CN114767936B - 复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，包括以下步骤：丝素/海藻酸钠材料制成片状材料，酒精浸泡再紫外照射使酒精挥发；使用MRS培养液培养干酪乳杆菌，制得干酪乳杆菌菌液；将所得片状材料置于培养容器内，用新鲜MRS培养液浸润，再取所得干酪乳杆菌菌液，均匀滴加到片状材料上，置于培养箱中孵育，每12小时更换一次MRS培养液；本发明方法可以提高干酪乳杆菌在丝素/海藻酸钠材料上的附着率，使其在材料表面形成生物膜，且由于益生菌生物膜的存在，使材料具备了抗菌能力；经SD大鼠金色葡萄球菌感染型全层皮肤缺损修复实验证明该材料可以促进创面的愈合，对于临床皮肤修复的应用具有重要的现实指导意义。

Description

复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及皮肤损伤修复支架材料制备方法。
背景技术
在临床实践中，由于各种原因引起的急慢性皮肤缺损的发生率很高。皮肤缺损的修复和功能重建已成为临床亟待解决的重大问题。近些年来，促进创面愈合的研究有了一定的突破，其中益生菌治疗为解决这一难题提供了新的思路。已有研究表明益生菌能够产生乳酸和细菌素等物质抑制金色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，体内实验证明，益生菌能够调节巨噬细胞极化，加速血管生成，从而达到治疗伤口的效果。单纯的益生菌制品难于保存，形成的生物膜容易破损，我们希望通过一种能够负载益生菌的支架材料作为敷料，为治疗难愈合创面提供新的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料的制备方法，以提高干酪乳杆菌在材料上的附着率，实现干酪乳杆菌在材料上的黏附和生存。
为达到上述目的，采用技术方案如下：
复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，包括以下步骤：
(1)丝素/海藻酸钠材料制成片状材料，酒精浸泡再紫外照射使酒精挥发；
(2)使用MRS培养液培养干酪乳杆菌，制得干酪乳杆菌菌液；
(3)将步骤1所得片状材料置于培养容器内，用新鲜MRS培养液浸润，再取步骤2所得干酪乳杆菌菌液，均匀滴加到片状材料上，置于培养箱中孵育，每12小时更换一次MRS培养液。
按上述方案，步骤1中所述片状材料为圆形、正方形或长方形；尺寸在5-20mm之间。
按上述方案，步骤2中所述干酪乳杆菌出自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为AB 2011138。
按上述方案，步骤2所述MRS培养液的制备：
牛肉膏8g/L，磷酸氢二钾2g/L，蛋白胨10g/L，硫酸锰0.04g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温－80为1ml/L；
调pH至6.2，121℃高温高压灭菌15min。
按上述方案，步骤2具体过程如下：
将4℃冷冻保存的干酪乳杆菌菌种解冻后，取100μl接种于100mlMRS培养液中混匀后严格密封，置于37℃恒温培养箱中孵育24小时；
将培养后的菌液在以1:1000的接种量接种于100ml MRS培养液中，培养24h制得干酪乳杆菌菌液。
按上述方案，步骤3中所述的培养容器是48孔板、24孔板、6孔板或培养皿。
按上述方案，步骤3中所述片状材料有孔隙的一面朝上。
按上述方案，步骤3中使用微量移液器少量多次的均匀滴加干酪乳杆菌菌液于片状材料表面，每次滴加的菌液宜为10μl～20μl不溢出。
本发明的有益效果在于：
本发明方法可以提高干酪乳杆菌在丝素/海藻酸钠材料上的附着率，使其在材料表面形成生物膜，且由于益生菌生物膜的存在，使材料具备了抗菌能力；
经SD大鼠金色葡萄球菌感染型全层皮肤缺损修复实验证明该材料可以促进创面的愈合，对于该功能材料在未来临床皮肤修复的应用具有重要的现实指导意义。
附图说明
图1：丝素/海藻酸钠材料扫描电镜示意图；
图2：复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料扫描电镜示意图；
图3：复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料的体外抑菌效果示意图；
图4：复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料治疗SD大鼠金色葡萄球菌感染型全层皮肤缺损的创面愈合示意图；
