CN110669692B - 一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法及应用方法，混合菌剂包括：不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX‑15，无色杆菌Achromobacter pulmonis strain PI3‑03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21。本发明中的不动杆菌属Acinetobacter sp.strain ZX‑15和无色杆菌属Achromobacter pulmonis strain PI3‑03为高效石油烃降解菌，不动杆菌属Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌属chrobactrum anthropi strain CON21为高效稠油降粘菌。本发明公开的稠油降粘降解混合菌剂是一种人工筛选构建的混合菌剂，菌种成分明确，制备工艺简单，对稠油的降解效率高，且有较好的降粘效果，在环境治理方法具有良好的应用前景和工业化生产潜力。

Description

一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法及应用方法
技术领域
本发明涉及一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法及应用方法，属于环境保护和污染防治与治理领域。
背景技术
我国有40万吨的稠油资源，东北与华北地区稠油储量占较大比重，其中渤海油田稠油在中海原油中所占的比例达到 80% 以上。稠油因其较高的粘度和较多的重组分，难以被开发利用，且在开采过程中造成的污染修复难度更高。微生物法用于稠油污染的修复时成本较低，修复效果更好；最终产物是小分子水、二氧化碳或有机物，无二次污染问题；可以原位异位处理，适用性强。因此，微生物降解凭借其巨大优势成为了当前许多发达国家针对油污水体和土壤的修复手段。
在微生物降解稠油过程中，原油的疏水性是限制其降解速率的主要因素之一，稠油的高粘度导致微生物难以对其进行降解利用。微生物对稠油的降解主要在油-水界面进行，油的乳化能极大地提高油的分散程度，增加菌株和油滴接触的表面积，促进微生物对石油烃的吸收和降解。直接添加表面活性剂只能改变稠油大分子的空间结构，无法改变其化学组成，因此稠油会由于色谱分离效应而恢复粘度；与之相比，微生物不仅能通过代谢过程中产生的糖脂类、脂肽类、磷脂类等生物表面活性剂降低油水界面张力和乳化原油，且能对原油重质组分进行生化活性的酶改进，从而改善原油粘度，还可以利用降解作用将大分子的烃类转化为低分子烃，从而降低稠油中大分子组分，减小其平均分子量，降粘效果更为彻底。研究表明某些细菌可以通过产生生物表面活性剂而促使原油乳化并被动扩散进入细胞内，从而被生物酶捕集降解，从而提高对原油的降解率。
由于稠油是由结构复杂、并难于降解的化合物组成，单一的菌株对其降解较差，不同稠油降解菌株复配可将芳环和杂环结构破坏后进一步降解，同时产表面活性剂菌株代谢的生物表面活性剂可乳化增溶原油，因此将石油烃降解菌和降粘菌进行复配更能提高对菌株对稠油的摄取和降解速率。
国内目前对于稠油微生物降解的研究还较少，且主要集中在高效降解菌的筛选或者石油烃降解菌之间的复配，或者用外加表面活性剂强化微生物修复，而鲜有将石油烃降解菌和降粘菌进行复配的研究。
人们对于微生物处理稠油进行了大量的深入研究，并取得了诸多成果，例如：
CN 109763803 A公开了一种公开了产鼠李糖脂假单胞菌QFP及其在稠油开采中的应用，包括一株兼性厌氧假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株QFP。应用方法如下：将保藏于甘油管中的假单胞菌QFP转移至LB液体培养基中，20-30℃摇床振荡 培养12h得到种子液，按体积比0.5％的比例将种子液接种到产表面活性剂发酵培养基中，20-30℃ 下连续曝气培养96h，发酵完成后得到发酵液。该发明的产鼠李糖脂具有很强的表面活性剂性能和乳化能力，能够显著降低稠油黏度，并且可以抑制其他细菌的生长，该菌具有应用于石油烃污染环境的修复和油藏环境中提高原油采收率的潜能，同时所产鼠李糖脂在医药、环境保护以及能源开采等方面具有重要应用价值。
CN 109576191 A公开了一种公开了一种稠油开发的复合微生物菌剂及其制备方法和应用，在于现有的微生物采油技术制备复杂、单一菌种不耐环境冲击的问题而提出的。该发明的复合微生物菌剂由苍白芽孢杆菌、泛菌属、嗜热 厌氧杆菌发酵后混合制成，有益效果在于避免因单功能菌种不耐受环境冲击的缺陷，三种菌株之间的功能表达没有受到抑制，制备方 法简单、成本低。
