피 세포에 대한 부착은 프로바이오틱 균주에 대한 일반적인 분석이다. 락토바실러스 람노수스 GG와 비교하여, 균주들 F2064 및 F2076의 상피 세포에 대한 친화성은 60% 낮게 나타났다. 그러나, 상피 세포에 대한 락토바실러스 람노수스 GG의 고친화성을 고려하면, 이러한 수치는 락토바실러스 플란타룸 299v와 같은 다른 잘 알려져 있는 프로바이오틱스와 상응하는 수준이며, 다수의 기타 프로바이오틱 균주들 보다 월등하였다 (Jacobsen C. N. et al., 1999). 한편, 상피 세포에 대한 균주 F1033의 부착성은 락토바실러스 람노수스 GG의 2.5배 이상이었다. 그 외에도, 균주들 F2064 및 F2076은 상피 세포에 비해 장 점막에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 나타내었으며, 균주 F1033은 반대로 거동하였다. 결과는 아래 표에 나타낸다.
표 2: 프로바이오틱 박테리아 균주들의 점막 부착. [* 박테리아 총 농도 108 cfu로부터].
| 균주 | Caco-2 (cfus/cm2) | 점액 (cfus/cm2) |
| F1033 | 1.21 ± 0.17 ·105 cfu | 6.06 ± 0.73 ·104 cfu |
| F2064 | 1.89 ± 0.12 ·104 cfu | 2.25 ± 0.12 ·106 cfu |
| F2076 | 1.71 ± 0.16 ·104 cfu | 5.91 ± 0.03·105 cfu |
| 락토바실러스 람노수스 GG | 4.41 ± 0.22 ·104 cfu | 3.29 ± 0.57·106 cfu |
5. 길항성
A) 방법
아래 지표 균주(indicator strain)를 사용하였다: 프로테우스 미라빌리스(proteus mirabilis) CECT 4557, 클레시엘라 옥시토카(Klesiella oxytoca) CIP 103434, 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) ATCC 13124, 클로스트리듐 라모섬(Clostridium ramosum) ATCC 25582, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CETC 795, 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis) ATCC29833, 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) ATCC 8482 및 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) ATCC2079는 채집 균주이다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 살모넬라 엔테리카 티피무리움(Salmonella enterica thyphimurium), 살모넬라 엔테리카 콜레라수이스, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 실험실 분리주이다. 지표 균주를 적정 배지(Oxoid)가 든 플레이트에 균일하게 도말하여, 미세호기 조건(5% CO2) 하 적정 온도에서 컨플루언스로 배양하였다. 그런 후, 컨플루언트 F1033, F2064 또는 F2076 아가의 6 mm (직경) 실린더형 섹션들을 지표 균주 플레이트에 뒤집어 위치시키고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 아가 플레이트를 평평한 곳에 플렛 룰에 위치시켜 저해 영역을 측정하였다. 증식 저해 활성(GI)은 하기와 같이 계산하였다:
상기 식에서, IZD는 저해 영역 직경이고, CD는 실린더 직경이며, mm로 측정하였다.
B) 결과
표 3: 12종의 병원성 또는 잠재적인 병원성 균주, 및 위장 미생물총의 일반적인 공생 균주 2종에 대한 프로바이오틱 균주들의 증식 저해 활성 (GI).
| F2064 | F2076 | F1033 | |
| 병원체 | |||
| 칸디다 알비칸스 | 2 | 0.5 | 1.25 |
| 살모넬라 엔테리카 티피무리움 | 1 | 1 | 0.25 |
| 살모넬라 엔테리카 콜레라수이스 | 1 | 1 | 0.5 |
| 에스케리키아 콜라이 | 1.75 | 3.7 | 1.1 |
| 캄필로박터 제주니 | 0 | 0 | 4.75 |
| 클레시엘라 옥시토카 | 0.5 | 1 | 2 |
| 프로테우스 미라빌리스 | 4 | 1.5 | 0.5 |
| 슈도모나스 에어루지노사 | 3 | 3.75 | 4.5 |
| 엔테로코커스 패칼리스 | 1.75 | 1 | 1.25 |
| 클로스트리듐 퍼프린겐스 | 2.25 | 3.75 | 1.75 |
| 클로스트리듐 라모섬 | 1.25 | 1.75 | 0.5 |
| 예르시니아 슈도투베르쿨로시스 | 5.5 | 3.4 | 4.5 |
| 공생 균주 | |||
| 박테로이데스 테타이오타오미크론 | 0.4 | 0.4 | 0.5 |
| 박테로이데스 불가투스 | 0.3 | 0.5 | 0.7 |
균주들 F2064, F2076 및 F1033은 칸디다 알비칸스와 수종의 잠재적인 병원성 박테리아에 대해 현저한 저해 활성을 나타내었다. 한편, 공생 균주에 대해 최소 활성을 보인 균주들은 일반적으로 박테로이데스 속의 고유한 위장 미생물총에서 확인되었다. 또한, 균주들 F2064, F2076 및 F1033은 서로에 대해 현저한 저해 활성을 나타내지 않았다. 주목할 만한 점은, 균주 F1033이 캄필로박터 제주니에 대해 강한 저해 활성을 보이는 유일한 균주이고, 균주 F2076은 에스케리키아 콜라이, 균주 F2064는 칸디다 알비칸스와 프로테우스 미라빌리스를 저해하는데 월등하다는 것이었다.
