TW201326395A - 具有大腸桿菌特異性的殺菌活性之新穎經單離的噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關一種具有大腸桿菌(E.coli)特異性殺菌活性之新穎噬菌體、一種包含該噬菌體作為活性成份供預防或治療由腸毒性大腸桿菌所引起傳染性疾病之組成物、一種包含該噬菌體作為活性成份之抗生素、一種包含該噬菌體作為活性成份之飼料添加劑組成物、一種包含該噬菌體作為活性成份之消毒劑或清潔劑、及一種使用該噬菌體治療大腸桿菌症之方法。本發明之新穎噬菌體具有針對病原性大腸桿菌之特異性殺菌活性，且具有極佳之抗酸性與抗熱性。因此，該新穎噬菌體可用於預防或治療豬之大腸桿菌症(其係一種由病原性大腸桿菌引起之傳染病)，且亦可廣泛用於動物飼料添加劑組成物、消毒劑及清潔劑中。

Description

具有大腸桿菌特異性的殺菌活性之新穎經單離的噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物
本發明係有關一種具有大腸桿菌(E.coli)特異性殺菌活性之新穎經單離的噬菌體，及含該噬菌體之抗菌組成物。
大腸桿菌係格蘭陰性之短桿型細菌，屬於大腸桿菌屬(Escherichia)及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，其出現在各種動物(包括哺乳動物)之腸道中為正常菌群之一部份。已知大多數大腸桿菌菌株為非病原性，且會造成機會性感染，但有些高病原性菌株則會造成哺乳動物(包括人類)各種不同腸道疾病及敗血症。其中會引起胃腸疾病之菌株依據其毒性主要分成6類：腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸病原性大腸桿菌(EPEC)、腸出血型大腸桿菌(EHEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、及壞死產毒性大腸桿菌(NTEC)。已知腸毒性大腸桿菌(ETEC)與豬之感染有關。通常，可藉由判別病原菌來診斷該疾病係由細菌或病毒感染所引起。然而，由於大腸桿菌存在於健康動物之腸道，因此很難早期診斷由大腸桿菌引起之疾病(韓國專利第963157 號)。
ETEC為一種格蘭陰性短桿狀細菌，且係具有周鞭毛之移動性或無鞭毛之非移動性。ETEC為好氧或兼性厭氧細菌，可從乳糖與果糖產生酸及氣體，並在一般培養基上，於7至48℃之溫度(最佳溫度為35至37℃)及pH 4.5至9.0下生長良好。ETEC產生之毒素類似霍亂毒素，且此毒素可分成熱敏感性內毒素(LT)(在60℃下加熱10分鐘即失去活性)及熱安定性內毒素(在100℃下加熱30分鐘仍展現抗性)。當感染時，會出現類似霍亂的症狀，並會在小腸上半段繁殖，且細菌濃度可達到每毫升107至108 cfu(菌落形成單位)，以致發生大腸桿菌傳染性疾病。
近來，由於趨向大規模合作養豬，豬之大腸桿菌症已成為養豬業常見且頻繁發生的問題(Park Young-il,Sun-Jin Publishing Co.353-359,1998)。韓國近來逐漸增加的豬大腸桿菌症病例已造成小豬因下痢而導致生長遲滯及死亡，造成農民重大經濟損失(Hong Eu-Chul,master's thesis,Dankook University,Addition Effect of Egg Yolk in Early Weaned Piglets,2001)。曾使用許多種抗生素來預防及治療豬大腸桿菌症，但誤用及濫用抗生素仍會產生豬之抗藥性及藥物殘留之重大問題。因此全世界有許多國家已限制使用抗生素(Mason HS等人之Trends in Biotech.13：388-392,1995)。
同時，噬菌體為一種僅感染特定細菌並控制細菌生長，且僅可在細菌宿主內部自行繁殖之特異化病毒。噬菌體係由呈單股或雙股DNA或RNA型式之遺傳物質所組成。依據其型態，噬菌體可分成肌尾噬菌體科(Myoviridae)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)、及短尾噬菌體科(Podoviridae)，其特徵分別為收縮尾、長型非收縮 尾、及短尾(Arch Virol(2001)146：843-857；Elizabeth Kutter等人之Bacteriophages Biology and Application；CRC press)。
