CN114805472A - 一种鸡法氏囊素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡法氏囊素的制备方法，1）将注射用水与绞碎后的鸡法氏囊混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液；2）匀浆液经细胞破碎后，离心，过滤，收集透过物；3）将透过物用截留孔径分子量不同的滤膜逐级进行切向流过滤，收集透过物或截留物，获得所需的不同分子量范围的鸡法氏囊素粗制品；4）将步骤3）中至少一种分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，即为鸡法氏囊素初制品；5）对鸡法氏囊素初制品除病毒后，调节PH和渗透压后，过滤除菌，获得鸡法氏囊素。本发明采用逐级切向流过滤，建立了精确有效的鸡法氏囊素分离浓缩技术、小分子纯化技术，选取截留孔径分子量不同的滤膜按照不同的工艺技术流程可按需制备出各种不同分子量鸡法氏囊素。

Description

一种鸡法氏囊素的制备方法
技术领域
本发明属于生物制品领域，具体涉及一种鸡法氏囊素的制备方法。
背景技术
法氏囊(Bursa of Fabricus，BF)最早是由意大利解剖学家HieronymusFabricius于1621年发现，由此而得名。由于它表现出随性成熟而逐渐退化的特征，因此在很长一段时间内认为它是与生殖功能有关的器官而未引起人们的重视。1956年Glick等发现摘除BF会降低雏鸡对沙门氏菌O抗原的抗体生成，法氏囊才被确认为禽类特有的中枢免疫器官。随后不少学者对BF在形态发展学、免疫学、组织提取物的生物学活性等方面进行了深入的研究，证实了BF是B淋巴细胞发育分化和成熟的场所，分化完全的B淋巴细胞再由BF迁移到外周淋巴器官定居、繁衍，并执行重要的免疫功能。
BF对禽类体液免疫的形成起中心作用，存在多种活性分子，称为禽法氏囊素(Bursin，BS)。BS具有免疫活性，不仅对禽类具有重要的免疫调节作用，而且对哺乳动物也具有明显的免疫学及生理学活性。其中，囊素三肽是从法氏囊获得的可促进B细胞发育的第一个结构明确的活性物质，其氨基酸组成顺序是Lys-His-Gly，其中Lys：His：Gly为1：0.9：1。法氏囊活性肽-Ⅱ，氨基酸组成为Met-Thr-Leu-Thr-Gly，可通过p53信号通路途径发挥抗肿瘤功能，具有抗肿瘤的潜能。法氏囊活性五肽，氨基酸序列为Cys-Lys-Asp-Val-Tyr，能促进T细胞和B细胞的增殖，提高机体体液和细胞免疫水平，还能平衡Th1和Th2类型的免疫反应，且这种免疫平衡作用是一般免疫增强剂所不具备的。此外，还有一些活性肽如BPP-I、BSP-I等具有抗肿瘤活性。
国内外学者对BS进行了大量的有益研究，Lawrence透析、化学合成、葡萄糖凝胶层析、基因工程表达等多种方法已被用于BS的制备研究。从BS的组织定位和生物学研究中，发现BS不仅存在于禽法氏囊中，也存在于哺乳动物体内。BS不仅具有免疫调节功能，可促进T细胞和B细胞的增殖，增强机体体液和细胞免疫力，提高抗病能力，同时BS还能通过拮抗细胞毒素环磷酸胺，达到下调细胞凋亡和缓解免疫抑制的作用。其中，每个功能包括不同分子量的BS分子。BS是具有生物学活性的分子量小于5kDa但分子量范围分布广泛的非均一性小分子混合物，研究显示BS至少包含不同分子量的多肽、核糖、Na、Zn、K、Mg、Ca等金属元素和游离氨基酸等。
目前，关于鸡法氏囊素的制备方法存在以下不足：
(1)BS是具有生物学活性的分子量小于5kDa且分子量范围分布广泛的非均一性小分子混合物，不仅具有免疫调节功能，可促进T细胞和B细胞的增殖，增强机体体液和细胞免疫力，提高抗病能力，同时BS可下调细胞凋亡和缓解免疫抑制，还具有抗肿瘤活性。其中，每个功能包括不同分子量的BS分子。不同分子量的BS具有不同的生物学活性，因此，BS的组份分子量不同，其生物学活性、制备质量、使用剂量、临床应用均有不同。现有BS制造技术缺乏有效的BS分离浓缩技术、小分子纯化技术，不具备不同分子量BS的制备方法，导致无法获得不同分子量组成的BS。这就限制了BS的生物学活性研究、作用机理研究及有效临床应用。
(2)鸡BS来源于鸡法氏囊，因此鸡源病毒也可经鸡BS传播。其中，禽白血病、禽网状内皮组织增生症和鸡传染性法氏囊病均是严重危害我国养鸡业的重要疫病。要保证鸡BS的安全性，必须对鸡法氏囊加以检验选择。现有鸡BS制造技术缺乏对鸡法氏囊进行严格系统的外源病毒检验，导致所制备鸡BS存在较大的病毒安全风险。