6. 항산화력
A) 방법
각 균주의 밤새 배양한 배양물(약 109 cfu/ml) 중 20 ㎕ 분액을 96웰 플레이트에 넣었다. 10 mM 파라쿼트 (C12H14Cl2N2, 슈퍼옥사이드 음이온 도너) 또는 10 mM 소듐 니트로프루시드 (Na2[Fe(CN)5NO], 질소 옥사이드 도너)가 첨가된 MRS 200 ㎕을 웰에 넣고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 620 nm에서의 광학 밀도를 6시간 후 판독하였다. 결과는 표준 MRS 배지에서의 증식 대비 증식율로서 나타내었다. 동일한 프로토콜을 락토바실러스 람노수스 GG 균주와 시판 제품 VSL#3에서 분리한(분리는 표준 공정을 이용하여 수행함) 락토바실러스 플란타룸 균주에 대해서도 수행하였다.
B) 결과
산화 스트레스는 반응성 산소종(ROD)의 생성과 약화된 항산화제 방어 시스템 간의 불균형으로서 정의된다. 염증 세포, 호중구 및 대식세포가 다량의 ROS를 생산하기 때문에, 산화 스트레스는 특히 염증 반응에서 발생한다 (Rezaie A. et al., 2007; Roessner A. et al., 2008). 균주들 F1033, F2064 및 F2076은 널리 알려진 프로바이오틱 균주 락토바실러스 람노수스 GG 뿐만 아니라 VSL#3 제형으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주에 상응하는 강력한 산화 조건에서 생존하는 능력을 나타내었다. 균주 F2076은 파라쿼트(슈퍼옥사이드 음이온 도너) 및 소듐 니트로프루시드(질소 옥사이드 도너) 둘다에 대해 최대 내성을 나타낸다는 점에 주목할 필요가 있다. 산화 스트레스에 대한 내성은 염증이 발생된 점막 환경에서 생존할 것으로 예상되는 프로바이오틱 균주들에 바람직한 형질이다.
표 4: 표준 MRS 배지와 비교한, 10 mM 파라쿼트 또는 소듐 니트로프루시드가 포함된 배지에서의 증식율.
| 균주 | 파라쿼트에서의 증식율% | 니트로프루시드에서의 증식율% |
| 락토바실러스 람노수스 GG | 70 ± 10 | 99 ± 17 |
| 락토바실러스 플란타룸 VSL#3 | 61 ± 4 | 88 ± 10 |
| F1033 | 67 ± 9 | 76 ± 22 |
| F2064 | 61 ± 18 | 67 ± 8 |
| F2076 | 72 ± 1 | 104 ± 19 |
7. 균주의 유전자형 분석
A) 방법
균주들 F1033, F2064 및 F2076을 일부 변형을 가하여 종래 기술된 프로토콜에 따라 수행하였다 (Rodas A. M. et al., 2005). 균주를 MRS 아가 플레이트에서 배양하고, 18시간 동안 37℃ 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 세포를 회수하여, 8 ml PET (10 mM Tris pH 7.6, 1 M NaCl)로 3번 헹군 다음, 6000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 펠렛을 700 ml 세포용혈 완충액 (6 mM Tris, 1 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.5% SLS, 0.2 % 데옥시콜산; 1 mg/ml 리소자임; 40 U/ml 무타노라이신; 20 mg/ml RNase)에 재현탁하였다. 저융점의 1.6% 아가로스(FMC BioProducts, Rockland, ME, USA)를 동일 부피로 상기 재현탁한 세포에 첨가하고, 1시간 동안 4℃에서 고형화하였다. 인서트를 2 ml 세포용혈 완충액 II (0.5 M EDTA pH 9.2, 1% N-라우릴 사르코신 및 1 mg/ml 프로나제)로 옮긴 다음, 50℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인서트를 실온에서 TE 완충액 (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)으로 헹구었다. Sfi-I 및 Sma-I 제한효소(Roche Diagnostics)에 의해 전체 DNA 절단을 각각 수행하였다.
