CN115820568A - 一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体pt15、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体PT15的保藏号为CGMCCNo.22377，于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；本申请还提供了包含上述噬菌体的噬菌体组合物，上述噬菌体及噬菌体组合物可作为活性成分用于制备治疗药物、饲料添加剂，应用于鸭细菌性浆膜炎的预防和治疗；该噬菌体组合物具有安全、高效、无毒副的优点，可作为一种新型的环境消毒剂的活性成分，有效防控养殖环境及饲养设施被污染，具有很好的应用前景。

Description

一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15、其噬菌体组合物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15、其噬菌体组合物及其应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎、鸭疫巴氏杆菌病等，是感染家鸭、野鸭、雏鹅和火鸭及多种其他鸟类的一种急性、败血性传染病，也是危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。病菌主要感染1～7周龄雏鸭，该病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎为特征。鸭疫里默氏杆菌感染雏鸭后发病率和死亡率较高，易产生耐药性，目前国内鉴定的鸭疫里默氏杆菌血清型至少有21个。近年来鸭疫里默氏杆菌常常与其他病原菌(如大肠杆菌)造成鸭群混合感染。

鸭大肠杆菌病是由某些不同血清型的致病性大肠杆菌引起的鸭全身性或者局部的感染性疾病。鸭大肠杆菌病一年四季均可发病，是鸭子最常见的细菌病，可感染所有年龄段的鸭子，幼鸭和胚胎感染较为严重。常引起鸭败血症、鸭心包炎、鸭肝周炎、鸭腹膜炎等多种炎症。大肠杆菌属于环境致病菌，疾病的感染往往是由于环境中的大肠杆菌超标，鸭抵抗力下降，防御能力不足或完全丧失时，容易造成的发病，呈现典型的继发性局部或者全身感染。患病鸭因死亡率高、生长迟缓、品质下降、饲料报酬率低和治疗费用增加等，给养鸭业造成了巨大经济损失。

鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌引起的细菌性浆膜炎是鸭常见的细菌性疾病，药物防治和疫苗免疫是目前控制上述疾病的重要措施，但是这两种措施都存在问题。一方面，由于致病菌往往具有较多的血清型且同一养鸭场可能存在不同血清型的流行，各血清型间无明显的交叉保护现象，这导致疫苗免疫面临一些实际困难，难以达到满意的预防效果。另一方面，抗菌药物治疗是控制细菌病的常用方法，同时也是控制细菌病流行性暴发的重要途径，但是，由于细菌病发病时间不固定、频率高，养殖场往往存在擅自使用高浓度抗菌药物进行预防和治疗细菌性疾病的问题，从而导致细菌产生严重的耐药性和抗菌药物残留。这会对环境造成严重污染，并会严重危害公共食品安全，给养殖业和人类健康带来危害。

目前还没有安全且有效的药物对鸭细菌性浆膜炎进行防控，虽然噬菌体开始被用于各个技术领域，但是目前也未发现有效的噬菌体用于防治鸭细菌性浆膜炎，因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株新的具有强裂解性的鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15及一种基于鸡尾酒防控方法建立的包括鸭疫里默氏杆菌噬菌体 PT15其他噬菌体组合形成的具有宽裂解谱、强裂解作用的噬菌体组合物，所述鸭疫里默氏杆菌噬菌体及其组合物可用于制备噬菌体制剂有效防控鸭疫里默氏杆菌引起的或和其他致病菌共同感染引起的鸭浆膜炎，还可用于制备禽类饲料添加剂、环境消毒剂和检测试剂盒等。

为解决上述问题，本申请提供以下的技术方案：

第一方面，本发明提供一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15，其保藏号为CGMCCNo.22377，该噬菌体于2021年4月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。在电子显微镜下观察了噬菌体PT15的形态，噬菌体具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部宽61-65nm，长63-69nm，尾长 171-208nm，属长尾噬菌体。

所述鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％的杀菌活性相同的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。 PT15的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。

第二方面，本发明提供一种噬菌体组合物，其特征在于，包括上述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15。