(3)由于技术水平的限制，目前还可能存在着未能发现或了解其特性的鸡源病毒。在鸡BS的制备中，鸡法氏囊中潜在的未知病毒依然使鸡BS面临病毒安全风险。因此，去除/灭活病毒工艺是保证鸡BS安全性的重要、必要手段。现有鸡BS制造技术多采用5-10kDa超滤膜超滤或透析袋透析后直接获得鸡BS成品，工艺流程没有采用去除/灭活病毒方法处理，而超滤膜超滤和透析袋透析尽管都具有一定程度的截留去除病毒作用，但是限于超滤膜和透析袋的滤膜结构特点和过滤工艺性质，超滤膜超滤和透析袋透析均不是安全可靠和容易验证的去除/灭活病毒方法，导致所制备鸡BS存在较大的病毒安全风险。此外，单一病毒去除/灭活方式，存在对有些病毒不能完全去除的可能性，不能绝对保证鸡法氏囊素的安全，存在较大的病毒安全风险。
(4)要保证鸡BS的安全性，除了对鸡法氏囊加以检验选择，对鸡BS进行去除/灭活病毒处理等措施外，对所制备的鸡BS进行严格系统的外源病毒检验，同样是保证鸡BS安全性的重要环节。现有鸡BS制造技术缺乏对鸡BS进行严格系统的外源病毒检验，导致所制备鸡BS存在较大的病毒安全风险。
发明内容
本发明的目的在于克服背景技术的不足，提供一种无病毒安全风险的鸡法氏囊素的制备方法，该方法可以获得特定分子量的鸡法氏囊素。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种鸡法氏囊素的制备方法，包括以下步骤：
1)选取健康鸡的法氏囊，去除鸡法氏囊表面的脂肪、肌肉、筋膜等组织，用注射用水洗净后，经绞肉机绞碎，将注射用水与绞碎后的鸡法氏囊混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液；
2)匀浆液经细胞破碎后，进行离心获得离心上清液，采用0.1-0.45μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物；
3)小于5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用5kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于5kDa鸡法氏囊素粗制品；
4)1至5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至5kDa鸡法氏囊素粗制品；
5)3至5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至5kDa鸡法氏囊素粗制品；
6)小于3kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa鸡法氏囊素粗制品；
或者，将步骤2)中透过物采用8-50kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa鸡法氏囊素粗制品；
7)1至3kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤6)中小于3kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至3kDa鸡法氏囊素粗制品；
或者，将步骤4)中1至5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为1至3kDa鸡法氏囊素粗制品；
8)小于1kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品或步骤6)中小于3kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa鸡法氏囊素粗制品；
或者，将步骤2)中透过物采用8-30kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa鸡法氏囊素粗制品；
9)将步骤3)至步骤8)中至少一种分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，即为鸡法氏囊素初制品。
10)对鸡法氏囊素初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后，调节PH至6.5-7.5，渗透压调节至280-320mosm/kg，采用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，即获得鸡法氏囊素。
进一步地，步骤1)中，鸡法氏囊无禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒污染，鸡法氏囊外源病毒检验法详见实施例4。
进一步地，步骤2)中，细胞破碎方法包括至少一种下述方法：①反复冻融破碎；②高压均质机破碎；③超声波细胞破碎仪破碎。