CN 104109646 A公开了一种适用于不同矿化度稠油油井的降粘菌剂及其应用，该降粘菌剂由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌组成，在30~70℃、pH值5~10、矿化度1000~12000mg/L0~30MPa条件下培养24h，各菌种的菌体浓度均能够达到108～109个/mL，繁殖能力强。该菌剂能够通过降解原油重组分，代谢生物表活剂、生物气等方式降低原油粘度，从而保证稠油油井的稳产增产。使用方法包括：取降粘菌剂发酵生产发酵菌液；采用发酵菌液配制注入菌液体系；将注入菌液体系挤入目的油层。该菌剂在矿化度6000~83000mg/L、pH7~8.6、40~60℃条件下的油井现场试验均取得了较好的增产效果原油粘度下降 50％～ 65％，产出液表面张力 下降20％~30％，原油凝点下降1~3℃。
CN 104450543 A公开了一种本源微生物修复复合制剂及其应用方法；该复合制剂由稠油降解菌群、营养物质、复合表面活性剂渗透剂、氧化促进活化剂四个部分组成，其中稠油降解菌群是由从稠油土壤中筛选分离出的好氧杆状细菌（Lactobacillus sp.）和厌氧杆状芽孢细菌（bacillus sp.）构成；将复合制剂喷洒在污染土壤中，经过2-3个月，稠油污染土壤的降解率达到50-80%。如上所述，虽然人们研发了很多利用微生物对稠油进行降解降粘的方法，但大多功能单一，对稠油降粘效果好但降解效率低，或者降解效率高但降粘效果不明显。因此对于新型的混合菌剂，仍存在继续研究的必要和需求。这是本发明得以完成的动力所在和基础所倚。
发明内容
鉴于混合菌对稠油降解降粘方面的诸多不足，本发明提供了一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法。该混合菌剂既能实现对稠油的高效降解，又能明显改善稠油粘度。
本发明通过以下技术方案予以实现：
一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
第1步，制备种子培养基；
第2步，将以下单菌分别接种于种子培养基中，经培养得到各单菌种子液，所述单菌包括不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacter pulmonisstrain PI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropistrain CON21；
第3步，将各单菌种子液按比例混合即得到稠油降粘降解混合菌剂。
上述各单菌均为现有菌株，可以通过编号在NCBI核酸数据库里搜索到，比如：不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15在NCBI数据库里的登录号为MF148465.1，无色杆菌Achromobacter pulmonis strain PI3-03在NCBI数据库里的登录号为MK396599.1，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206在NCBI数据库里的登录号为EU912468.1，苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21在NCBI数据库里的登录号为MK167392.1。
进一步的，所述第1步中种子培养基的制备包括如下步骤：
R1：将5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠溶解于1000mL的去离子水中，充分搅拌，得到混合液I；
R2：向所述混合液I中，加入0.1g钼酸钠、0.05g硝酸铝、0.04g氯化锌、0.06g硫酸铜、0.03g氯化锰、0.09g硫酸亚铁、0.10g硝酸镁和0.06g氯化钾，然后充分混合即得到所述种子培养基。
进一步的，所述第3步中不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15、无色杆菌Achromobacter pulmonis strain PI3-03、不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21的种子液混合体积比例为（1-2）：（1-2）：（1-2）：（1-2），尤其优选为2：2：1：1。
进一步的，所述不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacter pulmonis strain PI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21是从稠油开采区被稠油污染的土壤中驯化筛选得到，具体步骤如下：
