CN113383798A - 一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用 - Google Patents

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许文建
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Abstract

本发明公开了一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用，属于细菌性病害防治技术领域。所述新型复合制剂为噬菌体和益生菌配伍制剂，噬菌体和益生菌的组分比为1～5:5～1。本发明请求保护该新型复合制剂在弧菌病害、大肠杆菌病、沙门氏菌病、金黄色葡萄球菌病、由地毯草黄单胞菌致病变种侵染引起的溃疡病等细菌性病害中的应用；噬菌体和益生菌配伍的复合制剂能很好的控制弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、地毯草黄单胞菌菌群体数量，效果较二者的单独施用好。

Description

一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用
技术领域
本发明涉及细菌性病害防治领域，更具体地说，它涉及一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用。
背景技术
近年来，细菌性病害对水产养殖、毛皮动物养殖、家禽家畜养殖、农作物栽培等领域造成非常大的经济损失，针对细菌性病害的问题，研究者们也在不断地探寻新的解决方案，作为针对细菌具有专一性的噬菌体和绿色无应激性的益生菌也正逐步受到研究者们的亲睐，例如：
专利CN201710953780.5公布了利用2株副溶血弧菌噬菌体和3株溶藻弧菌噬菌体混合的鸡尾酒方案针对水产养殖中的弧菌进行防治；专利CN200510009788.3公布了利用副干酪乳杆菌HD1-7的天然代谢产物肽类作为防腐剂在大肠杆菌等致病菌中进行防治应用；专利CN201910354887.7公布了一种由地衣芽孢杆菌萎缩芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌所产抑菌物复配的鲜切果蔬保鲜剂；专利CN202010093203.5公布了一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用，能有效防治烟草青枯雷尔氏菌病害，缓解烟草青枯病害。
上述技术方案均未针对噬菌体与益生菌配伍的使用展开深入研究采用噬菌体或益生菌单一配伍的方案很难达到细菌性病害综合防治的预期，在噬菌体与益生菌配伍制备复合制剂这一方面仍存在技术空白。
发明内容
针对现有技术存在的空缺本发明的目的在于围绕噬菌体和益生菌的配伍使用为技术突破口，提供一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用，工艺可操作性强，具有普适性和推广性。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于：所述新型复合制剂为噬菌体和益生菌配伍制剂，噬菌体和益生菌的组分比为1～5∶5～1，该新型复合制剂在弧菌病害、大肠杆菌病、沙门氏菌病、金黄色葡萄球菌病、由地毯草黄单胞菌致病变种侵染引起的溃疡病等细菌性病害中的应用；
噬菌体和益生菌配伍的复合制剂能很好的控制弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、地毯草黄单胞菌菌群体数量，效果较二者的单独施用好。
进一步，所述噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体的一种或多种。
进一步，所述益生菌为植物乳杆菌、屎肠球菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、木糖葡萄球菌、酿酒酵母、干酪乳杆菌的一种或多种。
进一步，所述新型复合制剂为副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体和植物乳杆菌的复合制剂。
进一步，所述新型复合制剂为大肠杆菌噬菌体和屎肠球菌的复合制剂。
进一步，所述新型复合制剂为沙门氏菌噬菌体、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的复合制剂。
进一步，所述新型复合制剂为金黄色葡萄球菌噬菌体、干酪乳杆菌乳酸片球菌和木糖葡萄球菌的复合制剂。
进一步，所述新型复合制剂为地毯草黄单胞菌噬菌体和酿酒酵母的复合制剂。
进一步，所述噬菌体是依次通过如下步骤进行制备：种子培养，富集培养，除菌纯化和/或干燥；所述益生菌是依次通过如下步骤进行制备：种子培养，发酵培养，菌体收集和/或干燥。
综上所述，本发明具有以下有益效果：通过噬菌体与益生菌的配伍获得新型复合制剂，能够增强两者之间的优势，提高整体抑菌或杀菌的效果，改善生长环境，应用在细菌病害防治中，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号，部分菌株为市场购买获得。
副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016290。
副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016291。
副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016289。
溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)，保藏编号为CCTCCNO：M2018767，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；
溶藻弧菌噬菌体VAP9(Vibrio alginolyticus phage VAP9)，保藏编号为CCTCCNO：M 2018766，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；
溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phage VAP21)，保藏编号为CCTCCNO：M 2018768，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
