CN111410391B - 使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，该方法利用一种寄生型蛭弧菌能够侵入其他宿主细胞并利用宿主细胞内多肽及氨基酸等作为能源和碳源进行自我增值能力，对携带抗生素抗性基因的污泥宿主细胞内的遗传物质进行降解与重构，从而达到削减多种抗性基因丰度的目的，同时对可移动基因元件，即Ⅰ类整合子(intl 1)的降解也有效抑制了抗生素抗性基因在生物转化过程中的水平转移。本发明所述方法能够显著削减剩余污泥中多种抗性基因，包括磺胺类(sul1、sul2)、四环素类(tetC、tetQ)以及Ⅰ类整合子intl 1)丰度，同时具有设备简易，节约能源，无二次污染，为减轻市政剩余污泥抗生素抗性基因污染，以及开发园林绿化基质土、土壤改良剂等系列污泥资源化产品，拓宽土地利用范围与资源化产品利用量提供一条环境友好、绿色低碳、经济高效的生态途径。

Description

使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因 丰度和限制其水平转移的方法

技术领域

本发明涉及一种用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，属于环保技术领域。

背景技术

作为广谱抗菌药物，抗生素使用极其广泛且用量巨大，而我国的抗生素产量个消费量现一直居世界首位。存在于环境中的抗生素可诱导其胁迫下的细菌产生耐药性，而抗性基因是细菌耐药性形成和传播的基础，可由基因突变或水平转移获得。抗性基因不依赖其产生的生物毒性，并具有遗传性和自我复制性，可通过移动基因元件如质粒、整合子和转座子以结合、转导和转化等方式在物种间转移和传播。故抗性基因难以控制和消除，环境风险强，现被认定为一种新型环境污染物。

市政污水处理系统高密度的微生物菌群和优良的混合条件，有利于抗性基因的水平转移和耐药菌的产生。已有研究表明，活性污泥能够显著提高抗性基因的转移频率。污水处理厂现有工艺对抗性基因去除率一般较低，但活性污泥由于亲脂吸附和静电引力通常可富集抗生素，导致抗性基因在污泥中的种类和丰度远高于在污水处理厂进、出水中。因此，污水处理厂不可避免的成为抗性基因的重要储存库，而随着后续脱水污泥的处理处置过程及土地和农业资源化利用过程，抗性基因将通过地下水、沉积物和土壤等环境介质重新进入外部环境中，造成二次污染，并通过食物链的递进对人类健康造成重大威胁。

根据检出频率及丰度，在国内污水处理厂中尤以四环素类和磺胺类抗生素抗性基因为集中关注对象，同时Ⅰ类整合子(intl 1)作为常见的用于指示抗性基因水平转移程度的可移动基因元件也受到广泛关注。

本发明提供了一种利用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，期望能够为减轻市政剩余污泥抗生素抗性基因污染，以及开发园林绿化基质土、土壤改良剂等系列污泥资源化产品，拓宽土地利用范围与资源化产品利用量提供一条环境友好、绿色低碳、经济高效的生态途径。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用寄生型蛭弧菌对携带抗生素抗性基因的污泥宿主细胞内的遗传物质进行降解与重构，从而有效削减剩余污泥中多种抗性基因(包括磺胺类(sul1、sul2)、四环素类(tetC、tetQ)丰度，同时通过降低剩余污泥中可移动基因元件—Ⅰ类整合子(intl 1)的丰度来抑制多种抗生素抗性基因水平传播，且不对环境造成二次污染，绿色环保的抗性基因去除工艺，以缓解抗生素抗性基因污染问题，为保障人类公共健康提供支持。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于，所述方法包括具体如下：

步骤一：噬菌型微生物发酵剂的制备，所述噬菌型微生物发酵剂包括蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌，所述噬菌型微生物发酵剂的活菌数10⁸～10¹⁰cfu/g。其中蛭弧菌菌株命名为SDWB01，已于2016年5月12号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11671，分类命名为：蛭弧菌Bdellovibrio sp.，其余菌株均购自《中国微生物菌种保藏中心》，将培养好的蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌菌液复配后离心，取菌泥与保护剂和吸附载体混合制得噬菌型微生物发酵剂；

