CN117417901A - 一种Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体04086及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物技术领域，具体公开了一种Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体04086及其应用。本申请提供的Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）04086；保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.M2021216，保藏时间为2021年3月8日；本申请还提供了利用上述大肠杆菌噬菌体04086制备的药剂。本申请提供的大肠杆菌噬菌体04086的潜伏期短、爆发速度快、对酸碱和温度有着高耐受性、并且不含有毒力基因，能够安全地运用于大肠杆菌疾病防治药剂的制备中，有效的解决雏鸡养殖中出现的大肠杆菌感染问题。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，具体涉及一种Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体04086及其应用。
背景技术
禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）是一种条件致病菌，血清型众多，能感染各日龄禽类，引起禽大肠杆菌病（Avian colibacillosis，AC）。APEC的血清型众多，我国常见的致病性血清型有O1、O2、O35、O78，APEC具有多种毒力因子（粘附素、侵袭素、毒素、铁摄系统等）和耐药基因，且由于大肠杆菌之间耐药基因的传递，国内外各地耐药菌及多重耐药菌广泛出现，使得老疫区靠抗生素等西药很难有效控制疫情。
在传统上一直使用抗生素来对致病大肠杆菌进行防治，但是随着耐药菌的出现以及新抗生素发现的减少，亟需发展新的防控手段来应对这一状况，并减少致病细菌耐药性的出现和传播，以防危害人类的身体健康。噬菌体作为一种天然的细菌病毒，能够特异性的灭杀其宿主菌，但对其他细菌和生物无害，因此安全性能优于抗生素。此外，噬菌体还具有高度选择性、强适应性、快速复制和扩散、相对安全以及潜在的多功能性等优点。这些特点使得噬菌体成为一种有前景的生物防治手段，在控制细菌感染和抗药性细菌等挑战中发挥重要作用。
大肠杆菌由于其表面抗原的不同而分为不同的血清型，并能够引起不同的疾病。目前致病性大肠杆菌可以分为肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌(包含肠道出血性大肠埃希氏菌)和肠道集聚性大肠埃希氏菌等。血清型O86的大肠杆菌是产肠毒素大肠埃希氏菌中的一种，血清型O86的大肠杆菌最先发现于雏鸡养殖场，近年来的研究发现，现有的噬菌体并不能对其有很强的裂解效果。因此，急需寻找一种噬菌体能够针对性地裂解血清型为O86的大肠杆菌。
发明内容
为了获得一种能够针对性地裂解血清型为O86的大肠杆菌的噬菌体，本申请提供一种Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体04086及其应用。
第一方面，本申请提供一种Dhakavirus大肠杆菌噬菌体04086，采用如下的技术方案：
一种Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）04086；保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.M2021216，保藏时间为2021年3月8日。
本申请提供的Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体04086的潜伏期短，爆发速度快，并且对酸碱和温度有着高耐受性。此外，对其进行全基因测序后发现不含有毒力基因，能够安全的将其进行药剂的工业化制备，用于大肠杆菌疾病的防治，有效的解决雏鸡养殖中出现的大肠杆菌感染问题。
本申请提供的Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体04086头部形状为正廿面体，头部长和宽为76.7±8.8nm，尾长142.2±4.1nm。