大肠杆菌噬菌体CL1(Escherichia colili phage CL1)，保藏编号为CCTCC NO：M2018936，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体CL6(Escherichia coli phage CL6)，保藏编号为CCTCC NO：M2018932，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体CL7(Escherichia coli phage CL7)，保藏编号为CCTCC NO：M2018933，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日。
肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，
肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015145；
长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。
金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphy/ococcus aureus phage BP-13A)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号CCTCC NO：M 2016535。
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018579，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏时间为2018年09月12日。
以下实例中，供试菌株为市场购买获得该供试菌种处于公开状态科学工作者可以向相关单位索取。
植物乳杆菌菌株保藏编号为CCTCC AB 2013128；屎肠球菌保藏编号为CCTCC AB2010212；产朊假丝酵母编号为CCTCC AY91011；嗜酸乳杆菌编号为CCTCC AB 2010208；干酪乳杆菌编号为CCTCC AB 2011138；乳酸片球菌编号为CCTCC AB 204055；木糖葡萄球菌编号为CCTCC KB 20082105；酿酒酵母编号为CCTCC KY 2008613。
以下实例中，
TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。
MRS液体培养基的配方为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，酵母浸粉4g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1g，蒸馏水1000mL。
实施例1：
副溶血性弧菌噬菌体的制备
种子培养：将活化后的副溶血性弧菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得副溶血性弧菌宿主菌种子液。
富集培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。
除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得副溶血性弧菌噬菌体水剂，VP46、VP48和VP7的效价分别为5.7×1010PFU/mL、4.8×1010PFU/mL和4.5×1010PFU/mL。
干燥：按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，VP46、VP48和VP7的效价分别为1.1×1012PFU/g、9.5×1011PFU/g和73×1011PFU/g。
实施例2：
溶藻弧菌噬菌体的制备
种子培养：将活化后的溶藻弧菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得溶藻弧菌宿主菌种子液。
富集培养：将溶藻弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。
除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得溶藻弧菌噬菌体水剂，VAP7：VAP9和VAP21的效价分别为3.7×1010PFU/mL、2.8×1010PFU/mL和2.5×1010PFU/mL。
干燥：按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，VAP7：VAP9和VAP21的效价分别为8.2×1011PFU/g、9.4×1011PFU/g和7.9×1011PFU/g。
实施例3：
大肠杆菌噬菌体的制备
种子培养：将活化后的大肠杆菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
富集培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。
除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得大肠杆菌噬菌体水剂，CL1、CL6和CL7的效价分别为4.5×1010PFU/mL、3.4×1010PFU/mL和3.7×1010PFU/mL。
干燥：按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，CL1、CL6和CL7的效价分别为9.1×1011PFU/g、9.5×1011PFU/g和8.9×1011PFU/g。
实施例4：
沙门氏菌噬菌体的制备
种子培养：将活化后的沙门氏菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得沙门氏菌宿主菌种子液。
富集培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。
除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得沙门氏菌噬菌体水剂，BP-66、BP-63和BP-12的效价分别为4.7×1010PFU/mL、3.8×1010PFU/mL和3.9×1010PFU/mL。
干燥：按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，BP-66、BP-63和BP-12的效价分别为9.2×1011PFU/g、9.4×1011PFU/g和9.3×1011PFU/g。
实施例5：
金黄色葡萄球菌噬菌体的制备
种子培养：将活化后的金黄色葡萄球菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得金黄色葡萄球菌宿主菌种子液。
富集培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。
