CN116121203A - 一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116121203A
CN116121203A CN202210951608.7A CN202210951608A CN116121203A CN 116121203 A CN116121203 A CN 116121203A CN 202210951608 A CN202210951608 A CN 202210951608A CN 116121203 A CN116121203 A CN 116121203A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
bacteriophage
clostridium
salmonella
clostridium welchii
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210951608.7A
Other languages
English (en)
Inventor
潘强
任慧英
孙虎芝
刘广芹
王翠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd filed Critical Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Publication of CN116121203A publication Critical patent/CN116121203A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physiology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种魏氏梭菌噬菌体PM11、其噬菌体组合物及其应用，该用于防控禽细菌性腹泻的魏氏梭菌噬菌体PM11，保藏号为CGMCC No.22372，该噬菌体于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，本发明还公开了由该魏氏梭菌噬菌体PM11与大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192组配形成的噬菌体组合物，上述魏氏梭菌噬菌体及噬菌体组合物可作为有效预防及治疗禽细菌性腹泻的活性成分，也可以作为环境消毒剂，有效控制养殖环境被污染，与单一裂解性噬菌体相比，具有宽裂解谱的特点，扩宽了杀菌范围并提高杀菌活性。

Description

一株魏氏梭菌噬菌体PM11、其噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株魏氏梭菌噬菌体PM11、其噬菌体组合物及其应用。
背景技术
随着集约化养禽产业的迅速发展，细菌性疾病日益成为危害养禽业发展的首要疾病。而细菌性腹泻是危害养禽业重要的细菌性疾病，它不但影响蛋禽的产蛋量、肉禽的增重，严重的可导致禽群死亡，给养殖业造成严重的经济损失。引起禽发生腹泻的细菌性疾病包括禽大肠杆菌病、禽沙门氏菌病以及禽魏氏梭菌病等。
魏氏梭菌病又称产气荚膜菌病，是常见的一种急性致死性腹泻病，其发病率和死亡率均高，造成严重的经济损失。据统计，在全球范围内，由魏氏梭菌造成的经济损失约20亿美元/年。魏氏梭菌广泛分布于自然界，在土壤、污水、食物、粪便中均有生长，在动物体内能形成夹馍，具有强抵抗力。家禽感染A型和C型产气荚膜梭菌易患禽坏死性肠炎，临床症状表现为精神沉郁、眼闭合，采食量下降、腹泻，增重率下降，甚至排红褐色粪便或黑褐色焦油样粪便，严重影响动物的生长和健康，给养殖主带来较大的经济损失。
禽大肠杆菌病是由某些致病性或条件致病性大肠杆菌引起的禽类不同种类疾病的总称，是危害养禽业最为严重的细菌性疾病之一。该病可以感染各个日龄的鸡、鸭以及火鸡等多种类型的禽，但雏鸡较成年鸡易感，肉鸡较蛋鸡易感。呼吸道、消化道以及交配均可成为该病的传播途径，但消化道为主。发病禽类临床症状主要由食欲减退、精神沉郁、羽毛蓬乱、走路摇摆、跛行以及消瘦等，当侵害消化道时，会出现腹泻或排绿色粪便等症状。
禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属种的一种沙门氏菌所引起的禽类的急性或慢性疾病的总称，分为鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒。鸡是家禽沙门氏菌最大的宿主，鸡群爆发死亡率最高可达80％；其中最为常见的是鸡白痢，鸡白痢是雏鸡的一种急性、败血性传染病。2周龄以内的雏鸡发病率和死亡率都很高，成年鸡感染沙门菌则多表现为慢性症状。但这些定植在禽肠道中的非伤寒沙门菌常以蛋和禽肉制品为主要传播媒介，是引发人食源性疾病的首要病原菌。禽感染沙门氏菌后不仅会降低其生产性能，甚至导致自身死亡或带入卵中，给养殖产业增加生产成本等等。
由于目前临床上抗生素滥用导致细菌的耐药性严重，造成抗生素对家禽细菌性腹泻防治难度增大，且根据我国饲料添加剂禁止添加抗生素的政策的实施，导致家禽腹泻疾病日益严重。噬菌体是一种新型安全无残留的新型抑菌生物制剂，对耐药细菌具体同样的杀灭效果，具有很好的应用前景。
但是目前，可高效防治魏氏梭菌病的魏氏梭菌噬菌体少且单一，极大的制约了其应用范围，还需要继续研发繁殖速度快、裂解谱宽的魏氏梭菌噬菌体；同时，还需继续研发具有更广应用范围、裂解谱更宽、利用各噬菌体的优势互补的噬菌体组合物，以更好的防治由多种不同细菌病原菌引发的禽细菌性腹泻类疾病。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种魏氏梭菌噬菌体PM11以及基于鸡尾酒噬菌体防控方法建立的具有宽裂解谱、强裂解作用的一种包括魏氏梭菌噬菌体PM11的噬菌体组合物，所述魏氏梭菌噬菌体 PM11可高效裂解魏氏梭菌，而所述噬菌体组合物可有效防控禽大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌等多种致病菌引起的腹泻；同时，所述魏氏梭菌噬菌体PM11及其噬菌体组合物还可用于制备药物制剂、禽类饲料添加剂、环境消毒剂、试剂盒等。
为了解决上述问题，本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供一种用于防控禽细菌性腹泻的魏氏梭菌噬菌体PM11，保藏号为CGMCC No.22372，该噬菌体于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。在电子显微镜下观察到，该噬菌体PM11的形态，其呈头部呈多面体结构，头部直径约44nm，具有6个短尾丝，属短尾噬菌体。