步骤二：将噬菌型微生物发酵剂直接投入待处理的剩余污泥中，持续进行曝气和搅拌，进行生物裂解反应。

作为本发明的一种改进，所述蛭弧菌的活菌数为5.6×10¹⁰～7.8×10¹⁰cfu/g，所述黄色黏球菌的活菌数为1.6×10¹⁰～2.3×10¹⁰cfu/g，所述酵母菌的活菌数为2.6×10⁹～5.3× 10⁹cfu/g，所述放线菌的活菌数为5.7×10⁸～6.8×10⁸cfu/g。

其中，步骤一：噬菌型微生物发酵剂的制备，具体如下：

步骤1：菌种培养：分别将蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌接种于灭菌后的独立培养基中培养，分别获得蛭弧菌菌液、黄色黏球菌菌液、酵母菌菌液和放线菌菌液；

步骤2：菌液复配；分别取步骤1中制备得到的蛭弧菌菌液、黄色黏球菌菌液、酵母菌菌液和放线菌菌液，并将上述菌液混合均匀，经离心处理后取沉淀的菌泥；

步骤3：吸附烘干：先向混合机中依次加入保护剂和步骤2中制备得到的菌泥，所述保护剂：步骤2中制备得到的菌泥的质量比为(3-8)：1，混合均匀制得第一混合物；

然后再向第一混合物中加入吸附载体继续混合，所述第一混合物，吸附载体的重量比为1:10，混合均匀制得第二混合物，将第二混合物烘干处理后得到噬菌型微生物发酵剂；

所述吸附载体由稻草秸秆粉和丝兰提取物混合制成，所述吸附载体中稻草秸秆粉和丝兰提取物的重量比为(10-20)：1。

其中，步骤1中所述培养基的组分为：营养肉汤体积比6.5×10^-5，营养盐(Ca²⁺、Mg^{2 +})体积比4‰，pH为7.2-7.4。

步骤2中分别取得的各菌液所占体积比为：蛭弧菌菌液60％～80％、黄色黏球菌菌液 15％～20％、酵母菌菌液5％～10％和放线菌菌液5％～10％。

步骤2中所述离心处理过程的参数为：离心转速3500～5000r/min，离心时间5～10min。

步骤3中所述烘干的温度为30～35℃，烘干时间为5～8小时。

步骤3中所述保护剂的组分为：海藻糖质量比2％、脱脂奶粉质量比3％、谷氨酸钠质量比4％和91％水。

作为本发明的一种改进，所述噬菌型微生物发酵剂，通过添加保护剂，能够保证各组分的微生物的活性，在常温下保存4-6个月，活菌数基本不下降。

作为本发明的一种改进，所述噬菌型微生物发酵剂，在吸附活菌时添加一定量的丝兰提取物，能够促进微生物的活性，缩短微生物生长过程中的延缓期，迅速进入对数期。

步骤二：将噬菌型微生物发酵剂直接投入待处理的剩余污泥中。

作为本发明的一种改进，所述步骤1中所制备的噬菌型微生物发酵剂中蛭弧菌的活菌数为5.6×10¹⁰～7.8×10¹⁰cfu/g，提高投加菌剂中蛭弧菌的浓度可以在提升裂解效果的同时大幅降低单次菌剂投加质量，降低前期菌液制备频率，从而节省前期菌液制备的成本。

作为本发明的一种改进，所述步骤二中噬菌型微生物发酵剂在剩余污泥中的投加比例为1kg到500L剩余污泥，并可根据受试污泥浓度调整菌液的投加比例，保证蛭弧菌在体系中的浓度达到10⁹cfu/mL，确保裂解效果显著的前提下极大地减少了菌剂的投加量，降低前期菌液制备的压力。

