CN110179833A - 一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，采用能引起石斑鱼溃疡的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，最后通过冷冻干燥制备获得。本发明还公开了制剂的制备方法及应用。本发明的制剂可以通过稀释泼洒方式进行使用，对多种引起石斑鱼溃疡的病原菌有裂解作用，起到有效预防石斑鱼溃疡的发生，明显降低发病率。该噬菌蛭弧菌制剂对海水养殖动物皆可使用，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。

Description

一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂及其应用
技术领域
本发明涉及海水养殖的技术领域，具体涉及一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂和应用，主要运用于海水石斑鱼养殖过程中预防体表溃疡的发生。
背景技术
石斑鱼属鲈形目，石斑鱼属，是暖水性近海底层名贵鱼类。其生长速度快，肉质肥美鲜嫩，营养丰富，且石斑鱼具有健脾、益气的药用价值。由于石斑鱼具有较高的经济价值，人工养殖石斑鱼规模也就越来越大。其中石斑鱼人工养殖过程病害问题也就日益严重。根据报道，目前石斑鱼养殖过程病害主要有细菌性、寄生虫与病毒性疾病。其中由细菌感染的体表溃疡，造成石斑鱼发病面积广、死亡率高。这已经对石斑鱼养殖产生了严重危害与影响。
在国内有很多的研究报道，导致石斑鱼体表溃疡的病原菌主要有溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌以及鳗弧菌等。其中，20世纪90年代，在海南地区就有关于石斑鱼皮肤溃疡病的相关报道。石斑鱼溃疡病发病几率高、致病性强，且死亡率高，这给养殖石斑鱼产业带来巨大的经济损失。而目前石斑鱼养殖户治疗该类疾病也主要是采用化学制剂类、抗生素类药物，该类药物不仅对环境造成一定的污染，还可能导致药物残留与造成病原微生物产生耐药性。因此研究一种具有绿色环保的，且能预防该类疾病的发生显得十分重要。
噬菌蛭弧菌是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌，宿主菌主要为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌与多种弧菌等革兰氏阴性病原菌。且对人与动物无害，近年来蛭弧菌相关制剂的研究，越来越受到人们的青睐。而在国内针对使用噬菌蛭弧菌来防治石斑鱼溃疡的相关文章与专利基本未见报道。
通过调研国内噬菌蛭弧菌相关专利文献，发现大部分噬菌蛭弧菌制剂一般采用活宿主菌大肠杆菌培养，其中存在几点缺陷，一方面培养结束后需要分离未裂解大肠杆菌，操作繁琐；另一方面活宿主菌若分离不干净，则存在安全隐患，可能会破坏环境，引入病原菌，不利于大规模使用蛭弧菌制剂；又一方面使用一种宿主菌培养长时间可能导致蛭弧菌功能缺失，对其他种病原菌侵染裂解能力下降或散失。而本发明的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其制备生产工艺通过巧妙合理设计，使得上述问题都得到很好的解决，同时制备获得的蛭弧菌制剂具有高活性，对多种病原菌能高效裂解、安全环保等特点。
发明内容
本发明目的是提供一种有效预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂和应用，以克服了传统多数采用单一宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且能保证无外入宿主病原菌污染水体。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，单一活性菌株宿主菌多次培养噬菌蛭弧菌后，会造成噬菌蛭弧菌侵染能力变的较为单一，且病原宿主菌若去除不干净造成水体污染。而若一直采用灭活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，则可能会造成噬菌蛭弧菌对活性宿主菌无侵染能力。
故本发明采用3种或者3种以上，能引起石斑鱼溃疡的病原菌作为宿主菌，采用多种宿主菌混合培养噬菌蛭弧菌，先采用活性宿主菌培养后，过滤除去未被裂解的病原菌后，再采用多种混合且灭活的宿主病原菌进行扩大培养。基于此，完成了本发明。
具体地，本发明的解决方案是：一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，采用能引起石斑鱼溃疡的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，最后通过冷冻干燥制备获得。
优选地，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
优选地，所述的噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*1010PFU/g以上。
优选地，所述多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。
优选地，所述冷冻干燥的冻干保护剂甘油为1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。
优选地，所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。
本发明还提供了一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂的制备方法，该方法是采用能引起石斑鱼溃疡的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，最后通过冷冻干燥制备获得。
优选地，所述制备的方法包括以下步骤：
(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，10g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌海水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；
(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌海水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃，离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；
(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌海水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；
(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得多种混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，可获得蛭弧菌，活菌数在1-8*1010PFU/mL；
(5)噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。
优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m3/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；
优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
优选地，步骤(5)所述冻干载体，按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备。
优选地，步骤(5)所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。
采用上述方案后，本发明至少有以下优点：
一、本发明为保证对石斑鱼溃疡有防治功能，故采用导致石斑鱼溃疡的病原菌作为宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且采用多种病原宿主菌混合培养；
二、本发明采用60-80℃，水浴10-30min，进行灭活宿主病原菌，既能有效保持宿主菌形态的完整性，利于噬菌蛭弧菌的生长繁殖，而且又能保证无活宿主菌给环境造成污染；
三、本发明在冻干预冻前再加入1-50％(v/v)灭活宿主菌液，让噬菌蛭弧菌侵入宿主菌胞内，在冻干过程中能对噬菌蛭弧菌起到保护作用；
四、利用本发明制备出来的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂具有高活性，高菌数(菌数可达1.0*1010PFU/g以上)，在使用上用小剂量就能达到防治病效果，使用成本低廉。
本发明制剂可以通过稀释泼洒方式进行使用，对多种引起石斑鱼溃疡的病原菌有裂解作用，起到有效预防石斑鱼溃疡的发生，明显降低发病率。该噬菌蛭弧菌制剂对海水养殖动物皆可使用，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明提供了由上述方法制备得到的预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂。
此外，本发明还提供了所述噬菌蛭弧菌制剂在石斑鱼养殖中防治体表溃疡疾病的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
