CN105341622B - 防腐剂组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品添加剂技术领域，具体涉及一种防腐剂组合物及其用途，其中是由每1000mL溶剂中含有0.005~0.1g对羟基苯甲酸乙酯和0.005~0.1g乙二胺四乙酸二钠经过混合而成，对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠的质量比为0.5~1:0.5~1的防腐剂组合物。与现有技术相比，本发明的防腐剂组合物能够对食源性致病菌生物被膜产生强烈的抑制效应，本发明提供了防腐剂组合物在抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，可用于制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的药物、食品添加剂以及饲料添加剂，为食品工业中生物被膜的控制、清除提供了新的途径，进而为食品的安全性提供可靠的保障。

Description

防腐剂组合物及其用途

技术领域

本发明涉及食品添加剂技术领域，具体涉及一种防腐剂组合物及其用途。

背景技术

随着社会的发展、人民生活水平的提高，食品安全越来越受到人们的重视。但无论是在发展中国家还是发达国家，人类健康均遭受着食源性疾病的威胁。据统计，每年全球大约三分之一的人有犯食源性疾病的经历。

食源性病原菌是导致食物变质和引发食源性疾病的主要因素，也是食品安全面临的长期难题。目前，国内外的研究工作主要集中在食品中游离致病致腐微生物方面。然而，越来越多的研究表明，细菌生物被膜、亚致死细胞的修复以及病毒的变异等问题是食品安全的重要隐性危害，也是导致食源性疾病爆发的重要原因。据估计，约65%-80%细菌性感染是由生物被膜引起的（Hall-Stoodley L, Costerton J W, Stoodley P. Bacterialbiofilms: from the natural environment to infectious diseases[J]. NaturalReviews Microbiology, 2004, (2): 95-108）。其中，食品工业中形成的生物被膜最有可能是食源性疾病的罪魁祸首。例如，在食品发酵中，一些腐败菌和病原菌会形成生物被膜，从而导致最终产品的腐败和疾病的爆发。因此，食品工业中生物被膜对食品安全的威胁是不容忽视的。

生物被膜是微生物为适应自然环境而特有的生命现象，在不利于其生长或存在的条件下，细菌间相互粘连，并分泌聚合物基质形成膜状物。任何细菌在特定的条件下均能形成生物被膜，常见的被膜性致病菌包括单核细胞增生性李斯特菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、克雷伯氏肺炎杆菌和铜绿假单胞菌等生物被膜。其中，蜡样芽孢杆菌是一种能引起食物中毒的常见病源菌，在自然界中广泛存在，极易污染富含蛋白质和淀粉的米饭、肉制品、豆类食品、乳制品及焙烤食品等。该菌引起的食品中毒案例在我国食物中毒中位居前列。但是，迄今为止，国内尚未见关于蜡样芽孢杆菌生物被膜研究的报道；在国外相关研究也较少。

与浮游微生物相比，生物被膜对环境压力的抗性更强且危害更大、更难清除。据报道，生物被膜对各种化学杀菌剂的敏感程度只是同种浮游菌的1/10～1/1000。由于生物被膜对消毒剂的抗性更强，故生物被膜给食品工业如酿造、海产品加工、乳品加工、家禽屠宰场及肉类加工等带来严重的食品安全问题。食品加工的任何阶段，从食品生产到消费均可能感染各类微生物，特别是腐败菌和病原菌易粘附于食品表面，在食品加工系统中形成生物被膜。生物被膜一旦形成，不仅会污染食品、增加设备清洗难度，使就地清洗系统失效，成为其他有害微生物的藏身之地，生物被膜还会促使更多细菌协同共生，使设备内外表面成为传播食源性疾病的隐性生物危害源，导致难以解决的食品质量与安全问题。因此，食品加工过程中，生物被膜的控制和清除对保障食品安全尤为重要。

