CN110257292B

CN110257292B - 一种水产养殖用的微生物菌剂及其制备方法

Info

Publication number: CN110257292B
Application number: CN201910568033.9A
Authority: CN
Inventors: 彭健; 闵军; 胡晓珂
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: CN110257292A

Abstract

本发明属于微生物制品领域，特别涉及一种水产养殖用的微生物菌剂及其制备方法。菌剂发酵获得混合菌培养物；其中，混合菌为按重量百分比计，嗜酸乳杆菌10‑25％、枯草芽孢杆菌10％‑20％、双歧杆菌8％‑20％、光合细菌8％‑25％、巨大芽孢杆菌12％‑20％、粪链球菌5％‑15％和硝化菌4％‑12％。本发明中的微生物菌种通过牡蛎粉吸附，使各微生物菌种获得有利生存空间，缓解外界环境刺激，使得微生物菌剂具有良好的稳定性和高效性，施加至水体后能快速繁殖形成优势种群，快速分解水产养殖水体中的大分子有机质、残饵粪便等，降解水体中的氨氮、磷、亚硝酸盐、硫化氢等物质，净化水质，提高水体溶氧含量，抑制有害病菌和有害藻类的滋生，改善水生动物肠道环境，增强体质。

Description

一种水产养殖用的微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物制品领域，特别涉及一种水产养殖用的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

水产养殖是指在人为控制下繁殖、培育和收获水生产品的生产活动，包括在人工饲养管理下从苗种养成水产品的全过程。水体是水产动物生存生长所必须依赖的环境，水质的好坏是水产养殖特别是集约化养殖成败的关键。目前的水产养殖模式还大都是以多品种、高密度、大量施肥投饵从而获得高产量的传统养殖模式，人类的活动和养殖对象自身的分泌物和排泄物、饵料过剩、药物残留等因素极易导致养殖水体污染，水质因子平衡失调，使得水中氨氮、磷、亚硝酸盐、硫化氢等物质迅速升高，引起水产养殖动物发病甚至大批量死亡。

微生物菌剂是从天然环境中筛选出来的微生物菌体，经培养、繁殖后制成的含有大量有益菌的活菌制剂，已广泛应用于水产养殖、污水处理、水改良土壤、堆肥除臭等众多领域。当前以抗生素、激素、防腐剂为主的饲料药物添加剂给水产养殖业生产带来了很大的效益，这类饲料能够达到部分控制疾病发生、促进养殖动物生长的目的，但由此带来的药物残留、二次污染、水产品质量安全等问题愈发严重。而微生物菌剂主要通过调节水环境微生物平衡，拮抗致病微生物，降解养殖过程中有机废物等来达到提高水生生物的免疫力、抗病力、促生长和净化水质等作用，具有种类全、配伍合理、功能性强、经济效益高等优良特点。

因此，开发和推广一种具有保健、防疫和促生长的水产养殖用微生物菌剂来替代含有抗生素、激素、防腐剂的饲料已成为当务之急。

发明内容

本发明针对目前水产养殖的中水体底部污染严重等问题，提供了一种水产养殖用微生物菌剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供技术方案如下：

一种水产养殖用的微生物菌剂，菌剂发酵获得混合菌培养物；其中，混合菌为按重量百分比计，嗜酸乳杆菌10％-25％、枯草芽孢杆菌10％-20％、双歧杆菌8％-20％、光合细菌8％-25％、巨大芽孢杆菌12％-20％、粪链球菌5％-15％和硝化菌4％-12％。

所述混合菌为按重量百分比计，嗜酸乳杆菌16％-18％、枯草芽孢杆菌13％-15％、双歧杆菌12％-15％、光合细菌14％-18％、巨大芽孢杆菌15％-17％，粪链球菌9％-12％，硝化菌7％-10％。

上述各菌株中，嗜酸乳酸菌应用于水产养殖可改善水体环境、在宿主体内定植而抑制病原菌的增殖、补充必要的营养物质、维持微生态平衡及增强机体免疫机能，且能在水体环境中良好生存并发挥优势菌群作用。