本发明还提供一种用于防控家禽细菌性腹泻的大肠杆菌噬菌体PD205，保藏号为CGMCC No.22361，于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。本发明在电子显微镜下观察到噬菌体PD205的形态为：其具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部宽80-87nm，长113-120nm，尾长107-113nm，属肌尾噬菌体。
本发明还提供一种用于防控禽细菌性腹泻的沙门氏菌噬菌体PC192，其保藏号为CGMCC No.22367，于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。在电子显微镜下观察了噬菌体PC192的形态，噬菌体具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部宽60-67nm，长 60-67nm，尾长167-200nm，属长尾噬菌体。
经噬菌体全基因组分析，得到：噬菌体PD205、PC192、PM11的全基因组大小分别为168652bp、 39095bp和109054bp，其中噬菌体PD205基因组G+C含量为37.60％，含有269个开放阅读框(ORFs)，噬菌体PC192基因组G+C含量为48.29％，含有47个开放阅读框(ORFs)，噬菌体PM11基因组 G+C含量为39.09％，含有183个开放阅读框(ORFs)。噬菌体PD205、PC192和PM11不含耐药基因及毒力基因，不含溶原性相关基因。
第二方面，本发明提供一种噬菌体组合物，其包括前述的魏氏梭菌噬菌体PM11和其他噬菌体。
或者，提供一种噬菌体组合物，包括前述的大肠杆菌噬菌体PD205和其他噬菌体。
或者，提供另一种噬菌体组合物，其包括前述的沙门氏菌噬菌体PC192和其他噬菌体。
第三方面，本发明提供一种用于防控禽细菌性腹泻的噬菌体组合物，其包括如上所述的大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192和魏氏梭菌噬菌PM11。
可选地，大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体与魏氏梭菌噬菌体的活体数量之比为1:1:1；每种噬菌体的的含量不低于1×108PFU/mL。
本申请中，魏氏梭菌噬菌体PM11包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％的杀菌活性相同的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。PM11的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。大肠杆菌噬菌体PD205和沙门氏菌噬菌体PC192也分别包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％的杀菌活性相同的突变株，解释同魏氏梭菌噬菌体PM11。
第四方面，本发明还提供上述魏氏梭菌噬菌体PM11或上述噬菌体组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饲料添加剂、检测试剂盒中的应用。中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
所述禽细菌性腹泻包括由魏氏梭菌引发的魏氏梭菌病或由魏氏梭菌和其他病原菌(如大肠杆菌和沙门氏菌)共同感染导致的禽类腹泻类疾病。所述禽细菌性腹泻包括禽坏死性肠炎、沙门氏菌引起的腹泻、大肠杆菌感染引起的肠炎或混合感染导致的其它类型的肠炎。
此外，本发明还提供上述大肠杆菌噬菌体PD205或含该噬菌体的组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饮用水添加剂以及试剂盒中的应用。
本发明也提供沙门氏菌噬菌体PC192或含有该噬菌体的噬菌体组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饮用水添加剂以及试剂盒中的应用。
第五方面，本发明提供一种噬菌体药物制剂，该制剂的活性成分包括前述的魏氏梭菌噬菌体PM11 或前述的噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体组合物包括大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体 PC192和魏氏梭菌噬菌PM11。
所述噬菌体药物制剂还包括辅料；所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种。优选的，所述噬菌体药物制剂还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
其他方案中提供的噬菌体药物制剂中，其活性成分包括前述的大肠杆菌噬菌体PD205或含该噬菌体的组合物；或者活性成分包括沙门氏菌噬菌体PC192或含有该噬菌体的噬菌体组合物。
具体地，所述噬菌体药物制剂的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、胶囊剂、气雾剂、丸剂或片剂。
所述药物制剂的应用方法为：将药物制剂添加到患有细菌性腹泻的禽饮水中，或对禽类体表灌服、肌肉注射，或添加到饲料中的方式，其中优选的使用饮水方式预防及治疗禽细菌性腹泻，降低禽腹泻率，提高禽的存活率，提高蛋其产蛋率以及料肉比等。所述禽包括鸡、鸭、鹅等。
经实验验证，在感染大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌引起腹泻的7日龄雏鸡中，使用5×109PFU/mL 的噬菌体组合物进行饮用水混拌饲喂，连用3天。在14天内可以有效降低患病雏鸡的90％左右的腹泻率。
第六方面，本发明还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括魏氏梭菌噬菌体PM11、大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192或这三株噬菌体中至少两株组合的噬菌体组合物；优选的，环境消毒剂的有效成分包括魏氏梭菌噬菌体PM11、大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192这三株噬菌体；进一步优选地，每种噬菌体的浓度为5×108PFU/ml以上。优选地，还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的其他活性成分，以提高其灭菌或抑菌效果；还可包括其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。
