CN118028247A - 一株具有跨种裂解特性的噬菌体rdp-cp-22001及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种跨种属裂解的噬菌体RDP‑CP‑22001及其用途。一株具有跨种裂解特性的噬菌体RDP‑CP‑22001，该噬菌体为产气荚膜梭菌噬菌体，于2023年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.45448。本发明提供的噬菌体RDP‑CP‑22001可以同时裂解大肠杆菌和产气荚膜梭菌，并且裂解谱宽，对多种血清型均有裂解性，能耐受一定高温，遗传稳定。该噬菌体的发现，突破了细菌菌种界限，为无抗养殖提供了更多的可能性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种跨种属裂解的噬菌体RDP-CP-22001及其用途。
背景技术
产气荚膜梭菌作为一种重要的厌氧菌，广泛存在于健康人和动物肠道中，一旦宿主机体免疫力低下或者受到外界环境因素刺激便会大量增殖，致使肠道菌群失调，同时产生大量毒素，导致肠道上皮细胞破损，引起宿主的一系列疾病。由于发病迅速、病程短、致死率高，常规治疗手段很容易因为错过最佳治疗期而难
以达到治疗效果，这直接导致了其临床治疗成功率低。
噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成增殖，通过裂解细菌将自身释放到环境中的微生物。与抗生素治疗相比，噬菌体治疗具有代谢效率低、杀死细菌的最低剂量低、高度的特异性、高效的杀菌效果、筛选速度快等优势。
近年来，有关噬菌体的研究有了巨大的发展，国内外对噬菌体的应用研究范围很广，包括针对人类疾病的防治、动物疾病的防治、食品中病原菌的清除、农作物的细菌感染防治、细菌生物被膜的裂解等方面。虽然噬菌体应用前景巨大，但不容忽视的是，噬菌体往往具有较窄的宿主谱，一种噬菌体通常只能裂解一种细菌。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供跨种属裂解的噬菌体，该噬菌体不仅对大肠杆菌具有强裂解性，同时能够跨种属裂解产气荚膜梭菌，且具有较宽的裂解谱。
为实现上述目的，本发明采用的技术手段是提供一株具有跨种裂解特性的噬菌体RDP-CP-22001，该噬菌体为产气荚膜梭菌噬菌体Clostridium perfringens bacteriophage，于2023年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.45448。
进一步地，所述噬菌体能够裂解大肠杆菌及产气荚膜梭菌。
进一步地，本发明还提供所述噬菌体的用途，该噬菌体用来制备抗大肠杆菌或产气荚膜梭菌引起疾病的药物。
进一步地，本发明还提供所述噬菌体的另一种用途，该噬菌体用来制备抑制大肠杆菌或产气荚膜梭菌的环境消毒剂或生物制剂。
进一步地，本发明还提供所述噬菌体的另一种用途，该噬菌体用来制备饲料添加剂或饲料。
进一步地，本发明还提供一种抗大肠杆菌或产气荚膜梭菌引起疾病的药物，所述药物包含有效剂量的所述噬菌体。
进一步地，本发明还提供一种抑制大肠杆菌或产气荚膜梭菌的环境消毒剂或生物制剂，所述环境消毒剂或生物制剂包含所述的噬菌体。
进一步地，本发明还提供一种添加剂或饲料，所述添加剂或饲料中包含所述的噬菌体。
本发明提供的噬菌体可以同时裂解大肠杆菌和产气荚膜梭菌，并且裂解谱宽，对多种血清型均有裂解性，能耐受一定高温，遗传稳定。由于大肠杆菌和产气荚膜梭菌分属于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，该噬菌体的发现，突破了细菌菌种界限，为无抗养殖提供了更多的可能性。
附图说明
图1为噬菌体RDP-CP-22001在电子显微镜下的形态；
图2为噬菌体RDP-CP-22001的一步生长曲线；
图3为噬菌体RDP-CP-22001对pH稳定性曲线；
图4为噬菌体RDP-CP-22001对温度敏感性曲线；
图5为噬菌体RDP-CP-22001的遗传稳定性曲线；
图6为噬菌体RDP-CP-22001制成粉剂前后效价对比；
图7为噬菌体RDP-CP-22001对感染产气荚膜梭菌的肉鸡的保护作用曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
本发明通过研究一株产气荚膜梭菌CP-20032，对该菌株进行噬菌体分离，得到一株裂解性噬菌体。
1.宿主产气荚膜梭菌CP-20032的分离与保存步骤如下：
宿主从山东某发病养殖场采样，无菌操作取病禽盲肠，在选择性培养基上划线，37℃厌氧环境培养18-24h，病菌在血液琼脂培养基上的形态为圆顶状的菌落，菌落表面光滑，半径为1-2.5 mm呈半透明，边缘整齐；在血琼脂基础平板（5%绵羊血+1%葡萄糖）上挑取草绿色、周围有双层溶血环的菌落接种于胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础（TSC）上，放置厌氧环境，45℃培养 18-24h；挑取典型菌落继续划线纯化3~5次，直至菌落形态一致，然后挑取单菌落接种于5mL的液体硫乙醇酸盐（FTG）肉汤培养基中，37℃厌氧培养箱中培养12h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性产气荚膜梭菌，将其中一株命名为CP-20032，鉴定好的菌株在血琼脂基础平板培养基平板上划线，培养12h，将全部菌落用接种环刮至60%甘油-FTG液体中，保存于-80℃冰箱。