除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得金黄色葡萄球菌噬菌体水剂，BP-13A的效价为4.9×1010PFU/mL。
干燥：按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，BP-13A的效价为9.6×1011PFU/g。
实施例6：
地毯草黄单胞菌噬菌体的制备
种子培养：将活化后的地毯草黄单胞菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得地毯草黄单胞菌宿主菌种子液。
富集培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。
除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得地毯草黄单胞菌噬菌体水剂，YHC5的效价为5.1×1010PFU/mL。
干燥：按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，YHC5的效价为5.3×1011PFU/g。
实施例7：
植物乳杆菌的制备
种子培养：将活化后的植物乳杆菌，接入MRS培养基中，接种比例为10％，35℃静止培养12h，获得植物乳杆菌种子液。
发酵培养：将植物乳杆菌种子液接入MRS培养基中，接种比例为5％，50rpm，35℃培养10h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经10000rpm离心10min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得植物乳杆菌粉剂，活菌数为1.8×1011CFU/g。
实施例8：
屎肠球菌的制备
种子培养：将活化后的屎肠球菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，200rpm，37℃培养6h，获得屎肠球菌种子液。
发酵培养：将屎肠球菌种子液接入TSB培养基中，接种比例为6％，200rpm，37℃培养9h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经10000rpm离心10min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得屎肠球菌粉剂，活菌数为8.4×1010CFU/g。
实施例9：
产朊假丝酵母的制备
种子培养：将活化后的产朊假丝酵母，接入TSB培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得产朊假丝酵母种子液。
发酵培养：将产朊假丝酵母种子液接入TSB培养基中，接种比例为10％，200rpm，31℃培养24h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得产朊假丝酵母粉剂，活菌数为6.8×1010CFU/g。
实施例10：
嗜酸乳杆菌的制备
种子培养：将活化后的产朊假丝酵母，接入TSB培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得产朊假丝酵母种子液。
发酵培养：将嗜酸乳杆菌种子液接入TSB培养基中，接种比例为10％，200rpm，31℃培养24h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得嗜酸乳杆菌粉剂，活菌数为4.8×1010CFU/g。
实施例11：
干酪乳杆菌的制备
种子培养：将活化后的干酪乳杆菌，接入TSB培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得干酪乳杆菌种子液。
发酵培养：将干酪乳杆菌种子液接入TSB培养基中，接种比例为8％，200rpm，32℃培养24h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得干酪乳杆菌粉剂，活菌数为6.7×1010CFU/g。
实施例12：
乳酸片球菌的制备
种子培养：将活化后的乳酸片球菌，接入TSB培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得乳酸片球菌种子液。
发酵培养：将乳酸片球菌种子液接入TSB培养基中，接种比例为6％，200rpm，32℃培养24h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得乳酸片球菌粉剂，活菌数为7.8×1010CFU/g。
实施例13：
木糖葡萄球菌制备
种子培养：将活化后的木糖葡萄球菌，接入TSB培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得木糖葡萄球菌种子液。
发酵培养：将木糖葡萄球菌种子液接入TSB培养基中，接种比例为6％，200rpm，32℃培养24h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥：菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得木糖葡萄球菌粉剂，活菌数为5.8×1010CFU/g。
实施例14：
酿酒酵母制备
种子培养：将活化后的酿酒酵母，接入TSB培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得酿酒酵母种子液。
发酵培养：将酿酒酵母种子液接入TSB培养基中，接种比例为6％，200rpm，32℃培养24h。
菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。
干燥∶菌体按组分比3∶1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得酿酒酵母粉剂，活菌数为4.7×1010CFU/g。
实施例15：
副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体和植物乳杆菌复合制剂对南美白对虾早死综合征的应用
副溶血性弧菌噬菌体由实施例1制备获得；溶藻弧菌噬菌体由实施例2制备获得；植物乳杆菌由实施例7制备获得。