發現噬菌體之後，最初曾致力將其應用在治療傳染性疾病。然而，相較於具有廣譜標靶之抗生素，噬菌體卻因其特異標靶範圍而被視為沒有必要。儘管如此，誤用及濫用抗生素導致對於有關抗生素抗性細菌及在食物中殘留抗生素之有害效應之擔憂增加(Cislo,M等人之Arch Immunol.Ther.Exp.1987.2：175-183；Kim sung-hun等人之Bacteriophage,New Alternative Antibiotics.BRIC)。
這些不斷增加之擔憂讓噬菌體重新受到重視。美國專利案第6,485,902(2002)號已揭示用於控制大腸桿菌(E.coli)O157：H7之七種噬菌體，且美國專利案第6,942,858號(核發給Nymox，2005)揭示用於控制各種微生物之兩種噬菌體。
為了克服因誤用或濫用廣譜性抗生素所引發之問題(如：抗生素抗性細菌與食物中之抗生素殘留)，本發明者已自天然來源單離出一種新穎噬菌體，其中該噬菌體對引發性畜主要疾病之大腸桿菌具有特異性殺菌活性。藉由其形態、生化與遺傳特性來判別，已發現該噬菌體除了優異之抗酸性與抗熱性外，亦對病原性大腸桿菌具有特異性殺菌活性。亦發現該噬菌體可應用於組成物中，供預防或治療牲畜中由病原性大腸桿菌所引起之傳染性疾病，及該噬菌體可應用於供有效預防與控制病原性大腸桿菌增生之各種不同產品，包括牲畜飼料添加劑、牲畜飲用水、畜棚消毒劑與肉品清潔劑。
本發明之一目的係提供一種對腸毒性大腸桿菌具有特異性殺菌活性之新穎噬菌體。
本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之組成物，供預防或治療由腸毒性大腸桿菌引起之傳染性疾病。
本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之抗生素。
本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之飼料添加劑組成物。
本發明另一目的係提供一種包含該噬菌體作為活性成份之消毒劑或清潔劑。
本發明另一目的係提供一種使用該噬菌體或該組成物治療大腸桿菌症之方法。
本發明之新穎噬菌體具有針對腸毒性大腸桿菌之特異性殺菌活性，且具有優異之抗酸性與抗熱性。因此，該新穎噬菌體可用於預防或治療豬之大腸桿菌症，其係由病原性大腸桿菌引起之傳染性疾病，該噬菌體亦可廣泛用於動物飼料添加劑組成物、消毒劑與清潔劑。
第1圖為Φ CJ13之電子顯微鏡影像；第2圖為經單離之噬菌體Φ CJ13之PFGE結果；第3圖為經單離之噬菌體Φ CJ13之SDS-PAGE結果；第4圖為噬菌體Φ CJ13之抗酸性分析結果； 第5圖為噬菌體Φ CJ13之抗熱性分析結果；第6圖為接受標準飼料且補充Φ CJ13餵養之離乳仔豬與僅接受標準飼料餵養之離乳仔豬在強迫餵食ETEC後之糞便堅硬度之比較；及第7圖為定量糞便中ETEC之即時PCR結果。
[最佳模式]
達成上述目的之一態樣中，本發明提供一種對腸毒性大腸桿菌(ETEC)具有特異性殺菌活性之新穎噬菌體。
本發明者從Chung Cheong省Hong sung-gun市Kwangcheon地區之Samhwa GPS Breeding Agri.Inc.收集糞便樣本，並從其中單離出可選擇性感染並溶解宿主細胞ETEC之噬菌體。在電子顯微鏡下檢視其外型，證實該噬菌體對腸毒性大腸桿菌具有特異性殺菌活性，其屬於短尾噬菌體科(Podoviridae)，具有由下列組成之型態特徵等軸長外鞘且沒有尾巴(第1圖)；總基因組大小約35 kbp；且由蛋白質型態分析測得其包括約43 kDa、38 kDa、34 kDa及33 kDa之主要結構蛋白質(第3圖)。此外，本發明噬菌體具有物種特異性，會選擇性感染大腸桿菌中之ETEC(表1)。
此外，其遺傳特徵分析結果顯示，該噬菌體在總基因組中包括由SEQ ID NO.1至6代表之核酸分子。依據SEQ ID NO.1至6，與其他物種比較遺傳相似性。已發現隨各核酸片段而定，觀察到86%至100%之各種相似性，但沒有任何一種噬菌體與該所有片段出現100%相似性，此表示該噬菌體為新穎噬菌體(表2)。依據更詳細之遺傳特徵分析，已發現使用噬菌體特異性引子組(亦即SEQ ID NO.7與8、SEQ ID NO.9與10、SEQ ID NO.11與12、SEQ ID NO.13與14、SEQ ID NO.15與16、及SEQ ID NO.17與18)之PCR可產生特定大小之產物。