图5：复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料治疗SD大鼠金色葡萄球菌感染型全层皮肤缺损的体内抑菌效果示意图；
图6：人复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料治疗SD大鼠金色葡萄球菌感染型全层皮肤缺损的H&E染色示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步阐释本发明的技术方案，但不作为对本发明保护范围的限制。
具体实施方式提供了复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，包括将干酪乳杆菌与丝素/海藻酸钠材料复合培养，使其在材料表面形成生物膜。具体步骤如下：
(1)材料灭菌：用超薄刀片切去丝素/海藻酸钠材料表层，使其厚度均匀，露出孔隙，用打孔器将材料制成圆片，用95％医用级酒精浸泡4小时，再紫外照射使酒精挥发。
(2)干酪乳杆菌菌液的制备：使用MRS培养基培养干酪乳杆菌，调节PH至6.2左右，将4℃冷冻保存的干酪乳杆菌菌种解冻后，以1:1000的比例进行培养活化，严格密封置于37℃培养箱中孵育24小时以上，将培养后的菌液在以2.5:100的接种量接种于100ml MRS培养液中，培养24h制得干酪乳杆菌菌液。
(3)附着：将材料圆片置于孔板内，有孔隙的面朝上，用新鲜MRS培养基浸润，再取干酪乳杆菌菌液，用移液器以每次10μl的量，均匀滴加到支架材料上，随后补充足量MRS培养液，置于培养箱中孵育，每12小时更换一次MRS培养基。
具体实施例中采用的MRS培养基制备过程如下：
牛肉膏8g/L，磷酸氢二钾2g/L，蛋白胨10g/L，硫酸锰0.04g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温－80为1ml/L；调pH至6.2，121℃高温高压灭菌15min。
实施例1
复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料的制备：
(1)材料灭菌处理：用超薄刀片切去丝素/海藻酸钠材料表层，使其厚度均匀，露出孔隙，用打孔器将材料制成7mm圆片，95％医用级酒精浸泡4小时，再用紫外照射使酒精挥发，然后密封保存于4℃冰箱备用。丝素/海藻酸钠材料扫描电镜示意图如图1所示。
(2)干酪乳杆菌菌液的制备：
干酪乳杆菌培养：将4℃冷冻保存的干酪乳杆菌菌种解冻后，取100μl接种于1000mlMRS液体培养基中，在三角瓶中混匀后严格密封，置于37℃恒温培养箱中孵育24小时。将培养后的菌液在以2.5:100的接种量接种于100ml MRS肉汤培养基中，培养24h，活化菌种。活化完成后，即可进行实验。
(3)附着：
在超净工作台中用镊子将材料圆片置于24孔板内，注意哑光面朝上，露出孔隙，便于干酪乳杆菌附着。用移液器向材料上缓慢滴加100μl新鲜MRS培养，使材料润湿，再用移液器将干酪乳杆菌菌液缓慢逐次滴加到材料表面，每次滴加的量宜为10μl～20μl，滴加的总量为100μl，此时材料刚好处于吸附饱和状态，孔板内几乎没有多余的培养液析出。在24孔板中补充足量MRS肉汤培养基(约1ml)，孔板四周的孔中加入PBS缓冲液，防止挥发。将孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养1、3、5天，每12小时更换MRS培养基。
取步骤(3)中的材料圆片用2.5％戊二醛固定，避光置于4℃冰箱过夜，吸出戊二醛，PBS润洗两次，然后对材料进行脱水处理，脱水按照梯度酒精(30％，50％，70％，80％，90％，95％)分别处理10min以上，然后用无水乙醇彻底脱水两次。将脱水后的材料用导电胶固定在样品台上，电镀后进行SEM拍摄。复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料扫描电镜示意图见图2所示。
取上述步骤(3)中的材料圆片，以不负载干酪乳杆菌的材料做对照进行抑菌圈实验，即在金色葡萄球菌的琼脂培养皿上，用100μl浓度为109CFU/ml的金球菌菌液涂布平板，然后放置两种材料圆片，培养12h后，观察抑菌圈大小。复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料的体外抑菌效果示意图件图3所示。
实施例2
应用复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠支架材料修复SD大鼠金色葡萄球菌感染型全层皮肤缺损。
将按照此方法孵育24h的材料圆片移植到SD大鼠经金色葡萄球菌感染的背部皮肤缺损处，检测愈合效果。所使用的材料直径为10mm。