作为本发明的一种改进，所述步骤二中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，为使蛭弧菌的活性最高，以达到最佳的裂解效果，控制反应温度30±1℃，已有研究证实环境温度在30℃时，蛭弧菌对宿主的表面粘附程度达到最高，大多数蛭弧菌能够形成噬菌斑。

作为本发明的一种改进，所述步骤二中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，连续曝气过程采用曝气石将空气分散成细小气泡进入反应器，以增加空气与水的接触面积，从而增强气液传质效果，保持反应器内均匀充分的溶解氧浓度的同时，可将部分污泥絮体带起，絮体到达液面后在重力作用下沉降，形成内循环，与复合菌剂充分混合，提高生物裂解效果。

作为本发明的一种改进，所述步骤二中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，进行连续曝气，每立方米污泥的曝气量为6～7Nm³/h，以保证反应器中维持充足的溶解氧浓度供蛭弧菌生长繁殖，从而对剩余污泥中的有机质进行好氧降解，又不至于过度曝气而增加能耗。

作为本发明的一种改进，所述步骤二中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，为使菌液与剩余污泥充分混合，反应器中持续搅拌，搅拌速率为120—150r/min，由于菌液浓度提高后，菌剂的投加量大幅降低，为保证良好的生物裂解效果，使菌剂能够快速、均匀地进入剩余污泥中并与之充分接触，同时使受试污泥不至于沉降到反应器底部，又为防止污泥飞溅，故将机械搅拌速率控制在120—150r/min。

作为本发明的一种改进，所述步骤二中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，反应时间设置为12-20h，一般情况下，蛭弧菌与剩余污泥混合培养12h后，污泥原有微观结构即遭破坏，污泥中微生物细胞的细胞壁即可有效裂解，但受试污泥浓度过高可能导致反应时间适当延长，时间过长并不会进一步提高效能。

作为本发明的一种改进，所述的待处理剩余污泥，初始的污泥质量浓度需控制在20-25g/L，此浓度下剩余污泥中有机质的含量满足蛭弧菌生长繁殖的需要，既不需要外加碳源，也能够被充分有效地降解。

作为本发明的一种改进，所使用的剩余污泥体系，不同于以往研究中采用的菌液悬浮液和土壤环境。菌液悬浮液中菌属和营养成分都较为单一，而污泥是各种无机物和有机物组成的复杂混合体，菌群结构十分复杂，多种细菌水解酶的共同作用能够进一步增强裂解效果；另外，与土壤相比，市政污泥含水率高的特性更加利于鞭毛型噬菌型微生物的游动，从而增加与宿主的接触机会，进一步加强攻击效果。

作为本发明的一种改进，所针对的抗生素抗性基因的种类为四环素类和磺胺类，为国内污水厂中最常见且相对丰度较高的两类抗性基因，其中关于sul3的研究目前较少；另外Ⅰ类整合子(intl 1)作为常见的用于指示抗性基因水平转移程度的可移动基因元件被用来表征污泥体系中抗性基因的水平传播潜力。

蛭弧菌是一类以捕食宿主菌为生、附着有鞭毛的小型寄生性细菌。蛭弧菌可以裂解大多数科、属的革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌，包括具有多重耐药性/泛耐药性致病细菌，也可同时捕食携带ARGs的耐药宿主菌，却不会侵染真核细胞，对动物与人体无致病性。蛭弧菌具有独特的噬菌二态生活周期：进攻期和生长繁殖期。在进攻期，蛭弧菌寻找攻击宿主菌，同时释放多种能穿透细胞壁外膜和肽聚糖的酶，进入细胞周质空间形成球蛭体，以宿主菌的原生质为基质开始生长繁殖期，最后裂解宿主细胞并释放成熟子代个体，开始新一轮的生活周期。黄色黏球菌可以捕食各类原核生物，包括蓝细菌、各类革兰式阳性菌株和大肠杆菌、根瘤菌等各类革兰氏阴性菌。