同時，當ETEC被該噬菌體感染時，會觀察到噬菌斑(宿主細胞被一個噬菌體溶解後在軟洋菜盤上留下之透明區)並具有相同大小及濁度，此表示該噬菌體會藉由溶解ETEC來抑制ETEC生長。藉由檢視該噬菌體在各種不同溫度及pH條件下之安定性，已發現該噬菌體於pH 3至pH 10之寬廣pH範圍環境及40℃至60℃之溫度環境係安定，尤其是，其在高溫具有抗熱性(第5圖)。此等ETEC特異性殺菌活性其抗酸性與抗熱性之性質，使得本發明噬菌體可以在製造預防或治療豬之ETEC所介導疾病之組成物，及包含該噬菌體作為活性成份之各種不同產品時，可應用於各種不同溫度及pH條件下。
因此，本發明者將對ETEC具有特異性殺菌活性及上述特徵之噬菌體稱為"噬菌體Φ CJ13"，且於2011年11月7日寄存在韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms(361-221,Honje 1,Seodaemun,Seoul))，登錄號KCCM11217P。
達成上述目的之另一態樣中，本發明提供一種供預防或治療由腸毒性大腸桿菌(ETEC)所引起之傳染性疾病之組成物，其包含該噬菌體作為活性成份。
本發明噬菌體具有對抗ETEC之特異性殺菌活性，可用於預防或治療由ETEC所引起之疾病。較佳者，其實例包括由ETEC引起之豬大腸桿菌症，但不限於此。
本文所採用術語"大腸桿菌症"係指病原性大腸桿菌感染牲畜 所引起之疾病，其症狀為如：敗血病、下痢(新生兒下痢及離乳後下痢)、及毒血症(水腫及腦脊髓血管病變)。其中敗血病為急性全身性感染，經常發生在出生2至3天之新生仔豬，且具有高死亡率。下痢為最常見胃腸道感染之結果，發生在出生後1至2週內之哺乳期，及在離乳期後立即發生，並會造成死亡或生長遲滯。毒血症發生在離乳期後之8至12週大仔豬，並伴隨出現水腫及神經症狀，接著會猝死。
本文所採用術語"預防"係指藉由投與該噬菌體或該組成物來限制或延滯疾病進展之所有作用，且術語"治療"係指藉由投與該噬菌體或該組成物使病症好轉或受到限制或達成有利修飾之所有。
本發明組成物之Φ CJ13含量為5×102至5×1012 pfu/ml，較佳含量為1×106至1×1010 pfu/ml。
另一方面，本發明組成物可進一步包括醫藥上可接受之載劑。
本文所採用術語"醫藥上可接受之載劑"係指不會對生物體引起顯著刺激且不會影響所投與化合物之生物活性與性質之載劑或稀釋劑。調配該組成物為液態製劑時，可使用生理食鹽水、無菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)、緩衝生理食鹽水、白蛋白輸液、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、及其中一或多種之混合物作為無菌且生物上可相容之醫藥上可接受之載劑。若必要時，可添加其他習知之添加劑，如：抗氧化劑、緩衝劑與制菌劑。此外，可額外添加稀釋劑、分散劑、介面活性劑、結合劑與潤滑劑至組成物中，以製成注射用製劑，如：水溶液、懸浮液與乳液，或口服製劑，如：丸劑、膠囊、粒劑或錠劑。
本發明預防性或治療性組成物可施用或噴灑至患部，或經口或非經腸式途徑施用。該非經腸式投藥法可包括經靜脈內、腹膜內、肌內、皮下或局部投藥。適合塗覆、噴灑或投與本發明組成物之劑量將隨各種因素而定，包括調配方法、投藥模式、患者之年齡、體重、性別、病症、及所治療患者或動物之飲食、投藥時間、投藥途徑、排泄速率、及反應敏感度。熟悉此相關技術之醫師或獸醫很容易決定及處方所需組成物之有效量。
包括本發明組成物作為活性成份之口服劑型實例包括錠劑、含片、口含錠、水性或乳化懸浮液、粉劑或粒劑、乳液、硬式或軟式膠囊、糖漿或酏劑。對於如錠劑與膠囊之製劑而言，適合使用下列：結合劑，如：乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、支鏈澱粉、纖維素或明膠；賦形劑，如：磷酸二鈣；崩解劑，如：玉米澱粉或甘藷澱粉；與潤滑劑，如：硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂基富馬酸鈉、或聚乙二醇蠟。膠囊中除了上述化合物外，可進一步使用液態載劑，如：脂質。
包括本發明組成物作為活性成份之非經腸式劑型可調配成經由皮下、靜脈內或肌內途徑之注射劑、栓劑、或經由呼吸道之吸入式噴液，如：氣霧劑。注射劑型之製法可由本發明組成物與安定劑或緩衝劑共同溶解或懸浮於水中，並取該溶液或懸浮液裝入安瓿或小瓶單位劑型中。噴灑液(如：氣霧劑)中可使用供噴灑水分散性濃縮劑或濕化粉劑用之推進劑組合上添加劑。
另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種包含該噬菌體作為活性成份之抗生素。