上述消毒剂的应用方法为：将消毒剂在鸭屠宰场、鸭产品加工车间及器具、鸭养殖环境中使用，防止环境中魏氏梭菌或魏氏梭菌和其他病原菌的污染。所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，这种消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且其对人体及家禽不会造成损害。
第七方面，本发明还提供一种饲料添加剂或饮用水添加剂，用于预防家禽细菌性腹泻，其活性成分包括魏氏梭菌噬菌体PM11、或大肠杆菌噬菌体PD205、或沙门氏菌噬菌体PC192、或这三株噬菌体中至少两株组合的噬菌体组合物；优选的，添加剂的有效成分包括魏氏梭菌噬菌体PM11、大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192这三株噬菌体；饮用水中每种噬菌体的浓度至少为 1×108PFU/g。
第八方面，本发明还提供一种检测试剂盒，包括前述的魏氏梭菌噬菌体PM11、大肠杆菌噬菌体 PD205、沙门氏菌噬菌体PC192中的一种或多种。本申请提供的三株噬菌体的裂解特异性强，可利用噬菌体制备检测对应的宿主菌检测试剂盒，用于检测其特异侵染的魏氏梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌或用于防控由其宿主菌侵染导致的疾病。
本发明实施例提供的噬菌体组合物及其应用具有以下有益效果：
1、本发明提供了三株自行分离的具有优异裂解性能的魏氏梭菌噬菌体PM11、大肠杆菌噬菌体 PD205和沙门氏菌噬菌体PC192，并提供了基于这三种噬菌体的复配形成的用于防控禽细菌性腹泻的噬菌体组合物，该组合物通过大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192和魏氏梭菌噬菌体PM11 组合作为有效预防及治疗禽细菌性腹泻的活性成分，也可以作为环境消毒剂，有效控制养殖环境被污染；与单一裂解性噬菌体相比，具有宽裂解谱的特点，扩宽了杀菌范围，提高杀菌活性，可有效防控家禽大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌引起的腹泻；同时，可提高蛋鸡产蛋率、提高肉鸡料肉比以及增强鸡体免疫力，降低因细菌性腹泻引起的死亡率。
2、本发明涉及的噬菌体组合物均从自然界中获得，来源广，数量庞大，易分离，属于天然生物。经雏鸡安全性试验证明安全、无残留、没有毒副作用，不会影响雏鸡体内正常菌群。因此，以裂解性大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体以及魏氏梭菌噬菌体为主要成分的噬菌体组合物具有特异性高、不良反应小、不易产生抗药性、无残留且成本低等优点，为防控禽细菌性腹泻提供了一种绿色新型生物制剂。
3、本发明设计的噬菌体组合物应用广泛，不仅可用于养殖过程中，可特异、高效、快速安全杀灭致病性大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌乃至耐药性菌株引起的腹泻，有效降低雏鸡的腹泻率以及发病鸡只的死亡率；还可以用于环境消毒剂，防控大肠杆菌、沙门氏菌及魏氏梭菌的传播、增殖；还可用于生物抑菌剂，用于禽类产品的消毒，抑制产品加工以及保鲜过程中致病菌株乃至耐药菌株的生长。
附图说明
图1为大肠杆菌噬菌体PD205的噬菌斑图片；
图2为沙门氏菌噬菌体PC192的噬菌斑图片；
图3为魏氏梭菌噬菌体PM11的噬菌斑图片；
图4为大肠杆菌噬菌体PD205的电镜图片；
图5为沙门氏菌噬菌体PC192的电镜图片；
图6为魏氏梭菌噬菌体PM11的电镜图片；
图7为大肠杆菌噬菌体PD205的热稳定性；
图8为沙门氏菌噬菌体PC192的热稳定性；
图9为魏氏梭菌噬菌体PM11的热稳定性；
图10为大肠杆菌噬菌体PD205的pH值稳定性；
图11为沙门氏菌噬菌体PC192的pH值稳定性；
图12为魏氏梭菌噬菌体PM11的pH值稳定性；
图13为大肠杆菌噬菌体PD205的一步生长曲线；
图14为沙门氏菌噬菌体PC192的一步生长曲线；
图15为魏氏梭菌噬菌体PM11的一步生长曲线；
图16为噬菌体组合物对禽腹泻治疗的效果图；
图17为噬菌体组合物预防禽腹泻的效果图；
图18为噬菌体组合物的环境消毒的效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例一噬菌体的分离和制备
1、样品的采集
本发明中的粪液污水、鸡肠道等样品采自山东省多个养鸡场。
2、宿主菌的复苏培养与增殖液的制备
宿主菌为本实验室分离鉴定保存的大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌，分离来自山东省某鸡场的病鸡的肠道或肝脏。
(1)用灭菌的接种环蘸取保存的大肠杆菌和沙门氏菌菌液，在SS琼脂培养基上划线接种，37℃的恒温箱中培养16～24h，得到单菌落。挑取单菌落，接种于5mL的NB肉汤试管中，37℃，170rpm/min 震荡培养12～16h，即可得到新鲜的大肠杆菌和沙门氏菌增殖液，4℃暂存，备用。
(2)用灭菌的接种环蘸取保存的魏氏梭菌宿主菌菌液，在1％葡萄糖-5％绵羊血培养基上划线接种，37℃的恒温箱中厌氧培养16～24h，得到单菌落。挑取单菌落，接种含5mL的TSB液体培养基的试管中，37℃，170rpm/min震荡厌氧培养12～16h，即可得到新鲜的魏氏梭菌增殖液，4℃暂存，备用。
3、噬菌体的分离
(1)大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体的分离
取适量粪水放入泡样瓶中，加入大肠杆菌和沙门氏菌增殖液各200μL混合一起，再加入适量的 NB肉汤，37℃的条件下，以170rpm的转速在摇床16～18h培养，增殖富集噬菌体，得到培养液；取 5ml上述培养液，在11000rpm离心10min，取上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，得到噬菌体原液。采用双层平板法分离噬菌体：取噬菌体原液100μL，按照10倍比例稀释，取适当梯度稀释液120μL 与120μL宿主菌增殖液混合均匀，37℃孵育5min后，加入约45℃上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃的恒温箱中倒置培养6～8h后，获得形成噬菌斑的双层平板。分别通过采用不同的宿主菌(大肠杆菌或沙门氏菌)，最终分别分离获得两种噬菌体，分别命名为大肠杆菌噬菌体PD205和沙门氏菌噬菌体PC192。
(2)魏氏梭菌噬菌体的分离
