JP7045671B2 - 皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物、その製造方法、及び創傷被覆材 - Google Patents
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Description
<1.凝集型の乳酸菌末の製造>
乳酸菌としては、Enterococcus faecalis KH2(受託番号:NITE P-14444)(以下、「EF菌」とする。)を用いた。
<2.分散型の乳酸菌末の製造>
EF菌を前記と同様にして培養し、得られた培養液を前記と同様にして加熱して殺菌処理を行った。
<I.粒度分布の測定>
上記で得られた凝集型乳酸菌末と、分散型乳酸菌末とを、乾燥菌体換算で10mg/mLになるように精製水にそれぞれ懸濁した(サンプル溶液)。懸濁液中の乳酸菌の粒度分布を、「レーザー回折式粒度分布測定装置SALD-3100」(商品名、株式会社島津製作所製)を用いて測定した。具体的には、フローセルを使用し、水を測定溶媒とし、屈折率が1.50-0.00i、測定回数を2、平均回数を64、測定吸光度範囲の最大値を0.2、最小値を0.02として、サンプル溶液を測定範囲に達するまで添加して測定した。メジアン径の測定結果を表1と図1に、粒度分布を図2,3に示す。図2における(A)はデキストリン0質量%、(B)はデキストリン10質量%、(C)はデキストリン15質量%を示し、図3における(D)はデキストリン20質量%、(E)はデキストリン25質量%、(F)はデキストリン50質量%の結果を示す。
<II.野生型マウスにおける皮膚創傷治癒の検討(対照)>
本検討では、乾燥終濃度としてデキストリンを10質量%添加し乾燥粉末化した凝集型乳酸菌末(以下「対照菌末」とする)を用いた。
C57BL/6マウスの背側を剃毛し皮膚を完全に露出させ、70v/v%エタノールで消毒したのち、皮膚生検用6mmパンチとハサミを用い、マウス1匹につき4つの皮筋に達する全層欠損創を作成した。対照菌末群には、創作成直後に対照菌末を創部に0.1,10 μg/5 μL/wound の各濃度で投与し、コントロール群には生理食塩水を投与した。創部をポリウレタンフィルムと弾性粘着包帯で閉鎖環境におき、創作成7,10日目に創部を観察した。
創閉鎖率を測定した結果を図4に示す。メジアン径が1.0μmよりも大きい乳酸菌である対照菌末を投与した対照菌末群は、コントロール群と同等の閉鎖率であり、対照菌末が創閉鎖に与える影響は認められなかった。更に濃度依存的な有効性も認められず、逆に濃度を上げることで創閉鎖に与える影響が低下する可能性も推察できる。
<III.野生型マウスにおける皮膚創傷治癒の検討(その1)>
以下の検討では、上記で調製した、デキストリンを50質量%添加して菌体を分散させた分散型乳酸菌末(以下「実施例菌末」とする)を用いた。
上記と同様に、C57BL/6マウスに全層欠損創を作成した。実施例菌末群には、創作成直後に実施例菌末を創部に、1,10,100,1000 μg/5 μL/wound の各濃度で投与し、コントロール群には、デキストリンを投与した。創部をポリウレタンフィルムと弾性粘着包帯で閉鎖環境におき、創作成1,7,10,14日目にマウスを犠牲死させた後、ハサミで創部を含めた皮膚組織を摘出した。
マウス創作成後と創摘出時に、創部の写真をデジタルカメラで撮影し、創閉鎖率を算出した。
摘出した皮膚組織を、4v/v%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液にて固定し、パラフィンに包埋した。半切した面から厚さ3μmの切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施した。HE染色をした組織は、炎症像の観察、再上皮化率の算出に用いた。再上皮化率算出には、以下の数式(2)を用いた。
皮膚組織のtotal RNA を抽出した後、complement DNA(cDNA)を合成した。そのcDNAをtemplateとし、下記の特異的プライマーを用い(内部標準としてACTBを用いた)、StepOne and StepOnePlus リアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher Scientific,USA)でリアルタイムPCR法を行った。表2には、各遺伝子のPCRに用いたプライマーの塩基配列を示す。
摘出した皮膚組織をホモジネートし生理食塩水にて4倍希釈したものを測定サンプルとして用いた。bFGF測定にはQuantikine ELISA Mouse/ Rat FGF basic(R&D SYSTEMS a bio-techne)、TGF-β1測定にはMouse/ Rat/ Porcine/ Canine TGF-β1(R&D SYSTEMS a bio-techne)、VEGF測定にはMouse VEGF(R&D SYSTEMS a bio-techne)を用い、それぞれのキットに添付の方法に従いエライザ法を行った。
(1)創部へ与える影響(病理像での確認)
創部炎症反応を観察するため、創作成後1日目の病理像を図5に示す。図5に示されるように、デキストリンを投与したコントロール群ではほとんど白血球の浸潤が認められなかったのに対し、実施例菌末 1,10,100 μg/wound群では白血球の浸潤を認めた(黒矢印:白血球、白矢印:線維芽細胞)。実施例菌末 100 μg/wound群では、白血球のみならず線維芽細胞の集積も認められた。