试验过程在南美白对虾的养殖池中加入终浓度为1×105CFU/mL副溶血性弧菌菌液、终浓度为1×105CFU/mL溶藻弧菌菌液对南美白对虾进行攻毒试验，试验分复合制剂组、噬菌体组、益生菌组、普通组和阴性对照组，连续观察2周，每日观察并统计南美白对虾的死淘率，结果详见表1。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1×106复合制剂，加水混匀后泼洒，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为4∶1，副溶血性弧菌噬菌体为粉剂，溶藻弧菌噬菌体为粉剂，植物乳杆菌为粉剂，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48和VP7的组分比为1∶1∶1；溶藻弧菌噬菌体VAP7∶VAP9∶VAP21的组分比为1∶1∶1。噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1×106PFU/mL副溶血性弧菌噬菌体、终浓度为1×106溶藻弧菌噬菌体加水混匀后泼洒，副溶血性弧菌噬菌体为粉剂，溶藻弧菌噬菌体为粉剂，VP46、VP48和VP7的组分比为1∶1∶1，VAP7∶VAPg∶VAP21的组分比为1∶1∶1。益生菌组为攻毒并添加终浓度为1×106CFU/mL植物乳杆菌加水混匀后泼洒，植物乳杆菌为粉剂。普通组为攻毒但不添加制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。死淘率＝(南美白对虾死淘数/南美白对虾总数)×100％。
表1复合制剂对南美白对虾死淘率的影响
Figure BDA0003146709700000141
Figure BDA0003146709700000151
如表1，复合制剂组与普通组的南美白对虾死淘率相比，前者更低，说明复合制剂对弧菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制死淘率方面结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善南美白对虾的水质环境，且对南美白对虾无其它毒害作用，安全性较高。
实施例16：
大肠杆菌噬菌体和屎肠球菌复合制剂对鸡脐炎病的应用，
大肠杆菌噬菌体由实施例3制备获得，屎肠球菌由实施例8制备获得。
试验过程：在雏鸡的饮用水中注入终浓度为1×105CFU/mL大肠杆菌菌液，对雏鸡进行攻毒试验。试验分阴性对照组、复合制剂组和普通组，连续观察2周，每日观察并统计雏鸡的病死率，结果详见表2。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1×106复合制剂，加水混匀后饲喂，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为1∶1，大肠杆菌噬菌体为水剂，屎肠球菌为粉剂大肠杆菌噬菌体和屎肠球菌的组分比为4∶1；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1×106PFU/mL大肠杆菌噬菌体，大肠杆菌噬菌体CL1∶CL6∶CL7组分比为1∶1∶1，加水混匀后饲喂，大肠杆菌噬菌体噬菌体为水剂；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1×106CFU/mL屎肠球菌，加水混匀后饲喂；普通组为攻毒但不含有复合制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。病死率＝(雏鸡病死数/雏鸡总数)×100％。
表2复合制剂对雏鸡病死率的影响
Figure BDA0003146709700000161
如表2，复合制剂组与普通组的雏鸡病死率相比，前者更低，说明复合制剂对沙门氏菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制病死率方面的结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善雏鸡的肠内环境，且对雏鸡无其它毒害作用，安全性较高。
实施例17：
沙门氏菌噬菌体、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌复合制剂对鸡白痢的应用
沙门氏菌噬菌体由实施例4制备获得产朊假丝酵母由实施例9制备获得；嗜酸乳杆菌由实施例10制备获得。
试验过程：在雏鸡的饮用水中注入终浓度为1×105CFU/mL沙门氏菌，对雏鸡进行攻毒试验，试验分复合制剂组、噬菌体组、益生菌组、普通组和阴性对照组，连续观察2周，每日观察并统计雏鸡的发病率，结果详见表3。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1×106复合制剂，加水混匀后饲喂，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为3∶2，沙门氏菌噬菌体为水剂，产朊假丝酵母为发酵代谢水剂，嗜酸乳杆菌为粉剂，产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌的组分比为1∶1；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1×106PFU/mL沙门氏菌噬菌体，沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63、长尾噬菌体BP-12的组合物，BP-66∶BP-63∶BP-12的比为1∶1∶1，加水混匀后饲喂，沙门氏菌噬菌体为水剂；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1×106CFU/mL益生菌，加水混匀后饲喂，产朊假丝酵母发酵代谢水剂，嗜酸乳杆菌为粉剂；普通组为攻毒但不含有复合制剂；阴性对照组为未作攻毒处理发病率＝(鸡白痢病发病数/雏鸡总数)×100％。
表3复合制剂对鸡白痢病发病率的影响
Figure BDA0003146709700000171
Figure BDA0003146709700000181
如表3，复合制剂组与普通组的鸡白痢病发病率相比，前者更低，说明复合制剂对沙门氏菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制雏鸡发病率方面的结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善雏鸡的发病率，且对雏鸡无其它毒害作用，安全性较高。
实施例18：
金黄色葡萄球菌噬菌体、干酪乳杆菌、乳酸片球菌和木糖葡萄球菌复合制剂对奶牛乳房炎的应用
金黄色葡萄球菌噬菌体由实施例5制备获得干酪乳杆菌由实施例11制备获得；乳酸片球菌由实施例12制备获得；木糖葡萄球菌由实施例13制备获得。