进一步地，步骤10)中，去除/灭活病毒方法包括至少两种下述方法：①低pH孵放法：pH 2.0-4.0时4-25℃反应2h-1d；②膜过滤法：采用15-45nm除病毒过滤器过滤；③β-丙内酯灭活法：0.001％-0.025％浓度时4℃灭活6-24h后37℃水解2-8h；④甲醛灭活法：0.01％-0.05％浓度时37℃灭活6-12h。
进一步地，步骤10)获得的鸡法氏囊素无外源病毒污染。鸡法氏囊素外源病毒检验法详见实施例5。
制备的鸡法氏囊素成品中，分子量小于1kDa的鸡法氏囊素体积比为20％-60％时，适合用于提高鸡疫苗的攻毒保护效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明采用逐级切向流过滤，建立了精确有效的鸡BS分离浓缩技术、小分子纯化技术，选取截留孔径分子量不同的滤膜按照不同的工艺技术流程可制备出小于5kDa鸡法氏囊素粗制品、1至5kDa鸡法氏囊素粗制品、3至5kDa鸡法氏囊素粗制品、小于3kDa鸡法氏囊素粗制品、1至3kDa鸡法氏囊素粗制品、小于1kDa鸡法氏囊素粗制品，将至少一种上述分子量范围的鸡法氏囊素粗制品按不同比例混合，进行去除/灭活病毒处理、PH和渗透压调节后除菌，即获得鸡法氏囊素。
不同分子量的鸡法氏囊素具有不同的生物学活性。对比现有鸡法氏囊素制造技术所制备鸡法氏囊素，本发明所制备鸡法氏囊素不同分子量组份的占比不同，包含不同体积比例的小于5kDa、1至5kDa、3至5kDa、小于3kDa、1至3kDa、小于1kDa鸡法氏囊素。本发明所制备不同分子量范围组成的鸡法氏囊素，在诱导功能、免疫抑制功能和抗原特异性功能等主要功能方面具有不同的生物学活性，使用剂量和临床效果也不同，为法氏囊素的生物学活性研究、作用机理研究及有效临床应用提供了技术基础。
2.鸡法氏囊的质量是鸡法氏囊素的首要制约因素，外源病毒感染将严重影响鸡法氏囊素的质量及安全，鸡法氏囊是否有外源病毒感染是鸡法氏囊素正式制备前最主要的质量监测，对鸡法氏囊的质量监控是制造合格鸡法氏囊素的前提条件，对制造出安全有效的产品有着重要的作用。现有鸡法氏囊素制造技术缺乏对鸡法氏囊进行严格系统的外源病毒检验。对比现有鸡法氏囊素制造技术，本发明围绕禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡传染性法氏囊病病毒建立了严格系统的原料鸡法氏囊外源病毒检验方法，对鸡法氏囊加以严格检验筛选，保证了鸡法氏囊素的安全性，严格控制了所制备鸡法氏囊素的病毒安全风险。
3.鸡法氏囊经过外源病毒检验筛选、切向流过滤等工艺过程制得鸡法氏囊素粗制品，鸡法氏囊素粗制品仍然有可能被误入的外源病毒或潜在的未知病毒污染。为了排除鸡法氏囊素粗制品可能存留的外源病毒，防止病毒进入鸡法氏囊素成品，须对鸡法氏囊素粗制品进行去除/灭活病毒方法处理。现有鸡法氏囊素制造技术多采用安全可靠性不足且较难验证的超滤膜超滤或透析袋透析截留去除病毒，存在对有些病毒不能完全去除的可能性，不能绝对保证鸡法氏囊素的安全，导致所制备鸡法氏囊素存在较大的病毒安全风险。本发明通过对鸡法氏囊素的去除/灭活病毒方法进行验证与评价研究，从巴斯德消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂(S/D)处理法、膜过滤法、低pH孵放法、β-丙内酯灭活法、甲醛灭活法、二乙烯亚胺灭活法、辛酸处理法、光化学法、深度过滤、色谱技术等方法中筛选并建立了灭活病毒范围广、效果好、验证合格且可保持鸡法氏囊素效力和稳定性的去除/灭活病毒方法。对比现有鸡法氏囊素制造技术，本发明包括至少两种下述去除/灭活病毒方法：①低pH孵放法(pH 2.0-4.0时4-25℃反应2h-1d)；②膜过滤法(15-45nm除病毒过滤器过滤)；③β-丙内酯灭活法(0.001％-0.025％浓度时4℃灭活6-24h后37℃水解2-8h)；④甲醛灭活法(0.01％-0.05％浓度时37℃灭活6-12h)。单一病毒去除/灭活方式，存在对有些病毒不能完全去除的可能性，不能绝对保证鸡法氏囊素的安全，存在较大的病毒安全风险。本发明明确了在鸡法氏囊素生产过程中，必须分别采用两种或两种以上不同机理的去除/灭活病毒方法，共同保证病毒的彻底灭活/去除，以保证鸡法氏囊素的安全。
4.外源病毒污染将严重影响法氏囊素的质量及安全，任何一种禽源法氏囊素都不允许存在外源病毒。因此，对所制备的鸡法氏囊素进行严格系统的外源病毒检验是保证鸡法氏囊素安全性的重要环节。现有鸡法氏囊素制造技术缺乏对鸡法氏囊进行严格系统的外源病毒检验，导致所制备鸡法氏囊素存在较大的病毒安全风险。本发明首先对原料鸡法氏囊进行外源病毒检验，保证原料鸡法氏囊无外源病毒污染。还使用了5KD滤膜进行切向流超滤，进一步保障了鸡法氏囊素粗制品的安全性。随后，采用至少两种去除/灭活病毒方法灭活病毒，灭活可能存在的病毒。对比现有鸡法氏囊素制造技术，本发明围绕禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡传染性法氏囊病病毒建立了严格系统的鸡法氏囊素外源病毒检验方法，切实保障了鸡法氏囊素无外源病毒污染。