本发明还提供一种自行分离出的大肠杆菌噬菌体PD211，该噬菌体于2021 年4月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，所述大肠杆菌噬菌体PD211的保藏号为CGMCCNo.22362。在电子显微镜下噬菌体PD211的形态为：其头部呈多面体的头部结构，头部宽87-93nm，长100-107nm，尾长 120-127nm，属肌尾噬菌体。该噬菌体对病原菌大肠杆菌具有优异的裂解性能。

经噬菌体全基因组分析得到：噬菌体PD211、PT15的全基因组大小分别为149506bp和44128bp，其中噬菌体PD211基因组G+C含量为37.70％，含有265个开放阅读框(ORFs)，噬菌体PT15基因组G+C含量为34.81％，含有81个开放阅读框(ORFs)。噬菌体PD211和PT15不含耐药基因及毒力基因，不含溶原性相关基因。

优选地，前述噬菌体组合物包括上述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和大肠杆菌噬菌体PD211。

优选地，上述噬菌体组合物中，大肠杆菌噬菌体PD211与鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的活体数量之比为1:1；优选地，每种噬菌体的浓度不低于1× 10⁸PFU/mL。

本申请中，大肠杆菌噬菌体PD211包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％的杀菌活性相同的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。 PD211的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。

第三方面，本发明还提供上述鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15、大肠杆菌噬菌体PD211、或包含该噬菌体PT15的噬菌体组合物在制备预防和治疗鸭细菌性疾病药物、环境消毒剂、饲料添加剂、饮用水添加剂、检测试剂盒中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

进一步优选地，本发明也提供包括上述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和大肠杆菌噬菌体PD211组成的噬菌体组合物在制备预防和治疗鸭细菌性疾病药物、环境消毒剂、饲料添加剂、饮用水添加剂、检测试剂盒中的应用。

所述鸭细菌性疾病包括由鸭疫里默氏杆菌引起的各种疾病或由鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌共同引起的各种疾病，如鸭传染性浆膜炎、鸭大肠杆菌病等。

所述噬菌体及其组合物的应用方法为：将噬菌体或其组合物作为治疗药物添加到患有细菌性浆膜炎的鸭饮用水或饲料中，或对鸭灌服、皮下注射、肌肉注射，其中优选方式为拌料方式，通过上述方式可预防及治疗鸭细菌性浆膜炎，并降低鸭浆膜炎、肝周炎、心包炎，达到提高蛋鸭产蛋率、蛋壳品质、鸭的存活率、料肉比等的效果。

第四方面，本发明还提供一种噬菌体制剂，其有效成分包括前述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体PD211或前述包含该鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的噬菌体组合物或前述包含鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和大肠杆菌噬菌体PD211的噬菌体组合物。

优选地，上述噬菌体制剂的应用方法为：将所述噬菌体制剂通过皮下注射、肌肉注射、口服的方式进行使用，可治疗鸭细菌性浆膜炎。经实验验证，在感染大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌引起浆膜炎的7日龄雏鸭中，使用5×

10⁹PFU/mL的噬菌体组合物，连用3天。在14天内可以有效降低患病雏鸭的死亡率以及浆膜炎的发病率。替代的方案中，上述噬菌体制剂可通过肌肉注射或口服方式使用。

第五方面，本发明还提供一种饲料添加剂或饮用水添加剂，其包括前述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体PD211或前述包含该鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的噬菌体组合物或前述包含鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和大肠杆菌噬菌体PD211的噬菌体组合物；优选地，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×10⁸PFU/g。其应用方法为：通过与鸭饲料或鸭饮用水进行混和后饲喂使用，从而达到预防鸭细菌性浆膜炎的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×10⁸PFU/g，饮用水中每种噬菌体的浓度至少为1×10⁸PFU/g。

第六方面，本发明还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括前述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体PD211或前述包含该鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的噬菌体组合物或包含鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和大肠杆菌噬菌体PD211的噬菌体组合物。优选地，每种噬菌体的浓度为1×10⁸PFU/mL以上。优选地，还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的其他活性成分，以提高其灭菌或抑菌效果；还可包括其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。