CHEF DRIII 장치 (BioRad Laboratories)에서 펄스 장 전기영동을 수행하였다. 인서트를 1% 아가로스 겔 (SeaKem ME agarose, FMC BioProducts, ME, USA)에 로딩하였다. DNA MW 마커는 람다 래더 PFG 마커와 낮은 범위의 RFG 마커(New England Biolabs)를 사용하였다. 전기영동 후, 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고, GelDoc System (BioRad)을 이용하여 UV 하에서 검증하였다.
B) 결과
도 1은 수득한 펄스 장 전기영동 결과이다. 균주 F1033은, Sma-I으로 분해 후, 페디오코커스 액시딜락티시 R1001과 유사한 게놈 제한효소 프로파일을 나타낸다. 그러나, 효소 Not-I으로 분해한 후 수득한 게놈 프로파일은 명확하게 상이하다. 한편, 균주들 F2064 및 F2076의 게놈 제한효소 프로파일은 서로 간에 명확하에 차이가 있으며, 또한 락토바실러스 플란타룸 299v와 VSL#3 제형에 포함된 락토바실러스 플란타룸 균주들과 유사하였다.
8. 단쇄 지방산의 생산
A) 방법
균주를 특정량의 각각의 하나(이눌린, 펙틴 및 FOS)로 여러가지 섬유질이 보충된 기본 배지(표 5 참조)에서 미세호기 조건(5% CO2) 하 37℃에서 배양하였다. 다음으로, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 상층액을 여과 및 액체 질소에서 냉동시킨 후, 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 양에 초점을 맞춘 기체 크로마토그래피 분석을 수행할 때까지 -80℃에 두었다.
| 화합물 | 농도 |
| 펩톤 | 2 g/L |
| 효모 추출물 | 2 g/L |
| NaCl | 0.1 g/L |
| K2HPO4 | 0.04 g/L |
| KH2PO4 | 0.04 g/L |
| MgSO4.7H2O | 0.01 g/L |
| CaCl2.6H2O | 0.01 g/L |
| NaHCO3 | 2 g/L |
| 헤민 | 0.05 g/L |
| HCl 시스테인 | 0.5 g/L |
| 담즙산염 | 0.5 g/L |
| 트윈 80 | 2 g/L |
| 비타민 K1 | 10 ㎕ |
| 이눌린 | 10 g/L |
| 펙틴 | 10 g/L |
| FOS | 10 g/L |
B) 결과
단쇄 지방산 (SCFA)은 대장에서 탄수화물이 혐기성 박테리아에 의해 분해되어 만들어지는 최종 산물이다. SCF, 주로 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트는 대장 음이온 농도의 약 80%를 차지하며, 62:22:15의 거의 일정한 몰 비로 만들어진다. 이들의 다양한 특성들 중에서도, SCF, 특히 부티르산, 그리고 아세트산 및 프로피온산 역시 장 점막에 의해 쉽게 흡수되며, 비교적 칼러리 함량이 높고, 대장세포 및 간세포에서 대사되며, 대장에서 나트륨과 물 흡수를 자극하며, 장 점막에 영양원이다 (D'Argenio G. et al., 1999). 한편, 다량의 아세트산이 장 점막에 자극적인 것으로 오랜동안 알려져 왔다 (Yamada Y. et al., 1992). 균주들 F1033, F2064 및 F2076은 아세트산, 프로피온산 또는 부티르산의 강력한 생산체들이다.
표 6: 이눌린, 펙틴 및 FOS가 농화된 기본 배지에서 배양된 균주에 의한 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 생산.
| 균주 | 아세트산 (mg/ml) | 프로피온산 (mg/ml) | 부티르산 (mg/ml) |
| 락토바실러스 람노수스 GG | n.d | n.d | 7.7 |
| F1033 | n.d | n.d | 21.4 |
| F2064 | n.d | 30.2 | 9.7 |
| F2076 | 46.5 | n.d | n.d |
(n.d.= 검출 안됨)
9. IBD 치료제와의 상용성(compatibility)
A) 방법
MRS 액체 브로스에 최대 용해 농도(0.84 gr/L) 및 이의 절반 농도(0.42 gr/L)로 5-아미노살리실산 (Pentasa®, Ferring Pharmaceuticals)을 용해하여, 보강된 브로스를 제조하였다. 본 발명의 균주를 표준 MRS 브로스 또는 5-아미노살리실산-보충된 브로스에서 4시간 동안 37℃에서 미세호기 조건(5% CO2) 하에 배양하고, 620 nm에서의 광학 밀도를 측정하여 증식을 분석하였다. 결과는 표준 MRS 배지에서의 증식에 대한 퍼센트로서 나타낸다.