本文所採用術語"抗生素"係指任何施用至動物以殺死病原菌 之藥物，且在本文中作為抗菌劑、殺菌劑與抗細菌藥劑之通稱名詞。
該動物可為哺乳動物，包括人類。
不同於習知之抗生素，本發明噬菌體可有效殺死腸毒性大腸桿菌，且不會誘發耐藥性或抗藥性，因此可提供作為具有相對長生命循環之新穎抗生素。
另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種包含本發明噬菌體作為活性成份之飼料添加劑組成物。
畜牧業與漁業所使用之飼料添加用抗生素係用於預防感染。然而，目前可取得之大多數飼料添加用抗生素容易誘發抗藥性菌株之問題，且可能隨殘留在牲畜產品中而轉移至人體。吸收此等殘留抗生素可能造成人類病原菌亦對抗生素產生抗性，造成疾病傳播。此外，由於有許多種飼料添加用抗生素，因此全球日益增加之多重抗藥性菌株之出現為嚴重問題。因此，可使用本發明噬菌體作為飼料添加用抗生素，其對生態較環保且可以解決已知抗生素的上述問題。
本發明飼料添加劑組成物可製成包含該噬菌體之組成物，然後在即將餵食前才與飼料混合，或可直接加至飼料之製造過程中。本發明噬菌體可呈液體或乾燥型式(較佳呈乾燥粉末)包含在動物飼料中。乾燥過程可採用風乾法、天然乾燥法、噴霧乾燥法與冷凍乾燥法進行，但不限於此。本發明噬菌體可呈粉末型式添加，其添加量佔動物飼料重量之0.05至10重量%，較佳為0.1至2重量%。動物飼料中除了本發明噬菌體外，亦可包括可供長期防腐之其他習知添加劑。
本發明之飼料添加劑亦可額外包括其他非病原性微生物。該可使用之額外微生物可選自下列各物所組成群組：可產生蛋白酶、脂酶與轉化酶之枯草桿菌(Bacillus subtilis)、具有生理活性且在厭氧條件下(如：牛胃中)具有分解有機物質功能之乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)菌株、可提高家畜體重、增加乳產量及促進飼料消化與吸收之絲狀真菌(包括米麴菌(Aspergillus oryzae))(J Animal Sci 43：910-926,1976)、與酵母，包括釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)(J Anim Sci56：735-739,1983)。
包括本發明Φ CJ13之飼料可包括植物性飼料，如：穀粒、堅果、食品副產物、海藻、纖維、藥物副產物、油類、澱粉、磨粉、穀類副產物，及動物性飼料，如：蛋白質、無機物、脂肪、礦物質、單細胞蛋白質、浮游動物與食品廢棄物，但不限於此。
包括本發明Φ CJ13之飼料添加劑可包括結合劑、乳化劑、與用於預防品質損壞之防腐劑、胺基酸、維生素、酵素、益生菌、調味劑、非蛋白質態氮、矽酸鹽、緩衝劑、著色劑、供改善效率之抽出物與寡醣，及其他飼料預混合物，但不限於此。再者，供應與本發明噬菌體混合之飲用水可降低牲畜腸內之ETEC數量，藉以得到無ETEC之牲畜。
另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種包含該噬菌體作為活性成份之消毒劑或清潔劑。
為了移除ETEC，包含該噬菌體作為活性成份之消毒劑亦可噴灑及施用在牲畜活動之任何區域、屠宰場、牲畜死亡地點、烹煮空間及烹煮設備，但不限於此。再者，包含該噬菌體作為活性成份之清潔劑可用在已感染或可能感染ETEC之活動物體之皮膚及 身體表面。
另一個達成上述目的之態樣中，本發明提供一種使用本發明噬菌體或組成物治療由腸毒性大腸桿菌(較佳指ETEC)引起之傳染性疾病之方法。
詳言之，本發明之治療方法包括將醫藥上有效量之噬菌體或組成物投與患有由病原性大腸桿菌(較佳指ETEC)所引起之傳染性疾病之個體之步驟。本發明之噬菌體或組成物可呈醫藥製劑型式投與動物或可呈飼料添加劑組成物型式以與動物飼料或飲用水混合之混合物讓動物食入。只要其可到達目標組織，不論口服或非經腸式，任何途徑均可用於投與本發明噬菌體或組成物。詳言之，本發明組成物可依典型方式，經由任何途徑投藥，如：經口、直腸、局部、靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、穿皮式、鼻內、與吸入途徑。熟悉此相關技術者咸了解，利用治療法投與本發明噬菌體或組成物之每日總劑量應由醫師透過適當醫學判斷來決定。較佳者，針對特定患者之治療有效量可能隨醫學技藝習知之各種不同因素變化，包括所要達成反應之種類與程度、患者之條件，如：年齡、體重、健康狀態、性別與飲食、投藥時間與途徑、組成物之分泌速率、治療之時間期、依據是否同時使用其他藥劑之具體組成物，等等。
