CN110215466A - 一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂及其应用 - Google Patents

一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，采用能引起鳗鲡细菌性疾病的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。还公开了制剂的制备方法及应用。本发明制剂可以通过拌料喂食、稀释泼洒方式进行使用，对多种鳗鲡细菌性疾病的病原菌有裂解作用，起到有效预防鳗鲡细菌性疾病的发生，明显降低发病率，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。

Description

一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂及其应用
技术领域
本发明涉及淡水养殖的技术领域，具体涉及一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂和应用，主要运用于淡水鳗鲡养殖过程预防细菌性疾病的发生。
背景技术
鳗鲡为鳗鲡科动物，属鱼类，似蛇，但无鳞，一般产于咸淡水交界海域。成鳗生长快，外表圆碌碌，似圆椎形，色泽乌黑而令身，近年较多人工养殖，肉质爽脆。鳗鲡营养丰富，味道鲜美，少刺多肉，并具有清凉解暑、滋补强身的作用。鳗鲡的肉、骨、血、鳔等均可入药。其肉性味甘、平，有滋补强壮，去风杀虫之功效。入药对治疗肺结核经久不愈而造成的身体虚弱，结核发热，赤白带下，风湿，骨痛，体虚等症。故具有较高的经济价值、食用价值与药用价值。但由于鳗鲡很难进行人工育苗，故鳗鲡鱼苗价格高，导致养殖成本高。
在我国内中，鳗鲡养殖已有多年历史，尤其近十多年来，发展更加迅速。一般鳗鲡养殖密度大，一旦受病害，往往给养殖者造成巨大的经济损失。鳗鲡的常见疾病主要有细菌性、真菌性、寄生虫及其病毒性等，其中以细菌性疾病危害最为严重。国内报道最多的关于鳗鲡细菌性疾病的病原主要有气单胞菌、假单胞菌、鳗弧菌、爱德华氏菌与柱状屈桡杆菌为主。比如引起鳗鲡烂腮病的气单胞菌、柱状屈桡杆菌；引起鳗鲡败血症的气单胞菌、假单胞菌；引起鳗鲡红点病与肝肾病的爱德华氏菌等。
在国内中，针对鳗鲡细菌性疾病的预防或治疗，多数采用化学制剂类、抗生素类药物，该类药物不仅对环境造成一定的污染，还可能导致药物残留与造成病原微生物产生耐药性。而噬菌蛭弧菌是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌，宿主菌主要为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与弧菌等革兰氏阴性病原菌，且对人与动物无害，近年来蛭弧菌相关制剂的研究，越来越受到人们的青睐。而在国内针对使用噬菌蛭弧菌来防治鳗鲡细菌性疾病的相关文章与专利基本未见报道。
通过调研国内噬菌蛭弧菌相关专利文献，发现大部分噬菌蛭弧菌制剂一般采用活宿主菌大肠杆菌培养，其中存在几点缺陷，一方面培养结束后需要分离未裂解大肠杆菌，操作繁琐；另一方面活宿主菌若分离不干净，则存在安全隐患，可能会破坏环境，引入病原菌，不利于大规模使用蛭弧菌制剂；又一方面使用一种宿主菌培养长时间可能导致蛭弧菌功能缺失，对其他种病原菌侵染裂解能力下降或散失。而本发明的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其制备生产工艺通过巧妙合理设计，使得上述问题都得到很好的解决，同时制备获得的蛭弧菌制剂具有高活性，对多种病原菌能高效裂解、安全环保等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂和应用，以克服了传统多数采用单一宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且能保证无外入宿主病原菌污染水体。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，单一活性菌株宿主菌多次培养噬菌蛭弧菌后，会造成噬菌蛭弧菌侵染能力变的较为单一，且病原宿主菌若去除不干净造成水体污染。而若一直采用灭活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，则可能会造成噬菌蛭弧菌对活性宿主菌无侵染能力。
故本发明采用3种或者3种以上，能引起鳗鲡细菌性疾病的病原菌作为宿主菌，采用多种宿主菌混合培养噬菌蛭弧菌，先采用活性宿主菌培养后，过滤除去未被裂解的病原菌后，再采用多种混合且灭活的宿主病原菌进行扩大培养。基于此，完成了本发明。
本发明的解决方案是：一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，采用能引起鳗鲡细菌性疾病的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。
优选地，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
优选地，所述的噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*1010PFU/g以上。
优选地，所述冻干保护剂为甘油1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。
优选地，所述冷冻干燥处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。
优选地，所述的多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。
本发明还提供了一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂的制备方法，该方法是采用能引起鳗鲡细菌性疾病的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。
优选地，所述制备的方法包括以下步骤：
(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；
(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；
(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL，后于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；