B) 결과
경도 내지 중도의 IBD 증상의 장기간 처리는 통상 경구 아미노살리실레이트(5-ASA 유도체)를 이용하여 이루어진다 (Katz J. A., 2007). 따라서, 본 발명의 프로바이오틱 균주를 5-ASA 유도체와 공동-투여할 수 있는지를 평가하는 것에 관심이 있다. 상기 균주의 증식이 고엄격 조건에도 불구하고 완전히 저해된다는 것을 고려하여, 본 발명자들은, 메살라진의 공동-투여가 표 7에 나타낸 바와 같이 메살라진을 포화 농도(0.84 g/L)로 이용하더라도 프로바이오틱의 효능을 약화시킬 수 없을 것으로 결론내릴 수 있다.
| 4h (증식율%) | 8h (증식율%) | |||
| 0.42 g/L | 0.84 g/L | 0.42 g/L | 0.84 g /L | |
| VSL#3 | 56.2 | 38.1 | 43.2 | 35.1 |
| F1033 | 72.7 | 60.6 | 51.8 | 42.3 |
| F2064 | 59.7 | 48.0 | 62.3 | 55.1 |
| F2076 | 51.6 | 22.1 | 50.2 | 22.5 |
10. 화학적으로 유발된 장 염증에 대한 생체내 효과
A) 방법
경도의 장 염증에 대한 본 발명의 조성물의 치료학적 효과를, 마우스에서 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 5일간 반복적으로 경구 투여하여 평가하였다 (Okayasu I. et al., 1990). 단기간(5일) 저용량(2.5-3%)으로 사용하였을 때, DSS는, 조직학적 수준일 뿐 유의한 가시적인 변화(예, 대장의 단축, 장간막 부착)가 없는 수준의 장 염증이 형성되는 경도의 대장염을 발생시킨다
외관적 증상은 체중 감소 및 설사, 드물게는 혈변 발생을 포함한다. 따라서, 이 모델은 저등급의 궤양성 대장염의 예이다.
균주들 F1033, F2064 및 F2076을 동결보호제로서 15% 탈지유 및 4% 슈크로스를 첨가한 멸균수에서 동결건조하하고, 동량(농도 비 1:1:1)으로 혼합하였다.
8주령의 체중 20-25 g의 Balb/c 마우스 (Charles River, Barcelona, Spain)를, 격리소에서(Harlan Iberica, Barcelona, Spain) SPF(specific pathogen-free) 조건 하에, 12시간 주야 주기의 일정한 온도(22 ℃)에서 사육하였다. 마우스 2마리는 리터메이트(littermate)로서 사용하였다. 마우스는 멸균된 음식물(실험실의 표준 식이; Harlan Iberica, Barcelona, Spain)과 음용수에 자유롭게 접근가능하였다. 마우스는 실험 개시 전에 시설에서 7일간 두었다(격리). 마우스는 4가지 그룹 중 한 그룹으로 할당하였다: a) 본 발명의 프로바이오틱 조성물 + DSS (n=8); b) VSL#3 (VSL Pharmaceuticals, USA) + DSS (n=8); c) 비히클 + DSS (n=8); 및 d) 비히클 + 건강한 대조군 (n=6).
DSS 투여를 개시(0일)하기 10일 전(-10일) 동안 위관 영양에 의해 프로바이오틱스 (또는 비히클)를 투여하였다. 각 마우스에 멸균수 (비히클) 0.1 mL 중의 프로바이오틱 2.5 x 108 cfu로 매일 위관영양에 의해 투여하였다. 프로바이오틱 무처리 마우스에는 동일 체적의 비히클(15% 탈지유 및 4% 슈크로스가 첨가된 증류수)을 투여하였다.
기존 방법에 최소한의 변형 (Okayasu I, et al. Gastroenterol 1990)을 가하여, 5일간, 음용수 중에 3% (w/v) DSS (mol. Wt 40kD, Applichem Lifescience, VWR, Barcelona)로, 마우스에 섭취시켰다. 건강한 대조군에는 DSS를 섭취시키지 않았다.