2.噬菌体RDP-CP-22001的分离及鉴定
（1）病料处理：从养殖场取病鸡，解剖留取盲肠，无菌操作取盲肠内容物，加入2mL灭菌FTG液体，将盲肠内容物充分浸泡，然后 10000rpm离心30min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；
（2）制备噬菌体富集液：取0.2mL菌悬液和1mL滤出液加入5mL FTG肉汤中，37℃厌氧箱培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，滤出液备用；
（3）噬菌体分离：采用双层平板法进行噬菌体的分离，取噬菌体富集液滤出液0.1mL和宿主产气荚膜梭菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃厌氧培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL SM缓冲液中4℃浸泡12h，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃厌氧培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化5次，即得。RDP-CP-22001在双平板形成的噬菌斑直径在1mm-3mm。
噬菌体RDP-CP-22001保存方法：将噬菌体增殖液与60%的甘油按照1：1的比例混合，保存于-80℃冰箱或液氮中均可。
3.噬菌体RDP-CP-22001的电镜观察
取 20 μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀 15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2%的磷钨酸（PTA）于铜网上对噬菌体染色 10 min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示，该噬菌体RDP-CP-22001有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约nm，有一个长约nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为科，命名为产气荚膜梭菌噬菌体Clostridium perfringens bacteriophage。
将该噬菌体的全基因组进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示，全基因组长度为50166bp。该基因组由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的序列按照顺序连接而成。由于该基因组单条序列长度过长，不能通过电子申请客户端提交核苷酸序列表机读载体，故将其进行拆分处理。
该噬菌体于2023年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.45448。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
5.噬菌体RDP-CP-22001最佳感染复数测定
按照感染复数为100 、10、1、0.1、0.01、0.001的比例将噬菌体增殖液和宿主加入FTG肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃厌氧箱中培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。具体参见表2。
表1 最佳感染复数的测定结果
| 编号 | 产气荚膜梭菌数CP-20032（cfu/mL） | RDP-CP-22001噬菌体数（pfu/mL） | 感染复数 | 8h噬菌体效价（pfu/mL） |
| 1 | 1×107 | 1×109 | 100 | 4.02×109 |
| 2 | 1×107 | 1×109 | 10 | 6.25×109 |
| 3 | 1×108 | 1×108 | 1 | 9.64×109 |
| 4 | 1×108 | 1×107 | 0.1 | 7.03×109 |
| 5 | 1×109 | 1×107 | 0.01 | 5.41×109 |
| 6 | 1×109 | 1×106 | 0.001 | 3.19×109 |
由表1数据显示，当感染复数为1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-CP-22001的最佳感染复数为1。
6.噬菌体RDP-CP-22001一步生长曲线的绘制