取适量鸡场的粪液污水或鸡肠道组织，加入500μL魏氏梭菌菌液，再加入TSB培养基至200mL， 37℃厌氧培养16h～18h，富集噬菌体。次日，取出5-8mL的液体，11000rpm离心10min，上清液经 0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体原液。利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液按照10 倍比稀释，取稀释液各取120μL与120μL致病菌增殖液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约45℃ TSA上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒TSA下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置进行厌氧培养3～6h后，获得形成噬菌斑的双层平板。将获得的魏氏梭菌噬菌体命名为PM11。
4、噬菌体的纯化和增殖
(1)大肠杆菌噬菌体PD205与沙门氏菌噬菌体PC192的纯化和增殖
采用双层平板法，在形成噬菌斑的双层平板中挑取单个、边缘光滑且透亮的噬菌斑，置于1mlNB 肉汤中，37℃、170rpm条件下振荡30min，得到噬菌体浸出液；11000rpm离心5min，取120μL离心后的噬菌体浸出液与120μL宿主菌增殖液充分混合，37℃孵育5min后，加入约45℃上层琼脂中，混匀，迅速倒入含有下层琼脂培养基平板上，待上层琼脂凝固后，倒置37℃恒温箱培养6～8h。重复上述步骤3-5次反复纯化噬菌体，直至得到大小、形态、分布均一的噬菌斑。从完成纯化的噬菌斑双层平板上，扣取单个噬菌斑接种于盛有1mlNB肉汤的中，37℃170rpm培养30min，11000rpm离心 5min，取100μL上清液与100μL对应的宿主菌增殖液加入5ml肉汤中，37℃、170rpm/min的条件下，震荡培养，直至混合液变清亮，然后再离心过滤，即可得到噬菌体增殖液。按照上述方法分别制备大肠杆菌噬菌体PD205和沙门氏菌噬菌体PC192的增殖液。
大肠杆菌噬菌体PD205在双层琼脂培养基平板上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约1mm(见图1)。
沙门氏菌噬菌体PC192在双层琼脂培养基平板上可以形成中等且透亮空斑，周围有晕环，边缘规则，直径约2mm(见图2)。
(2)魏氏梭菌噬菌体PM11纯化和增殖
采用双层平板法纯化噬菌体，从形成噬菌斑的上述双层培养基挑取单个噬菌斑，并将其置于1mL 的TSB肉汤中，在37℃，170rpm的条件下震荡1h，得到噬菌体浸出液。取噬菌体浸出液220μL与220μL相应的上述魏氏梭菌增殖液混合均匀，于37℃条件下孵育5min，取孵育后混合液加到约45℃ TSA上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒TSA下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，并将平板置于37℃倒置厌氧培养6～12h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。重复上述步骤3-5次反复纯化噬菌体，直至得到大小、形态、分布均一的噬菌斑。从完成纯化的噬菌斑双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1mL的TSB肉汤中，170rpm震荡1h得到噬菌体浸出液，11000rpm离心5min，取200μL上清液与200μL宿主菌增殖液于5mL液体TSB培养基中，37℃，170rpm厌氧振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。
魏氏梭菌噬菌体PM11在双层琼脂培养基平板上可形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约2mm(见图3)。
实施例二噬菌体的形态学特性
1、形态观察方法为：
取20μL噬菌体样本滴在带有碳涂布膜的铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸稍吸干后，再用 2％(W/V)磷钨酸(PTA)染色1-2min，滤纸稍吸干，待干燥后，采用透射电子显微镜进行观察拍照。
2、观察结果：
如图4所示，大肠杆菌噬菌体PD205的头部呈正二十面体，头部宽80-87nm，长113-120nm，尾长107-113nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PD205形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体科。
如图5所示，沙门氏菌噬菌体PC192的头部呈多面体结构，头部宽60-67nm，长60-67nm，尾长 167-200nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PC192形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体科。
如图6所示，魏氏梭菌噬菌体PM11的头部呈多面体结构，头部直径约54nm，具有6个短尾丝。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PM11的形态符合短尾噬菌体科的特征，属于短尾噬菌体科。
实施例三三株噬菌体的全基因组分析
分别提取前述三株噬菌体的基因组，进行全基因组测序，PD205基因组序列在NCBI的GenBank 号为ON922919，PC192的GenBank号为ON922920，PM11的GenBank号为OP022426，对其基因组序列进行分析得到：
PD205基因组全长168652bp，G+C含量为37.6％，碱基C、G、A、T含量依次为18.1％、19.5％、 31.9％、30.5％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有269个开放阅读框(ORFs)。在这 269个开放阅读框(ORFs)中，发现结构蛋白有84种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、 DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、 HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在 269个ORFs中，有259个起始密码子为ATG，5个起始密码子为GTG，2个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGEserver分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。