现有技术中，食品工业中的研究方向仍是针对食品及其加工设备中的病原菌，主要是采用消毒剂或杀菌剂等化学试剂来杀灭食品中的病原菌。但杀菌剂能够杀灭食品中的普通病原菌却难以杀灭被膜态菌及其生物被膜。再者，食品工业对杀菌剂的使用有严格的要求，杀菌剂必须安全、有效、使用方便、用完后能从载体表面去除、无毒性残留。但传统的化学杀菌剂只在高浓度、大剂量时才对生物被膜有较显著的杀灭作用，而高浓度、大剂量化学杀菌剂的使用对人类健康构成严重威胁。因此，在生物被膜尚未形成前采取措施抑制生物被膜的形成是控制生物被膜的首选。但生物被膜的形成是一个非常迅速的过程，到目前为止，还没有一种方法能完全有效地抑制生物被膜的形成。在食品工业中，很难通过频繁消毒抑制生物被膜的形成，故选择不易形成生物被膜甚至能抑制生物被膜形成的材料作为食品加工接触表面是抑制被膜形成的重要途径。近年来，一些含杀菌剂成分的食品包装材料在抑制食品表面病原菌和腐败菌的生长方面表现出广阔的应用前景。研究发现，某些化学试剂可显著抑制生物被膜的形成。Shanks等研究了柠檬酸钠浓度对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响，发现当其浓度大于0.5%时，可有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成；相反，当浓度低于0.5%时，会促进大多数金黄色葡萄球菌菌株生物被膜的形成（ShanksR M Q, Sargent J L, Martinez R M, et al. Catheter lock solutions influencestaphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces[J]. Nephrology DialysisTransplantation, 2006, 21(8): 2247-2255）。目前，还发现诸多化合物是生物被膜的专一性抑制剂，但是出于安全的考虑，这些生物被膜抑制剂难以直接用在食品加工中。

食品添加剂是为改善食品色、香、味等品质，以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质，目前我国食品添加剂有23个类别，2000多个品种，包括抗氧化剂、膨松剂、着色剂酶制剂、增味剂、营养强化剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、香料等等。其中，食品防腐剂是能防止由微生物引起的腐败变质、延长食品保质期的添加剂。现有的防腐剂仅仅是起到抑制食品中微生物的繁殖的作用，并不具有抑制食源性致病菌生物被膜活动的作用，而且防腐剂必须严格按中国《食品添加剂使用卫生标准》规定添加，不能超标使用。防腐剂在实际应用中存在很多问题，例如：达不到防腐效果，影响食品的风味食品防腐剂和品质等；例如茶多酚作为防腐剂使用时，浓度过高会使人感到苦涩味，还会由于氧化而使食品变色。

由于食品添加剂通常较安全，故从食品安全性的角度来说，利用具有抗生物被膜形成的食品添加剂来控制食品加工中的生物被膜是最理想的。但目前尚未有关于食品添加剂能够抑制食源性致病菌生物被膜，特别是抗性较强的蜡样芽孢杆菌生物被膜形成的报道。因此，亟需研究能够抑制具有抗性强、危害大的食源性致病菌生物被膜形成，并且能够安全地添加到食品中的技术，从而为食品工业中生物被膜的控制、清除以及保障食品安全提供新的途径。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种能够显著抑制蜡样芽孢杆菌等食源性致病菌生物被膜形成的防腐剂组合物。

本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种防腐剂组合物在抑制蜡样芽孢杆菌等食源性致病菌生物被膜形成的新用途，可用于制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的药物、食品添加剂以及饲料添加剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

提供一种防腐剂组合物，所述防腐剂组合物是用于抑制食源性病原菌生物被膜形成，其包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.005~0.1g；

乙二胺四乙酸二钠 0.005~0.1g；

溶剂 每1000mL；

其中：

所述溶剂为浓度为20%~35%的乙酸或乙醇溶液；

所述对羟基苯甲酸乙酯和所述乙二胺四乙酸二钠的质量比为0.5~1:0.5~1；

其制备方法如下：

按配比将对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠依次添加至溶剂中，待充分溶解后，即获得所述防腐剂组合物。