枯草芽孢杆菌能大量消耗水体中的有机质，将其分解为小分子有机酸、氨基酸及氨，改善水质，为单胞藻提供营养，净化水质。双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物。双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对水产动物健康具有生物屏障、营养作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。

光合细菌是一大类在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称。具有多种异养功能：固氮、脱氮：固碳、硫化物氧化等，与水体中的氮磷、硫循环密切相关，在水体的自净过程中扮演着重要角色。巨大芽孢杆菌为产孢杆菌，且为革兰氏阳性菌及好氧菌，是有机磷的分解菌。在水产养殖方面能分解水体过量的磷元素，能有效提高水产动物对饲料的利用率，提升经济效益。粪链球菌属于乳酸菌中的一种，其能调节动物胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能。提高食物消化率和生物效价，降低血清胆固醇，控制内毒素。抑制肠道内腐败菌生长；提高机体免疫力。

所述混合菌按3-5％的接种量接种于发酵营养液中发酵培养，将添加进行发酵，将发酵产物与牡蛎粉混合振荡培养充分混匀，离心、收集沉淀、干燥即为水产养殖用微生物菌剂；发酵营养液按重量份数计为乙酸30-50份、乙醇50-70份、蔗糖水150-200份、硫酸镁10-30份、磷酸二氢钾20-50份、氯化钠50-100份、碳酸钠20-50份、葡萄糖150-300份和蒸馏水300-500份。

所述发酵产物和50目蛭石的质量比1:5-1:10的比例混合，于30-37℃下振荡培养时间为8-12h。

所述混合菌为按上述比例将各培养至对数生长期的菌株混合，混合后添加冻干保护剂，而后真空干燥，待用；其中，混合菌与冻干保护剂的质量比为1:3-1:5。

所述冻干保护剂为占微生物菌剂质量的30-50％的甘油溶液和占微生物菌剂质量的10-20％海藻糖溶液。

一种水产养殖用的微生物菌剂的制备方法：将按上述比例混合获得的混合菌按3-5％的接种量接种于发酵营养液中发酵培养，将添加进行发酵，将发酵产物与牡蛎粉混合振荡培养充分混匀，离心、收集沉淀、干燥即为水产养殖用微生物菌剂；发酵营养液按重量份数计为乙酸30-50份、乙醇50-70份、蔗糖水150-200份、硫酸镁10-30份、磷酸二氢钾20-50份、氯化钠50-100份、碳酸钠20-50份、葡萄糖150-300份和蒸馏水300-500份。

进一步的说：

(1)将上述活化后各个菌种进行扩大培养至对数生长期，将各发酵液过滤浓缩收集菌体，按照所需比例将收集的各菌体混合；

(2)向上述获得的菌体混合物中添加冻干保护剂，混合均匀，将混合物冷冻干燥，得混合菌体干燥物，待用。

所述扩大培养为，将各菌株分别接种于发酵营养液，在30-37℃，培养18-24h，而后调节各培养液的OD600值至1.5。

本发明的有益效果是：

本发明中的微生物菌种通过牡蛎粉吸附，使各微生物菌种获得有利生存空间，缓解外界环境刺激，使得微生物菌剂具有良好的稳定性和高效性，施加至水体后能快速繁殖形成优势种群，快速分解水产养殖水体中的大分子有机质、残饵粪便等，降解水体中的氨氮、磷、亚硝酸盐、硫化氢等物质，净化水质，提高水体溶氧含量，抑制有害病菌和有害藻类的滋生，改善水生动物肠道环境，增强体质。微生物菌剂中各类功能菌混合发酵、协同作用，可对多种养殖水样进行综合处理，提高水产品的产量和质量。

具体实施方式:

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，但本发明所保护范围不限于此，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：一种水产养殖用微生物菌剂的制备方法，按如下步骤进行：

混合菌种，由质量百分比如下的有效成分组成：嗜酸乳杆菌25％、枯草芽孢杆菌20％、双歧杆菌8％、光合细菌8％、巨大芽孢杆菌12％、粪链球菌15％、硝化菌12％。

制备方法如下：

(1)按现有技术分别将嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、光合细菌、巨大芽孢杆菌、粪链球菌、硝化菌接种于固体培养基上进行活化培养。