炎症性サイトカイン産生への影響について解析するため、創作成後1日目の創部における各サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-10)のmRNA発現について解析を行った結果を図6に示す。図6に示されるように、TNF-α、IL-1βのmRNA発現は実施例菌末の濃度依存的に発現の増加がみられた。IL-10のmRNA発現はコントロール群と比較して、実施例菌末 10, 100 μg/wound群で有意に増加した。
創作成後0,10,14日目の創部の所見を図7に示す。図7に示されるように、コントロール群と比較すると、実施例菌末 100, 1000 μg/wound群で有意に創閉鎖が確認された。
創作成後10日目に創部を含む皮膚組織を摘出し、HE染色を施し再上皮化と肉芽組織の観察を行った。創作成後10日目の病理像を図9に示す。また、創作成後10日目の肉芽の高さを測定した結果を図10に示す。図9,10に示されるように、肉芽の高さは、コントロール群と比較し、実施例菌末1000 μg/wound群で有意に増加した。
実施例菌末投与による創部の増殖因子発現への影響について、より詳細に解析するため、bFGFのmRNA発現量を前述した方法で測定した。創作成後10日目のbFGFのmRNA発現量を図13に示す。図13に示されるように、コントロール群と比較し、実施例菌末 1000 μg/wound群で有意に増加した。
実施例菌末投与による創部の増殖因子への影響について、より詳細に解析するため、bFGF、TGF-β1、VEGFの各タンパク質発現量を測定した。その結果を図14~16に示す。
<IV.糖尿病マウスのおける皮膚創傷治癒の検討>
1.方法
糖尿病マウスとして、創作成10日前にC57BL/6マウスにストレプトゾトシンを腹腔に単回投与したマウスを用いた。
マウス創作成後と創摘出時に、創部の写真をデジタルカメラで撮影し、創閉鎖率を算出した。
摘出した皮膚組織をホモジネートし生理食塩水にて4倍希釈したものを測定サンプルとして用いた。TGF-β1測定にはMouse/ Rat/ Porcine/ Canine TGF-β1(R&D SYSTEMS a bio-techne)を用い、キットに添付の方法に従いエライザ法を行った。
(1)創閉鎖に与える影響
創作成後0,7日目の肉眼所見を図17に示す。また、創作成後7日目の創閉鎖率を図18に示す。図17,18に示されるように、糖尿病マウスにおいて、コントロール群と比較すると実施例菌末群で有意に創閉鎖が促進されていた。
実施例菌末投与による創部増殖因子への影響について、より詳細に解析するため創部におけるTGF-β1量を測定した。創作成後7日目のTGF-β1量を図19に示す。
<V.野生型マウスにおける皮膚創傷治癒の検討(その2)>
1.方法
試験例3と同様にして、C57BL/6マウスに全層欠損創を作成し、創作成直後に実施例菌末を創部に1000 μg/5 μL/wound の濃度で投与し、コントロール群にはデキストリンを投与した。創部をポリウレタンフィルムと弾性粘着包帯で閉鎖環境におき、創作成から所定日数後にマウスを犠牲死させた後、ハサミで創部を含めた皮膚組織を摘出した。
摘出した皮膚組織をホモジネートし生理食塩水にて4倍希釈したものを測定サンプルとして用いた。各サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6)のタンパク質発現量をELISAキット (R&D SYSTEMS, Minneapolis, USA) を用いて測定し、摘出した皮膚組織1gあたりの値で示した。
摘出した皮膚組織を、4v/v%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液にて固定し、パラフィンに包埋した。半切した面から厚さ3μmの切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施した。このHE染色を施した組織像の観察により、上記と同様にして再上皮化率を算出し、また、肉芽部分の面積を測定した。
上記と同様にして別途作成した組織切片に対し、抗CD31抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA USA) を用いて免疫染色を行い、肉芽組織中の5視野を観察して、その単位視野面積当たりのCD31陽性血管数を求めた。
(1)創部における炎症性サイトカイン産生への影響
図20には、創作成後1、3、5日目の創部における各サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6)のタンパク質発現量について調べた結果を示す。図20(A)に示されるように、TNF-αの発現量は、創作成後1、3、5日目のいずれにおいても、デキストリンを投与したコントロール群と比べて、実施例菌末投与群で有意に高値を示した。特に創作成後1日目では、顕著に高い値であった。また、図20(B)に示されるように、IL-1βでは、有意差は得られなかったものの、創作成後1、3、5日目のすべてで、実施例菌末投与群で高くなる傾向が認められた。また、図20(C)に示されるように、IL-6の発現量は、創作成後1、5日目で有意に高値を示した。