取对数生长期的产气荚膜梭菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种大肠杆菌CP-20032和噬菌体RDP-CP-22001，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用FTG肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的FTG肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量 = 暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。
由图3可以看出，噬菌体感染宿主菌后的40min 内效价没有明显变化，表明其潜伏期约40min，感染后40-80min 内噬菌体的效价明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为40 min。通过计算，噬菌体裂解量约为162PFU/感染细胞，表明噬菌体具有较强的裂解和复制能力。
7.噬菌体RDP-CP-22001pH稳定性测定
制备105cfu/mL的指数期宿主菌液，将噬菌体液按最佳感染复数调整浓度。调整FTG液体培养基的pH值分别为 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，取噬菌体液加入到等体积的不同pH值下的FTG液体培养基混匀，37°C培养箱静置2h后，取100μL混合液与等体积的菌液混合，通过双层板法测效价，每个pH值三个平行，绘制 pH-效价曲线，确定最高点的pH范围。
结果如图4所示。噬菌体RDP-CP-22001在pH5.0−11.0范围能维持较好的活性，噬菌体能保持较高的效价，在pH为2或13.0时，噬菌体效价降低。随着pH值的降低或升高，噬菌体的效价下降明显，表明噬菌体RDP-CP-22001不能够耐受强酸和强碱。
8.噬菌体RDP-CP-22001最适生长温度测定
制备105cfu/mL指数期宿主菌液，将噬菌体原液按照最佳感染复数稀释到适合浓度，取100μL与等体积菌液混合，倒双层平板，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下培养30min和60min，30min后每隔10min取出噬菌体液体，冷却至室温，然后通过双层板法测噬菌体效价，每个温度三个平行，绘制时间-效价曲线，确定温度范围。
由图5可以看出噬菌体RDP-CP-22001在60℃以下活性可保持80%，在80℃时，活性也可以保持60min以上，90℃环境中1h内活性下降较快，说明该噬菌体能耐受一定高温，不能耐受极高的温度。
9.噬菌体RDP-CP-22001遗传稳定性实验
将RDP-CP-22001连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-CP-22001和BE-20199，每代培养时间6h，然后倒双平板，测定其效价。
由图6可以看出，噬菌体RDP-CP-22001在传代30次的过程中，始终保持较高的效价，没有出现明显波动，说明该噬菌体可以稳定遗传
10.噬菌体RDP-CP-22001裂解谱测定
噬菌体宿主谱采用点滴法检测。于细菌库中选取30株经鉴定为致病性大肠杆菌的宿主和30株产气荚膜梭菌宿主，各取100 μL待测菌液分别涂布于LB固体培养基上和TY固体培养基，待晾干后，吸取10 μL噬菌体液各滴2滴于培养基上，大肠杆菌与37℃普通培养箱倒置培养6~8h，产气荚膜梭菌于37℃厌氧培养箱倒置培养6~8h，观察是否出现空斑，若出现则说明噬菌体对该菌株有裂解作用。
如表2所示，噬菌体RDP-CP-22001可对试验中所选的30株大肠杆菌中的22株有裂解作用，裂解率73%；噬菌体RDP-CP-22001可对试验中所选的30株产气荚膜梭菌中的21株有裂解作用，裂解率为70%，说明该噬菌体有较宽的裂解谱，可以同时高效裂解大肠杆菌和产气荚膜梭菌。
表2：噬菌体RDP-CP-22001对大肠杆菌的裂解谱
| 大肠杆菌宿主 | RDP-CP-22001裂解性 | 产气荚膜梭菌宿主 | RDP-CP-22001裂解性 |
| BE-19001 | + | CP-20010 | + |
| BE-19008 | + | CP-20012 | – |
| BE-19015 | + | CP-20014 | + |
| BE-19023 | – | CP-20016 | + |
| BE-19031 | + | CP-20018 | – |
| BE-19039 | + | CP-20020 | + |
| BE-19047 | – | CP-20022 | + |
| BE-19055 | + | CP-20024 | – |
| BE-19063 | + | CP-20026 | + |
| BE-19072 | + | CP-20028 | – |
| BE-20005 | + | CP-21002 | + |
| BE-20013 | – | CP-21004 | + |
| BE-20021 | + | CP-21006 | – |