本申请提供的大肠杆菌噬菌体04086经过全基因组测序，分析显示大肠杆菌噬菌体基因组全长177253bp，为线性DNA分子结构，预测有139个开放阅读框。其中有72个ORF与已知功能蛋白相似，67个推测为未知功能蛋白，没有预测到tRNA和rRNA，且不存在毒力基因和耐药基因。大肠杆菌噬菌体04086主要衣壳蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，经过主要衣壳蛋白的系统进化树分析显示，大肠杆菌噬菌体04086属于Dhakavirus属噬菌体。
通过对上述大肠杆菌噬菌体04086进行了一系列的性能检测，结果如下：
（一）通过效价测定和最佳感染复数测定实验得出，该大肠杆菌噬菌体最佳感染复数MOI为0.1，效价为7.2×1011 pfu/mL。
（二）通过一步生长曲线测定得出，该大肠杆菌噬菌体的潜伏期约为10min，爆发期约为15min，平均爆发量约127pfu/cell。
（三）通过温度对大肠杆菌噬菌体04086的影响实验得出，该大肠杆菌噬菌体在0~60℃中稳定，效价保持在1×107~1×108pfu/mL，在超过60℃处理1h后大肠杆菌噬菌体效价出现明显下降，80℃下完全失活。
（四）通过pH对大肠杆菌噬菌体04086的影响实验得出，该大肠杆菌噬菌体在pH4~11范围时，效价还能够稳定在1×107pfu/mL以上；当pH＜4或者＞11时，效价逐渐降低，在pH等于2和12时，大肠杆菌噬菌体04086完全丧失活性。
（五）大肠杆菌噬菌体04086裂解谱的测定实验得出，该大肠杆菌噬菌体对血清型为O86的宿主菌株会出现很强的裂解性，对其他血清型的大肠杆菌无法裂解。
第二方面，本申请提供一种包括大肠杆菌噬菌体04086的发酵上清液。
本申请中，所述发酵上清液是所述大肠杆菌噬菌体04086经发酵、离心获得的上层澄清液。
第三方面，本申请提供一种包括大肠杆菌噬菌体04086的药剂。
可选地，所述药剂的剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
可选地，所述药剂还包含药学上可接受的载体。
本申请提供一种噬菌体药剂粉，通过药剂杀菌效能检测发现，该噬菌体药剂粉对大肠杆菌04086有很好的杀菌效果，且噬菌体药剂粉中大肠杆菌噬菌体04086的含量越高，杀菌效果越好。
可选地，所述噬菌体药剂中包含的大肠杆菌噬菌体04086的有效效价为7.2×1011pfu/mL。
本申请还提供一种溶液状的噬菌体药剂，通过药剂防治效能检测发现，该噬菌体药剂对宿主菌04086的消杀能力极强，并且还能够有效的降低鸡舍环境中的大肠杆菌含量，达到防治大肠杆菌的目的。
在一个具体的实施方案中，所述噬菌体药剂在使用时的稀释浓度为7.2×106pfu/mL。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1. 本申请提供的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）04086；保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），属于Dhakavirus属噬菌体，保藏编号为CCTCC NO.M2021216，保藏时间为2021年3月8日。该大肠杆菌噬菌体04086经全基因组测序后发现其不含有毒力基因和耐药基因，能够安全的进行工业化生产。
2. 本申请提供的大肠杆菌噬菌体04086的潜伏期短、裂解效率高，裂解时间为10min，并且在25min内即可杀灭宿主，能够及时应对大肠杆菌爆发性的突发情况，以及对大肠杆菌疾病的预防和治疗。
3. 本申请提供的大肠杆菌噬菌体04086具有较强的酸碱和温度耐受性，在pH 4~11范围和温度0~60℃下还有较高的效价，能够达到1×107~108pfu/mL，故该大肠杆菌噬菌体04086能够在不同环境下对大肠杆菌起到防控作用。
附图说明
图1为本发明的大肠杆菌噬菌体04086的噬菌斑图；
图2为本发明的大肠杆菌噬菌体04086的透射电镜图；
图3为本发明的大肠杆菌噬菌体04086基于主要衣壳蛋白的系统进化树图；
图4为本发明的大肠杆菌噬菌体04086的一步生长曲线图；
图5为温度对本发明的大肠杆菌噬菌体04086活性影响的示意图；
图6为pH对本发明的大肠杆菌噬菌体04086活性影响的示意图。
具体实施方式
本申请提供了一种大肠杆菌噬菌体，该噬菌体是从雏鸡排泄物与地面水体中分离获得，通过基因组测序及系统发育树进行鉴定，判定该噬菌体为大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage），属于Dhakavirus属噬菌体，并命名为大肠杆菌噬菌体04086，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.M2021216，保藏时间为2021年3月8日。