附图说明
图1是鸡胚发育情况。
图2是绒毛尿囊膜情况。
图3是禽网状内皮组织增生症病毒检验结果。
具体实施方式
实施例1
一种鸡法氏囊素的制备方法，包括以下步骤：
1)选取健康鸡的法氏囊，所述鸡法氏囊无禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡传染性法氏囊病病毒污染，去除鸡法氏囊表面的脂肪、肌肉、筋膜等组织，用注射用水洗净后，经绞肉机绞碎，将注射用水与绞碎后的鸡法氏囊混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。
2)匀浆液经细胞破碎后(反复冻融破碎)，进行离心获得离心上清液，采用0.22μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。
3)小于5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用5kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于5kDa鸡法氏囊素粗制品。
4)3至5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至5kDa鸡法氏囊素粗制品。
5)小于1kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用30kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa鸡法氏囊素粗制品。
6)将步骤3)至步骤5)中所制备的不同分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，混合比例为：小于5kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比20％，3至5kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比20％，小于1kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比60％，即为鸡法氏囊素初制品。
7)对鸡法氏囊素初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后(先后为以下两种：①低pH孵放法：pH 4.0时4℃反应2h；②膜过滤法：采用45nm除病毒过滤器过滤)，调节PH至7.0，渗透压调节至300mosm/kg，采用0.1μm除菌过滤器除菌，即获得鸡法氏囊素成品，经检测无外源病毒污染，该产品尤其适用于提高鸡疫苗的攻毒保护效果(分子量小于1kDa的鸡法氏囊素占成品体积比为20％-60％)。
实施例2
一种鸡法氏囊素的制备方法，包括以下步骤：
1)选取健康鸡的法氏囊，该鸡法氏囊无禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡传染性法氏囊病病毒污染，去除鸡法氏囊表面的脂肪、肌肉、筋膜等组织，用注射用水洗净后，经绞肉机绞碎，将注射用水与绞碎后的鸡法氏囊混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。
2)匀浆液经细胞破碎(高压均质机破碎)后，进行离心获得离心上清液，采用0.45μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。
3)小于3kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用50kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa鸡法氏囊素粗制品。
4)1至3kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于3kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至3kDa鸡法氏囊素粗制品。
5)将步骤3)至步骤4)中所制备不同分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，混合比例为：小于3kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比30％，1至3kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比70％，即为鸡法氏囊素初制品。