市政污水处理厂使用活性污泥法处理生活污水，从而导致大量的剩余污泥产生，高污泥浓度条件(20-25g/L)的剩余污泥成分复杂，生物质营养丰富，在持续曝气(6～7Nm³/h) 和搅拌(120—150r/min)并控制反应温度为30±1℃的条件，保证了蛭弧菌与宿主细菌的充分接触并适宜蛭弧菌的生长。

目前降低污泥中抗生素抗性基因丰度的方法主要有原位控制和污染处理两方面。原位控制是通过在城镇污水处理厂中添加紫外线、臭氧与氯化消毒处理，这种处理方式成本较高，且可能会产生其他毒副作用造成二次污染。污染处理方面，目前对堆肥处理降低抗生素抗性基因丰度的研究增多，但均采用添加活性剂等化学添加剂实现抗性基因的高效去除，化学试剂的添加也会造成成本与二次污染的增加。而在本发明中，通过向剩余污泥中投加蛭弧菌，使处于生长繁殖期的蛭弧菌侵入宿主细胞周质内并与其形成球蛭体后，利用宿主细胞内多肽及氨基酸等作为能源和碳源，进行自我繁殖，其DNA合成前体物均来自宿主细胞DNA/RNA，即其可通过对携带抗生素抗性基因的污泥宿主细胞内遗传物质的降解重构，来降低剩余污泥中多种抗生素抗性基因的丰度，同时对污泥中可移动基因元件—Ⅰ类整合子(intl 1)丰度的有效削减也将显著抑制抗性基因在污泥中的水平转移，从而大大降低公共健康风险，同时此过程不依赖化学药剂且能耗极低，绿色低碳，经济高效。

本发明主要运用微生物裂解、抗生素抗性基因的降解重构等生物作用原理，通过外加蛭弧菌，攻击剩余污泥中的多重耐药性/泛耐药性致病细菌，同时捕食携带抗生素抗性基因的耐药宿主菌，并对污泥中游离的抗性基因也有捕获降解作用，从而消减市政剩余污泥中多种抗生素抗性基因的丰度且显著抑制生物转化过程中抗性基因的水平转移，在裂解污泥细胞，自我增值的同时，还可有效缓解抗性基因污染问题及遏制其通过污泥的传播，且环保高效，不存在二次污染的风险。

相对于现有技术，本发明的优点如下：1)该技术方案通过投加噬菌型微生物发酵剂促进了剩余污泥中污泥细胞及微生物的自身裂解，无需添加任何活性剂等化学添加剂，绿色环保，避免了对环境造成二次污染；2)该技术所述的噬菌型微生物发酵剂通过添加保护剂，可在常温下保存4-6个月，而活菌数基本不下降，省去了菌剂存放冰库的费用；3) 该技术将液体菌液通过离心和添加吸附载体制成固态菌剂，很大程度上解决了液态菌液运输困难的问题；4)该技术方案省略了常规抗生素抗性基因降解工艺中对污泥的预处理步骤，例如超声波破壁等，即不使用任何大型耗能设备进行控制，节约能耗；5)该方案只需要外加噬菌型微生物发酵剂，不需要对现有污水处理设施进行任何技术改造，直接投加，操作方便，适用于各种规模的污水处理厂，利于广泛推广实施；6)该技术方案显著减少购买化学药剂和能源消耗的资金投入，大大降低污泥处理处置成本。

附图说明

图1为本发明生物裂解过程中空白组和实验组磺胺类(sul1)抗性基因相对丰度的变化示意图；

图2为本发明生物裂解过程中空白组和实验组磺胺类(sul2)抗性基因相对丰度的变化示意图；

图3为本发明生物裂解过程中空白组和实验组四环素类(tetC)抗性基因相对丰度的变化示意图；

图4为本发明生物裂解过程中空白组和实验组四环素类(tetQ)抗性基因相对丰度的变化示意图；

图5为本发明生物裂解过程中空白组和实验组可移动基因元件—Ⅰ类整合子(intl1) 相对丰度的变化示意图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明所述利用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，下面结合附图和实施详细说明实施方式。

