CN110169982A - 一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，采用能引起蛙类歪头病的病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。本发明还公开了制备方法及其应用。本发明可以有效预防蛙类“歪头病”的发生，明显降低发病率，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及淡水养殖的技术领域，具体涉及一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂和应用，主要运用于蛙类养殖过程预防歪头病的发生。
背景技术
蛙类，属无尾目，本种身体短宽，四肢比较长，幼体有尾，成体无尾。其各数量约有2500种，中国的蛙类有130种左右。养殖中较为常见的有牛蛙、青蛙、黑斑蛙等。蛙类一般具有生长快、味道鲜美、营养丰富、蛋白质含量高等优点，是名贵食品。其皮还可制高级皮革，蛙内脏可以药用，蛙油可制作高级润滑油。所以具有较高的经济价值、食用价值与药用价值。故国内有已经有较多的养殖，并形成一定的规模。
近年来，随着牛蛙的养殖规模不断扩大，一些常见病害问题也日渐突出，比如气泡病、肠胃炎病、脑膜炎、肝炎等，其中脑膜炎病也就是常说的“歪头病”，得病牛蛙死亡率高达50％以上，且传染性极强。流行于夏季，在春秋季也时有发生。主要症状表现为体色发黑，歪头，失去定向能力，在水中做"旋转"式游动眼球突出。内有一层白内障，失明，解剖后可见腹部有大量脓血水流出。
早在1992年8月份上海市某牛蛙养殖场爆发一种“歪头病”，大批牛蛙感染死亡，经过诊断化验确诊为牛蛙脑膜炎脓毒性黄杆菌引起的歪头病。2015年以来，我国湖南省、湖北省等多地的养殖牛蛙都爆发了类似脑膜炎的“歪头病”，给牛蛙的养殖造成了巨大的经济损失。顾泽茂教授团队对该病进行了大规模的流行病学调查，通过病原检测、病理分析和致病性验证，发现米尔伊丽莎白菌为黑斑蛙传染病的主要病原。该病原菌不仅侵染了肝脏、肾脏等器官，还入侵了蛙的脑部组织，进入了神经系统，从而引起中枢神经系统功能失调，表现出歪头等症状。湖南农业大学杨春浩等人对美国青蛙歪头病病原的研究报告中指出，导致歪头病的病原菌为嗜水气单胞菌。
在国内中，针对蛙类“歪头病”的治疗，多数采用消毒类、抗生素类药物与中药配伍，杀菌消毒类药物不仅对环境造成一定的污染，还可能导致药物残留与造成病原微生物产生耐药性。而噬菌蛭弧菌是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌，宿主菌主要为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌与弧菌等革兰氏阴性病原菌。且对人与动物无害，近年来蛭弧菌相关制剂的研究，越来越受到人们的青睐。在国内针对使用噬菌蛭弧菌来防治牛蛙“歪头病”的相关文章与专利基本未见报道，而是主要用于防治弧菌病害较多。
通过调研蛭弧菌相关专利文献，发现大部分噬菌蛭弧菌制剂一般采用活宿主菌大肠杆菌培养，其中存在几点缺陷，一方面培养结束后需要分离未裂解大肠杆菌，操作繁琐；一方面活宿主菌若分离不干净，则存在安全隐患，可能会破坏环境，引入病原菌，不利于大规模使用蛭弧菌制剂；另一方面使用一种宿主菌培养长时间可能导致蛭弧菌功能缺失，对其他种病原菌侵染能力下降或散失。而本发明的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂的制备生产工艺通过巧妙合理设计，使得上述问题都得到很好的解决，同时制备获得的蛭弧菌制剂具有高活性，对多种病原菌能高效裂解、安全环保等特点。
发明内容
本发明目的是提供一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂和应用，以预防蛙类的“歪头病”，克服了传统多数采用单一宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且能保证无外入宿主病原菌污染水体。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，单一活性菌株宿主菌多次培养噬菌蛭弧菌后，会造成噬菌蛭弧菌侵染能力变的较为单一，且病原宿主菌若去除不干净造成水体污染。而若一直采用死宿主菌培养噬菌蛭弧菌，则可能会造成噬菌蛭弧菌对活性宿主菌无侵染能力。
故本发明采用3种或者3种以上的造成蛙类“歪头病”的病原菌混合培养噬菌蛭弧菌，先采用活性宿主菌培养后，过滤除去未被裂解的病原菌后，再采用多种混合且灭活的宿主病原菌进行扩大培养。基于此，完成了本发明。
具体地，本发明的解决方案是：一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，采用能引起蛙类歪头病的病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。
优选地，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌的3种或者3种以上。
优选地，所述噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*1010PFU/g以上。
优选地，所述多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。
优选地，所述冷冻干燥时，冻干保护剂为甘油1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。
优选地，所述的噬菌蛭弧菌制剂，冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。
本发明还提供了一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂的制备方法，该方法采用能引起蛙类歪头病的多种病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再与多种混合灭活宿主菌共培养，最后通过冷冻干燥制备获得。
优选地，所述制备的方法包括以下步骤：
(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；
(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃，离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；