所述哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌都是现有的常见菌种，可通过采购获得。比如，以下实施例和对比例中，哈维氏弧菌采购自广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.781；溶藻弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10889；副溶血弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC23924；创伤弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10383。
实施例1有效噬菌蛭弧菌分离试验
该实施例用于说明本发明噬菌蛭弧菌的来源及其获取方法。
在某石斑鱼养殖基地，取养殖海水于3000r/min离心5min，取上清液，用50mL三角瓶分装10mL，4小瓶，分别加入菌浓度为108CFU/mL的哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌富集培养，30℃，100r/min好氧培养48h。富集培养结束后采用海水琼脂双层平板分离检测，分别以哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌为宿主菌检验，平板在30℃培养2d，均出现多个透明噬菌斑。挑取多个上层噬菌斑培养基加入少量灭菌海水，旋涡震荡，使固体小块状培养基均匀分散于灭菌海水中。再通过各自扩大液体培养后，把这4种有效噬菌蛭弧菌混合在一起，即得到噬菌蛭弧菌悬浊液。
实施例2噬菌蛭弧菌菌液制备
该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌菌液及其制备方法。
本实施例所述噬菌蛭弧菌由实施例1提供。
1.灭活宿主菌浓缩液制备：分别接种哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌，于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，10g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，30℃好氧培养24h后，离心收集菌泥，混合后于60℃，水浴30min，冷却备用。
2.噬菌蛭弧菌菌液制备：取上述步骤1未灭活的混合宿主菌用灭菌海水稀释，使菌浓度在109CFU/mL接种噬菌蛭弧菌，于30℃，好氧培养48h。所得培养液于4000r/min，温度4℃离心15min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤。得到的滤液按5％接种量接入步骤1灭活后的混合宿主菌，于30℃，好氧培养24h，即获得蛭弧菌浓度为5.3*1010PFU/mL。
实施例3噬菌蛭弧菌制剂1的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，菌浓度约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝6％:94％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-40℃条件下，预冻3h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量7％，活菌数6.3*1010PFU/mL。
实施例4噬菌蛭弧菌制剂2的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，灭活菌浓约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝10％:90％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-30℃条件下，预冻5h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量7％，活菌数3.6*1010PFU/mL。
实施例5噬菌蛭弧菌制剂3的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，灭活菌浓约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入2％甘油，搅拌均匀，再与载体保护剂(以蔗糖:脱脂奶粉＝2％:98％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-30℃条件下，预冻5h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量7％，活菌数2.5*1010PFU/mL。
测试例1噬菌蛭弧菌制对体表创伤石斑鱼测试试验
大小一致，活跃健康的石斑鱼，规格在50g左右，在15个水族箱(100*55*50cm)里面，采用过滤海水养殖，每缸加海水约200L，每缸养殖10条，总共120条石斑鱼，设置5组试验组。试验前先将石斑鱼按分组后暂样7天，无任何异常后开始试验。取每条石斑鱼在相同部位拔出2片鱼鳞后放回鱼缸。在处理试验组中加入活性混合病原菌(哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌)，控制最终菌浓在102CFU/mL。第1组采用实施例3制备的噬菌蛭弧菌制剂；第2组采用实施例4制备的噬菌蛭弧菌制剂；第3组采用实施例5制备的噬菌蛭弧菌制剂；用量皆为1g/缸，化水稀释，每隔5天使用一次；第4组不添加噬菌蛭弧菌制剂作为处理对照组；第5组采用不添加病原菌与噬菌蛭弧菌制剂作为空白对照组。其中每组设3个平行组。养殖采用统一管理方式，连续观察2周石斑鱼健康状况。
表1试验期间石斑鱼伤口出现严重溃疡条数情况
试验表明，第4组/处理对照组病原菌感染的石斑鱼在6天后陆续发病，表现为拔掉鱼鳞伤口处红肿，并出现点状溃疡，发病石斑鱼表现反应迟钝、摄食量少，随着感染时间加长，伤口出现大面积溃疡，严重则死亡。其中第1组/实施例3、第2组/实施例4、第3组/实施例5这3组试验组石斑鱼有出现伤口红斑，但后期逐渐恢复正常，出现严重溃疡的第2组与第3组各1条。而第5组/空白对照组无外加病原菌感染，无加噬菌蛭弧菌制剂处理，也出现3条石斑鱼严重溃疡。
综上，本发明的噬菌蛭弧菌制剂可以有效预防石斑鱼的体表溃疡，大大降低溃疡的发病率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，采用能引起石斑鱼溃疡的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，最后通过冷冻干燥制备获得。
2.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
3.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述的噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*1010PFU/g以上。
4.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。
5.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述冷冻干燥的冻干保护剂甘油为1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。
6.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。
7.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，10g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌海水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；
(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌海水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃，离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；
(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌海水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；
(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得多种混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌，活菌数在1-8*1010PFU/mL；
(5)噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。
8.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m3/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；
优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
9.根据权利要求1所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(5)所述冻干载体，按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备；
优选地，步骤(5)所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种预防石斑鱼溃疡的噬菌蛭弧菌制剂在预防石斑鱼溃疡的应用。
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