实施例1：一种使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，所述方法包括具体如下：

步骤一：噬菌型微生物发酵剂制备：将培养好的蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌菌液复配后离心，取菌泥与保护剂和吸附载体混合制得噬菌型微生物发酵剂；

步骤二：将噬菌型微生物发酵剂直接投入待处理的剩余污泥中。

所述步骤1)中所制备的噬菌型微生物发酵剂中蛭弧菌的活菌数为5.6×10¹⁰～7.8× 10¹⁰cfu/g，提高投加菌剂中蛭弧菌的浓度可以在提升裂解效果的同时大幅降低单次菌剂投加质量，降低前期菌液制备频率，从而节省前期菌液制备的成本。

所述步骤2)中噬菌型微生物发酵剂在剩余污泥中的投加比例为1kg到500L剩余污泥，并可根据受试污泥浓度调整菌液的投加比例，保证蛭弧菌在体系中的浓度达到10⁹cfu/mL，确保裂解效果显著的前提下极大地减少了菌剂的投加量，降低前期菌液制备的压力。

所述步骤2)中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，为使蛭弧菌的活性最高，以达到最佳的裂解效果，控制反应温度30±1℃，已有研究证实环境温度在30℃时，蛭弧菌对宿主的表面粘附程度达到最高，大多数蛭弧菌能够形成噬菌斑。

所述步骤2)中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，连续曝气过程采用曝气石将空气分散成细小气泡进入反应器，以增加空气与水的接触面积，从而增强气液传质效果，保持反应器内均匀充分的溶解氧浓度的同时，可将部分污泥絮体带起，絮体到达液面后在重力作用下沉降，形成内循环，与复合菌剂充分混合，提高生物裂解效果。

所述步骤2)中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，进行连续曝气，每立方米污泥的曝气量为6～7Nm³/h，以保证反应器中维持充足的溶解氧浓度供蛭弧菌生长繁殖，从而对剩余污泥中的有机质进行好氧降解，又不至于过度曝气而增加能耗。

所述步骤2)中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，为使菌液与剩余污泥充分混合，反应器中持续搅拌，搅拌速率为120—150r/min，由于菌液浓度提高后，菌剂的投加量大幅降低，为保证良好的生物裂解效果，使菌剂能够快速、均匀地进入剩余污泥中并与之充分接触，同时使受试污泥不至于沉降到反应器底部，又为防止污泥飞溅，故将机械搅拌速率控制在120—150r/min。

所述步骤2)中的噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，反应时间设置为12-20h，一般情况下，蛭弧菌与剩余污泥混合培养12h后，污泥原有微观结构即遭破坏，污泥中微生物细胞的细胞壁即可有效裂解，但受试污泥浓度过高可能导致反应时间适当延长，时间过长并不会进一步提高效能。

所述的待处理剩余污泥，初始的污泥质量浓度需控制在20-25g/L，此浓度下剩余污泥中有机质的含量满足蛭弧菌生长繁殖的需要，既不需要外加碳源，也能够被充分有效地降解。

该技术方案通过投加噬菌型微生物发酵剂促进了剩余污泥中污泥细胞及微生物的自身裂解，无需添加任何活性剂等化学添加剂，绿色环保，避免了对环境造成二次污染；该技术方案省略了常规抗生素抗性基因降解工艺中对污泥的预处理步骤，例如超声波破壁等，即不使用任何大型耗能设备进行控制，节约能耗；将噬菌型微生物发酵剂投加到好氧生物转化装置中，持续进行曝气和搅拌，保证溶解氧充足。

应用实施例：

一、原料说明：

1)污泥获取：取自南京某污水处理厂浓缩池污泥。

2)污泥预处理：污泥经过自然沉降，取下层污泥，初始污泥质量浓度需控制在20—25g/L，无需调节污泥pH，污泥pH测定结果为6.98，无需调节污泥温度，污泥温度测定为 30℃。