(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；
(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得多种混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，可获得蛭弧菌，活菌数在1-5*1010PFU/mL；
(5)噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。
优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m3/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；
优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌其中的3种或者3种以上。
优选地，步骤(5)所述冻干载体，按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备。
优选地，步骤(5)所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。
采用上述方案后，本发明至少有以下优点：
一、本发明为保证对蛙类“歪头病”有防治功能，故采用该病的病原菌作为宿主菌培养噬菌蛭弧菌，且采用多种病原宿主菌混合共培养；
二、本发明采用60-80℃，水浴10-30min，进行灭活宿主病原菌，既能有效保持宿主菌形态的完整性，利于噬菌蛭弧菌的生长繁殖，而且又能保证无活宿主菌给环境造成污染；
三、本发明在冻干预冻前再加入1-50％(v/v)灭活宿主菌液，让噬菌蛭弧菌侵入宿主菌胞内，在冻干过程中能对噬菌蛭弧菌起到保护作用；
四、利用本发明制备出来的噬菌蛭弧菌冻干粉制剂具有高活性，高菌数(菌数可达1.0*1010PFU/g以上)，在使用上用小剂量就能达到防治病效果，使用成本低廉。
本发明可以有效预防蛙类“歪头病”的发生，明显降低发病率，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明还提供了由上述方法制备得到的预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂。
此外，本发明还提供了所述噬菌蛭弧菌制剂在牛蛙养殖中防治“歪头病”的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
所述脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌都是现有的常见菌种，可通过采购获得。比如，以下实施例和对比例中，脑膜炎脓毒性黄杆菌采购自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号：bio-75015；米尔伊丽莎白菌采购自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号：bio-76599；铜绿假单胞菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10351；嗜水气单胞菌采购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CICC10868。
实施例1有效噬菌蛭弧菌分离试验
该实施例用于说明本发明噬菌蛭弧菌的来源及其获取方法。
从某牛蛙养殖场的排水沟中取得污水样品，于3000r/min离心5min，取上清液，用250mL三角瓶分装100mL，4小瓶，分别加入菌浓度为108CFU/mL的脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌富集培养，30℃，100r/min好氧培养48h。富集培养结束后采用自来水琼脂双层平板分离检测，分别以脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌为宿主菌检验，平板在30℃培养2d，均出现多个透明噬菌斑。挑取多个上层噬菌斑培养基加入少量灭菌生理盐水，旋涡震荡，使固体小块状培养基均匀分散于生理盐水中。再通过各自扩大液体培养后，把这4种有效噬菌蛭弧菌混合在一起，即得到噬菌蛭弧菌悬浊液。
实施例2噬菌蛭弧菌菌液制备
该实施例用于说明本发明提供的噬菌蛭弧菌菌液及其制备方法。
本实施例所述噬菌蛭弧菌由实施例1提供。
1.灭活宿主菌浓缩液制备：分别接种脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌，于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，30℃好氧培养24h后，离心收集菌泥，混合后于60℃，水浴30min，冷却备用。
2.噬菌蛭弧菌菌液制备：取上述步骤1未灭活的混合宿主菌用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在109CFU/mL接种蛭弧菌，于30℃，好氧培养48h。所得培养液于4000r/min，温度4℃离心15min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤。得到的滤液按5％接种量接入步骤1灭活后的混合宿主菌，于30℃，好氧培养24h，即获得蛭弧菌浓度为4.2*1010PFU/mL。
实施例3噬菌蛭弧菌制剂1的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防牛蛙歪头病的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，菌浓度约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝6％:94％)按液固质量比1:0.5的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-40℃条件下，预冻3h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量7％，活菌数5.7*1010PFU/mL。
实施例4噬菌蛭弧菌制剂2的制备
该实施例用于说明本发明提供的一种预防牛蛙歪头病的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