上述消毒剂的应用方法为：将消毒剂在鸭屠宰场、鸭产品加工车间及器具、鸭养殖环境中使用，防止环境中鸭疫里默氏杆菌或鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌的污染。所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，这种消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且其对人体及鸭不会造成损害。

第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括前述鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和所述大肠杆菌噬菌体PD211中的任意一种或两种。本申请提供的噬菌体的裂解特异性强，可利用上述鸭疫里默氏杆菌噬菌体制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的鸭疫里默氏杆菌、或用于防控由其宿主鸭疫里默氏杆菌侵染导致的疾病。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供两株申请人自行分离的具有高效裂解性能的噬菌体，分别为鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15和大肠杆菌噬菌体PD211，利用这两组噬菌体单独用于制备预防和治疗鸭细菌性疾病的药物，也可基于鸡尾酒法以上述两种或更多种噬菌体制备高效防控鸭细菌性浆膜炎的噬菌体组合物，并用于作为治疗药物、饲料添加剂防控鸭细菌性浆膜炎；也可以作为环境消毒剂的活性成分，有效防控养殖环境及饲养设施被污染，也可用于制备检测试剂盒，用于快速检测待测样品中的病原菌。

2、本发明涉及的噬菌体及噬菌体组合物制备周期短，成本低廉，易于工业化生产。噬菌体主要是从自然界中筛选得到的，来源广泛，数量庞大，属于天然生物。

3、噬菌体治疗不受细菌耐药性的限制，也不易产生耐药性，因此可广泛应用于养殖过程中，可高效、快速、特异性杀灭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌乃至耐药性菌株引起的鸭细菌性浆膜炎，有效降低其发病率和死亡率，为防控鸭细菌性浆膜炎提供了一种绿色天然的生物制剂。

4、与单一裂解性噬菌体相比，本发明提供的噬菌体组合物的杀菌范围更广，杀菌活性更高，可有效的防控鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌引起的浆膜炎，提高产蛋率和料肉比；且安全性能高，只感染特定种属的病原菌，不会破坏鸭体内的正常菌群，经雏鸭安全性试验证明安全、无残留、没有毒副作用，不会影响雏鸭正常生长发育。同时，噬菌体进入机体后不会造成机体二次污染。

附图说明

图1为大肠杆菌噬菌体PD211的噬菌斑图片；

图2为鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的噬菌斑图片；

图3为大肠杆菌噬菌体PD211的电镜图片；

图4为鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的电镜图片；

图5为大肠杆菌噬菌体PD211的热稳定性；

图6为鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的热稳定性；

图7为大肠杆菌噬菌体PD211的pH值稳定性；

图8为鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的pH值稳定性；

图9为大肠杆菌噬菌体PD211的一步生长曲线；

图10为鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的一步生长曲线；

图11为噬菌体组合物对鸭细菌性浆膜炎治疗的效果图；

图12为噬菌体组合物预防鸭死亡率的效果图；

图13为噬菌体对鸭养殖场环境消毒的实验。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例一 噬菌体的分离培养

1、样品的采集

本发明中的粪便、污水等样品采自广东省多个养鸭场。

2、宿主菌的复苏培养与增殖液的制备

宿主菌为本实验室分离鉴定保存的大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌，分离来自广东省某鸭场病鸭的鸭脑或肝脏。

(1)用灭菌的接种环蘸取保存的大肠杆菌宿主菌菌液，在SS琼脂培养基上划线接种，37℃的恒温箱中培养16～24h，得到单菌落。挑取单菌落，接种于5mL的NB肉汤试管中，37℃，170rpm/min震荡培养12～16h，即可得到新鲜的大肠杆菌增殖液，备用。

(2)用灭菌的接种环蘸取保存的鸭疫里默氏杆菌宿主菌菌液，在10ml/L 新生牛血清的胰酶大豆琼脂(TSA)划线接种，37℃的恒温箱中浊缸培养16～ 24h，得到单菌落。挑取单菌落，接种含5mL的TSB液体培养基的试管中，37℃，170rpm/min震荡培养12～16h，即可得到新鲜的鸭疫里默氏杆菌增殖液，备用。