3)噬菌型微生物发酵剂制备：所述噬菌型微生物发酵剂包括蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌，所述噬菌型微生物发酵剂的活菌数10⁸～10¹⁰cfu/g。其中蛭弧菌菌株命名为SDWB01，已于2016年5月12号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11671，其余菌株均购自《中国微生物菌种保藏中心》。将培养好的蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌菌液复配后离心，取菌泥与保护剂和吸附载体混合制得噬菌型微生物发酵剂。其中蛭弧菌的活菌数为5.6×10¹⁰～7.8× 10¹⁰cfu/g数量级。

4)原始污泥特性如表1所示。

表1原始污泥特性

注：括号内数值为标准差

二、降低剩余污泥中多种抗性基因丰度及抑制生物转化过程中抗性基因转移的效果试验

实验分为空白组和实验组

所有对照组和实验组的污泥取同一批次预处理的污泥。经沉淀后的下层浓稠污泥混合均匀后装进2000mL玻璃瓶中，每瓶装1500mL；

空白组；将3g超纯水加入1500mL污泥中，混匀，共设置三次重复；

实验组：将3g浓度为10⁹cfu/g的噬菌型微生物发酵剂加入1500mL污泥中，混匀，共设置三次重复。

将空白组和实验组都放入30℃、150r/min摇床中，并调节曝气头的曝气强度使其维持在6-7Nm³/h，反应16h。

本发明采用荧光定量PCR方法检测污泥中各类抗性基因丰度：定量PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL，正反引物各0.75μL，酶10μL，无菌水7.5μL，阴性对照不加 DNA模板，无菌水为4μL。

定量PCR反应程序设定为：95℃预变性5min，循环包括94℃变性30s；退火温度30s；72℃延伸30s；最后延伸，72℃，7min。Melting Curve 65℃-95℃,每5s增加0.5℃(读板)。根据各类抗性基因的引物序列和退火温度进行设置参数并检测。

检测反应进行0h、4h、8h、12h和16h时各玻璃瓶污泥中多种抗生素抗性基因丰度的降低情况，并记录如图1—图3所示。经生物裂解处理后，污泥中磺胺类(sul1、sul2)、四环素类(tetC、tetQ)的相对丰度显著降低，且各实验组各类抗性基因相对丰度均显著低于空白组，同时可移动基因元件—Ⅰ类整合子(intl 1)在污泥中丰度的降低也指示了生物裂解过程对于抑制抗性基因在污泥中的水平转移的巨大潜能，说明利用蛭弧菌进行生物裂解处理能够有效削减污泥中多种抗生素抗性基因的丰度并抑制其通过污泥的转移。

如图1所示，生物裂解反应结束后，空白组中的磺胺类抗性基因相对丰度发生增多，而试验组中的磺胺类抗性基因相对丰度出现显著降低，空白组中sul1相对丰度升高了47.33％，实验组中sul1相对丰度降低了92.14％；空白组中sul2相对丰度升高了52.48％，实验组中sul2相对丰度降低了94.25％。

如图1所示，生物裂解反应结束后，空白组中的四环素类抗性基因相对丰度发生增多，而试验组中的四环素类抗性基因相对丰度出现显著降低，空白组中tetC相对丰度升高了 67.20％，实验组中tetC相对丰度降低了96.53％；空白组中tetQ相对丰度升高了62.30％，实验组中tetQ相对丰度降低了97.64％。

如图1所示，生物裂解反应结束后，空白组中的Ⅰ类整合子(intl 1)相对丰度发生增多，而试验组中的Ⅰ类整合子(intl 1)相对丰度出现显著降低，空白组中intl 1相对丰度升高了67.78％，实验组中intl 1相对丰度降低了98.60％。