6)对鸡法氏囊素粗制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后(先后为以下两种：①低pH孵放法：pH 3.0时4℃反应2h；②β-丙内酯灭活法：0.001％浓度时4℃灭活6h后37℃水解2h)，调节PH至7.2，调节渗透压至290mosm/kg，采用0.22μm除菌过滤器除菌，即获得鸡法氏囊素成品，经检测无外源病毒污染。
实施例3
一种鸡法氏囊素的制备方法，其包括以下步骤：
1)选取健康鸡的法氏囊，该鸡法氏囊无禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡传染性法氏囊病病毒污染，去除鸡法氏囊表面的脂肪、肌肉、筋膜等组织，用注射用水洗净后，经绞肉机绞碎，将注射用水与绞碎后的鸡法氏囊混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。
2)匀浆液经细胞破碎后(超声波细胞破碎仪破碎)，进行离心获得离心上清液，采用0.22μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。
3)小于5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用5kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于5kDa鸡法氏囊素粗制品。
4)3至5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至5kDa鸡法氏囊素粗制品。
5)小于1kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用10kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa鸡法氏囊素粗制品。
6)将步骤4)至步骤5)中所制备不同分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，混合比例为：3至5kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比70％，小于1kDa鸡法氏囊素粗制品占混合液体积比30％，即为鸡法氏囊素初制品。
7)对鸡法氏囊素初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后(先后为以下两种：①甲醛灭活法：0.01％％浓度时37℃灭活6h；②膜过滤法：采用15nm除病毒过滤器过滤)，调节PH至6.8，渗透压调节至310mosm/kg，采用0.1μm除菌过滤器除菌，即获得鸡法氏囊素成品，检测无外源病毒污染。该产品尤其适用于提高鸡疫苗的攻毒保护效果(分子量小于1kDa的鸡法氏囊素占成品体积比为20％-60％)。
对比实验
以下通过对比例1-3，将本发明制备的鸡法氏囊素与现有鸡法氏囊素进行对比试验。
对比例1
本发明实施例1制备的鸡法氏囊素与现有鸡法氏囊素进行提高La Sota株鸡新城疫弱毒疫苗免疫保护率的对比实验。
本试验中所用到的现有鸡法氏囊素制备方法如下：
取健康法氏囊，加入适量1N冰醋酸应用液，匀浆使其成糊状。在水平振荡仪上振荡后，离心取上清，沸水浴中作用20min，再离心一次，取上清过滤。过滤液用旋转蒸发仪在60℃-70℃之间减压浓缩，浓缩液于4℃条件下高速离心，得上清液，即为粗提物，取粗提物过G-50葡聚糖凝胶柱，1N醋酸洗脱，收集CuSO4反应阳性部分，用7.5％的NaHCO3调pH值至中性，即为现有鸡法氏囊素。
1材料与方法
1.1疫苗与病毒株
鸡新城疫病毒(Newcastle disease,virus,NDV)La Sota株弱毒疫苗病毒含量为107.17EID50/羽份，NDV F48E9株病毒含量为105.0ELD50/mL。
1.2主要仪器
动物饲养隔离器。
1.3实验动物
SPF鸡攻毒前在正压动物饲养隔离器中饲养，30日龄免疫接种，44日龄转至负压动物饲养隔离器中攻毒饲养。
1.4鸡法氏囊素对La Sota株弱毒疫苗攻毒保护率的影响研究
选取80羽SPF鸡随机分为4组，每组各20羽，分别为：单独免疫组、联合免疫组与对照组(均点眼免疫10-5羽份La Sota株弱毒疫苗)、空白组(不免疫)，同时，联合免疫组肌肉注射本发明实施例1鸡法氏囊素0.2mL，对照组肌肉注射现有鸡法氏囊素0.2mL。免疫后14d，单独免疫组、联合免疫组与对照组均肌肉注射0.5mL NDV F48E9株强毒，设立空白组为非免疫非攻毒组，见表1。每日观察临床症状至攻毒后14d，剖检病死鸡和试验结束时存活鸡，SPF鸡发病即判为不保护，统计各剂量组SPF鸡的发病率和保护率。