3、噬菌体的分离

(1)大肠杆菌噬菌体的分离

取适量粪水放入泡样瓶中，加入宿主菌增殖液各取200μL，再加入适量的 NB肉汤，37℃、170rpm培养16～18h，增殖富集噬菌体，得到培养液；取5ml 上述培养液，在11000rpm离心10min，取上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，得到噬菌体原液。采用双层平板法分离噬菌体：取噬菌体原液100μL，按照 10倍比例稀释，取适当梯度稀释液120μL与120μL宿主菌增殖液混合均匀， 37℃孵育5min后，加入约45℃上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃的恒温箱中倒置培养6～8h后，获得形成噬菌斑的双层平板，命名为大肠杆菌噬菌体PD211。

(2)鸭疫里默氏杆菌噬菌体的分离

取适量鸭场的新鲜粪便，加入等体积的无菌PBS，充分混匀后8000rpm离心10min，上清液通过450nm滤膜进行过滤。滤液中加入500μL鸭疫里默氏杆菌，再加入等体积2×TSB，37℃温箱培养16h～18h，富集噬菌体。次日，取出5-8mL的液体8000rpm离心10min，上清液用450nm滤膜过滤。滤液按照上述方法重复增殖1次，2次增殖后的滤液即为原液。

利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液按照10倍比稀释，取120μL 噬菌体稀释液与120μL致病菌增殖液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约 45℃TSA上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒TSA下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置进行培养10～ 16h后，获得形成噬菌斑的双层平板。将获得的鸭疫里默氏杆菌噬菌体命名为 PT15。

4、噬菌体的纯化和增殖

(1)大肠杆菌噬菌体PD211的纯化和增殖

采用双层平板法，在形成噬菌斑的双层平板中挑取单个、边缘光滑且透亮的噬菌斑，置于1mlNB肉汤中，37℃、170rpm振荡30min，得到噬菌体浸出液；11000rpm离心5min，取120μL离心后的噬菌体浸出液与120μL宿主菌增殖液充分混合，37℃孵育5min后，加入约45℃上层琼脂中，混匀，迅速倒入含有下层琼脂培养基平板上，待上层琼脂凝固后，倒置37℃恒温箱培养6～ 8h。重复上述步骤3-5次反复纯化噬菌体，直至得到大小、形态、分布均一的噬菌斑。从完成纯化的噬菌斑双层平板上，扣取单个噬菌斑接种于盛有1mlNB 肉汤的中，37℃170rpm培养30min，11000rpm离心5min，取100μL上清液与100μL对应的宿主菌增殖液加入5ml肉汤中，37℃、170rpm/min的条件下，震荡培养，直至混合液变清亮，然后再离心过滤，即可得到噬菌体增殖液。

大肠杆菌噬菌体PD211在双层琼脂培养基平板上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约2mm(见图1)。

(2)鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15纯化和增殖

采用双层平板法纯化噬菌体，从形成噬菌斑的上述双层培养基挑取单个噬菌斑，并将其置于1mL的SM缓冲液中，加入50μL氯仿，在37℃170rpm 的条件下震荡1h，4℃静置数小时，然后10000rpm离心5min，吸取上清装于新的小管中。取噬菌体浸出液220μL与220μL相应的上述鸭疫里默氏杆菌增殖液混合均匀，于37℃条件下孵育10min，取孵育后混合液加到约45℃TSA 上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒TSA下层琼脂(琼脂浓度为1.5％) 平皿上，并将平板置于37℃培养10～16h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。再次挑单噬菌斑重复上述步骤3～5次，直至得到大小、形态、分布均一的噬菌斑，即认为得到纯化的噬菌体原种。从完成纯化的噬菌斑双层培养基上抠取单个噬菌斑置于1mL的TSB肉汤中，170rpm震荡1h得到噬菌体浸出液，11000rpm离心5min，取200μL上清液与200μL宿主菌增殖液于5mL 液体TSB培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0.45μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。

鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15在双层琼脂培养基平板上可形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约0.5mm(见图2)。