創作成後5、7、10日目に創部を含む皮膚組織を摘出し、HE染色を施し再上皮化と肉芽組織の観察を行った。図21(A)には、創作成後5、7、10日目の再上皮化率の結果を示す。また、図21(B)には、創作成後7、10日目の肉芽面積を測定した結果を示す。
図22(A)には、創作成後10日目の創部について、摘出した皮膚組織から作成した組織切片に対する、抗CD31抗体による免疫染色の結果を示す。また、図22(B)には、観察した組織切片の単位視野面積当たりのCD31陽性血管数の結果を示す図表である。図22(B)に示されるように、創部の視野単位面積当たりのCD31陽性血管数は、実施例菌末投与群で有意に高値を示した。
<VI.抗菌試験>
1.方法
黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus, ATCC6538P)ないしは大腸菌 (Escherichia coli, ATCC8739)に対する抗菌性についてin vitroにて評価した。具体的には、実施例菌末を水に100 mg/mLの濃度に懸濁させて、その500μLを円形シャーレに充填した標準寒天培地 (日水製薬株式会社)の培地表面の一面に塗布して、37℃で2時間置き、菌末懸濁液の水分を寒天培地に吸収させた後、黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus, ATCC6538P)、又は大腸菌 (Escherichia coli, ATCC8739)を、それぞれ6×104、 6×105、6×106CFU/mLの菌数濃度でスポット状に接種し、37℃で24時間静置後に撮像して菌のスポット面積を測定した。
その結果、図23に示されるように、実施例菌末を塗布した寒天培地上では、黄色ブドウ球菌又は大腸菌の菌懸濁液をスポットして37℃で24時間静置したときのスポット面積が、デキストリンを塗布した寒天培地上に比べて有意に減少していた。よって、実施例菌末の作用によって、黄色ブドウ球菌又は大腸菌の生育が有意に抑制されることが明らかとなった。
Claims (12)
- 乳酸菌の死菌体であって、湿式によるレーザー回折散乱法により測定された菌体粒子のメジアン径が1.0μm以下である、該乳酸菌末を有効成分とすることを特徴とする皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 創部の肉芽組織の増殖を促進させる、請求項1に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 創部の再上皮化の速度を増加させる、請求項1又は2に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 創部の血管新生を促進させる、請求項1~3のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 創部皮膚組織のTNF-α、IL-1β、IL-6、及び/又はIL-10の発現を誘導する、請求項1~4のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 創部皮膚組織のbFGF、及び/又はTGF-β1の発現を誘導する、請求項1~5のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 創部皮膚組織のVEGFの発現を誘導する、請求項1~6のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、及びエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)からなる群から選択された1種又は2種以上である、請求項1~7のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 前記乳酸菌は、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)である、請求項1~7のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 粉末状の形態である前記乳酸菌末と可溶性賦形剤とを含有する、請求項1~9のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物。
- 乳酸菌が含有された菌体濃縮液を、乳酸菌の含有量が該濃縮液中に乾燥菌体換算で0.01質量%以上20質量%未満となるように調製し、該菌体濃縮液に可溶性賦形剤を乾燥終濃度で12質量%以上となるように添加し、該可溶性賦形剤を添加した菌体濃縮液を粉砕・分散した後、乾燥粉末化することにより、乳酸菌の死菌体であって、湿式によるレーザー回折散乱法により測定された菌体粒子のメジアン径が1.0μm以下である、該乳酸菌末を得ることを特徴とする皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物の製造方法。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の皮膚塗布用の皮膚創傷治癒促進組成物を含有することを特徴とする創傷被覆材。
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