[發明模式]
下文將參照實例更詳細說明本發明。然而，此等實例僅供說明用，且本發明不侷限於此等實例。
實施例1：感染腸毒性大腸桿菌之噬菌體之單離法
實施例1-1：噬菌體篩選法與單一噬菌體單離法
從Chung Cheong省Hong sung-gun市Kwangcheon地區之Samhwa GPS Breeding Agri.Inc.收集雞糞與環境樣本，取50 mL樣本於4000 rpm下離心10分鐘。然後，使用0.45 μm過濾器過濾上清液，製成樣本溶液，並用於軟瓊脂覆層法。
詳言之，取18 mL樣本濾液與150μl腸毒性大腸桿菌(ETEC,SNU0105)振盪培養溶液(OD600=2)及2 mL 10×LB培養基(蛋白腖10 g/L、酵母抽出物5 g/L與NaCl 10 g/L)混合。將混合物於30℃下培養18小時，該培養溶液於4000 rpm下離心10分鐘。上清液使用0.45μm過濾器過濾。混合3mL 0.7%瓊脂(w/v)與150μl ETEC(SNU0105)振盪培養溶液(OD600=2)，加入LB培養皿中，使其固化。於其上塗開10μl培養基濾液，於30℃下培養18小時，觀察噬菌斑之形成。
單一噬菌斑代表一個噬菌體，且因此可從噬菌斑單離出單一噬菌體。詳言之，取一個噬菌斑加至400μl SM溶液(NaCl，5.8 g/L；MgSO47H2O，2 g/L；1 M Tris-Cl(pH 7.5)50 ml)，於室溫下靜置4小時，以單離出噬菌體溶液。隨後取100μl噬菌體溶液，與12mL 0.7%(w/v)瓊脂及500μl ETEC(SNU0105)振盪培養溶液(OD600=2)混合，隨後，於直徑150 mm之LB培養皿上進行軟瓊脂覆層法。當完成溶菌作用後，添加15 mL SM溶液至LB培養皿。將培養皿於室溫下靜置4小時，得到噬菌體溶液。
回收溶液，於其中添加1%(v/v)氯仿，均勻混合10分鐘。將溶液於4000 rpm下離心10分鐘。使用0.45 μm過濾器過濾所得上清液，得到最終樣本。
實施例1-2：噬菌體之大規模培養及純化
使用ETEC(SNU105)大量培養得自實施例1-1之噬菌體，並自其中純化該噬菌體。
詳言之，將ETEC(SNU105)振盪培養，取一份1.5×1010 cfu於4000 rpm下離心10分鐘，取集結粒再懸浮於4 ml SM溶液中。接種1.5×1010 pfu噬菌體，滴定至MOI(感染倍數)為0.0001，並置於室溫下20分鐘。隨後接種溶液至150 ml LB培養基中，於30℃下培養5小時。培養完畢後，添加氯仿至最終體積為1%(v/v)，攪拌培養溶液20分鐘。添加限制酶DNase I與RNase A至最終濃度分別為1μg/ml。溶液置於30℃下30分鐘。然後添加NaCl與PEG(聚乙二醇)至最終濃度分別為1 M與10%(w/v)，並再置於4℃下3小時。將溶液於4℃與12,000 rpm下離心20分鐘，得到集結粒。取集結粒再懸浮於5 mL SM溶液中，置於室溫下20分鐘。添加4 mL氯仿並混合均勻，隨後於4℃與4000 rpm下離心20分鐘。使用0.45μm過濾器過濾上清液，藉由甘油密度梯度超離心法純化噬菌體(密度：40%，5%甘油，於35,000 rpm與4℃下1小時)。
本發明者將該噬菌體稱為"噬菌體Φ CJ13"，其中該具有對抗ETEC之特異性殺菌活性及上述特徵之噬菌體係自雞屠宰場之糞便樣本中單離出，並於2011年11月7日寄存在韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms(361-221,Honje 1,Seodaemun,Seoul))，登錄號KCCM11217P。
實施例2：Φ CJ13感染大腸桿菌之檢測法
為了分析實施例1所純化之噬菌體Φ CJ13對ETEC(SNU105)以外之大腸桿菌菌種之溶菌活性，試圖以其他大腸桿菌菌種進行交叉感染。
詳言之，培養兩種ETEC(SNU105)及ETEC(CANRO8)及八種非病原性大腸桿菌(DH5a、MC4100、Rosetta(DE3)、GM2929、K12G、W3110、BL21(DE3)、Tuner(DE3))，以得到培養溶液。採用各培養溶液及經純化之Φ CJ13進行軟瓊脂覆層法，並檢測所形成之噬菌斑(表1)。
* 'SNU'來源：首爾國立大學獸醫醫學院(College of Veterinary Medicine,Seoul National University)
* 'CAN'來源：加拿大葛樂福大學(University of Guelph in Canada)