PC192基因组全长39095bp，G+C含量为48.29％，碱基C、G、A、T含量依次为25.68％、22.61％、 24.90％、26.81％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有47个开放阅读框(ORFs)。在这 47个开放阅读框(ORFs)中，发现结构蛋白有32种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、 DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、 HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在 47个ORFs中，有45个起始密码子为ATG，1个起始密码子为GTG，0个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGEserver分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。
PM11基因组全长17894bp，G+C含量为28.17％，碱基C、G、A、T含量依次为17.40％、10.76％、 31.46％、40.37％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有19个开放阅读框(ORFs)。在这19个开放阅读框(ORFs)中，发现结构蛋白有9种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、衣壳蛋白等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、DNA复制和修饰有关的蛋白质(含内含子的DNA聚合酶前体、HNH核酸内切酶、等)、其他功能性蛋白。同时在19个ORFs 中，有16个起始密码子为ATG，1个起始密码子为GTG，2个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE 分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGE server分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经 PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。
噬菌体PD205的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维(tail fibersprotein)蛋白基因序列见序列表序列1；高度保守的末端酶大亚基(terminase largesubunit)蛋白基因的序列见序列表中序列 2；DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列3；与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme) 基因序列见序列表中序列4，相关信息具体见下表1。
噬菌体PC192的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维蛋白(tail fibersprotein)基因序列见序列表序列5；高度保守的末端酶大亚基(terminase large subunit)蛋白基因的序列见序列表中序列 6；DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列7；与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme) 基因序列见序列表中序列8，相关信息具体见下表1。
噬菌体PM11的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维蛋白(tail fibersprotein)基因序列见序列表序列9；DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列10；与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme)基因序列见序列表中序列11，相关信息具体见下表1。
表1噬菌体基因序列信息表
实施例四噬菌体效价的测定
1、实验方法：
将增殖好的噬菌体原液做10倍比稀释，分别取上述适宜稀释度噬菌体240μL和宿主菌悬液240μL 混合加入到无菌EP管中，充分混匀。37℃孵育5min后，采用双层平板法进行铺板，带琼脂凝固后，倒置37℃恒温箱培养3～6h(魏氏梭菌噬菌体进行厌氧培养)，观察结果。每个稀释梯度做2个平行，计数时以噬菌斑为30～300之间的稀释度为准，取每个稀释度2个平行的平均值，计算噬菌体的效价。
噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。
2、实验结果及分析
PD205的噬菌体效价为3.80×1010PFU/mL，PC192的噬菌体效价为8.60×1010PFU/mL，PM11的噬菌体效价为1.20×1010PFU/mL。
实施例五噬菌体的热稳定性
1、实验方法：
取500μL不同类型噬菌体增殖液分装于无菌EP管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min、60min、120min。设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，按照10倍比例稀释，采用双层平板法测定效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，分别绘制大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192和魏氏梭菌噬菌体PM11的热稳定性曲线。
2、实验结果及分析
如图7所示，大肠杆菌噬菌体PD205在40～60℃的温度范围内的效价较稳定，在70℃作用40min，其效价降低4个数量级；在80℃作用20min，噬菌体被灭活。
如图8所示，沙门氏菌噬菌体PC192在40～60℃中放置120min，效价稳定，在70℃作用60min，其效价降低3个数量级；在80℃作用20min，噬菌体失活。
如图9所示，魏氏梭菌噬菌体PM11在40～70℃的温度范围内作用2h，效价较稳定，在80℃作用 20min，噬菌体失活。
该结果说明，大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192和魏氏梭菌噬菌体PM11具有较强的耐热性，在较高的温度环境中可保持一定活性，其中魏氏梭菌噬菌体PM11的耐热性更突出。
实施例六噬菌体的pH稳定性
1、实验方法