S1：取稠油开采区被稠油污染的土壤加入到首期含有稠油的富集/降解培养基中，然后于恒温摇床培养后，取上清液转入第二期含有稠油的富集/降解培养基中，再次培养；每期逐步提高富集/降解培养基中稠油浓度，共多个驯化周期；
S2：取最后一个驯化周期的培养液涂平板，挑取外观不同的菌落重复划线，得到多个不同的纯化后的单菌株；
S3：分别用各个单菌株菌液对稠油进行降解实验，得到石油烃降解率最高的两株菌，以及通过菌液表面张力测定，得到对稠油降粘效果最好的两株菌；
S4：对筛选得到的四个菌株进行16sRNA测序，确定石油烃降解率最高的两株菌为不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15和无色杆菌Achromobacter pulmonis strainPI3-03，对稠油降粘效果最好的两株菌为不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21。
进一步的，所述的富集/降解培养基的制备方法为：将5.0g氯化钠，1.0g硫酸铵，0.25g七水硫酸镁，2.0g硝酸钠，4.0g磷酸二氢钾，7.6g磷酸氢二钾溶解于1000mL去离子水中，再加入适量稠油配置而成。
进一步的，所述步骤S3的降解实验包括如下步骤：
T1：将单菌株接种在含稠油的无机盐培养基中，于160 r/min 、37℃恒温摇床培养8d；
T2：将培养基中的残油萃取出来，进而求得石油烃降解率，选取石油烃降解率最高的两株菌；
所述的菌液表面张力测定包括如下步骤：
M1：将单菌株接种到发酵培养基中，于160 r/min，37℃条件下分别培养3d；
M2：将发酵液于8000 r/min下，离心10 min，去除发酵液中的细胞体；
M3：对发酵液的表面张力进行测定，选取发酵液表面张力最小的两个菌株为高效稠油降粘菌。
进一步的，所述步骤S4的16sRNA测序是提取菌株的基因组DNA并进行电泳检测，利用通用引物进行基因扩增，再进行电泳PCR产物鉴定，进行测序、同源性比对和进化树分析，确定石油烃降解率最高的两株菌为不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15和无色杆菌Achromobacter pulmonis strain PI3-03，对稠油降粘效果最好的两株菌为不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21。
接着给出上述制备方法得到的稠油降粘降解混合菌剂的应用方法，应用于稠油污染的降粘、降解，其应用温度控制为25-40℃，最佳为35℃；应用pH控制为7-8，最佳为7.5；应用接种量控制为体积分数3-5%。
与现有技术相比，本发明具有下述优点：
（1）本发明涉及的混合菌剂的筛菌、培养过程均使用常规培养基，不需要特殊的培养环境，混合菌剂的制备更为简便。
（2）本发明涉及的混合菌剂是从稠油污染土壤中分离富集、纯化得到的，菌株本身来自稠油土壤中，属于本源微生物降解菌，所以对含有重质成分和胶质沥青较高的稠油环境具有很好的适应性和高效性。
（3）本发明公开的稠油降粘降解混合菌剂是一种人工筛选构建的混合菌剂，较成分不 完全明确的天然混菌体系和单一菌株对污染物的生物降解优势明显。该菌剂的菌种成分明确，制备工艺简单，降解效率高，降粘效果好，具有较好的应用前景。
（4）本发明公开的稠油降粘降解混合菌剂可以同时实现对稠油的粘度降低和石油烃高效降解，较现有的微生物技术而言功能更全面。
附图说明
图1是实施例2中不同培养温度下菌液的表面张力和石油烃降解率示意图；
图2是实施例2中不同pH下菌液的表面张力和石油烃降解率效果示意图；
图3是实施例2中不同接种量下菌液的表面张力和石油烃降解率示意图；
图4是实施例3中不同混合比例菌液的表面张力和石油烃降解率示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例 1
不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacter pulmonisstrain PI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropistrain CON21的驯化、筛选及混合菌剂的制备：
（1）取3g胜利油田稠油开采区长期被稠油污染的土壤加入到含有稠油1g/L的150mL富集/降解培养基中，37℃于恒温摇床培养5d（160 r/min）后，取上清液3 mL转入稠油含量为2g/L的新富集/降解培养基中，再次培养5d。以此类推，逐步提高稠油浓度至5g/L，共驯化五个周期。
（2）取最后一个驯化周期的培养液涂平板，挑取具有不同形态特征的菌落，重复划线，直至确认同一平板中菌落的形态和大小都相同，得到纯化后的单菌株。
（3）将单菌株接种在含稠油的无机盐培养基中，37℃于恒温摇床培养8d（160r/min），分别在第3d、5d、8d各取两瓶；将降解培养基用的石油醚萃取后，求得石油烃降解率，选取石油烃降解率最高的两株菌为高效石油烃降解菌。
（4）将单菌株接种到发酵培养基中，于160 r/min，37℃条件下分别培养3d，将发酵液于8000r/min下，离心10min，去除发酵液中的细胞体，用表面张力仪对发酵液的表面张力进行测定。选取发酵液表面张力最小的两个菌株为高效稠油降粘菌。
（5）对筛选得到的菌株进行16sRNA测序，提取菌株的基因组DNA并进行电泳检测，利用通用引物进行基因扩增，再进行电泳PCR产物鉴定，进行测序、同源性比对和进化树分析，可知高效石油烃降解菌为不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15和无色杆菌Achromobacter pulmonis strain PI3-03，高效稠油降粘菌为不动杆菌Acinetobactersp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21；
（6）将不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacterpulmonis strain PI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrumanthropi strain CON21接种于种子培养基中，于37℃，160r/min条件下恒温振荡24h得到种子液，种子液按体积比例为2：2：1：1混合即得混合菌剂。
其中，种子培养基制备步骤：将5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠溶解于1000mL的去离子水中，充分搅拌，得到混合液I，向所述混合液I中，加入微量元素0.1g钼酸钠、0.05g硝酸铝、0.04g氯化锌、0.06g硫酸铜、0.03g氯化锰、0.09g硫酸亚铁、0.10g硝酸镁和0.06g氯化钾，然后充分混合。
其中，富集/降解培养基的制备方法为：将5.0g氯化钠，1.0g硫酸铵，0.25g七水硫酸镁，2.0g硝酸钠，4.0g磷酸二氢钾，7.6g磷酸氢二钾溶解于1000mL去离子水中，再加入适量稠油。
实施例 2
二、不同培养条件下混合菌剂的降解降粘性能
将不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacterpulmonis strain PI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrumanthropi strain CON21分别接种于种子培养基中，于37℃，160r/min条件下恒温振荡24h得到种子液，再将它们的种子液按照体积比例为2：2：1：1混合，接种于降解培养基中，进行如下降解条件的实验。其中，降解培养基为1.0g硫酸铵，0.25g七水硫酸镁，2.0g硝酸钠，4.0g磷酸二氢钾，7.6g磷酸氢二钾溶解于1000mL去离子水中。
1.不同温度
降解条件：pH7.5，稠油2g/L，接种量5%（V/V），氯化钠 4g/L；温度：20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃；培养10d后用紫外分光光度法测石油烃降解率，用表面张力仪测定菌液的表面张力。
结果表明：混合菌在25-40℃时都有较高的降解率，其中35℃为最适温度，降解率可达到最高44.12%，此时菌液的表面张力也达到最低43.6mN/m。
2.不同pH
降解条件：温度37℃，稠油2g/L，接种量5%（V/V），氯化钠 4g/L；pH：3，5，7，7.5，8，9，11，12；培养10d后用紫外分光光度法测石油烃降解率，用表面张力仪测定菌液的表面张力。
结果表明：混合菌在pH7-8时都有较高的降解率，其中最适pH为7.5，此时降解率达到最大42.14%，菌液表面张力也达到最低44.1mN/m。
3.不同接种量
降解条件：温度37℃，pH7.5，稠油2g/L，氯化钠 4g/L；接种量：1%，2%，5%，10%，15%，20%；培养10d后用紫外分光光度法测石油烃降解率，用表面张力仪测定菌液的表面张力。
结果表明：当接种量高于5%时，石油烃降解率相比接种量时无明显变化，混合菌对培养基中石油烃的降解率提高并不明显，且表面张力下降幅度减小。当接种量低于3%时，菌株对石油烃的降解率较低且表面张力较大。
实施例 3
不同混合比例下的菌剂的降解降粘性能
将不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacterpulmonis strain PI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrumanthropi strain CON21接种于种子培养基中，于37℃，160r/min条件下恒温振荡24h得到种子液，种子液按体积比例按照如下比例混合：
Figure 25596DEST_PATH_IMAGE001
结果表明：D组合石油烃降解率最高，为43.84%，而表面张力为41.2mN/m，E组合的表面张力最低，为38.7mN/m，而石油烃降解率为40.58%。两个组合的表面张力和降解率都相差较小， D组合对稠油的降解能力最好，且有较好的降粘效果，最适合用于稠油污染的生物治理，因此D组合为最佳混合比例。
从实施例2和实施例3可以看出，四个菌株混合后的降解降粘效果明显大于单菌株的降解降粘效果。菌株混合后的稠油降解率最高可达到43.84%，而单菌株10d的最高降解率为28.96%，降解效果提高了34%，表面张力最低可达到38.7mN/m，而单菌株在稠油培养基中10d的最低表面张力为54.1mN/m左右。综上所属，菌株间的复配具有协同增效作用，既增强了对稠油的降解能力，又增强了稠油乳化分散的效果，双重作用共同提高稠油的流动性。
以上所述，仅是本发明的典型实施例，本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
第1步，制备种子培养基；
第2步，将以下单菌分别接种于种子培养基中，经培养得到各单菌种子液，所述单菌包括不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15，无色杆菌Achromobacterpulmonis strainPI3-03，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strainCON21；不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15在NCBI数据库里的登录号为MF148465.1，无色杆菌Achromobacterpulmonis strain PI3-03在NCBI数据库里的登录号为MK396599.1，不动杆菌Acinetobacter sp.RS206在NCBI数据库里的登录号为EU912468.1，苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21在NCBI数据库里的登录号为MK167392.1；
第3步，将各单菌种子液按比例混合即得到稠油降粘降解混合菌剂；
所述第3步中不动杆菌Acinetobacter sp.strain ZX-15、无色杆菌Achromobacterpulmonis strain PI3-03、不动杆菌Acinetobacter sp.RS206和苍白杆菌chrobactrum anthropi strain CON21的种子液混合体积比例为(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)。
2.根据权利要求1所述的稠油降粘降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，所述第1步中种子培养基的制备包括如下步骤：
R1：将5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠溶解于1000mL的去离子水中，充分搅拌，得到混合液I；
R2：向所述混合液I中，加入0.1g钼酸钠、0.05g硝酸铝、0.04g氯化锌、0.06g硫酸铜、0.03g氯化锰、0.09g硫酸亚铁、0.10g硝酸镁和0.06g氯化钾，然后充分混合即得到所述种子培养基。
3.权利要求1-2任一项所述制备方法得到的稠油降粘降解混合菌剂的应用方法，其特征在于，应用于稠油污染的降粘、降解，其应用温度控制为25-40℃。
4.根据权利要求3所述的稠油降粘降解混合菌剂的应用方法，其特征在于，应用于稠油污染的降粘、降解，其应用pH控制为7-8。
5.根据权利要求3所述的稠油降粘降解混合菌剂的应用方法，其特征在于，应用于稠油污染的降粘、降解，其应用接种量控制为接种的菌液体积/接种后液体培养基总体积的体积分数为3-5％。
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