CN115418355A - 一种迟缓葡萄球菌噬菌体及其分离方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体，命名为迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910‑8923，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45259，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。并提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法及其应用；为规模化生产噬菌体用于反刍动物养殖环境中致病性迟缓葡萄球菌ST‑8923的防治提供了噬菌体来源；在治疗迟缓葡萄球菌感染疾病具有很好的优势，裂解谱广，而且不会对益生菌造成伤害，效价较高，防治效果好。
Description
技术领域
本申请属于微生物技术领域，具体涉及一种迟缓葡萄球菌噬菌体及其分离方法与应用。
背景技术
迟缓葡萄球菌是一种常见的致病菌，能引起奶牛乳房炎等疾病，人类主要使用抗生素来对付迟缓葡萄球菌感染，然而随着抗生素的不规范使用，导致细菌的耐药性越来越严重，甚至出现一种细菌多重耐药现象，临床上可供选择的敏感抗生素越来越少，这给奶牛养殖行业造成极大的经济损失。
噬菌体是一种以细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物作为宿主的病毒，它能够特异性的杀死宿主菌，达到预防和治疗的目的。噬菌体疗法作为细菌性病害控制的方法之一，具有特异性强、裂解效率高、无残留等特点。
目前利用噬菌体对奶牛乳房炎防控的研究多集中于金黄色葡萄球菌噬菌体，对于迟缓葡萄球菌噬菌体的研究尚未见报道。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
为了解决上述技术缺陷之一，本申请实施例中提供了一种迟缓葡萄球菌噬菌体，旨在解决养殖场奶牛类因感染迟缓葡萄球菌发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等问题；本申请还提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体分离与纯化方法，用于迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923的制备；本申请还提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体的应用，用于治疗迟缓葡萄球菌感染的疾病；或用于防控奶牛迟缓葡萄球菌性乳房炎。
根据本申请实施例第一个方面，提供了一种迟缓葡萄球菌噬菌体，命名为迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45259，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
根据本申请实施例第二个方面，提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体的在如下至少一项中的应用：
(1)用于生产预防和或治疗迟缓葡萄球菌感染的疾病的药物；
(2)制备预防和或治疗迟缓葡萄球菌引起的疾病的饲料；
(3)生产预防和或治疗迟缓葡萄球菌引起的疾病的添加剂；
(4)制备迟缓葡萄球菌噬菌体的清洁剂或消毒剂。
有选的，用于治疗迟缓葡萄球菌感染的疾病；或用于防控奶牛迟缓葡萄球菌性乳房炎。
根据本申请实施例第三个方面，提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，包括以下步骤：
(1)迟缓葡萄球菌噬菌体的分离：将奶牛发酵床垫料及复苏好的迟缓葡萄球菌依次加入SM缓冲液后置于培养箱中培养，培养结束后制备得到滤液；将滤液点在含有迟缓葡萄球菌LB平板中央，并置于培养箱至出现噬菌斑；
(2)迟缓葡萄球菌噬菌体的纯化：
从步骤(1)中出现噬菌斑的LB平板挑取单个噬菌斑，加入到含有SM缓冲液的EP管中，置于水浴锅中使噬菌体充分从琼脂中逸出，然后连续梯度稀释，并通过双层平板培养，获得纯化的噬菌体。
优选的，迟缓葡萄球菌噬菌体的分离，包括如下步骤
(1.1)将奶牛发酵床垫料加入SM缓冲液得到混合溶液A；