本方法简单易行，将噬菌型微生物发酵剂直接投加进待反应的剩余污泥中，在曝气和搅拌条件下进行生物裂解反应，降低人工、能耗成本，且没有对环境造成二次污染的风险，能够有效阻止剩余污泥中多种抗生素抗性基因的积累并抑制其在污泥中的转移，降低抗性基因对人类健康的威胁，为保障公众健康提供了一条低碳高效的生态途径。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (8)

1.一种使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于，所述方法包括具体如下：

步骤一：噬菌型微生物发酵剂的制备，所述噬菌型微生物发酵剂包括蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌，所述噬菌型微生物发酵剂的活菌数10⁸～10¹⁰cfu/g，其中蛭弧菌菌株命名为SDWB01，已于2016年5月12号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11671，其余菌株均购自《中国微生物菌种保藏中心》，将培养好的蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌菌液复配后离心，取菌泥与保护剂和吸附载体混合制得噬菌型微生物发酵剂；

步骤二：将噬菌型微生物发酵剂直接投入待处理的剩余污泥中，持续进行曝气和搅拌，进行生物裂解反应；

所述蛭弧菌的活菌数为5.6×10¹⁰～7.8×10¹⁰cfu/g，所述黄色黏球菌的活菌数为1.6×10¹⁰～2.3×10¹⁰cfu/g，所述酵母菌的活菌数为2.6×10⁹～5.3×10⁹cfu/g，所述放线菌的活菌数为5.7×10⁸～6.8×10⁸cfu/g；

步骤一：噬菌型微生物发酵剂的制备，具体如下：

步骤1：菌种培养：分别将蛭弧菌、黄色黏球菌、酵母菌和放线菌接种于灭菌后的独立培养基中培养，分别获得蛭弧菌菌液、黄色黏球菌菌液、酵母菌菌液和放线菌菌液；

步骤2：菌液复配；分别取步骤1中制备得到的蛭弧菌菌液、黄色黏球菌菌液、酵母菌菌液和放线菌菌液，并将上述菌液混合均匀，经离心处理后取沉淀的菌泥；

步骤3：吸附烘干：先向混合机中依次加入保护剂和步骤2中制备得到的菌泥，所述保护剂：步骤2中制备得到的菌泥的质量比为(3-8)：1，混合均匀制得第一混合物；

然后再向第一混合物中加入吸附载体继续混合，所述第一混合物，吸附载体的重量比为1:10，混合均匀制得第二混合物，将第二混合物烘干处理后得到噬菌型微生物发酵剂；

所述吸附载体由稻草秸秆粉和丝兰提取物混合制成，所述吸附载体中稻草秸秆粉和丝兰提取物的重量比为(10-20)：1。

2.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于，步骤1中所述培养基的组分为：营养肉汤体积比6.5×10^-5，营养盐(Ca²⁺、Mg²⁺)体积比4‰，pH为7.2-7.4。

3.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于：步骤2中分别取得的各菌液所占体积比为：蛭弧菌菌液60％～80％、黄色黏球菌菌液15％～20％、酵母菌菌液5％～10％和放线菌菌液5％～10％。

4.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于：步骤2中所述离心处理过程的参数为：离心转速3500～5000r/min，离心时间5～10min。

5.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于，其特征在于：步骤3中所述烘干的温度为30～35℃，烘干时间为5～8小时。

6.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于：步骤3中所述保护剂的组分为：海藻糖质量比2％、脱脂奶粉质量比3％、谷氨酸钠质量比4％和91％水。

7.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于，所述步骤二中生物裂解反应，噬菌型微生物发酵剂在剩余污泥中的投加比例为1kg到500L剩余污泥；噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，进行连续曝气，每立方米污泥的曝气量为6～7Nm³/h；噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，持续搅拌，搅拌速度为120—150r/min：噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，控制反应温度为30±1℃；噬菌型微生物发酵剂投加到污泥中后，反应时间为12-20h。

8.根据权利要求1所述的使用微生物裂解反应来削减剩余污泥中多种抗生素抗性基因丰度和限制其水平转移的方法，其特征在于：所述待处理剩余污泥的初始质量浓度需控制在20-25g/L。

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