(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌，活菌数在1-6*1010PFU/mL；
(5)噬菌蛭弧菌制剂的制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。
优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m3/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；
优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
优选地，步骤(5)所述冻干载体，按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备；
优选地，步骤(5)所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。
采用上述方案后，本发明至少有以下优点：
一、本发明为保证对鳗鲡细菌性疾病有防治功能，故采用导致鳗鲡常见细菌性疾病的病原菌作为宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且采用多种病原宿主菌混合培养；
二、本发明采用60-80℃，水浴10-30min，进行灭活宿主病原菌，既能有效保持宿主菌形态的完整性，利于噬菌蛭弧菌的生长繁殖，而且又能保证无活宿主菌给环境造成污染；
三、本发明在冻干预冻前再加入1-50％(v/v)灭活宿主菌液，让噬菌蛭弧菌侵入宿主菌胞内，在冻干过程中能对噬菌蛭弧菌起到保护作用；
四、利用本发明制备出来的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂具有高活性，高菌数(菌数可达1.0*1010PFU/g以上)，在使用上用小剂量就能达到防治病效果，使用成本低廉。
本发明制剂可以通过拌料喂食、稀释泼洒方式进行使用，对多种鳗鲡细菌性疾病的病原菌有裂解作用，起到有效预防鳗鲡细菌性疾病的发生，明显降低发病率，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明提供了由上述方法制备得到的预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂。
此外，本发明还提供了所述噬菌蛭弧菌制剂在鳗鲡养殖中防治细菌性疾病的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
所述鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌都是现有的常见菌种，可通过采购获得。比如，以下实施例和对比例中，鳗弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC24712；爱德华氏菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10630；铜绿假单胞菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10351；嗜水气单胞菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10868；创伤弧菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10383。
实施例1有效噬菌蛭弧菌分离试验
该实施例用于说明本发明噬菌蛭弧菌的来源及其获取方法。
取发病的鳗鲡肠道内容物加入适量无菌生理盐水，稀释震荡，于3000r/min离心5min，取上清液，用50mL三角瓶分装10mL，5小瓶，分别加入菌浓度为108CFU/mL的鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌富集培养，30℃，100r/min好氧培养48h。富集培养结束后采用自来水琼脂双层平板分离检测，分别以鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌为宿主菌检验，平板在30℃培养2d，均出现多个透明噬菌斑。挑取多个上层噬菌斑培养基加入少量灭菌生理盐水，旋涡震荡，使固体小块状培养基均匀分散于生理盐水中。再通过各自扩大液体培养后，把这5种有效噬菌蛭弧菌混合在一起，即得到噬菌蛭弧菌悬浊液。
实施例2噬菌蛭弧菌菌液制备
该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌菌液及其制备方法。
本实施例所述噬菌蛭弧菌由实施例1提供。
1.灭活宿主菌浓缩液制备：分别接种鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌，于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，30℃好氧培养24h后，离心收集菌泥，混合后于60℃，水浴30min，冷却备用。
2.噬菌蛭弧菌菌液制备：取上述步骤1未灭活的混合宿主菌用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在109CFU/mL接种噬菌蛭弧菌，于30℃，好氧培养48h。所得培养液于4000r/min，温度4℃离心15min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤。得到的滤液按5％接种量接入步骤1灭活后的混合宿主菌，于30℃，好氧培养24h，即获得蛭弧菌浓度为4.6*1010PFU/mL。
实施例3噬菌蛭弧菌制剂1的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，菌浓度约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入冻干保护剂2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝6％:94％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-40℃条件下，预冻3h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量6％，活菌数6.5*1010PFU/mL。