(2)使用接种环分别挑取固体培养基平板上的单菌落接种于相应的液体培养基中培养，获得液体菌剂种子液；

其中，液体培养基成分按重量份数计为乙酸40份、乙醇60份、蔗糖水180份、硫酸镁20份、磷酸二氢钾35份、氯化钠75份、碳酸钠35份、葡萄糖240份和蒸馏水400份。

固体培养基为上述液体培养基中添加2％的琼脂。

(3)将获得的各个菌种的种子液分别按3％的接种量转接至含发酵营养液的发酵罐中进行扩大培养，直至培养至对数生长期，培养物采用陶瓷膜过滤浓缩系统，将各发酵液过滤浓缩收集菌体，而后按照上述比例将收集的各菌株混合得混合菌种；其中，扩大培养条件为在30-37℃，培养18-24h，而后调节各培养液的OD600值至1.5。其中，发酵营养液按重量份数计为乙酸40份、乙醇60份、蔗糖水180份、硫酸镁20份、磷酸二氢钾35份、氯化钠75份、碳酸钠35份、葡萄糖240份和蒸馏水400份。(营养液成分具体用量)。

(4)向上述获得的菌体混合物中添加冻干保护剂，混合均匀，将混合物全部转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得菌体干燥物；其中，混合菌与冻干保护剂的质量比为1:3；所述冻干保护剂为占微生物菌剂质量的30％甘油溶液和占微生物菌剂质量的10％海藻糖溶液。上述冷冻干燥条件为-50℃预冻4-6h，逐步升温至30℃主干燥共12h。

(5)将上述得到的菌体干燥物按3wt％接种量接种至发酵营养液中于30-37℃进行发酵培养，将发酵产物与50目牡蛎粉摇动培养充分混匀，离心机于4000rpm 5min离心，去除上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得水产养殖用微生物菌剂；所述发酵产物和50目蛭石的质量比1:5的比例混合，于30-37℃下振荡培养时间为12h。上述冷冻干燥条件为-50℃预冻4-6h，逐步升温至30℃主干燥共12h。

实施例2：一种水产养殖用微生物菌剂的制备方法，按如下步骤进行：

本实施例水产养殖用的微生物菌剂，由质量百分比如下的有效成分组成：嗜酸乳杆菌18％、枯草芽孢杆菌15％、双歧杆菌15％、光合细菌18％、巨大芽孢杆菌16％，粪链球菌10％，硝化菌8％。

制备方法同实施例1。

实施例3：一种水产养殖用微生物菌剂的制备方法，按如下步骤进行：

本实施例水产养殖用的微生物菌剂，由质量百分比如下的有效成分组成：嗜酸乳杆菌17％、枯草芽孢杆菌13％、双歧杆菌15％、光合细菌15％、巨大芽孢杆菌16％，粪链球菌14％，硝化菌10％。

制备方法同实施例1。

实施例4：一种水产养殖用微生物菌剂的制备方法，按如下步骤进行：

本实施例水产养殖用的微生物菌剂，由质量百分比如下的有效成分组成：嗜酸乳杆菌10％、枯草芽孢杆菌12％、双歧杆菌20％、光合细菌25％、巨大芽孢杆菌20％，粪链球菌8％，硝化菌5％。

制备方法同实施例1。

应用例1

将上述实施例获得菌剂与某生物科技有限公司生产的水产养殖用微生物菌剂(对照1)分别进行性能：

方法：取5份水产养殖水体2L，各加入实施例1、2、3和4与对比例1所制备的微生物菌剂2g，每三天加菌剂一次，连续投料三周后，测定结果。

试验前水体各成分含量表如表1

表1

COD(mg/L)	NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N(mg/L)	总氮(mg/L)	总磷(mg/L)	NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N(mg/L)
					214	11.3	22.5	2.13	2.09