实施例二 噬菌体的形态学特性及基因组分析

1、噬菌体的形态特性

(1)形态观察方法

取20μL噬菌体样本滴在带有碳涂布膜的铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸稍吸干后，再用2％(W/V)磷钨酸(PTA)染色1-2min，滤纸稍吸干，待干燥后，采用透射电子显微镜进行观察拍照。

(2)观察结果及分析

A、大肠杆菌噬菌体PD211

如图3所示，噬菌体PD211的头部呈多面体的结构，头部宽87-93nm，长 100-107nm，尾长120-127nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PD211形态符合肌尾噬菌体科的特征，其属于肌尾噬菌体科。

B、鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15

如图4所示，噬菌体PT15呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部宽61-65nm，长63-69nm，尾长171-208nm。根据病毒分类国际委员会(ICTV) 的定义，噬菌体PT15的形态符合长尾噬菌体科的特征，其属于长尾噬菌体科。

2、噬菌体全基因组分析

分别提取两株噬菌体的基因组，进行全基因组测序，PD211基因组序列在NCBI的GenBank号为OM401812，PT15的GenBank号为ON933637，对其基因组序列进行分析得到：

PD211基因组全长149506bp，G+C含量为37.6％，碱基C、G、A、T含量依次为18.4％、19.2％、31.2％、31.2％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有265个开放阅读框(ORFs)。在这265个开放阅读框(ORFs) 中，发现结构蛋白有35种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、 DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH 盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在265个ORFs 中，有219个起始密码子为ATG，16个起始密码子为GTG，15个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGEserver分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。

噬菌体PD211的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维蛋白 (tailfibersprotein)基因序列见序列表序列1；高度保守的末端酶大亚基 (terminase largesubunit)蛋白基因的序列见序列表中序列2；转移酶 (Nicotinamide phosphoribosyltransferase)基因的序列见序列表中序列3；与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme)基因序列见序列表中序列4，相关信息具体见下表1。

PT15基因组全长44128bp，G+C含量为34.81％，碱基C、G、A、T含量依次为18.65％、16.16％、28.24％、36.96％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有81个开放阅读框(ORFs)。在这81个开放阅读框(ORFs) 中，发现结构蛋白有13种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、 DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH 盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在81个ORFs 中，有76个起始密码子为ATG，1个起始密码子为GTG，1个起始密码子为 TTG。经软件tRNAscan-SE分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGEserver分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。

噬菌体PT15的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的结构蛋白 (Helix-turn-helixdomainprotein)蛋白基因序列见序列表序列5；高度保守的末端酶大亚基(terminaselargesubunit)蛋白基因的序列见序列表中序列6；DNA 结合酶(DNA-bindingprotein)基因的序列见序列表中序列7；相关信息具体见下表1。

表1噬菌体基因序列信息表

实施例三 噬菌体效价的测定

1、测定方法：

将增殖好的噬菌体原液做10倍比稀释，分别取上述适宜稀释度噬菌体 240μL和宿主菌悬液240μL混合加入到无菌EP管中，充分混匀。37℃孵育 5min后，采用双层平板法进行铺板，带琼脂凝固后，倒置37℃恒温箱培养3～6h (鸭疫里默氏杆菌噬菌体进行烛缸培养)，观察结果。每个稀释梯度做2个平行，计数时以噬菌斑为30～300之间的稀释度为准，取每个稀释度2个平行的平均值，计算噬菌体的效价。

噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。

2、测定结果及分析

结果显示：大肠杆菌噬菌体PD211的效价为3.85×10¹⁰PFU/mL，鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的效价为9.80×10⁹PFU/mL。

实施例四 噬菌体的热稳定性

1、实验方法：

取500μL不同类型噬菌体增殖液分装于无菌EP管中，分别于40℃、50℃、 60℃、70℃、80℃水浴中作用20min，40min，60min。每个温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，按照10倍比例稀释，采用双层平板法测定效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制大肠杆菌噬菌体PD211和鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15的热稳定性曲线。