임상 신호를 매일 모니터링하였다. 질환 활성 지수를 하기 식과 해석 표에 따라 계산하였다:
DAI = Score체중 감소 + Score혈변 + Score변 굳기(Stool Consistency)
결과는 표 8에 나타낸다:
| 체중 | 스코어 | 혈변 | 스코어 | 변 굳기 | 스코어 |
| < 1% | 0 | 없음 | 0 | 형태 형성 및 단단함 | 0 |
| 1 - 5% | 1 | 형태 형성, 부드러움 | 1 | ||
| 5 - 10% | 2 | 있음 | 2 | 물렁한 변 | 2 |
| 10 - 15% | 3 | 경도의 설사 (묽음) | 3 | ||
| > 15% | 4 | 과도한 출혈 | 4 | 심한 설사 | 4 |
본원에서 사용한 질환 활성 지수는 Cooper 등에 의해 최초로 언급되었으며, 몇가지 임상 증상들을 하나의 표준화된 스코어로 연결시킨다 (Cooper H. S. et al., 1993). 최대 스코어는 12 포인트이다. 이 스코어는 IBD 동물 모델에서 실험적 치료제 - 특히 프로바이오틱스 -의 효능을 평가하기 위해 널리 사용되고 있다 (Fitzpatrick L. R. et al., 2007; Grabig A. et al., 2006; Sasaki M. et al., 2005).
흡입용 할로탄(Fluotane®, Zeneca Ltd, UK)을 마취 이상으로 과량 투여하여 희생시킨 후, 동물의 대장 샘플을 회수하여 차가운 PBS로 헹구었다. 대장 중량/길이 비를 기록하였다. 사이토카인 측정을 위한 샘플을 액체 질소에서 동결시키고, 저해제 단백질 칵테일(Sigma-Aldrich Chem., Spain)이 첨가된 차가운 PBS 1 mL 중에서 균질화한 다음 원심분리하였다(15000 x g, 10분). Luminex® 플랫폼 (Luminex® Co, Austin, USA)에 대한 사이토카인 6-Plex 분석(ProcartaTM Cytokine Profiling Kit, PANOMICS, Spain)을 이용하여 대장 상층액에서 IL-6, IL-10, IL23p19, IFN-γ 및 TNF-알파 농도를 측정하였다. 사이토카인-특이 항체로 미리 스팟팅한 형광 미세입자 비드를 50 ㎕의 1:5 희석 상층액과 함께 인큐베이션하였다. 특이적인-바이오틴화된 이차 항체 및 스트렙타비딘-피코에리트린(S-PE)을 순차적으로 첨가하였다. 데이타는 단백질 mg 당 사이토카인 pg으로 표시하였다(Quick Start Bradford Protein Assay, BIO-RAD, CA, USA). 모든 측정은 2세트로 수행하였다.
B) 결과
질환 활성 지수
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로바이오틱 제형을 복용한 그룹에서는 질환 활성 지수 분석(p < 0.05, Tukey-Kramer 사후 검정(post-hoc test)을 이용한 양측(two-tail) ANOVA)에 따라 DSS-처리 대조군과 비교하여 임상 증상의 현저한 개선을 보여주었다. 또한, 건강한 대조군에서는 보다 낮은 질환 활성 지수가 나타났다(p < 0.05).
사이토카인 수준
장 점막에서의 다양한 사이토카인 분석을 통해, 본 발명의 프로바이오틱 제형은, DSS-처리 대조군과 비교하여, IL-6의 현저한 감소가 확인되었고 (p < 0.01, Tukey-Kramer 사후 검정을 이용한 양측 ANOVA), 시판 프로바이오틱 제형 VSL#3의 효과는 유의성에 도달하지 못하였다 (p > 0.05). IL-6는 급성 염증의 마커이다(도 3). 예상된 바와 같이, 건강한 대조군에서의 IL-6의 수준은 DSS-처리 대조군 보다 현저하게 낮았다 (p < 0.05). 통계적으로 유의한 상관성이 장 점막에서의 임상 증상(DAI 스코어) 및 IL-6 수준 간에 확인되었다 (데이타 미기재). 한편, 임상 증상과 IL-10, IL-23, TNF알파 또는 IFNγ 간의 상관성은 통계적으로 유의하지 않았으며, 본 발명의 프로바이오틱 제형은 이들 사이토카인의 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다.
11. 자발성인 장 염증의 생체내 효과
A) 방법
본 발명의 프로바이오틱 제형의 치료학적 효과도 IL-10 낫아웃 마우스 모델에서 조사하였다. 이 모델에서 8주령 내지 12주령에 장 염증이 자발적으로 발생되었고, 침투율(penetrance)이 80-90%이었다 (Scheinin T. et al., 2003). 인터루킨 10(IL-10)은 대식세포/단핵구, T 헬퍼1(Th1) 세포 및 자연 살상 세포의 작동자 기능을 억제하는 중요한 조절 사이토카인이다. 또한, IL-10은 B 세포의 증식과 분화를 증대시킨다. IL-10 유전자 결핍성 뮤라인 모델에서는 염증성 장 질환 및 위장 종양이 자발적으로 발생된다. 무균(germ free) 동물에서는 질병이 발생되지 않기 때문에, 위장 미생물총은 이러한 질환 상태들의 병인과 관련되어 있다. IL-10 낫아웃 마우스는 IBD에 대한 새로운 치료 옵션을 평가하기 위해 널리 사용되고 있다.