试验过程：对奶牛的乳房注入终浓度为1×105CFU/mL金黄色葡萄球菌，进行攻毒试验，试验分复合制剂组、噬菌体组、益生菌组、普通组和阴性对照组，连续观察2周，每日观察并统计奶牛的发病率，结果详见表4。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1×106复合制剂，加水混匀后注射，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为1∶3，金黄色葡萄球菌噬菌体为水剂，干酪乳杆菌为发酵代谢水剂，乳酸片球菌为粉剂，木糖葡萄球菌为粉剂，干酪乳杆菌、乳酸片球菌、木糖葡萄球菌的组分比为1∶1∶1；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1×106PFU/mL金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A，加水混匀后注射，金黄色葡萄球菌噬菌体为水剂；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1×106CFU/mL混合益生菌，加水混匀后注射；普通组为攻毒但不含有复合制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。发病率＝(奶牛乳房炎发病数/奶牛总数)×100％。
表4复合制剂对奶牛乳房炎发病率的影响
Figure BDA0003146709700000191
Figure BDA0003146709700000201
如表4，复合制剂组与普通组的奶牛乳房炎发病率相比，前者更低，说明复合制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制奶牛发病率方面的结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善奶牛的发病率，且对奶牛无其它毒害作用，安全性较高。
实施例19：
地毯草黄单胞菌噬菌体和酿酒酵母复合制剂对柑橘溃疡病的应用
地毯草黄单胞菌噬菌体由实施例6制备获得干酪乳杆菌由实施例11制备获得；乳酸片球菌由实施例12制备获得；木糖葡萄球菌由实施例13制备获得。
试验过程：对柑橘注入终浓度为1×105CFU/mL地毯草黄单胞菌，进行攻毒试验，试验分复合制剂组、噬菌体组益生菌组普通组和阴性对照组，连续观察2周，每日观察并统计柑橘的发病率，结果详见表4。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1×106复合制剂，加水混匀后注射，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为2∶1，地毯草黄单胞菌噬菌体为水剂，酿酒酵母为粉剂；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1×106PFU/mL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5，加水混匀后注射，地毯草黄单胞菌噬菌体为水剂；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1×106CFU/mL益生菌，加水混匀后注射；普通组为攻毒但不含有复合制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。发病率＝(柑橘溃疡病发病数/柑橘总数)×100％。
表5复合制剂对柑橘溃疡病发病率的影响
Figure BDA0003146709700000211
如表5，复合制剂组与普通组的柑橘溃疡病发病率相比，前者更低，说明复合制剂对地毯草黄单胞菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制柑橘溃疡病发病率方面的结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善柑橘溃疡病的发病率，且对柑橘无其它毒害作用，安全性较高。
综合实施例1-19，所制备的新型复合制剂，能够充分体现出噬菌体和益生菌各自的优势，能针对细菌性病害均起到显著的防治效果，且过程温和，无应激性反应，绿色环保，安全性较高，在细菌性病害应用领域具有广阔前景。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于：所述新型复合制剂为噬菌体和益生菌配伍制剂，噬菌体和益生菌的组分比为1～5:5～1，该新型复合制剂在弧菌病害、大肠杆菌病、沙门氏菌病、金黄色葡萄球菌病、由地毯草黄单胞菌致病变种侵染引起的溃疡病等细菌性病害中的应用；
噬菌体和益生菌配伍的复合制剂能很好的控制弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、地毯草黄单胞菌菌群体数量，效果较二者的单独施用好。
2.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体的一种或多种。
3.根据权利要求2所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述益生菌为植物乳杆菌、屎肠球菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌 、乳酸片球菌、木糖葡萄球菌、酿酒酵母、干酪乳杆菌的一种或多种。
4.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述新型复合制剂为副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体和植物乳杆菌的复合制剂。
5.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述新型复合制剂为大肠杆菌噬菌体和屎肠球菌的复合制剂。
6.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述新型复合制剂为沙门氏菌噬菌体、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的复合制剂。
7.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述新型复合制剂为金黄色葡萄球菌噬菌体、干酪乳杆菌、乳酸片球菌和木糖葡萄球菌的复合制剂。
8.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述新型复合制剂为地毯草黄单胞菌噬菌体和酿酒酵母的复合制剂。
9.根据权利要求1所述一种新型复合制剂在细菌性病害中的应用，其特征在于，所述噬菌体是依次通过如下步骤进行制备：种子培养，富集培养，除菌纯化和/或干燥；所述益生菌是依次通过如下步骤进行制备：种子培养，发酵培养，菌体收集和/或干燥。
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