实施例4噬菌蛭弧菌制剂2的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，灭活菌浓约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入冻干保护剂2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝10％:90％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-30℃条件下，预冻5h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量7％，活菌数2.8*1010PFU/mL。
实施例5噬菌蛭弧菌制剂3的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，灭活菌浓约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入冻干保护剂2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝2％:98％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-30℃条件下，预冻5h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量8％，活菌数4.5*1010PFU/mL。
测试例1噬菌蛭弧菌制剂拌料饲喂鳗鲡测试试验
在某鳗鲡养殖场中，挑选12个养殖小塘，设置4组试验组。其中3小塘饲喂实施例3制备的噬菌蛭弧菌制剂，其中3小塘饲喂实施例4制备的噬菌蛭弧菌制剂，其中3小塘饲喂实施例5制备的噬菌蛭弧菌制剂，其中3小塘不饲喂噬菌蛭弧菌制剂，作为空白对照组。拌料量为每10g拌500kg鳗鲡饲料，每周拌料投喂2次。整个试验期间以30天为限，养殖采用统一管理方式，观察期间鳗鲡摄食及健康状况。
按照上述试验，观察1个月后，3组使用噬菌蛭弧菌制剂的试验组与空白对照组相比，鳗鲡幼鳗的存活率高，摄食旺盛，幼鳗不出现或极少条数出现细菌性病害。故本发明的噬菌蛭弧菌制剂能有效预防细菌性病害发生。
测试例2噬菌蛭弧菌制剂鳗鲡养殖稀释泼洒测试试验
在某鳗鲡养殖场中，挑选12个养殖小塘，设置4组试验组。其中3小塘泼洒实施例3制备的噬菌蛭弧菌制剂，其中3小塘泼洒实施例4制备的噬菌蛭弧菌制剂，其中3小塘泼洒实施例5制备的噬菌蛭弧菌制剂，其中3小塘不泼洒噬菌蛭弧菌制剂，作为空白对照组。泼洒量为每10g/亩，先用养殖水溶解稀释后全塘泼洒，每周使用2次。整个试验期间以30天为限，养殖采用统一管理方式，观察期间鳗鲡摄食及健康状况。
按照上述试验，观察1个月后，3组使用噬菌蛭弧菌制剂的试验组与空白对照组相比，鳗鲡幼鳗的存活率高，摄食旺盛，幼鳗不出现或极少条数出现细菌性病害。故本发明的噬菌蛭弧菌制剂能有效预防细菌性病害发生。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，采用能引起鳗鲡细菌性疾病的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。
2.根据权利要求1所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
3.根据权利要求1所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述的噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数达1.0*1010PFU/g以上。
4.根据权利要求1所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述冻干保护剂为甘油1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。
5.根据权利要求1所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述的多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。
6.根据权利要求1所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述冷冻干燥处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。
7.根据权利要求1所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；
(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；
(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL，后于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；
(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌，活菌数在1-6*1010PFU/mL；
(5)噬菌蛭弧菌制剂的制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。
8.根据权利要求7所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m3/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；
优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为鳗弧菌、爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与创伤弧菌其中的3种或者3种以上。
9.根据权利要求7所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(5)所述载体按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备；
优选地，步骤(5)所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；
最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种预防鳗鲡细菌性疾病的噬菌蛭弧菌制剂在鳗鲡养殖中防治细菌性疾病的应用。
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