本申请中所用到的培养基配方如下：
LB液体培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠。
半固体的LB培养基（0.6%琼脂）：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、6g琼脂粉。
LB固体培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、15g琼脂粉。
上述各培养基的制备方法如下：取各组分混合均匀，并溶于1L蒸馏水中，并调节体系pH为7，在121℃下灭菌30min，即获得所需培养基。
本申请中SM缓冲液的制备方法为：，取2g七水硫酸镁、5.8g氯化钠与1mol/L的PH值为7.5的Tris-HCl缓冲液50mL混合，超纯水进行定容至1L，混合摇匀后，121℃下灭菌30min，获得SM缓冲液。本申请中，大肠杆菌噬菌体04086增殖液即噬菌体扩大培养的富集液，通过双层平板法进行增殖，将纯化完毕的噬菌体，选取空斑数最为密集的双层板，挖取上层于10ml SM缓冲液中，搅拌均匀，放置于4℃冰箱，24h后取出置于离心机中以12000 rpm离心2min，上清液用0.22μm滤膜过滤，即得大肠杆菌噬菌体04086增殖液。
本申请所使用的其他试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
以下结合实施例、性能检测试验及附图说明对本申请作进一步详细说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
菌株的分离、纯化
（1）取样：于福建省龙岩市的雏鸡养殖场收集雏鸡排泄物和地面的水体样本，将其混匀后分别放入两个2L的富集桶中，每桶体积不超过1/4。
（2）富集与分离：使用100mL LB液体培养基扩大培养20株致病性大肠杆菌，并以其为宿主菌，分别放入装有样品的两个富集桶中，每桶各10株宿主菌，并各桶再添加300mL的新鲜LB液体培养基，随后将两个富集桶置于37℃下过夜培养。次日分别取10mL富集液于离心管中，10000rpm离心10min，再分别取5mL上清液经0.22μm滤膜过滤两次，将滤液于4℃保存。采用点板法进行噬菌体的分离。吸取制备好的滤液10μL点在经20株不同宿主菌涂布后的琼脂板上，每个琼脂板分点两次，做好标记，在37℃条件下倒置培养过夜，观察噬菌斑。
（3）纯化：使用双层琼脂法对分离到的噬菌体进行纯化。挑取单个噬菌斑（噬菌体04086的噬菌斑图如图1所示）于2mL离心管中，加入SM缓冲液500μL并捣碎斑块，置于4℃孵育过夜。次日涡旋震荡5min后12000 rpm离心5min，取上清液用0.22μL滤膜过滤，取噬菌体滤液和等体积的宿主菌，双层平板法培养。纯化步骤重复3次，最后得到噬菌斑形态均一的噬菌体（命名为大肠杆菌噬菌体04086），向大肠杆菌噬菌体04086中加入终浓度20％的甘油，保存于-80℃超低温冰箱待用。
形态学特征
取实施例1纯化后的大肠杆菌噬菌体04086富集液20μL于铜网上，静置吸附15min，用滤纸吸去多余菌液，再取适量2%磷钨酸染色10min，干燥后在透射电镜下观察。结果如图2所示，所筛选的大肠杆菌噬菌体04086为Dhakavirus属噬菌体，头部形状为正廿面体，头部长和宽为76.7±8.8nm，尾长142.2±4.1nm。
实施例2
菌株的鉴定
对实施例1获得的大肠杆菌噬菌体04086进行全基因组测序及分析，具体如下：
使用PacBio RS II单分子实时测序（SMRT）和Illumina测序平台组合，二代测序数据原始数据（raw data）以fastq格式储存，在对原始数据进行质量剪切后，利用canu及HGAP软件进行PacBio数据组装。同时利用Glimmer和GeneMarkS软件对基因组中的编码序列（CDS）进行预测，tRNAscan-SE进行tRNA预测，Barrnap进行rRNA预测。利用BLASTP、Diamond、HMMER等序列比对工具，从NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KEGG数据库中对预测到的CDS进行功能注释。随后通过NCBI确定大肠杆菌噬菌体04086与已报道噬菌体相似性，选择注释为衣壳蛋白的基因，将其与已报道的相似噬菌体的衣壳蛋白进行比较，利用MEGA7作系统发育树进行分析。