6주령의 C57B6J IL-10-결핍 마우스 또는 야생형 마우스 (Charles River, Barcelona, Spain)는 격리소에서 특별한 병원균-결핍(SPF) 조건 하에 일정한 온도(22℃)에서 주야 12시간 주기 하에 사육하였다. 마우스는 멸균 식이(마우스 유지를 위한 AIN-93 기반의 식이는 12% 물, 14,5% 단백질, 4% 지방, 4,5% 섬유질 및 4,7% 회분(ash)로 구성됨; Harlan Interfauna Iberica S.A., Barcelona, Spain)와 음용수에 자유롭게 접근가능하게 하였다.
마우스는 3가지 그룹 중 한 그룹으로 할당하였다: a) 프로바이오틱 제형 I.3.1 (n=12 IL-10-/-; n=5 야생형); b) VSL#3 (n=12 IL-10-/-; n=5 야생형); 및 c) 비히클 (n=12 IL-10-/-; n=5 야생형). 그룹 "a" 및 "b"의 각 마우스에는 멸균 음용수(비히클) 중에 프로바이오틱 109 CFU로 매일 투여하였다. 프로바이오틱 무처리 마우스(위약군)에는 비히클만 투여하였다. 프로바이오틱스(또는 비히클)은 10주간 투여하였다. 임상 신호를 매일 모니터링하였다. 질환 활성 지수(Cooper H. S. et al., 1993)를 DSS-유발성 장 염증 모델에서와 같이 계산하였다(상기 참조).
16주령의 마우스는 흡입용 할로탄(Fluotane®, Zeneca Ltd, UK)을 마취 이상으로 과량 투여하여 희생시켰다. 동물의 대장 샘플을 회수하여 차가운 PBS로 헹구었다. 심장 천공에 의해 혈액 샘플도 채혈하여, 헤마토크릿 및 헤모글로빈 농도를 분석하였다(Coulter MaxM Analyzer with autoloader, Izasa, Spain). 대장 중량/길이 비를 기록하였다. 그런 후, 장을 액체 질소에서 냉동시키고, 사이토카인 IL-6 및 IFNγ를 DSS-유발된 장 염증 모델에서와 동일한 프로토콜을 이용하여 측정하였다(상기 참조).
B) 결과
질환 활성 지수
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물 처리군과 VSL#3 시판 제형 처리군 둘다에서는, 비히클 처리 대조군과 비교하여, 임상 증상의 개시가 유의하게 지연되었다(p < 0.01, Tukey-Kramer 사후 검정을 이용한 양측 ANOVA). 추가적으로, 처리군에서는 차이가 유의한 수준에 이르지는 않았지만 질환 활성 지수 스코어를 낮게 나타내는 경향이 있었다(데이타 미기재).
사이토카인 수준
다양한 사이토카인의 분석을 통해, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은, 비히클-처리 낫아웃 그룹(p < 0.01, Tukey-Kramer 사후 검정을 이용한 양측 ANOVA)과 시판 프로바이오틱 제형 VSL#3 (p > 0.05)와 비교하여, IFNγ 수준의 현저한 감소가 확인되었다. 실제, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, IFNγ 수준은 야생형 건강한 대조군에서와 동일한 수준에 도달하였다. 아울러, 도 6에서 유추되는 바와 같이, 결과들이 비히클 낫아웃 마우스 군들에서 큰 표준편차로 인해 유의성에 도달하진 못하였지만, IL-6 수준을 낮추는 프로바이오틱 제형의 뚜렷한 경향이 드러났다.
희생시킨 후 측정한 대장 점막 실험 종료시, 유의한 상관성은 임상 증상의 중증도(질환 활성 지수)와 IFNγ 수준 간에 확인되었다 (p < 0.05, 스피어만의 순위 검사) (데이타 미기재).
프로바이오틱 제형의 안전성
임상 신호(체중 감소, 이상 행태, 털 외양, 설사 및 혈변)를 본 발명이 프로바이오틱 제형, VSL#3 제형 또는 비히클을 10주간 매일 투약한 야생형 마우스에서 매일 모니터링하였다. 실험하는 동안에 사망 신호는 검출되지 않았다. 희생시 동물의 신체 전체 검시를 수행하였다. 모든 주요 강 및 장기의 분석에서 어떠한 병리학적 이상은 확인되지 않았다 (데이타 미기재).