(1.2)将取适量复苏好的迟缓葡萄球菌加入混合溶液A中，并置于培养箱中培养；培养结束后静置、离心、吸出上清液、过滤备用；
(1.3)取适量复苏好的迟缓葡萄球菌加入到含有半琼脂的试管中，混匀后倒入LB平板上，待半琼脂冷却凝固后，取步骤(1.2)制备的滤液点在LB平板中央，待滤液被LB平板的半琼脂吸收后，放入培养箱至出现噬菌斑。
优选的，迟缓葡萄球菌噬菌体的纯化，包括如下步骤：
(2.1)从步骤(1)中出现噬菌斑的LB平板用无菌接种环挑取单个噬菌斑，加入到含有SM缓冲液的EP管中，置于水浴锅中使噬菌体充分从琼脂中逸出，然后连续梯度稀释，通过双层平板培养；
(2.2)待双层平板培养长出噬菌斑后，挑取单个噬菌斑重复步骤(,2.1)～步骤(2.2)，获得纯化的噬菌体。
优选的，奶牛发酵床垫料与SM缓冲液的体积比为1:10。
优选的，培养结束后静置、离心、吸出上清液、过滤备用具体为：培养结束后室温静置20min，4℃、12000r/min离心5min，吸出上清液并用过滤器过滤，得到滤液备用。
优选的，置于水浴锅中使噬菌体充分从琼脂中逸出，水浴锅的温度为42℃。
优选的，培养箱的培养温度为37℃，培养箱的培养时间为10h。
本申请的有益效果：
1.本申请从奶牛发酵床垫料环境中分离得到一株裂解性迟缓葡萄球菌噬菌体，该噬菌体命名为迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923，对反刍动物养殖环境中致病性迟缓葡萄球菌ST-8923具有强裂解作用，在防控奶牛迟缓葡萄球菌性乳房炎中具有良好的应用前景；提供了一种迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法为规模化生产噬菌体以及用于反刍动物养殖环境中致病性迟缓葡萄球菌ST-8923的防治提供了噬菌体来源。
2.本申请所提供的迟缓葡萄球菌噬菌体，对温度具有较好的耐受性，有利于长期保存；在治疗迟缓葡萄球菌感染疾病具有很好的优势，裂解谱广，而且不会对益生菌造成伤害，效价较高，防治效果好。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请的迟缓葡萄球菌噬菌体形成的噬菌斑图；
图2本申请的迟缓葡萄球菌噬菌体的电镜照片；
图3为本申请的迟缓葡萄球菌噬菌体感染复数图；
图4为本申请的迟缓葡萄球菌噬菌体一步生产曲线图；
图5为本申请的迟缓葡萄球菌噬菌体温度耐受性曲线图；
图6为本申请的迟缓葡萄球菌噬菌体pH值耐受性曲线图；
图7为单独进化枝上的衣壳蛋白基因；
图8为位于单独进化枝上的核酸内切酶。
具体实施方式
为了使本申请实施例中的技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图对本申请的示例性实施例进行进一步详细的说明，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是所有实施例的穷举。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本申请提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体，噬菌体命名为迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923，对全基因进行测序后发现，该噬菌体为长尾噬菌体科，其头部为正六面体立体对称，头部直径约为65nm，尾部长度约为253nm，为长尾科噬菌体，基因全长40573bp，GC碱基含量为33.95％，不具有毒力基因和溶原性基因，该噬菌体对引起奶牛乳房炎的迟缓葡萄球菌ST-8923具有强裂解效用，可有效防控迟缓葡萄球菌ST-8923的产生及传播。该噬菌体可以应用在制备预防和或治疗迟缓葡萄球菌引起的奶牛乳房炎疾病的药物中。
本申请提供一种迟缓葡萄球菌噬菌体，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45259，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例1
迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法包括步骤(1)迟缓葡萄球菌噬菌体的分离与步骤(2)迟缓葡萄球菌噬菌体的纯化。