经过主要衣壳蛋白的系统进化树分析显示，大肠杆菌噬菌体04086属于Dhakavirus属噬菌体，经全基因组比对后分析其与最接近的噬菌体差异在5%以上，推测其为一个新种噬菌体。通过全基因组分析显示，大肠杆菌噬菌体04086的基因组为线性结构，基因组全长177253bp，预测有139个开放阅读框（Open ReadingFrame，ORF），开放阅读框注释表如下表1所示。没有预测到tRNA和rRNA，另有72个ORF与已知功能蛋白相似，不存在细菌的耐药基因和毒力基因。
表1大肠杆菌噬菌体04086开放阅读框注释表
此外，该大肠杆菌噬菌体04086有着两种尾丝蛋白，其中ORF44和ORF93分别编码噬菌体的长尾丝蛋白和短尾丝蛋白。尾丝蛋白是噬菌体能够特异性的侵染识别宿主的关键蛋白，因此可以通过基因工程来表达本发明噬菌体的尾丝蛋白，作为特异性检测血清型为O86的大肠杆菌的工具，此外也可通过基因编辑技术用于拓宽噬菌体的裂解谱。
大肠杆菌噬菌体04086主要衣壳蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，噬菌体主要衣壳蛋白的系统进化树如图3所示，由图3分析可知，大肠杆菌噬菌体04086属于Dhakavirus属噬菌体。将该大肠杆菌噬菌体04086保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.M2021216，保藏时间为2021年3月8日。
性能检测试验
（一）最佳感染复数（MOI）的测定
设置7组100mL的新鲜LB液体培养基，然后按照表2所示，分别根据不同的MOI加入大肠杆菌噬菌体04086和宿主菌液，随后置于30℃下，150 rpm/min培养10h，然后测定各组的噬菌体效价。
表2：噬菌体04086最佳感染复数（MOI）的测定
结果如表2的检测结果，感染复数MOI为0.01-1时，噬菌体的效价＞3.5×1011，尤其是在感染复数为0.1时，噬菌体的效价最高，达到7.2×1011 pfu/mL。
（二）一步生长曲线测定
取生长至对数期的大肠杆菌菌液和噬菌体增殖液各500μL，按照最佳感染复数（MOI=0.1）进行充分混合，随后置于37℃下孵育5min。10000g离心1min后舍弃上清并用1mL培养基重悬，随后全部转移至49mL的LB液体培养基，置于30℃恒温震荡箱中培养，每间隔5min取样进行噬菌体的效价测定。每次取样1mL，离心后经0.22μm滤膜过滤，通过双层平板法来测定噬菌体效价，每次试验设计3个平行。
结果如图4所示，根据图4的一步生长曲线可以看出，大肠杆菌噬菌体04086在初期感染宿主后，有10min左右的潜伏期，随后噬菌体的数量在之后的10~15min内急速增加，在25min后达到顶峰，平均爆发量约127pfu/cell。
（三）温度对噬菌体04086的影响测定
分别在24个2mL的无菌离心管中各加入1mL的大肠杆菌噬菌体04086增殖液(109pfu/mL)，分别于0℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下孵育1h（每个温度做3个平行）。用双层平板法测定处理结束后的离心管中噬菌体的效价。
结果如图5所示，大肠杆菌噬菌体04086在温度0~60℃中稳定，在超过60℃处理1h后噬菌体效价出现明显下降，80℃下完全失活。
（四）噬菌体04086对酸碱耐受性的测定
分别配置11个不同pH（梯度为2~12）的培养基，每个梯度配置3份。取100μL大肠杆菌噬菌体04086增殖液（1×109pfu/mL）与900μL各pH培养基混合在2mL的无菌离心管中，于30℃下孵育1h。待处理结束后通过双层平板法测定各离心管中的噬菌体效价。
结果如图6所示，当pH在4~11范围时，大肠杆菌噬菌体04086的效价还能够稳定在1×107pfu/mL以上；当pH小于4或者大于11时，大肠杆菌噬菌体效价逐渐降低，在pH等于2和12时，大肠杆菌噬菌体完全丧失活性。
（五）噬菌体04086裂解谱的测定
配置好半固体的LB培养基（0.6%琼脂），分别取6mL的半固体培养基与过夜培养的不同血清型大肠杆菌100μL（不同血清型大肠杆菌如表3所示）混合，随后均匀倒入在LB固体培养基上。静置5-10分钟，待琼脂凝固后吸取大肠杆菌噬菌体04086增殖液2μL滴加在平板上，待液滴晾干后，将培养皿倒置在37℃恒温培养箱孵育过夜。次日观察平板上滴加噬菌体悬液的位置是否形成噬菌斑，出现噬菌斑则说明对应的大肠杆菌能够被噬菌体裂解，用+表示；反之，用-表示。
表3：噬菌体04086的裂解谱
结果如表3所示，测定了10种血清型的大肠杆菌（共16株），大肠杆菌噬菌体04086对血清型为O86的宿主菌株会出现很强的裂解性，对其他血清型的大肠杆菌无法裂解。这是由于大肠杆菌噬菌体04086有着短尾丝蛋白和长尾丝蛋白，两种蛋白都是对宿主受体进行特异性的识别，使得大肠杆菌噬菌体04086具有高度的特异性。