取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的NB肉汤(应用于噬菌体PD205和PC192)或TSB肉汤(应用于噬菌体PM11)4.5mL，各三支，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL的不同类型的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用 1h、2h、3h。作用结束之后，立即向各混合液中加入适量的1mol/L的HCl或者NaOH，使混合液的 pH值约为7。采用双层平板法测定不同pH作用下的噬菌体效价，每个pH值试管设定2个重复。最后，以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标，分别绘制噬菌体PD205、PC192和PM11的 pH值稳定性曲线。
2、实验结果及分析
如图10所示，大肠杆菌噬菌体PD205在pH5～11范围内作用3h后，效价仍接近于起始效价，pH 12或pH 13作用2h效价降低5个数量级或失活。
如图11所示，沙门氏菌噬菌体PC192在pH 4～11范围内作用3h后，活性稳定，在pH3和pH 13 作用3h后，效价明显降低或失活。
如图12所示，魏氏梭菌噬菌体PM11在pH4～11范围内作用3h后，效价比较稳定，在pH 3的条件下作用2h，效价开始下降，pH 13时效价降低5个数量级。上述结果说明：噬菌体PD205、PC192 和PM11酸碱耐受能力较强，能适应较广范围的pH环境。
实施例七噬菌体的一步生长曲线的测定
1、实验方法
将感染复数为10的不同类型的噬菌体增殖液和对应的新鲜宿主菌增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，12000rpm条件下离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mL NB 肉汤(应用于PD205和PC192)或TSB肉汤(应用于PM11)洗涤1次(12000rpm离心30s)，弃上清。用预热的NB肉汤(应用于PD205和PC192)或TSB肉汤(应用于PM11)混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μL， 10000rpm离心1min，采用双层平板法测效价，做2个平行，结果取平均值。
以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，分别得到PD205、 PC192和PMQ01噬菌体的潜伏期、爆发期，计算噬菌体的爆发量。
爆发量＝稳定期噬菌体浓度/初始菌浓度
2、测试结果及分析
如图13和14所示，大肠杆菌噬菌体PD205和沙门氏菌噬菌体PC192感染宿主菌后，在30min 内效价基本保持不变，效价分别维持在106PFU/mL和107PFU/mL，表明PD205和PC192潜伏期为 30min；而在40～90min内，均进入爆发期，噬菌体数量急剧增加，在90min后达到稳定，分别达到 109PFU/mL和1010PFU/mL，通过计算可得出噬菌体PD205和PC192的爆发量分别为90和102。
如图15所示，魏氏梭菌噬菌体PM11在感染宿主菌的40min内效价基本保持在106PFU/mL，表明PM11潜伏期为40min，在40～50min内，均进入爆发期，噬菌体效价急剧增加，并在60min后达到稳定，达到109PFU/mL，爆发期约为20min，通过计算可得出噬菌体PM11爆发量分别为86。综上， 3种噬菌体的爆发量均较高，尤其是噬菌体PC192，这说明相同周期内这些噬菌体的产量高，适用于工业化大批量生产。
实施例八噬菌体组合物的裂解率检测实验
1、三株不同噬菌体的裂解率的检测
①实验方法：准备新鲜的噬菌体增殖液PD205、PC192和PM11，选取实验室保存的从山东、江苏、广西等地区中患病鸡只的肝脏和肠道组织中分离的共90株致病菌株(30株大肠杆菌、30株沙门氏菌和30株魏氏梭菌)，采用双层平板法检测噬菌体组合物的裂解谱。检测所用宿主菌信息和裂解谱详细结果见表2。
结果显示：大肠杆菌噬菌体PD205共裂解30株大肠杆菌中的24株，对大肠杆菌的裂解率达到80％，但是对90株致病菌的总裂解率为26.67％；沙门氏菌噬菌体PC192共裂解30株沙门氏菌中的28株，对沙门氏菌的裂解率为93.33％，但是对90株致病菌的总裂解率为31.11％；魏氏梭菌噬菌体PM11 可裂解30株魏氏梭菌中的26株，对魏氏梭菌的裂解率达到86.67％，但是对90株噬菌体的总裂解率为28.89％；而噬菌体组合物对90株致病菌的总裂解率为86.67％；可见，噬菌体组合物对大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌混合感染具有很好的裂解效果和广谱性，其裂解能力被最大化，有效弥补单一噬菌体裂解谱的局限性。
2、与现有噬菌体的裂解性能的比较：
将申请人已申请的申请号为CN202010691495.2的专利中公开的噬菌体PMQ06对上述30株魏氏梭菌噬菌体进行裂解，比较该噬菌体PMQ06与本申请的魏氏梭菌噬菌体PM11的裂解性进行比较。方法见前述内容。
实验结果：魏氏梭菌噬菌体PMQ06仅可裂解上述30株魏氏梭菌中的17株，裂解率为56.67％；而魏氏梭菌噬菌体PM11可裂解30株魏氏梭菌中的26株，对魏氏梭菌的裂解率达到86.67％；可见，魏氏梭菌噬菌体PM11对上述鸡源魏氏梭菌的裂解率明显高于PMQ06。
表2噬菌体及其组合物裂解结果
注：+：裂解；-：不裂解。
实施例九噬菌体的安全性试验
1、实验方法：
将60只1日龄SPF鸡分为试验组1(15只)、试验组2(15只)和对照组1(15只)、对照组2 (15只)。对试验组1中的每只雏鸡灌服1×1010PFU/mL的噬菌体组合物1ml，对试验组2中的每只雏鸡肌肉注射1×1010PFU/mL噬菌体组合物1ml；对对照组1和2中的每只雏鸡灌服1ml的无菌营养肉汤。在同等环境下饲养2周观察每组鸡的临床体征，并解剖鸡以便观察内脏和肠道病变。
2、实验结果及分析
在噬菌体组合物处理2周后，与对照组相比，2个试验组的鸡只临床症状及剖检无显著性差异，且鸡的生长良好，未出现死亡，未出现腹泻，精神萎顿，嗜睡，羽毛蓬乱，食欲减退等异常现象；剖检结果显示，试验组鸡内脏和肠道均无病变；上述结果说明噬菌体组合物是安全且无毒副作用。
实施例十噬菌体组合物对大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌引起的鸡腹泻的治疗试验
1、实验方法：
选取7日龄SPF鸡只120只分成6组(20只/组)，分成空白组、攻毒组、治疗组，治疗组又分为3个单一噬菌体治疗组和1个噬菌体组合物治疗组；将三种菌液(大肠杆菌菌液、沙门氏菌菌液和魏氏梭菌菌液)按照1：1：1混合调成5×108CFU/mL的混合菌液，采用口服方式(0.2ml/只)对攻毒组、治疗组的鸡只分别进行攻菌，攻菌后待鸡群50％出现腹泻或糊肛等症状后，对治疗组的鸡只开始进行1×108PFU/mL噬菌体口服治疗(0.2ml/只)，连续治疗5天后饲养观察14天，观察鸡只死亡、腹泻以及增重情况，活鸡剖检观察包心包肝以及肠道病变情况。