2、实验结果及分析

结果如图5所示，大肠杆菌噬菌体PD211在40～60℃的温度范围内的效价较稳定，在70℃作用60min，其效价降低6个数量级；在80℃作用20min，噬菌体被灭活。

如图6所示，鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15在40～60℃的温度范围内作用1h，效价较稳定，在70℃作用40min，噬菌体还保持较高活性。该结果说明，大肠杆菌噬菌体PD211和鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15具有较强的耐热性，在较高的温度环境中可保持一定活性。

实施例五 噬菌体的pH稳定性

1、实验方法：

取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13)的NB肉汤(应用于PD211)或TSB肉汤(应用于PT15)4.5mL，各三支，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL的不同类型的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，立即向各混合液中加入适量的1mol/L的HCl或者NaOH，使混合液的pH值约为7。采用双层平板法测定不同pH作用下的噬菌体效价，每个pH值试管设定2个重复。最后，以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体PD211和PT15的pH值稳定性曲线。

2、实验结果及分析

如图7所示，大肠杆菌噬菌体PD211在pH5～11范围内作用3h后，效价仍接近于起始效价，pH12或pH13作用2h效价降低5个数量级或失活。

如图8所示，鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15在pH5～11范围内作用3h后，效价比较稳定，在pH4或pH12时的条件下作用1h，效价开始下降，pH3时噬菌体失活。该结果说明：噬菌体PD211、PT15酸碱耐受能力较强，对pH 具有较广的适应范围。

实施例六 噬菌体一步生长曲线的测定

1、实验方法：

将感染复数为10的不同类型的噬菌体增殖液和对应的新鲜宿主菌增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，12000rpm条件下离心 30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mLNB肉汤(应用于PD211)或TSB 肉汤(应用于PT15)洗涤1次(12000rpm离心30s)，弃上清。用预热的NB 肉汤(应用于PD211)或TSB肉汤(应用于PT15)混悬沉淀(总体积为5mL) 并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min 取出150μL，10000rpm离心1min，采用双层平板法测效价，做2个平行，结果取平均值。

以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，分别得到PD211、PT15噬菌体的潜伏期、爆发期，计算噬菌体的爆发量。

爆发量＝稳定期噬菌体浓度/初始菌浓度

2、实验结果及分析

如图9所示，大肠杆菌噬菌体PD211感染宿主菌后，在30min内效价基本保持不变，效价分别维持在10⁶PFU/mL，表明PD211潜伏期为20min；而在 30～70min内，均进入爆发期，噬菌体数量急剧增加，在70min后达到稳定，分别达到10⁹PFU/mL，通过计算可得出噬菌体PD211的爆发量为97。

如图10所示，鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15在感染宿主菌后20min内效价基本保持在10⁶PFU/mL，表明PT15潜伏期为20min，在20～70min内，均进入爆发期，噬菌体效价急剧增加，并在70min后达到稳定，达到10⁹PFU/mL，爆发期约为50min，通过计算可得出噬菌体PT15爆发量分别为85。

实施例七 噬菌体组合物的裂解率检测实验

1、实验方法：

准备新鲜的噬菌体增殖液PD211和PT15，选取实验室保存的从广东、江苏、广西等地区中患病鸭只的肝脏和脑组织中分离的共40株致病菌株(20株大肠杆菌、20株鸭疫里默氏杆菌)，采用双层平板法检测噬菌体组合物的裂解谱。检测所用宿主菌信息和裂解谱详细结果见表2。

噬菌体组合物的制备方法：按照实施例一中噬菌体增殖的方法将两种噬菌体进行增殖，然后将大肠杆菌噬菌体PD211和鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15 按照1:1的活体数量之比混合制成噬菌体组合物。

2、实验结果及分析

结果显示：大肠杆菌噬菌体PD211共裂解20株大肠杆菌中的17株，其对大肠杆菌的裂解率达到85％，不裂解鸭疫里默氏杆菌，对40株宿主菌的总裂解率为42.5％；鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15可裂解20株鸭疫里默氏杆菌中的17株，对鸭疫里默氏杆菌的裂解率为85％，不裂解大肠杆菌，对40株宿主菌的总裂解率为42.5％；而由上述两种噬菌体组成的噬菌体组合物的总裂解率为85.00％；可见，噬菌体组合物对大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌混合感染具有很好的裂解效果和广谱性，其裂解能力被最大化，可弥补单一噬菌体裂解谱的局限性。