如表1所示，實施例1所純化之噬菌體Φ CJ13沒有對非病原性大腸桿菌展現溶菌活性。
實施例3：Φ CJ13之型態
取實施例1所純化之Φ CJ13以0.01%明膠溶液稀釋，然後於2.5%戊二醛溶液中固定。取樣本滴在塗覆碳之雲母板(約2.5×2.5 mm)上，調適10分鐘，以無菌蒸餾水洗滌。將碳膜裝置在銅網格上，使用4%乙酸鈾染色30至60秒，及乾燥。在JEM-1011穿透式電子顯微鏡下檢視(80 kV，放大倍數×120,000~×200,000)(第1圖)。第1圖為Φ CJ13之電子顯微鏡照片。發現該經純化之Φ CJ13之型態類型屬於短尾噬菌體科(Podoviridae)，其特徵在於等軸外鞘且沒有尾巴。
實施例4：Φ CJ13之總基因組DNA大小之分析
自實施例1所純化之Φ CJ13中萃取基因組DNA。
詳言之，在經純化之Φ CJ13培養溶液中添加20 mM EDTA、50 μg/ml蛋白酶K與0.5%(w/v)SDS，然後於50℃下培養1小時。添加等體積酚(pH 8.0)，並混合均勻。於室溫與12,000 rpm下離心10分鐘後，取上清液與等體積PC(酚：氯仿=1：1)均勻混合。再次於室溫與12,000 rpm下離心10分鐘。然後將所得上清液與等體積氯仿混合，隨後於室溫與12,000 rpm下離心10分鐘。取所得之上清液依序與10%(v/v)之3M乙酸鈉及2份體積之冷95%乙醇混合，置於-20℃下1小時。於0℃與12,000 rpm下離心10分鐘後，得到集結粒，取DNA集結粒溶於50μL TE緩衝液(Tris-EDTA(pH 8.0))，並測定其濃度。取1μg DNA裝載至1% PFGE(脈衝場凝膠電泳)瓊脂凝膠上，於室溫下，使用BIORAD PFGE系統程式7進行電泳20小時(大小範圍25至100kb；時間切換梯度0.4至2.0秒，直線形狀；前向電壓180V；反向電壓120 V(第2圖)。第2圖為噬菌體Φ CJ13之基因組DNA之電泳結果，其顯示其大小為約35 kbp。
實施例5：Φ CJ13之蛋白質型態分析法
取15μL效價為101wpfu/ml之經純化Φ CJ13溶液與3μL 5×SDS樣本溶液混合，加熱5分鐘。進行15% SDS-PAGE(第3圖)。第3圖為噬菌體Φ CJ13之SDS-PAGE結果。如第3圖所示，在43 kDa、38 kDa、34 kDa與33 kDa處檢測到主要蛋白質。
實施例6：Φ CJ13之遺傳分析
為了進行實施例1所純化之Φ CJ13之遺傳分析，取5 μg Φ CJ13之基因組DNA以限制酶EcoR V、ScaI與NruI，及PvuII、HincII與StuI進行雙重分解。以限制酶SmaI分解載體pCL1920(Promega)，然後以CIP(仔牛腸鹼性磷酸酶)處理。該經分解之基因組DNA以3：1之比例與載體混合，於16℃下黏合5小時。所得重組載體轉形至大腸桿菌(E.coli)DH5 α中，然後塗覆在包含胺苄青黴素(ampicillin)與X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-哌喃半乳糖苷)之LB培養皿上，供選擇藍色/白色菌落。選擇2個菌落，並於包含胺苄青黴素之培養基中振盪培養16小時。然後使用質體純化套組(Solgent)萃取質體。
使用正向M13及反向M13引子組進行PCR，並僅選拔大小為1 kb或更長之嵌段，以證實選殖之質體。使用正向M13及反向M13引子組分析其鹼基序列(表2)。
實施例7：Φ CJ13-特異性引子序列之設計
為了判別Φ CJ13，設計Φ CJ13-特異性引子。
詳言之，分別依據SEQ ID NO.1與2，構築引子組SEQ ID NO.7與8，及SEQ ID NO.9與10。再者，分別依據SEQ ID NO.3、4、5與6，構築引子組SEQ ID NO.11與12、SEQ ID NO.13與14、SEQ ID NO.15與16、及SEQ ID NO.17與18。進行PCR。添加0.1μg噬菌體之基因組DNA及0.5 pmol各引子至預混合物(Bioneer)中，調整最終體積至20μL。PCR如下進行30次循環： 變性：94℃，30秒；黏合：60℃，30秒；及聚合：72℃，1分鐘。結果使用引子組SEQ ID NO.7與8、SEQ ID NO.9與10、SEQ ID NO.11與12、SEQ ID NO.13與14、SEQ ID NO.15與16、及SEQ ID NO.17與18所得到之PCR產物大小分別為約170 bp、180 bp、200 bp、205 bp、240 bp及200 bp。