步骤(1)迟缓葡萄球菌噬菌体的分离具体为如下步骤：
(1.1)取适量奶牛发酵床垫料加入SM缓冲液，奶牛发酵床垫料加入SM缓冲液的体积比为1:10得到混合溶液A；
(1.2)取500μL复苏好的迟缓葡萄球菌加入混合溶液A中，置于恒温震荡培养箱中37℃孵育过夜培养10h。
(1.3)培养结束后室温静置20min，4℃、12000r/min离心5min，吸出上清液用0.22μm滤器过滤，所有滤液备用；
(1.4)取200μL复苏好的迟缓葡萄球菌加入到含有8mL半琼脂的试管中，混匀后倒入LB平板上，待半琼脂冷却凝固后，取5μL滤液轻轻点在双层平板中央，室温放置30min待滤液被双层琼脂吸收后，放入恒温培养箱中37℃，培养过夜；次日观察形成噬菌斑。
步骤(2)迟缓葡萄球菌噬菌体的纯化具体为如下步骤：
(2.1)将出现噬菌斑的LB平板用无菌接种环挑取单个噬菌斑，加入到含有500μLSM缓冲液的1.5ml EP管中，置于42℃水浴锅中是噬菌体充分从琼脂中逸出，然后连续梯度稀释，通过双层平板培养；
(2.2)待双层平板培养长出噬菌斑后(见图1)，挑取单个噬菌斑重复以上步骤5～6次，即可获得纯化的噬菌体。
将分离和纯化后迟缓葡萄球菌噬菌体的运用磷钨酸负染法，通过电子显微镜对噬菌体的大小形状等形态进行观察。
图2为迟缓葡萄球菌噬菌体的电镜照片；如图2所示，透过电镜观察该噬菌体头部呈正六边形，头部直径约为65nm，尾部长度约为253nm，为长尾科噬菌体。
实施例2
迟缓葡萄球菌噬菌体最佳感染复数测定
将过夜复苏好的宿主菌液重新接到10mL LB培养基(1:100)中培养至对数前期，按照感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例，将不同稀释浓度的迟缓葡萄球菌噬菌体与等体积的对数前期的菌液进行混合，37℃孵育10min后，11000r/min离心5min，将沉淀重悬后加入到10mL LB液体中，37℃、200r/min培养5h，11000r/min离心10min收集噬菌体上清液，用0.22μm滤器过滤稀释成不同的梯度与宿主菌混合后双层平板法培养，次日计算迟缓葡萄球菌噬菌体效价；重3次，计算平均值。
如图3所示，迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923高效感染迟缓葡萄球菌，其最佳感染复数为0.01。
实施例3
迟缓葡萄球菌噬菌体一步生长曲线测定
将过夜复苏好的宿主菌液重新接到100mL LB液体中，37℃、200r/min振荡培养至对数前期，按最佳感染复数加入噬菌体混匀后，37℃、170rpm继续振荡培养，每隔10min取样进行双层平板测效价，连续取至180min。平行重复3次，计算平均值。
如图4所示，迟缓葡萄球菌噬菌体的潜伏期为30min，之后迟缓葡萄球菌噬菌体数量开始快速增长，140min到达1012PFU/mL，进入稳定期，裂解量约为195PFU/cell。
实施例4
pH值耐受性及温度耐受性
各取1mL迟缓葡萄球菌噬菌体(1012PFU/mL)分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃中孵育1h后进行双层平板测效价，每组重复3次。
如图5所示，迟缓葡萄球菌噬菌体在pH在5-10范围内作用8小时，其效价在1*1010pfu/mL之上，适宜生长在中性环境中；在pH＝12以及pH＝3时,噬菌体彻底失去活性，迟缓葡萄球菌噬菌体的酸碱耐受范围宽。
将迟缓葡萄球菌噬菌体(1012PFU/mL)按照1:9倍分别添加到pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM缓冲液中，37℃温育1h后进行双层平板测效价，每组重复3次。
如图6所示，迟缓葡萄球菌噬菌体在30-60℃的温度范围内，效价稳定，保持在1*109pfu/mL以上，当温度达到70℃其效价不低于105pfu/mL。
实施例5
迟缓葡萄球菌噬菌体的全基因组测序
迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923的全基因组测序，由亚特兰大，乔治亚理工大学生物学院博罗多夫斯基实验完成。
经全基因测序可知迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923基因全长40573bp，预测到60个阅读开放区，其中41个功能性蛋白基因、11个假定蛋白基因和8个非特异性蛋白基因，不具有毒力基因和溶原基因。