表2噬菌体及其组合物裂解结果

注：+：裂解，有透亮噬菌斑；-：未裂解，无噬菌斑。

实施例八 噬菌体的安全性试验

1、实验方法：

将60只1日龄樱桃谷鸭，隔离饲养2天后进行噬菌体安全性试验。分为试验组1(15只)、试验组2(15只)和对照组1(15只)、对照组2(15只)。试验组1每只雏鸭灌服1×10¹⁰PFU/mL噬菌体组合物1ml，试验组2每只雏鸭腿部皮下注射1×10¹⁰PFU/mL噬菌体组合物1ml；对照组1每只雏鸭灌服 1ml无菌生理盐水，对照组2每只雏鸭注射1ml的无菌生理盐水。在同等环境下饲养2周观察每组鸭的临床体征，并解剖鸭以便观察内脏病变。

2、实验结果及分析

结果显示，在噬菌体组合物处理2周内试验组鸭只临床症状及剖检与对照组无显著性差异；试验鸭只均未死亡，且未出现羽毛蓬乱，精神不佳，瘦弱，食欲减退等异常现象，剖检试验组鸭只无浆膜炎现象，其它内脏均无病变，注射局部吸收良好，无炎性结节及残留，上述结果说明噬菌体组合物是安全的且无毒副作用。

实施例九 噬菌体组合物对大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌引起雏鸭浆膜炎的治疗试验

1、实验方法：选取7日龄鸭只100只分成5组(20只/组)，分成空白组、攻菌组、治疗组，治疗组又分为2个单一噬菌体治疗组和噬菌体组合物治疗组；将两种菌液按照1：1混合调成混合菌液的菌浓度为5×10⁷CFU/mL，分别对攻菌组和单一噬菌体治疗组和噬菌体组合物治疗组进行注射攻菌(0.2ml/ 只)，攻菌后半小时分别对3个治疗组采用皮下注射1ml 1×10⁸PFU/mL噬菌体组合物进行治疗，连续治疗3天后饲养观察14天，记录每天鸭的死亡数，14天剖杀所有存活鸭，观察是否有肝周炎、心包炎等病变情况。

2、实验结果及分析：

结果如图11所示，空白组鸭只无死亡，无腹泻、包心包肝等病变症状；攻菌组死亡率达到90％，病变率100％；PD211治疗组的死亡率为50％，病变率 70％；PT15治疗组的死亡率为45％，病变率75％；PD211+PT15治疗组死亡率为15％，病变率10％。PD211+PT15治疗组死亡保护率和病变保护率均大于 85％，说明噬菌体组合物可明显降低雏鸭的死亡率并有效减轻雏鸭心包炎和肝周炎的病变程度。

实施例十 噬菌体组合物预防鸭养殖中细菌性浆膜炎的试验

1、实验方法：

选取广东某鸭场4个5000羽、1日龄肉鸭鸭舍，均分为2个单一噬菌体组， 1个噬菌体组合物组，1个对照组。采用混拌到雏鸭饲料中，1吨料拌500g噬菌体混合物，噬菌体含量为1×10⁸PFU/g，按照养殖场饲养程序分别在20日龄和35日龄开始含噬菌体的混合饲料，每次连用3天，观察至出栏；对照组和试验组按照养殖场内程序正常饲养，测定鸭群的成活率、生长速度、均匀度、饲料转化率。

饲养过程中死亡鸭剖检存在纤维性渗出物，心包炎、肝周炎现象。

2、实验结果及分析

结果如图12所示，使用噬菌体组合物拌料预防阶段，噬菌体组合物较对照组成活率提高3.8％，高于单一噬菌体组的成活率；噬菌体组合物试验组鸭单只体重高于对照组68.2g(P<0.05)；同时，噬菌体组合物饲料转化率也高于对照组；说明使用噬菌体组合物可以提高鸭群成活率，同时根据鸭的日增重、饲料转换率表明使用噬菌体组合物对提高鸭群的生产性能有一定的促进作用。