12. IBS 개체에서의 생체내 효능
A) 방법
실험 설계
본 발명의 조성물의 효능을 조사하기 위한 다기관 무작위 배정된 이중 맹검의 위약 대조 임상 실험을 수행하였다.
하이드록시메틸 프로필 셀룰로스 캡슐에, (1) 말토덱스트린 150 mg, (2) 마그네슘 스테아레이트 5 mg, (3) 실리콘 디옥사이드 5 mg, 및 (4) 본 발명의 균주 3종 1:1:1 혼합물 200 mg(농도 5 x 1010 cfu/캡슐)을 채워넣었다. 또한, 본 발명의 조성물을 제외시키고, 상기와 동일한 부형제와 양으로 위약을 제조하였다. 실험 전체 동안의 캡슐제의 내용물은 5 x 1010 내지 1 x 1010 cfu의 범위이다.
과민성 장 증후군에 대한 로마 III 기준(Longstreth G. F. et al., 2006)을 만족시키는 양 성별의 적합한 성인 환자들 33명을 리스트에 등록하여, 6주간 다음과 같은 처리군 중 한 그룹으로 무작위 할당하였다: a) 본 발명의 조성물이 함유된 캡슐 매일 1회 (n = 18); 및 b) 위약 매일 1회 (n = 15). 실험은 임상 실험에 대한 헬싱키 선언에 준하여 수행하고, 적절한 윤리 위원회로부터 승인받았다.
효능 평가
본 실험의 일차 평가 항목(primary endpoint)은, IBS에 대한 특수 앙케이트: IBSQOL 앙케이트의 검증된 스페인 버전(Badia X. et al., 2000)을 이용하여 평가되는, 건강 관련 삶의 질(이하, "HRQOL"라 함)에 대한 전반적인 효과였다. 스페인 위장학 협회의 지침에 따라, 스코어를 0-100 스케일로 표준화하였다. 이차 평가 항목은 검증된 내장 민감성 지수 앙케이트(이하, "VIS"라 함)(Labus J. S. et al., 2004)를 이용한 위장 감각 및 증상 관련 불안 평가였다. 지원자들에게는 베이스라인(1일), 21일 및 42일에 이러한 앙케이트를 채우도록 요청하였다. 데이타는 분석 처리 의도에 따라 평가하였다. 결과는 도 7 및 8에 나타낸다.
B) 결과
베이스라인 특징들
도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 베이스라인 특징들 측면에서 그룹 간에 유의한 차이는 입증되지 않았으며, 이는 양 그룹의 개체들이 평가한 변수들 측면에서 유사하다는 것을 시사한다. 또한, 그룹들은 베이스라인 표준 혈액 생화학적 파라미터, 인체측정학적 파라미터, 연령 및 성별 측면에서 유사하였다.
표 9: 치료 2 그룹들에서의 베이스라인 스코어
| 그룹 | 본 발명의 조성물이 함유된 캡슐 | 위약 (n=15) |
| IBSQOL | 45.7 ± 7.9 | 48.2 ± 19.2 |
| VSI | 34.9 ± 13.3 | 41.2 ± 11.8 |
건강 관련 삶의 질 개선 (도 7)
본 발명의 조성물은, 치료 21일 및 42일 후에 평가하였을 때, 위약 대비, 건강 관련 삶의 질을 유의하게 개선시켰다 (p < 0.05, T-test). 따라서, 본 발명의 조성물은 위약 효과에 비해 훨씬 높은 수준으로 유의하게 IBS 개체의 사망율을 낮추고 삶의 질을 개선시키는 것으로 확인되었다. 조성물의 긍정적인 효과로는 HRQOL의 앙케이트에서 음식물 관련 문제(food-related distress), 불안, 일상 생활 방해 및 수면 장애 범위를 포함한다. 이러한 스케일의 개선은 복통, 불편함 및 이상 장 행태의 감소를 시사한다. 이러한 결과는, 아는 한에서는, 프로바이오틱 조성물이 IBS 환자의 전반적인 건강 관련 삶의 질에 대해 유의한 효과를 나타냄을 최초로 입증한 것이다.