与GenBank数据库进行比较，分析保守功能蛋白基因，衣壳蛋白和核酸内切酶基因并基于这些迟缓葡萄球菌噬菌体的基因信息分别构建系统发育树，分析迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923的进化关系，发现在主要衣壳蛋白和核酸内切酶基因上，噬菌体PG1910-8923都位于单独的进化分支；见图7、图8。综上结果表明迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923是一个新型的噬菌体。
尽管已描述了本申请的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种迟缓葡萄球菌噬菌体，命名为迟缓葡萄球菌噬菌体PG1910-8923，于2022年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45259，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的迟缓葡萄球菌噬菌体在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)用于生产预防和或治疗迟缓葡萄球菌感染的疾病的药物；
(2)制备预防和或治疗迟缓葡萄球菌引起的疾病的饲料；
(3)生产预防和或治疗迟缓葡萄球菌引起的疾病的添加剂；
(4)制备迟缓葡萄球菌噬菌体的清洁剂或消毒剂。
3.一种迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)迟缓葡萄球菌噬菌体的分离：将奶牛发酵床垫料及复苏好的迟缓葡萄球菌依次加入SM缓冲液后置于培养箱中培养，培养结束后制备得到滤液；将滤液点在含有迟缓葡萄球菌LB平板中央，并置于培养箱至出现噬菌斑；
(2)迟缓葡萄球菌噬菌体的纯化：
从步骤(1)中出现噬菌斑的LB平板挑取单个噬菌斑，加入到含有SM缓冲液的EP管中，置于水浴锅中使噬菌体充分从琼脂中逸出，然后连续梯度稀释，并通过双层平板培养，获得纯化的噬菌体。
4.如权利要求3所述的迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，迟缓葡萄球菌噬菌体的分离，包括如下步骤
(1.1)将奶牛发酵床垫料加入SM缓冲液得到混合溶液A；
(1.2)将取适量复苏好的迟缓葡萄球菌加入混合溶液A中，并置于培养箱中培养；培养结束后静置、离心、吸出上清液、过滤备用；
(1.3)取适量复苏好的迟缓葡萄球菌加入到含有半琼脂的试管中，混匀后倒入LB平板上，待半琼脂冷却凝固后，取步骤(1.2)制备的滤液点在LB平板中央，待滤液被LB平板的半琼脂吸收后，放入培养箱至出现噬菌斑。
5.如权利要求3所述的迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，迟缓葡萄球菌噬菌体的纯化，包括如下步骤：
(2.1)从步骤(1)中出现噬菌斑的LB平板用无菌接种环挑取单个噬菌斑，加入到含有SM缓冲液的EP管中，置于水浴锅中使噬菌体充分从琼脂中逸出，然后连续梯度稀释，通过双层平板培养；
(2.2)待双层平板培养长出噬菌斑后，挑取单个噬菌斑重复步骤(2.1)～步骤(2.2)，获得纯化的噬菌体。
6.如权利要求5所述的迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，奶牛发酵床垫料与SM缓冲液的体积比为1:10。
7.如权利要求5所述的迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，培养结束后静置、离心、吸出上清液、过滤备用具体为：培养结束后室温静置20min，4℃、12000r/min离心5min，吸出上清液并用过滤器过滤，得到滤液备用。
8.如权利要求6所述的迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，置于水浴锅中使噬菌体充分从琼脂中逸出，水浴锅的温度为42℃。
9.如权利要求3所述的迟缓葡萄球菌噬菌体的分离方法，其特征在于，培养箱的培养温度为37℃，培养箱的培养时间10h。
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