| BE-20029 | + | CP-21008 | + |
| BE-20037 | + | CP-21010 | + |
| BE-20045 | + | CP-21012 | + |
| BE-20053 | – | CP-21014 | + |
| BE-20061 | + | CP-21016 | – |
| BE-20069 | – | CP-21018 | + |
| BE-20076 | + | CP-21020 | – |
| BE-21011 | – | CP-22002 | + |
| BE-21019 | + | CP-22004 | + |
| BE-21027 | + | CP-22006 | + |
| BE-21035 | + | CP-22008 | + |
| BE-21043 | – | CP-22010 | + |
| BE-22009 | + | CP-22012 | – |
| BE-22017 | + | CP-22014 | + |
| BE-22025 | + | CP-22016 | + |
| BE-22033 | – | CP-22018 | – |
| BE-22041 | + | CP-22020 | + |
11.噬菌体RDP-CP-22001粉制剂生物活性试验
将2%的淀粉和4%的山梨醇按质量体积比溶于噬菌体溶液，在37°C、180 r/min的条件下与噬菌体孵育2 h进行噬菌体包被。将包被好的噬菌体溶液以1:4(质量比)的比例喷洒在载体脱脂米糠，一边喷洒一边搅拌，混合均匀，50°C干燥2 h，湿度<10%，过40目筛。
按照如上方法制备完成后，取样检测效价，后常温保存。
噬菌体制成粉剂后检测效价，如图6所示，表明噬菌体制成粉剂后，噬菌体效价保持不变。
12.噬菌体RDP-CP-22001在临床治疗中的应用
设计试验，验证噬菌体对肉鸡产气荚膜梭菌引起疾病的治疗作用。
实验步骤：
（1）取75只1周龄的白羽肉鸡，随机分成5组，各组鸡只口服1mL产气荚膜梭菌CP-20032（108CFU/mL），空白对照组口服等体积的生理盐水。
（2）2h后，各试验组口服不同浓度的噬菌体1mL，各对照组肌肉注射等体积的生理盐水。分组及给药情况见表2。
（3）每天观察各组鸡只的精神状况，统计肉鸡的死亡情况绘制生存曲线。称量各组鸡只攻毒前与攻毒8d后的体重，比较各组鸡只体重的差异。
表3：噬菌体RDP-CP-22001对肉鸡产气荚膜梭菌引起疾病的治疗作用
| 试验分组 | 口服 | 口服 |
| 高剂量噬菌体组 | 1mL CP-20032（108CFU/mL） | 1mL RDP-CP-22001（109CFU/mL） |
| 中剂量噬菌体组 | 1mL CP-20032（108CFU/mL） | 1mL RDP-CP-22001（107CFU/mL） |
| 低剂量噬菌体组 | 1mL CP-20032（108CFU/mL） | 1mL RDP-CP-22001（105CFU/mL） |
| 对照组 | 1mL CP-20032（108CFU/mL） | 生理盐水 |
| 空白组 | 生理盐水 | 生理盐水 |
结果由图7可以看出，实验鸡感染宿主后，高剂量噬菌体组可以完全保护鸡只，试验过程中没有出现死亡情况；中剂量组和低剂量组均出现了一定的死亡。对照组肉鸡死亡较严重，试验证明，噬菌体RDP-CP-22001对产气荚膜梭菌引起的死亡有很好的保护作用。
Claims (10)
1.一株具有跨种裂解特性的噬菌体RDP-CP-22001，其特征在于：该噬菌体为产气荚膜梭菌噬菌体，于2023年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC NO.45448。
2.根据权利要求1所述的具有跨种裂解特性的噬菌体RDP-CP-22001，其特征在于：所述噬菌体能够裂解大肠杆菌及产气荚膜梭菌。
3.根据权利要求1所述的具有跨种裂解特性的噬菌体RDP-CP-22001，其特征在于：所述噬菌体的最佳感染复数为1。
4.一种如权利要求1或2所述噬菌体RDP-CP-22001的用途，其特征在于：该菌噬菌体用来制备抗大肠杆菌或产气荚膜梭菌引起疾病的药物。
5.一种如权利要求1或2所述噬菌体RDP-CP-22001的用途，其特征在于：该噬菌体用来制备抑制大肠杆菌或产气荚膜梭菌的环境消毒剂或生物制剂。
6.一种如权利要求1或2所述噬菌体RDP-CP-22001的用途，其特征在于：该噬菌体用来制备饲料添加剂或饲料。
7.一种抗大肠杆菌或产气荚膜梭菌引起疾病的药物，其特征在于：所述药物包含有效剂量的如利要求1或2所述的噬菌体。
8.一种抑制大肠杆菌或产气荚膜梭菌的环境消毒剂或生物制剂，其特征在于：所述环境消毒剂或生物制剂包含如利要求1或2所述的噬菌体。
9.一种添加剂，其特征在于：包含如利要求1所述的噬菌体。
10.一种饲料，其特征在于：包含如利要求1所述的噬菌体，或者包含如权利要求9所述的添加剂。
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2024
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