내장 민감성 지수의 개선 (도 8)
본 발명의 조성물은 위약에 비해 IBS 개체의 위장 증상-특이적인 내장 민감성을 유의하게 완화시켰다. 효과는 처리 21일째에 유의 수준에 근접하였고, 처리 42일 후에 명확하게 유의하였으며 (p < 0.01, T-검정), 이는 본 발명의 조성물이 IBS 치료에 유용함을 추가로 입증해준다. 가장 현저한 개선은 앙케이트의 복부 불편함과 팽창 관련 항목에서 관찰되었다. 특히, 표 10은, 치료 종료시, 팽창감 및 팽만감 관련 유의한 개선을 기록한 개체의 수를 나타낸다(팽창 및 팽만 관련 불안을 측정하는 VSI 앙케이트의 6 포인트 스케일에서, 베이스라인 대비 2 포인트 이상의 증가로 정의됨). 2가지 그룹 간의 차이는 통계적으로 유의하다 (p < 0.05, 피셔의 정밀 검사).
표 10. 치료 42일째, VSI 앙케이트에 따른 복부 팽창 및 팽만 관련 불안에 대한 효과
| 팽창 및 팽만 관련 불안 | 본 발명의 조성물이 함유된 캡슐 (n=18) | 위약 (n = 15) |
| 베이스라인 대비 개선을 기록한 개체 | 7 | 1 |
| 베이스라인 대비 개선을 기록하지 않은 개체 | 11 | 14 |
따라서, 수득된 결과들로부터, 본 발명의 조성물이 복부 팽창 및 팽만에 효과적인 것으로 결정되었다.
13. 복부 팽창 및 감소된 장 운동성에 대한 효과
25세 여성은 만성적인 복부 팽창 및 장 운동성 이상을 앓고 있었으며, 때로는 주 당 장 움직임이 거의 없는 것으로 기록되었다. 진단 결과, 위장관에 다른 구조적 이상의 증거는 없었고, 위의 저삼투압증 및 운동저하증이 확인되었다.
환자에게 1일 당 캡슐 1개를 처방받았다(실시예 12에 기술된 바와 같음). 치료 1주일 후, 환자에서는 복부 팽창 및 팽만의 유의한 감소와 장 행태의 정상화가 보고되었다. 수일간 치료를 중단한 후, 증상들이 다시 나타났다. 2일 마다 캡슐 1개의 형태로 치료를 다시 재개한 후, 환자에서는 팽창 및 장 거동 모두에 현저한 장기적인 양성 반응이 다시 보고되었다.
본 실시예는 과민성 장 증후군을 가진 것으로 분류되지 않는 개체에서 복부 팽창 및 장 운동성 이상을 치료하는 본 발명의 조성물의 용도를 뒷받침해준다.
SEQUENCE LISTING
<110> AB-Biotics S. A.
<120> PROBIOTIC COMPOSITION FOR USE IN THE TREATMENT OF BOWEL
INFLAMMATION
<130> P1509EP00
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> forward Eub27f primer
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse Eub1492r primer
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> forward 357f primer
<400> 3
cgcccgccgc gccccgcgcc cggcccgccg cccccgcccc cctacgggag gcagcag 57
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse 907r primer
<400> 4
ccgtcaattc ctttgagttt 20
Claims (23)
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7485, 및 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici) CECT 7483을 유효량으로 포함하는 프로바이오틱(probiotic) 조성물.
- 제1항에 있어서, 장 염증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 과민성 장 증후군의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 복부 팽만(abdominal distension) 및 팽창(bloating)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 유효량의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7485, 및 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici) CECT 7483과, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는,
장 염증, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 및 복부 팽만 및 팽창의 예방 또는 치료용 약제학적 제품. - 유효량의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7485, 및 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici) CECT 7483과, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는,
장 염증, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 및 복부 팽만 및 팽창의 예방 또는 치료용 수의학 제품. - 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 따른 조성물과, 기타 식용 성분을 포함하는 식용 제품.
- 제8항에 있어서, 식이 보조제(dietary supplement)인 것을 특징으로 하는 식용 제품.
- 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 따른 조성물을 포함하는 프로바이오틱(probiotic) 제품.
- 스페인 생물자원센터(Spanish Type Culture Collection)에 수탁번호 CECT 7484로 기탁된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주.
- 스페인 생물자원센터(Spanish Type Culture Collection)에 수탁번호 CECT 7485로 기탁된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주.
- 스페인 생물자원센터(Spanish Type Culture Collection)에 수탁번호 CECT 7483으로 기탁된 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici) 균주.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7485 또는 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici) CECT 7483을 출발 균주로서 사용하는 단계 및 돌연변이 유발을 적용하는 단계를 포함하며,
수득되는 돌연변이주는 상기 출발 균주의 항-염증 활성, 항-염증성 장 질환(IBD) 활성, 항-과민성 장 증후군(IBS) 활성 또는 항-복부 팽창 활성을 유지하거나 또는 강화된 것인,
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7484, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CECT 7485 또는 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici) CECT 7483의 돌연변이주를 수득하는 방법. - 삭제
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