實施例8：噬菌體之pH安定性
為了測定Φ CJ13是否可在豬胃之低pH環境下存活且具安定性，在寬廣之pH範圍下分析Φ CJ13(pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0、9.8與11.0)。製備各種不同pH溶液(乙酸鈉緩衝液(pH 2.1、pH 4.0、pH 5.5與pH 6.4)、檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5、pH 3.0，與pH 3.5)、磷酸鈉緩衝液(pH 6.9與pH 7.4)與Tris-HCl(pH 8.2、pH 9.0、pH 9.8與pH 11.0))使濃度為0.2 M。各pH溶液取90μL，與10μL噬菌體溶液(1.0×1011 pfu/mL)混合，以產生濃度1M之各pH溶液，然後於室溫下培養2小時。反應溶液經過連續稀釋，各10μL稀釋液於37℃下培養18小時，進行軟瓊脂覆層法，來測定噬菌體溶菌物之效價(第4圖)。第4圖為該噬菌體Φ CJ13之抗酸性分析結果。如第4圖顯示，相較於對照組，該噬菌體Φ CJ13在pH 3.0至pH 10之間仍未喪失其活性，並仍保持安定。
實施例9：噬菌體之熱安定性
為了作為飼料添加劑使用，分析該噬菌體對調配過程中所產生熱之安定性。因此，取100μL Φ CJ13溶液(效價1.0×108 pfu/mL)於40℃、50℃、60℃、及70℃下培養0分鐘、30分鐘、60分鐘與120分鐘。連續稀釋溶液，各10μL稀釋液，採用軟瓊脂覆層 法，於30℃下培養18小時，以測定噬菌體溶菌物之效價(第5圖)。第5圖為該噬菌體Φ CJ13之抗熱性分析結果。如第5圖所示，該噬菌體Φ CJ13即使曝露在50℃長達2小時仍維持其活性，但當曝露在60℃ 30分鐘或更久時，其活性會隨時間下降。
實施例10：噬菌體對野生型ETEC之感染範圍
實驗中除了使用ETEC(SNU105)外，亦分析Φ CJ13對10種野生型ETEC菌株(來自韓國首爾國立大學獸醫醫學院(College of Veterinary Medicine,Seoul National University)及加拿大葛樂福大學(University of Guelph in Canada))之溶菌活性。取各菌株150μL振盪培養溶液(OD600=2)混合，滴加10μL Φ CJ13溶液(效價108 pfu/mL)，採用軟瓊脂覆層法，於30℃下培養18小時，以觀測噬菌斑之形成(表3)。
* 'SNU'來源：首爾國立大學獸醫醫學院(College of Veterinary Medicine,Seoul National University)
* 'CAN'來源：加拿大葛樂福大學(University of Guelph in Canada)
如表3所示，該噬菌體對ETEC O-血清型O149(SNU107、SNUF4、SNUJG280、CAN3220、SNUR08)(其係最常見之豬下痢原因)及F-血清型K88(SNU105、SNU107、SNU160、SNU162、SNU193、SNUF4、CAN3220、SNUR08、SNUJG280)、K99(SNU2618)展現感染力，因此預期應用該噬菌體時將會展現優異之效力。
實施例11：ETEC噬菌體於離乳仔豬之飼料中之利用性
取50隻25天大之離乳仔豬(Landrace X Yorkshire)，且經過粗觀檢查及臨床診斷(下痢、抑鬱，等等)判定為ETEC抗原陰性之健康仔豬，並依據體重與性別分開進行糞便PCR。該實驗進行14天。
首先，取ETEC菌株接種在TSB中，並於37℃下培養18小時。培養溶液使用PBS(PH 7.2)稀釋，並調整該效價至108 pfu/ml，在實驗開始7天後，使用探針經口投與5週大仔豬。從實驗第一天開始，該噬菌體處理組每天早晚在固定時間點餵食1 g噬菌體(106 pfu/g或108 pfu/g)/1 kg飼料之飼料混合物，一天兩次。該噬菌體對照組則僅在相同時間餵食標準飼料(第6圖及第7圖)。
首先，第6圖為餵食標準飼料且補充Φ CJ13之離乳仔豬與僅餵食標準飼料之離乳仔豬在強迫餵食ETEC後之糞便堅硬度得分之比較。未強迫餵食ETEC菌株之離乳仔豬則定義為負對照組。被強迫餵食ETEC菌株(1.0x108 pfu/ml)並僅餵食標準飼料餵養之離乳仔豬則定義為正對照組。在餵食ETEC菌株前7天開始，該實驗組餵食補充該噬菌體之飼料。餵食補充該噬菌體之飼料之離乳仔豬之糞便堅硬度得分低於僅餵食標準飼料組。如第6圖所示，糞便堅實度得分係依據Sherman等人(1983)所採用之下列指數(正常糞便，0；軟便，1；流體下痢，2；嚴重下痢，3)。餵食該ETEC 噬菌體之正對照組(在餵食ETEC後餵食標準飼料)的糞便堅硬度得分高，但餵食補充該噬菌體飼料實驗組則直到第3至4天才出現高糞便堅硬度得分，然後即恢復正常。