优选的，所述防腐剂组合物包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.01~0.1g；

乙二胺四乙酸二钠 0.01~0.1g；

溶剂 每1000mL 。

优选的，所述防腐剂组合物包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.05g；

乙二胺四乙酸二钠 0.05g；

溶剂 每1000mL 。

优选的，所述防腐剂组合物包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.03g；

乙二胺四乙酸二钠 0.02g；

溶剂 每1000mL。

优选的，所述防腐剂组合物中，对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠的质量比为1:1。

优选的，所述防腐剂组合物的pH值为4~8。

本发明还提供了上述防腐剂组合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途。

所述防腐剂组合物在制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的药物或食品添加剂组中的应用。

所述防腐剂组合物在制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的饲料添加剂中的应用。

所述食源性致病菌生物被膜为蜡样芽孢杆菌生物被膜。

本发明的有益效果是：

本发明的防腐剂组合物，是由每1000mL溶剂中含有0.005~0.1g 对羟基苯甲酸乙酯和0.005~0.1g乙二胺四乙酸二钠经过混合而成，其中对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠的质量比为0.5~1:0.5~1的防腐剂组合物。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1）本发明的防腐剂组合物中，对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠的质量比为0.5~1:0.5~1，对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠复合使用，能够对食源性致病菌生物被膜产生强烈的协同抑制效应，从而具有显著抑制食源性致病菌生物被膜形成的功效；

2）本发明的防腐剂组合物安全性好，具有高效、低毒、广谱、易配伍、低成本的优点，而且该防腐剂组合物的浓度为0.02~0.1g/L，其符合国家对食品添加剂的用量要求，其在低浓度范围内即具有显著抑制食源性致病菌生物被膜的作用，这对于在保障食品合理保存期的前提下尽可能少地使用防腐剂、增加食品的安全性以及降低产品成本是具有积极意义的；

3）本发明提供了防腐剂组合物在抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，可用于制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的药物、食品添加剂以及饲料添加剂，为食品工业中生物被膜的控制、清除提供了新的途径，进而为食品的安全性提供可靠的保障。

附图说明

图1是本发明的防腐剂组合物及其用途的实施例1的蜡样芽孢杆菌生物被膜生长曲线图。

具体实施方式

结合以下实施例及附图对本发明作进一步说明。

以下实施例均采用广东省微生物研究所菌种保藏中心的蜡样芽孢杆菌（菌种保藏号：CMCC63303），按菌悬液定量杀菌进行试验。

1 实验材料与仪器设备

对羟基苯甲酸乙酯、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸钾、苯甲酸等均购自诺维信生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯试剂或生化试剂。不锈钢片（304型，规格1.2 cm×1.2cm）由广州南联实业有限公司提供。

2 实验方法

2.1 菌悬液的制备

蜡样芽孢杆菌经活化后，接种于无菌肉汤培养基中，37 ℃培养12 h至活菌数为10⁸ CFU/mL，备用。

2.2 生物被膜的制备

（1）载体片的清洗：将载体片用自然水冲洗，放在丙酮中超声15 min（超声频率40kHz，超声功率250 W），除去表面油污；然后，将其置于75%乙醇中浸泡30 min，随后用洗涤剂清洗，最后用蒸馏水冲洗干净，烘干后灭菌备用。

（2）生物被膜的培养：向试管中加入载体片和10 mL肉汤培养基，灭菌后，接入1%的上述菌悬液（10⁸ CFU/mL），于37 ℃下培养。

2.3生物被膜活菌数的测定

生物被膜菌数按下列公式计算：

采用超声平板菌落计数法：生物被膜培养一定时间后，倒掉试管中的液体培养液，然后用无菌PBS（0.05 M，pH 7.2）漂洗3次，除去浮游菌和粘附不牢的菌，再用无菌移液管加入10 mL无菌PBS（0.05 M，pH 7.2），并超声15 min（250 W），随后对菌悬液进行平板菌落计数，平行试验3次，统计学分析使用Microsoft Office Excel软件。

实施例1。

分别称取0.05g对羟基苯甲酸乙酯和0.05g乙二胺四乙酸二钠，添加至1000mL浓度为30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即获得浓度为0.1g/L的防腐剂组合物。