加微生物菌剂后水体检测具体情况如表2

表2

检测项目	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对照1
						COD(mg/L)	30.2	18.61	25.3	21.58	50.92
NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N(mg/L)	1.33	0.35	0.86	0.62	3.55
						总氮(mg/L)	2.49	0.83	1.3	1.27	5.8
总磷(mg/L)	0.95	0.29	0.75	0.98	2.31
						NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N(mg/L)	0.72	0.16	0.55	0.37	1.39

由上述对比可知，本发明所生产的微生物菌剂，有效解决水产养殖的水体污染问题，且不易产生二次污染。

应用例2

将上述实施例2和4获得菌剂以及某生物科技有限公司生产的水产养殖用微生物菌剂(对照2)分别进行性能：

方法：选取4个20亩对虾养殖池塘，分别施加实施例2、4与对比例2所制备的微生物菌剂500g，其中一个不添加任何微生物菌剂(空白)，每15天施加菌剂一次，连续投料三月后，测定结果(表3)。

表3

检测项目	实施例2	实施例4	对照2	未添加菌剂组
					平均每只对虾重量g	28.5	26.8	22.4	19.3

由上述对比可知，本发明所生产的微生物菌剂，改善了水产动物的生长状况，提高水产品的产量和质量。是一种安全高效的水产养殖用微生物菌剂，值得推广和使用。

Claims

1.一种水产养殖用的微生物菌剂，其特征在于：菌剂发酵获得混合菌培养物；其中，混合菌按重量百分比计，嗜酸乳杆菌10-25%、枯草芽孢杆菌10%-20%、双歧杆菌8%-20%、光合细菌8%-25%、巨大芽孢杆菌12%-20%、粪链球菌5%-15%和硝化菌4%-12%；

所述混合菌按3%的接种量接种于发酵营养液中发酵培养，进行发酵；将发酵产物与牡蛎粉混合振荡培养充分混匀，离心、收集沉淀、干燥得到水产养殖用微生物菌剂；其中，发酵营养液按重量份数计为乙酸30-50份、乙醇50-70份、蔗糖水150-200份、硫酸镁10-30份、磷酸二氢钾20-50份、氯化钠50-100份、碳酸钠20-50份、葡萄糖150-300份和蒸馏水300-500份；

所述发酵产物和50目牡蛎粉以质量比1:5-1:10的比例混合，于30-37℃下振荡培养时间为8-12h；

所述混合菌为按比例将各培养至对数生长期的菌株混合，混合后添加冻干保护剂，而后冷冻干燥，待用；其中，混合菌与冻干保护剂的质量比为1:3-1:5；

所述冻干保护剂为占微生物菌剂质量的30-50%的甘油溶液和占微生物菌剂质量的10-20%海藻糖溶液。

2.按权利要求1所述的水产养殖用的微生物菌剂，其特征在于：所述混合菌按重量百分比计，嗜酸乳杆菌16%-18%、枯草芽孢杆菌13%-15%、双歧杆菌12%-15%、光合细菌14%-18%、巨大芽孢杆菌15%-17%，粪链球菌9%-12%，硝化菌7%-10%。

3.一种权利要求1所述的水产养殖用的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：将按比例混合获得的混合菌按3-5%的接种量接种于发酵营养液中发酵培养，进行发酵；将发酵产物与牡蛎粉混合振荡培养充分混匀，离心、收集沉淀、干燥得到水产养殖用微生物菌剂；其中，发酵营养液按重量份数计为乙酸30-50份、乙醇50-70份、蔗糖水150-200份、硫酸镁10-30份、磷酸二氢钾20-50份、氯化钠50-100份、碳酸钠20-50份、葡萄糖150-300份和蒸馏水300-500份。

4.按权利要求3所述的水产养殖用的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，混合菌的制备过程如下：

（1）将活化后的各个菌种进行扩大培养至对数生长期，将各发酵液过滤浓缩收集菌体，按照所需比例将收集的各菌体混合；

（2）向步骤（1）获得的菌体混合物中添加冻干保护剂，混合均匀，将混合物冷冻干燥，得混合菌体干燥物，待用。

5.按权利要求4所述的水产养殖用的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述扩大培养为，将各菌株分别接种于发酵营养液，在30-37℃，培养18-24h，而后调节各培养液的OD₆₀₀值至1.5。