第7圖為定量糞便中ETEC之即時PCR。在餵食補充該噬菌體飼料之離乳仔豬糞便中觀察到之ETEC含量低於僅餵食標準飼料之離乳仔豬。如第7圖所示，定量糞便中ETEC之即時PCR結果顯示，餵食該噬菌體之實驗組之糞便中之ETEC含量低於正對照組。
實施例12：離乳仔豬之腸絨毛長度
通常，曝露於ETEC之仔豬的特徵在於其腸絨毛比正常仔豬短，並出現水份吸收異常，造成下痢(Gaastra W.等人之Microbial Rev.46,129-161,1982)。依據此等現象，檢測Φ CJ13對曝露於ETEC之仔豬之腸絨毛長度的影響。
在完成實施例11之實驗後，麻醉實驗用仔豬，各收集3 cm十二指腸、空腸、迴腸及結腸組織，並固定在10%標準(normal)福馬林中48小時。經過一般組織處理過程後，將組織包埋在石蠟中，切片成3-μm厚度。組織切片經過解封蠟及復水後，使用H&E(蘇木精與伊紅)染色。隨後，測定絨毛高度及腺窩長度，以分析腸之型態。此時，為了測定絨毛高度及腺窩長度，採用數字圖像採集照像系統(spot diagnostic insight)(Olympus,USA))，從左至右及上至下取得染色之十二指腸、空腸及迴腸組織切片之影像。測定絨毛高度(V)、腺窩深度(C)、及絨毛高度與腺窩深度之比例(V/C比)，然後進行統計分析(表4)。
a,b,c：表示該數值具有高於標準差範圍之顯著性差異
如表4所示，該ETEC攻毒組(正對照組)之十二指腸比未攻毒之負對照組具有較短的絨毛及較深的腺窩(P<0.05)。以該噬菌體(1E+8)處理組之空腸中絨毛長度為128.5μm，此表示比ETEC攻毒之正對照組之52.5μm更長(P<0.05)。腺窩深度之間沒有顯著差異。該噬菌體(1E+6)與(1E+8)處理組之V/C比分別為1.013及1.747，此表示該比例顯著高於ETEC攻毒之正對照組之0.885。該噬菌體(1E+8)處理組之比例高於該噬菌體(1E+6)處理組(P<0.05)。該噬菌體(1E+6)處理組與該噬菌體(1E+8)處理組之迴腸V/C比分別為1.235及1.868，此表示其顯著高於正對照組之0.804(P<0.05)。考量該等健康仔豬具有長絨毛，發現該噬菌體具有顯著效力。
<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CHEILJEDANG CORPORATION)
<120> 具有大腸桿菌特異性的殺菌活性之新穎經單離的噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物
<130> OPA12123
<150> 10-2011-0118446
<151> 2011-11-14
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
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該代表圖無元件符號及其代表之意義。

Claims (8)

  1. 一種對腸毒性大腸桿菌具有特異性殺菌活性之噬菌體，登錄號KCCM11217P。
  2. 一種預防或治療由腸毒性大腸桿菌所引起之傳染性疾病之組成物，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中該由腸毒性大腸桿菌所引起之傳染性疾病為大腸桿菌症。
  4. 一種抗生素，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
  5. 一種飼料添加劑組成物，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
  6. 一種消毒劑或清潔劑，其包含如申請專利範圍第1項所述之噬菌體作為活性成份。
  7. 一種治療大腸桿菌症之方法，其包括對有此需要之哺乳動物(不包括人類)投與如申請專利範圍第1項所述之噬菌體或如申請專利範圍第2或3項所述之組成物。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該哺乳動物為豬。
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