1、动物模型制造：取6只体重220g的雄性SD大鼠，使用0.4％的戊巴比妥钠，按照1ml/100g体重剂量腹腔麻醉大鼠，所有手术操作均在经过灭菌的房间进行。使用剃毛器褪去大鼠背部及腹部的毛发，碘伏擦拭消毒，双手轻轻绷紧大鼠皮肤，在接近上肢的部位使用10mm的冲孔器轻压出一个圆形，并用记号笔描记，左右各一，使用手术剪刀沿边缘剪去皮肤，深度达到筋膜，制造直径为10mm的圆形全层皮肤缺损。用移液器取100μl浓度为109CFU/ml的金色葡萄球菌菌液滴加到伤口处，静置20nin造成感染。
2、手术分组：随机将SD大鼠分为3组，其中control组为无治疗组；SF/SA组为单纯材料组，使用MRS肉汤培养基孵育24h的无益生菌材料填充伤口，覆盖凡士林纱布并缝合边缘固定，然后覆盖灭菌纱布包扎，最后用医用弹力绷带固定2-3圈；L-SF/SA组为复合干酪乳杆菌材料组，使用复合干酪乳杆菌培养24h的材料填充伤口，包扎方法同上。实验动物采取单笼喂养，避免动物之间互相舔舐伤口，每天观察SD大鼠的饲养情况及检查伤口材料是否脱落。
3、大体观察：手术4、7、12天时取一只SD大鼠，麻醉，剪开纱布，用尺子衡量并拍照，用计算机图像分析软件计算创面愈合率。大体形态学观察皮肤愈合情况结果如图4所示，复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料组显示出更高的愈合率。
4、体内抑菌实验：手术4、7、12天时取一只SD大鼠，麻醉，剪开纱布，用无菌棉棒蘸取伤口表面，将棉棒置于10ml PBS的离心管中，混匀后，取100μl溶液在金球菌琼脂培养皿上均匀涂布，12h后进行菌落计数。结果如图5所示，复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料组的金球菌数量明显减少。
5、组织学观察：动物麻醉拍照后，即可进行取材，取材时沿初始伤口的外缘完整切除整块大鼠皮肤组织，深度达背部肌肉层，以保证创面组织的完整性。所有标本切取后保存在多聚甲醛组织固定液中，做H&E染色分析。结果如图6所示，复合干酪乳杆菌的丝素/海藻酸钠材料组更早的形成上皮化，且有毛囊样皮肤附属器结构形成。

Claims (6)

1.复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)丝素/海藻酸钠材料制成片状材料，酒精浸泡再紫外照射使酒精挥发；
(2)使用MRS培养液培养干酪乳杆菌，制得干酪乳杆菌菌液；所述干酪乳杆菌出自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为AB2011138；
(3)将步骤1所得片状材料置于培养容器内，用新鲜MRS培养液浸润，再取步骤2所得干酪乳杆菌菌液，均匀滴加到片状材料上，置于培养箱中孵育，每12小时更换一次MRS培养液；
所述MRS培养液的制备：
牛肉膏8g/L，磷酸氢二钾2g/L，蛋白胨10g/L，硫酸锰0.04g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温－80为1ml/L；调pH至6.2，121℃高温高压灭菌15min。
2.如权利要求1所述复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，其特征在于步骤1中所述片状材料为圆形、正方形或长方形；尺寸在5-20mm之间。
3.如权利要求1所述复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，其特征在于步骤2具体过程如下：
将4℃冷冻保存的干酪乳杆菌菌种解冻后，取100μl接种于100mlMRS培养液中混匀后严格密封，置于37℃恒温培养箱中孵育24小时；
将培养后的菌液在以1:1000的接种量接种于100mlMRS培养液中，培养24h制得干酪乳杆菌菌液。
4.如权利要求1所述复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，其特征在于步骤3中所述的培养容器是48孔板、24孔板、6孔板或培养皿。
5.如权利要求1所述复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，其特征在于步骤3中所述片状材料有孔隙的一面朝上。
6.如权利要求1所述复合干酪乳杆菌的皮肤损伤修复支架材料制备方法，其特征在于步骤3中使用微量移液器少量多次的均匀滴加干酪乳杆菌菌液于片状材料表面，每次滴加的菌液宜为10μl～20μl不溢出。
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