2、实验结果：
结果显示，空白组鸡只无死亡，无腹泻、包心包肝及肠道病变症状；如图16所示，PD205治疗组、PC192治疗组、PM11治疗组都可明显分别降低鸡只的腹泻和死亡率；而上述三株噬菌体组合的噬菌体组合物的治疗效果得到大幅度地提高，其治疗组的鸡腹泻率下降85％，鸡只死亡率下降了76％，且该噬菌体组合物同时也减轻内脏和肠道组织病变程度。
显然，PD205、PC192和PM11的噬菌体组合物在降低腹泻率和死亡率的效果明显优于单一噬菌体的效果。
实施例十一噬菌体组合物预防家禽养殖中细菌性腹泻的试验
1、实验方法：
选取山东某规模鸭场5个10000羽、25日龄肉鸭鸭舍，将其分别设置为：4个试验组和1个对照组，4个试验组分为3个不同的单一噬菌体组(PD205预防组、PC192预防组、PM11预防组)和1 个噬菌体组合物组。
饮水中分别添加噬菌体PD205、PC192、PM11以及噬菌体组合物组(PD205、PC192、PM11的比例为1:1:1)，含量为1×107pfu/mL。25日龄开始使用，添加噬菌体的水于3h内饮用完，连用5天，观察至出栏，对照组饲喂正常的饮用水；对照组和试验组按照场内程序正常饲养观察鸡群腹泻情况，统计鸭群成活率、日增重、料肉比。
2、实验结果及分析
如图17所示，使用添加有一种噬菌体的饮水进行预防后，鸭场的腹泻率得到明显降低，但是降低程度不如使用噬菌体组合物的实验组。使用添加有噬菌体组合物的饮水预防5次后，噬菌体组合物较空白对照组的腹泻率下降16.00％，成活率提高5.00％，且噬菌体组合物的腹泻率与空白对照组差异极显著(P<0.01)，说明使用噬菌体组合物对预防禽细菌性腹泻有明显效果；同时根据鸡群日增重、日饲料消耗量和料肉比表明使用噬菌体组合物还可提高鸡群的生产性能，为今后噬菌体作为绿色添加剂的推广奠定了基础。
实施例十二噬菌体对鸭/鸡养殖场环境消毒试验
1、实验方法
山东某白羽肉鸡场，随机选取1日龄雏鸡舍18个，试验组12个，对照组3个，空白对照组3 个。试验组包括3个单一噬菌体组(3个/组)和噬菌体组合物组，试验组用养殖场的饮用水对噬菌体悬浮液进行稀释(1×106PFU/mL)，2次/天，喷洒量为10mL/m2，对照组每天2次喷洒相同量的84 消毒剂，空白对照组按照常规操作进行饲养，检测消毒前后环境中大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌含量变化，以鸡舍中央点及墙角4点共5点作为测试点，采样点距地面0.5m，墙角四点离墙1m，每点放置9cm直径大小的SS平板(测大肠杆菌和沙门氏菌)和1％葡萄糖-5％绵羊血培养基(测魏氏梭菌)。采样后，将SS培养皿放37℃恒温培养箱，将1％葡萄糖-5％绵羊血培养皿37℃厌氧培养，培养18-24h 后记录各培养皿中细菌菌落数。
按奥氏公式记数菌落总数C＝50000N/AT，式中C:每立方米三种菌的菌落总数(CFU/m3)；N:每皿菌落数；A:培养皿面积(cm2)；T:采样时间(min)。
2、实验结果及分析
如图18所示，噬菌体组合物试验组环境中大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌总含量低于对照组(84 消毒液消毒)和空白对照组，同时也低于单一噬菌体组环境中大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌的总含量，这表明，噬菌体组合物(PD205+PC192+PM11)能够明显降低环境中大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌的的总含量，减少三种菌感染率；此外，相对于对照组使用的84消毒液，噬菌体组合物具有使用安全、高效消毒、无毒副、环境友好等优点，另噬菌体组合物消毒无刺激气味，不会对动物呼吸道黏膜造成刺激伤害，长期使用不会造成病原菌耐受，且噬菌体作为消毒剂可长期存在于消毒场所，持续抑菌，噬菌体消毒后(比如料槽等)残留的消毒液可被动物舔食，比84消毒剂更安全；可见，噬菌体消毒剂应用的消毒对象和消毒环境范围更广，具有更好的应用前景；因此，该噬菌体及组合物 (PD205+PC192+PM11)可作于做为一种新型生物环境消毒剂进行应用。
实施例十三噬菌体对非宿主性细菌的裂解试验
1、实验方法
选取5株鸭疫里默式杆菌、5株葡萄球菌、5株绿脓杆菌、5株变形杆菌、5株巴氏杆菌共25株非宿主性细菌，按照实施例8中裂解谱的测定方法对三种噬菌体进行裂解实验。
2、实验结果及分析
结果显示，大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192和魏氏梭菌噬菌体PM11对上述选取的共25株非宿主性细菌均不裂解，详细信息见表3，该结果表明大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192和魏氏梭菌噬菌体PM11均无法识别上述5株鸭疫里默式杆菌、5株葡萄球菌、5株绿脓杆菌、5株变形杆菌、5株巴氏杆菌这些非宿主性细菌，这说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用。
表3噬菌体及其组合物对非宿主性细菌的裂解结果
以上所述实施例仅表达了本发明几种较佳的实施例而已，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进和等同替换等，这些均应包含在本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一株魏氏梭菌噬菌体PM11，其特征在于，保藏号为CGMCC No.22372。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体PM11。
3.根据权利要求1所述的噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体PM11、保藏号为CGMCC No.22361的大肠杆菌噬菌体PD205以及保藏号为CGMCCNo.22367的沙门氏菌噬菌体PC192。
4.根据权利要求3所述的噬菌体组合物，其特征在于，大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体与魏氏梭菌噬菌体的活体数量之比为1:1:1；优选地，每种噬菌体的含量不低于1×108PFU/mL。
5.如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体PM11或如权利要求2-4中任一项所述的噬菌体组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饲料添加剂、检测试剂盒中的应用。
6.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，活性成分包括如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体PM11或如权利要求2-4中任一项所述的噬菌体组合物。