将实施例2所得的噬菌蛭弧菌菌液，接入灭活宿主菌，灭活菌浓约106CFU/mL，好氧培养2h后，加入2％(V/V)甘油，搅拌均匀，再与冻干载体(以蔗糖:脱脂奶粉＝10％:90％)按液固质量比1:1的比例混合，获得待冻干混合液。
将上述待冻干混合液分装进入不锈钢浅盘内，置于真空冷冻干燥机中-30℃条件下，预冻5h，然后开始进行抽真空。首先在24h内使温度上升至0℃，在后24h使温度逐渐上升至10℃，最后获得疏松块状结构的噬菌蛭弧菌冻干制剂，其含水量6％，活菌数4.1*1010PFU/mL。
测试例1噬菌蛭弧菌制剂对牛蛙“歪头病”防治测试试验(实验室)
挑选长势、大小一致，外观正常、健康的牛蛙，规格在50g左右，在9个水族箱(100*55*50cm)里面，放水高度4cm(约22L水)，每个鱼缸养殖25只牛蛙，设置3组试验组，在每组试验组中加入活性混合菌(脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌)，控制最终菌浓在103-104CFU/mL。且第1组采用实施例3制备的噬菌蛭弧菌制剂，第2组采用实施例4制备的噬菌蛭弧菌制剂，用量皆为1g/缸。第3组不添加噬菌蛭弧菌制剂作为空白对照组1，每组试验组再设3个平行组。养殖采用统一管理方式，观察牛蛙健康状况。
表1试验期间牛蛙出现歪头平均只数
在本试验中，6天后牛蛙才陆续发病，患病牛蛙表现为在水中不停地打转，其头向左或向右歪转，患病久后眼睛伴随有白内障。在这试验16天期间，添加噬菌蛭弧菌制剂的2组试验组牛蛙发生“歪头病”的概率约8％-12％，而空白对照组的牛蛙发生“歪头病”概率约84％。所以该噬菌蛭弧菌制剂可以明显降低牛蛙“歪头病”的发病概率。
测试例2噬菌蛭弧菌制剂对青蛙“歪头病”防治测试试验(养殖场)
在某大型青蛙养殖场中，该养殖场曾爆发大规模青蛙“歪头病”，现挑选24个试验小区均为40m3，养殖密度约330只/40m3，其中试验的青蛙来源一致，养殖环境条件一致，喂食管理一致。24个试验小区平均3组试验，每组试验8个试验小区。第1组采用实施例3制备的噬菌蛭弧菌制剂，第2组采用实施例4制备的噬菌蛭弧菌制剂，第3组不添加噬菌蛭弧菌制剂，作为空白对照组2。其中从放蛙苗后10天、17天、24天分别使用噬菌蛭弧菌制剂用水稀释后泼洒，用量为10g/40m3。整个试验期间以30天为限，观察每个试验小区青蛙“歪头病”发病情况。
表2试验小区在30天内青蛙发病统计
| 试验 | 实施例3 | 实施例4 | 空白对照2 |
| 大规模发病试验小区数 | 0 | 0 | 3 |
| 轻微发病试验小区数 | 0 | 1 | 2 |
| 防控率 | 100％ | 12.5％ | 62.5％ |
由以上试验结果可知，该噬菌蛭弧菌制剂能明显预防、降低青蛙“歪头病”的发生。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，采用能引起蛙类歪头病的病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。
2.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌的3种或者3种以上。
3.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*1010PFU/g以上。
4.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。
5.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述冷冻干燥时，冻干保护剂为甘油1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。
6.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述的噬菌蛭弧菌制剂，冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。
7.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，制备的方法包括以下步骤：
(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；
(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃，离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；
(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在108-1010CFU/mL，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；
(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得多种混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌，活菌数在1-5*1010PFU/mL；
(5)噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。
8.根据权利要求7所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m3/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；
优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌其中的3种或者3种以上。
9.根据权利要求7所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(5)所述冻干载体，按质量百分比以蔗糖2-10wt％，脱脂奶粉90-98wt％比例添加制备；
优选地，步骤(5)所述冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h；
最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂在预防蛙类歪头病的应用。
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