实施例3
实施例3提供一种发酵上清液。
上述发酵上清液的制备方法为：按照最佳MOI对大肠杆菌噬菌体04086进行发酵培养，培养条件37℃、150rpm/min，培养时间为8h；然后对发酵液离心，转速为8000r/min，离心完毕，过滤获得上清液与沉淀物，该上清液即为发酵上清液。
实施例4
实施例4提供一种噬菌体药剂粉。
上述噬菌体药剂粉的制备方法为：将实施例3获得的发酵上清液进行冻干，获得噬菌体药剂粉。
药剂杀菌效能检测
（1）取实施例4获得的噬菌体药剂粉末1g溶于1ml的无菌水中，配置成浓度为7.2×1011pfu/mL的菌剂，随后取100μL菌剂加入到900μL的无菌水中进行稀释，梯度稀释至10、102、103、104、105、106倍，至各梯度中噬菌体效价分别为7.2×109、7.2×108、7.2×107、7.2×106、7.2×105、7.2×104pfu/mL。设置一个空白对照，并且每个梯度做三个平行。
（2）取已经通过平板计数法计算含量的宿主菌04086 500μL，分别与500μL各梯度的噬菌体药剂稀释液和500μL的空白无菌水混匀。随后在37℃的恒温震荡箱中180 rpm/min孵育2h，处理结束后通过稀释平板涂布法计算宿主菌04086的含量结果如下表4所示。
表4：噬菌体药剂效能测定表
根据表4的检测结果可知，实施例4获得的噬菌体药剂粉对大肠杆菌04086有很好的杀菌效果，且噬菌体药剂粉中大肠杆菌噬菌体04086的含量越高，杀菌效果越好。
实施例5
实施例5提供一种噬菌体药剂。
上述噬菌体药剂的制备方法，包括以下步骤：向实施例4获得的噬菌体药剂粉中加入水，获得噬菌体药剂。
药剂防治效能检测
（1）将新鲜培养的宿主菌04086浓度稀释到1×105cfu/mL；将实施例5获得的噬菌体药剂稀释到噬菌体的效价为7.2×106pfu/mL。
（2）在雏鸡养殖场的鸡舍中规划四个区域，分别做如下处理：
区域1使用稀释后的宿主菌液均匀喷洒，随后再喷洒稀释后的噬菌体药剂；
区域2使用稀释后的宿主菌液均匀喷洒，不喷洒噬菌体药剂；
区域3不喷洒宿主菌液，只均匀喷洒噬菌体药剂；
区域4不做处理。
（3）等待2h后分别检测四个区域环境中大肠杆菌的含量。
检测结果显示，区域2在喷洒宿主菌后没有杀菌处理，大肠杆菌含量在105cfu以上，区域1喷洒宿主菌后经过噬菌体药剂消毒，检测出的大肠杆菌含量在33cfu以下；未作处理的区域4检测出的大肠杆菌含量在47cfu左右，经过噬菌体药剂喷洒的区域3检测出的大肠杆菌含量在23cfu以下。表明噬菌体药剂对宿主菌的消杀能力极强，并且还能够有效的降低鸡舍环境中的大肠杆菌含量，达到防治大肠杆菌的目的。
综上所述，本申请提供的大肠杆菌噬菌体04086的潜伏期短、爆发速度快、对酸碱和温度有着高耐受性、并且不含有毒力基因，利用其制得的噬菌体菌剂能够降低鸡舍环境中的大肠杆菌含量，有效的解决雏鸡养殖中出现的大肠杆菌感染问题。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1. 一种Dhakavirus属大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）04086；保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.M2021216，保藏时间为2021年3月8日。
2.一种发酵上清液，其特征在于，所述发酵上清液是权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体04086经发酵、离心获得的上层澄清液。
3.一种药剂，其特征在于，所述药剂包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体04086。
4.根据权利要求3所述的药剂，其特征在于，所述药剂的剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
5.根据权利要求3或4所述的药剂，其特征在于，所述药剂还包含药学上可接受的载体。
6.根据权利要求3所述的药剂，其特征在于，所述药剂中包含的大肠杆菌噬菌体04086的有效效价为7.2×1011pfu/mL。
7.如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体04086、权利要求2所述的发酵上清液、权利要求3-6中任一项所述的药剂在裂解血清型O86大肠杆菌中的应用。
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