7.根据权利要求6所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体组合物中还包含药学上可接受的载体；优选地，其剂型为粉剂、水剂、冻干剂、胶囊剂、气雾剂、丸剂或片剂；优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他用于防控禽细菌性腹泻杀菌剂的活性成分。
8.一种环境消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体PM11或如权利要求2-4中任一项所述的噬菌体组合物；优选地，每种噬菌体的浓度为1×108PFU/mL以上；优选地，其中还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的其他活性成分。
9.一种饲料添加剂及饮用水添加剂，用于预防家禽细菌性腹泻，其特征在于，活性成分包括如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体PM11或如权利要求2-4中任一项所述的噬菌体组合物；优选地，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×108PFU/g；饮用水中每种噬菌体的浓度至少为1×108PFU/g。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的魏氏梭菌噬菌体PM11、大肠杆菌噬菌体PD205、沙门氏菌噬菌体PC192中的一种或多种。
CN202210951608.7A 2021-08-11 2022-08-09 一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用 Pending CN116121203A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110919107 2021-08-11
CN2021109191076 2021-08-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116121203A true CN116121203A (zh) 2023-05-16

Family

ID=86297878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210951608.7A Pending CN116121203A (zh) 2021-08-11 2022-08-09 一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116121203A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210046131A1 (en) Wide-spectrum salmonella phage and application thereof
CN112680423B (zh) 一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
CN110129283B (zh) 一种短尾大肠杆菌噬菌体及其应用
CN112029732A (zh) 一种耐高温宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及其组合物
CN113583972B (zh) 一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用
CN111254121B (zh) 一种沙门氏菌噬菌体及在防治沙门氏菌感染的疾病的药物中的应用
CN112280749B (zh) 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用
CN111909904B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN113583971B (zh) 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
CN111690620B (zh) 一株魏氏梭菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111647567B (zh) 一种耐酸的沙门氏菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
CN113755450A (zh) 一株大肠杆菌噬菌体gn4-1及其应用
CN115786279A (zh) 一种耐高温鸽源鼠伤寒沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN113201505B (zh) 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN111705041B (zh) 一株哈维氏弧菌噬菌体vB_KaS_PK22、其噬菌体组合物及其应用
CN116286671A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体sp8、噬菌体组合物及其应用
JP2017518736A (ja) 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物
CN111363723B (zh) 新型霍乱弧菌噬菌体及其应用
CN116121203A (zh) 一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用
CN114703151B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用
CN114480307B (zh) 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用
CN115820568A (zh) 一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体pt15、其噬菌体组合物及其应用
CN113430176B (zh) 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用
CN113755451B (zh) 一株大肠杆菌噬菌体gn6及其应用
CN111349618B (zh) 一种大肠杆菌噬菌体组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination