CN114107129A - 一种屎肠球菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域,涉及屎肠球菌菌株及其用途。一种屎肠球菌菌株,该菌株为屎肠球菌RKP‑EF‑21001,于2021年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23638。本发明提供了一种屎肠球菌菌株,该菌株能有效的调节宿主肠道菌群的微生态环境,调节免疫应答、促进营养物质的消化吸收等益生功能,在代谢过程中可以通过核糖体合成机制产生一类具有抑菌活性的多肽,这类多肽具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等特点,可以抑制多种细菌、真菌甚至病毒。利用该菌株发酵液上清与噬菌体复配制成的益生菌制剂,能够增强噬菌体的杀菌能力,并且安全无毒,无耐药性。

Description

一种屎肠球菌菌株及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及屎肠球菌菌株及其用途。
背景技术
噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒,没有细胞结构,必须依赖宿主进行复制和增殖,广泛存在于自然界,专一性、自我裂解能力强,具备裂解细菌和控制细菌生长的功能,可以调节自然界中细菌的消长,用噬菌体作为生物杀菌剂预防、治疗和控制在禽类养殖过程中的细菌病,具有低污染、高效率的优势,在一定程度上减少人为活动对自然界的影响。
屎肠球菌是存在于人类和动物体内的一种正常菌群,不仅能有效的调节宿主肠道菌群的微生态环境,调节免疫应答、促进营养物质的消化吸收等益生功能,而且在代谢过程中可以通过核糖体合成机制产生一类具有抑菌活性的多肽。这类多肽具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等特点,可以抑制多种细菌、真菌甚至病毒。将这种多肽作为生物制剂,既可减少抗生素的使用带来的不利影响,又可带来可观的经济效益,在生产实际中有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鸡场粪便内分离得到的屎肠球菌菌株,由该菌株制备的益生菌制剂,具有增强噬菌体杀菌能力的效果。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:一种屎肠球菌菌株,该菌株为屎肠球菌RKP-EF-21001,于2021年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23638。
本发明还提供了上述屎肠球菌菌株的用途,该菌株用于增强噬菌体杀菌能力。
进一步地,该菌株用于制备增强噬菌体杀菌能力的制剂。
进一步地,本发明还提供一种增强噬菌体杀菌能力的方法,该方法包括:
利用所述的屎肠球菌菌株制备菌液;
将制备好的菌液上清与噬菌体溶液混合。
本发明还进一步提供了一种具有杀菌能力的益生菌制剂,该益生菌制剂包含所述的屎肠球菌或其培养物。
进一步地,所述益生菌制剂还包括噬菌体。
本发明提供了一种屎肠球菌菌株,该菌株能有效的调节宿主肠道菌群的微生态环境,调节免疫应答、促进营养物质的消化吸收等益生功能,在代谢过程中可以通过核糖体合成机制产生一类具有抑菌活性的多肽,这类多肽具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等特点,可以抑制多种细菌、真菌甚至病毒。利用该菌株与噬菌体复配制成的益生菌制剂,能够增强噬菌体的杀菌能力,并且安全无毒,无耐药性。
附图说明
图1为本发明的屎肠球菌RKP-EF-21001牛津杯抑菌实验结果图;
图2为益生菌制剂对大肠杆菌ATCC-25922体外抑菌实验图;
图3为益生菌制剂对沙门氏菌CVCC-3376体外抑菌实验图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面结合附图和具体实施例,对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本说明书所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例中涉及到的生物材料:大肠杆菌ATCC-25922购自广东省微生物菌种保藏中心,沙门氏菌CVCC-3376购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心,大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029(保藏编号为CGMCC No .18196,专利申请号:2019107339067)、沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118(保藏编号CGMCC No . 18198,专利申请号:2019107339175)。
实施例1屎肠球菌的分离、纯化
从青岛即墨养鸡场内采得粪便样品,将粪便样品与SM缓冲液按照1:50比例混合,吸取1ml液体接种于屎肠球菌选择性培养基内,在37℃厌氧培养箱内培养48±2h,选择暗红色或粉红色、表面光滑凸起,周边整齐的菌落,纯化3次,取单菌落转入肠球菌肉汤培养基37℃培养箱中培养2h。革兰氏染色呈阳性,菌落形态为椭圆形,无芽孢。生化鉴定显示甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、精氨酸水解阳性,山梨醇、棉子糖、色素、动力阴性。
将菌株送至华大基因测序,NCBI数据库比对结果显示,该菌株与Enterococcusfaecium strain IGM5-9 、Enterococcus faecium strain IGM3-8同源性高达100%,与Enterococcus faecium strain SH103、Enterococcus faecium strain SHU1563同源性为99%。该菌株的16s rRNA 序列如SEQ No.1所示,将其命名为屎肠球菌RKP-EF-21001。
上述菌株于2021年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23638。保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2屎肠球菌发酵液制备和冻干保存
将菌株RKP-EF-21001在MRS固体培养基上划线接种,37℃培养48h;取单菌落接种于MRS肉汤培养基中37℃下静置培养48h;以5%的比例接种于MRS肉汤培养基中扩大培养,37℃下静置培养48h。取培养液,4000r/min离心5min,留上清。将上清放入真空冷冻干燥机中,先在-70℃预冷冻2h,然后调整冻干温度为50℃、真空度10Pa,进行冻干。将冻干结束后的粉末收集低温保存。
实施例3 牛津杯抑菌实验
取0.4㎎屎肠球菌上清冻干粉溶于1ml 无菌生理盐水中,与大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029液体(109pfu/ml)1:1混合,对大肠杆菌ATCC-25922进行牛津杯抑菌实验,按表1中标记的组合进行牛津杯抑菌实验。
表1 抑菌实验分组
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结果如图1所示,屎肠球菌上清液冻干粉、噬菌体、屎肠球菌上清液冻干粉与噬菌体的组合物对大肠杆菌ATCC-25922有明显的抑菌作用。
实施例3菌株RKP-EF-21001上清冻干粉与噬菌体体外协同抑菌试验
(1)、菌株RKP-EF-21001上清冻干粉与噬菌体对大肠杆菌体外协同抑菌试验
取效价为109pfu/ml的噬菌体RDP-EC-16029增殖液0.1ml、菌浓度为109 cfu/ml 的大肠杆菌ATCC-25922宿主菌悬液0.1ml、冻干粉16mg加入至4ml LB肉汤培养基中,37℃、100rmp下培养,每隔5min测定其OD600值。另设阴性对照组为4 ml LB肉汤;阳性对照组加入0.1ml宿主大肠杆菌ATCC-25922增殖液。共测定48h。
结果如图2所示,16mg冻干粉与0.1ml 噬菌体 RDP-EC-16029的组合物对大肠杆菌ATCC-25922的抑菌时长明显长于0.1ml噬菌体 RDP-EC-16029和16mg菌株RKP-EF-21001冻干粉单独使用。0.1ml 噬菌体RDP-EC-16029单独处理的抑菌时长为2.5h, 16mg菌株RKP-EF-21001冻干粉单独处理的抑菌时长为7.5h,16mg冻干粉与0.1ml RDP-EC-16029噬菌体协同处理的抑菌时长为14h。
(2)、菌株RKP-EF-21001上清冻干粉与噬菌体对沙门氏菌体外协同抑菌试验
取效价为109pfu/ml的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118增殖液0.1ml、菌浓度为109cfu/ml 沙门氏菌CVCC-3376悬液0.1ml、菌株RKP-EF-21001冻干粉16mg加入至4ml LB肉汤培养基中,37℃、100rmp下培养,每隔5min测定其OD600值。另设阴性对照组为4 ml LB肉汤;阳性对照组加入0.1ml宿主沙门氏菌CVCC-3376增殖液。共测定70h。
如图3所示,16mg冻干粉与0.1ml 噬菌体RDP-SA-17118的组合物对沙门氏菌CVCC-3376的抑菌时长明显长于0.1 ml 噬菌体RDP-SA-17118和16mg菌株RKP-EF-21001冻干粉单独使用。0.1 ml 噬菌体RDP-SA-17118单独处理的抑菌时长为2.1h, 16mg菌株RKP-EF-21001冻干粉单独处理的抑菌时长为1h,16mg冻干粉与0.1ml 噬菌体RDP-SA-17118协同处理的抑菌时长为14.6h。
上述抑菌试验结果可以看出,本发明提供的屎肠球菌菌株RKP-EF-21001能够用于增强噬菌体的杀菌能力,可以用来制备具有杀菌能力的益生菌制剂,增强禽类的抵抗力,降低病变和病死率,提高养殖场的经济效益。
序列表
<110> 青岛润达生物科技有限公司
<120> 一种屎肠球菌菌株及其用途
<141> 2021-12-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 713
<212> RNA
<213> Enterococcus faecium
<400> 1
gggaggcgcg gcaacagcag cgacgcccca ccggagcgcc caccggaaaa agaggagggc 60
gaacggggag aacacgggga accgcccaca gaaggggaaa cacggaaaca gggcaaaccg 120
aaacaacgaa accgcaggga gaaaggcgcc ggggcgcgag gaggacccgc gggcaagcag 180
gggaggaacg gccaccaagg ccacgagcaa gccgaccgag aggggacggc cacagggacg 240
agacacggcc caaacccacg ggaggcagca gagggaaccg gcaaggacga aagcgaccga 300
gcaacgccgc ggaggaagaa ggcggacgaa aaccggagag aagaacaagg agagagaacg 360
cacccgacgg acaaccagaa agccacggca acacggccag cagccgcgga aacgaggggc 420
aagcggccgg aagggcgaaa gcgagcgcag gcggcaagcg aggaaagccc ccggccaacc 480
ggggagggca ggaaacggga gacgaggcag aagaggagag ggaaccagga gcgggaaagc 540
gagaaaggag gaacaccagg gcgaaggcgg cccggcgaac gacgcgaggc cgaaagcggg 600
ggagcaaaca ggaagaaccc ggagccacgc cgaaacgaga ggcagggggg gagggccgcc 660
ccaggcgcag caacgcaaag cacccgccgg gggagacgac cgcaagggaa acc 713

Claims (6)

1.一种屎肠球菌菌株,其特征在于:该菌株为屎肠球菌RKP-EF-21001,于2021年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23638。
2.一种如权利要求1所述的屎肠球菌菌株的用途,其特征在于:该菌株用于增强噬菌体杀菌能力。
3.根据权利要求2所述的屎肠球菌菌株的用途,其特征在于:该菌株用于制备增强噬菌体杀菌能力的制剂。
4.一种增强噬菌体杀菌能力的方法,其特征在于:该方法包括:
利用如权利要求1所述的屎肠球菌菌株制备菌液;
将制备好的菌液上清与噬菌体溶液混合。
5.一种具有杀菌能力的益生菌制剂,其特征在于:包含如权利要求1所述的屎肠球菌或其培养物。
6.根据权利要求5所述的具有杀菌能力的益生菌制剂,其特征在于:还包括噬菌体。
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