实施例2。

分别称取0.03g对羟基苯甲酸乙酯和0.02g乙二胺四乙酸二钠，添加至1000mL浓度为30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即获得浓度为0.05g/L的防腐剂组合物。

实施例3。

分别称取0.01g对羟基苯甲酸乙酯和0.01g乙二胺四乙酸二钠，添加至1000mL浓度为30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即获得浓度为0.02g/L的防腐剂组合物。

对比例1。

分别称取0.0005g对羟基苯甲酸乙酯和0.0005g乙二胺四乙酸二钠，添加至1000mL浓度为30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即获得浓度为0.001g/L的防腐剂组合物。

对比例2。

分别称取0.05g对羟基苯甲酸乙酯和0.05g山梨酸钾，添加至1000mL浓度为30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即获得浓度为0.1g/L的添加剂组合物。

对比例3。

分别称取0.05g对羟基苯甲酸乙酯和0.05g苯甲酸，添加至1000mL浓度为30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即获得浓度为0.1g/L的添加剂组合物。

试验结果及分析：

（一）本发明的防腐剂组合物对蜡样芽孢杆菌生物被膜形成的抑制效果

分别取实施例1至3以及对比例1至3的防腐剂组合物1 mL，分别加入装有9 mL肉汤培养基和不锈钢片的试管中，以30%乙醇溶液为空白，以0.1 g/L的对羟基苯甲酸乙酯单独使用为对照组1，以0.1 g/L的乙二胺四乙酸二钠单独使用为对照组2。灭菌后，接入1%密度为10⁸ CFU/mL的蜡样芽孢杆菌菌悬液，37 ℃培养24 h，采用超声平板菌落计数法对不锈钢片上的生物被膜菌进行计数。实施例1至3的防腐剂组合物对蜡样芽孢杆菌生物被膜形成的影响如表1所示。

表1实施例1至3的防腐剂组合物与对比例1至3的添加剂组合物抑制生物被膜的效果对比

添加剂组合物	生物被膜菌数（log CFU/cm<sup>2</sup>）
		空白	4.10
对照组1（对羟基苯甲酸乙酯）	2.49
		对照组2（乙二胺四乙酸二钠）	3.01
实施例1	0.54
		实施例2	0.72
实施例3	0.84
		对比例1	3.62
对比例2	3.24
		对比例3	2.26

从表1可以看出：

（1）对比例1的浓度为0.001g/L的防腐剂组合物对蜡样芽孢杆菌生物被膜的形成基本没有抑制效果。当防腐剂组合物的浓度增加到0.02g/L（实施例3），其抑制效果显现，并且随着浓度继续增大，抑制效果不断增强。当防腐剂组合物的浓度达到的0.1g/L（实施例1）时，抑制效果最强，蜡样芽孢杆菌生物被膜中的活菌数下降至0.54 log CFU/cm²。这表明本发明的防腐剂组合物对蜡样芽孢杆菌生物被膜的形成有显著的抑制作用。

（2）分别以0.1 g/L的对羟基苯甲酸乙酯和0.1 g/L的乙二胺四乙酸二钠单独使用为对照，其生物被膜的活菌数分别为2.49和3.01，显然乙二胺四乙酸二钠单独使用对生物被膜抑制效果非常弱；另一方面，当对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸钾所组成的添加剂组合物（对比例2）以及对羟基苯甲酸乙酯和苯甲酸所组成的添加剂组合物（对比例3），其不仅对蜡样芽孢杆菌生物被膜的形成无协同抑制效应，而且有拮抗效应；然而，本发明的防腐剂组合物，即对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠二者复合使用时，二者对生物被膜表现出强烈的协同抑制效应，生物被膜的活菌数分别降至0.54 logCFU/cm²（实施例1）、0.72logCFU/cm²（实施例2）和0.84 logCFU/cm²（实施例3），其远低于单独使用对羟基苯甲酸乙酯的对应值2.49 log CFU/cm²（对照组1）和单独使用乙二胺四乙酸二钠的对应值3.01（对照组2）。这说明本发明的防腐剂组合物对蜡样芽孢杆菌生物被膜有强烈的协同抑制效应。