实施例十一 噬菌体对鸭养殖场环境消毒试验

1、实验方法

山东某樱桃谷肉鸭场，随机选取1日龄鸭舍15个，试验组9个，对照组 3个，空白对照组3个。试验组包括2个单一噬菌体组和噬菌体组合物组(3 个/组)，试验组用养殖场的饮用水对噬菌体悬浮液进行稀释(1×10⁶PFU/mL)， 2次/天，喷洒量为10mL/m²，对照组每天2次喷洒相同量的84消毒剂，空白对照组按照常规操作进行饲养，检测消毒前后环境中大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌的含量变化，以鸭舍中央点及墙角4点共5点作为测试点，采样点距地面0.5m，墙角四点离墙1m，每点放置9cm直径大小的SS平板(测大肠杆菌) 和胰酶大豆琼脂(TSA)培养基(测鸭疫里默氏菌)。采样后，将SS培养皿放37℃恒温培养箱，将TSA培养皿厌氧培养，培养18-24h后记录各培养皿中细菌菌落数。

按奥氏公式记数菌落总数C＝50000N/AT，式中C:每立方米三种菌的菌落总数(CFU/m³)；N:每皿菌落数；A:培养皿面积(cm²)；T:采样时间(min)。

2、实验结果及分析

如图13所示，噬菌体组合物试验组环境中大肠杆菌和鸭疫里默氏菌总含量低于对照组(84消毒液消毒)和对照组，同时也低于单一噬菌体组环境中大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌的总含量，这表明，噬菌体组合物(PD211+PT15) 能够明显降低环境中大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌的的总含量，减少两种菌的感染率；相对于对照组使用的84消毒液，该噬菌体组合物(PD211+PT15) 具有安全、高效、无毒副、环境友好的优点，大肠杆菌在环境中时刻存在，特定条件下可引起动物体致病，噬菌体作为消毒剂可长期存在于消毒场所，持续抑菌，且噬菌体无刺激气味，对动物体呼吸道黏膜无刺激。因此，本申请的噬菌体和噬菌体组合物可用于作为一种新型的生物环境消毒剂进行应用。

实施例十二 噬菌体对非宿主性细菌的裂解试验

1、实验方法

选取10株沙门氏菌、5株魏氏梭菌、5株葡萄球菌、5株变形杆菌共30株非宿主性细菌，按照实施例7中裂解谱的测定方法进行噬菌体的裂解实验。

2、实验结果及分析

大肠杆菌噬菌体PD211和鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15对上述选择的25 株非宿主性细菌均不裂解，详细见表3，表明噬菌体PT15、PD211均无法识别上述10株沙门氏菌、5株魏氏梭菌、5株葡萄球菌、5株变形杆菌这些非宿主性细菌，说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用。

表3噬菌体及其组合物对非宿主性细菌的裂解结果

以上所述实施例仅表达了本发明几种较佳的实施例而已，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进和等同替换等，这些均应包含在本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.22377。

2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体。

3.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体PT15或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备预防和治疗鸭细菌性疾病药物、饲料添加剂、环境消毒剂中的应用；优选地，所述鸭细菌性疾病包括由鸭疫里默氏杆菌引起或由鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌共同引起的鸭浆膜炎。

4.一种噬菌体制剂，其特征在于，其有效成分包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。

5.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，还包含药学上可接受的载体，所述药物剂型形式为口服给药剂型、外用剂型和注射剂型；优选的，所述噬菌体制剂还包括其它特定病原菌的噬菌体。

6.一种饲料添加剂或饮用水添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物；优选地，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×10⁸PFU/g。

7.一种环境消毒剂，其特征在于，其有效成分包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。

8.根据权利要求7所述的环境消毒剂，其特征在于，还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的其他活性成分；优选地，每种噬菌体的浓度为1×10⁸PFU/mL以上。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体。

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