（二）本发明的防腐剂组合物对蜡样芽孢杆菌生物被膜生长的影响

将实施例1和对比例1的防腐剂组合物，分别于肉汤培养基中培养蜡样芽孢杆菌生物被膜，每隔3 h测生物被膜中的活菌数，生长曲线如图1所示。在对比例1的条件下，0-21 h蜡样芽孢杆菌生物被膜中的活菌数呈显著上升趋势（P＜0.05），21-24 h被膜中的活菌数增加缓慢；培养24 h后，被膜中的活菌数为4.56 log CFU/cm²。而在实施例1的条件下，0-12 h蜡样芽孢杆菌生物被膜中的活菌数显著增加（P＜0.05），12-24 h被膜中的活菌数增加缓慢，24 h时活菌数达2.71 log CFU/cm²。这表明尼泊金乙酯的加入对蜡样芽孢杆菌生物被膜的形成有显著的抑制作用，并且大大缩短了生物被膜生长的对数生长期，促进了稳定期的出现。

结论：

1）本发明的防腐剂组合物中，对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠复合使用，能够对食源性致病菌生物被膜产生强烈的协同抑制效应，从而具有显著抑制食源性致病菌生物被膜形成的功效；

2）本发明的防腐剂组合物安全性好，具有高效、低毒、广谱、易配伍、低成本的优点，而且该防腐剂组合物的浓度为0.02~0.1g/L，其符合国家对食品添加剂的用量要求，其在低浓度范围内即具有显著抑制食源性致病菌生物被膜的作用，这对于在保障食品合理保存期的前提下尽可能少地使用防腐剂、增加食品的安全性以及降低产品成本是具有积极意义的；

3）本发明提供了防腐剂组合物在抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，可用于制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的药物、食品添加剂以及饲料添加剂，为食品工业中生物被膜的控制、清除提供了新的途径，进而为食品的安全性提供可靠的保障。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.防腐剂组合物，其特征在于：所述防腐剂组合物是用于抑制食源性病原菌生物被膜形成，其包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.005~0.1g；

乙二胺四乙酸二钠 0.005~0.1g；

溶剂 每1000mL；

其中：

所述溶剂为浓度为20%~35%的乙醇溶液；

所述对羟基苯甲酸乙酯和所述乙二胺四乙酸二钠的质量比为0.5~1:0.5~1；

其制备方法如下：

按配比将对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠依次添加至溶剂中，待充分溶解后，即获得所述防腐剂组合物。

2.根据权利要求1所述的防腐剂组合物，其特征在于：所述防腐剂组合物包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.01~0.1g；

乙二胺四乙酸二钠 0.01~0.1g；

溶剂 每1000mL。

3.根据权利要求2所述的防腐剂组合物，其特征在于：所述防腐剂组合物包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.05g；

乙二胺四乙酸二钠 0.05g；

溶剂 每1000mL。

4.根据权利要求2所述的防腐剂组合物，其特征在于：所述防腐剂组合物包括以下组分：

对羟基苯甲酸乙酯 0.03g；

乙二胺四乙酸二钠 0.02g；

溶剂 每1000mL。

5.根据权利要求2所述的防腐剂组合物，其特征在于：所述防腐剂组合物中，对羟基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二钠的质量比为1:1。

6.根据权利要求1所述的防腐剂组合物，其特征在于：所述防腐剂组合物的pH值为4~8。

7.权利要求1至6任意一项所述的防腐剂组合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途。

8.根据权利要求7所述的防腐剂组合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，其特征在于：所述防腐剂组合物在制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的药物或食品添加剂组中的应用。

9.根据权利要求7所述的防腐剂组合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，其特征在于：所述防腐剂组合物在制备抑制食源性致病菌生物被膜形成的饲料添加剂中的应用。

10.根据权利要求7所述的防腐剂组合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，其特征在于：所述食源性致病菌生物被膜为蜡样芽孢杆菌生物被膜。