表1实验设计
Figure BDA0003667284730000091
2结果
2.1临床症状
免疫后，各组鸡精神、采食、饮水、粪便均正常，鸡法氏囊素注射部位无肿胀、无坏死、无炎症等异常变化，未见局部和全身不良反应。攻毒后，单独免疫组和对照组均共有20羽鸡、联合免疫组共有9羽鸡，表现出采食量下降或废绝、精神沉郁、被毛粗乱、不愿走动、神经症状、头颈歪斜、点头呈啄米状、腿翅麻痹、动作失调、倒向一侧、鸡冠及肉髯渐变暗红色或暗紫色、昏睡、张口呼吸、流涎、粪便稀薄而后期排出蛋清样排泄物等临床症状。空白组无发病、无死亡(表2)。
2.2剖检变化
攻毒后，各组发病鸡均出现气管和腺胃乳头出血，腺胃粘膜水肿，肌胃角质层下有出血点，全身浆膜和粘膜出血，脑部点状出血且有炎症，心冠脂肪有针尖大小出血点，脾脏表面有白色坏死点，肾脏出血、肿大，嗉囊充满酸臭味的稀薄液体，十二指肠弥漫性出血，空肠与回肠有溃疡，盲肠扁桃体枣核样坏死，直肠出血、坏死，泄殖腔粘膜出血等剖检病变。
2.3攻毒保护率
攻毒后，单独免疫组、联合免疫组、对照组和空白组的发病率分别为20/20(100％)、9/20(45％)、20/20(100％)和0/20(0％)，单独免疫组、联合免疫组和对照组的保护率分别为0/20(0％)、11/20(55％)和0/20(0％)，见表2。
表2各组的保护效率
组别 发病率 保护率
单独免疫组 20/20(100％) 0/20(0％)
联合免疫组 9/20(45％) 11/20(55％)
对照组 20/20(100％) 0/20(0％)
空白组 0/20(0％)
对比例2
本试验中所用到的现有鸡法氏囊素制备方法如下：
取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗，将法氏囊与注射用水混合，用捣碎机捣碎，再经胶体磨匀浆，得到匀浆液。反复冻融后离心，得到一次上清液和沉淀。将沉淀和pH值为2.5-3.5的注射用水，经胶体磨匀浆得到匀浆液，反复冻融后离心，得到二次上清液。将一次上清液和二次上清液混合均匀，加入终浓度为0.01-0.02％的β-丙内酯，于2-8℃条件下搅拌16-32h进行灭活后，于35-39℃条件水解2-3h，经0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤后收集微滤透过液，经1-5kD滤膜进行切向流超滤后收集超滤透过液，调节渗透压至等渗溶液后，经0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，即为现有法氏囊素。
1试验材料
1.1病毒检测试剂盒 禽白血病病毒(ELISA法)检测试剂盒。
1.2毒株 禽白血病病毒(RAV1和RAV2)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV-T株)。
1.3抗体 鸡抗网状内皮组织增生症病毒(REV)阳性血清、兔抗鸡IgG。
1.4动物 SPF鸡胚，于孵化器孵化。
1.5试剂 胰蛋白酶、新生牛血清、水解乳蛋白、M-199培养基、青霉素链霉素溶液(双抗)、甲醇、鸡红细胞。
1.6仪器 CO2培养箱、倒置荧光显微镜、酶标仪。
2试验方法
2.1样品处理 本发明实施例2制备的鸡法氏囊素、现有鸡法氏囊素各取3瓶分别对应混合，作为待检样品。
2.2鸡胚检查法
2.2.1鸡胚接种 选9～11日龄SPF鸡胚20枚，分成2组，第1组10枚鸡胚，经尿囊腔内接种待检样品0.2ml，第2组10枚鸡胚，经绒毛尿囊膜接种待检样品0.2ml，置37℃下培养7d。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，但每组鸡胚应至少存活8枚，试验方可成立。观察胎儿发育正常和绒毛尿囊膜病变情况。
2.2.2鸡胚液血凝实验 接种后培养7d存活的鸡胚，放置2～8℃过夜，取鸡胚液进行血凝试验。在96孔微量板上，从第l孔至12孔，用移液器每孔加入PBS 0.025ml，用移液器吸取样本0.025m1，从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至最后1个孔，弃去移液器内0.025ml液体(稀释倍数依次为2、4、8、l6、32…、4096)。每孔加入l％鸡红细胞悬液0.025ml，并设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振摇器上摇匀，置室温20～40min，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
2.3细胞检查法
2.3.1鸡胚成纤维细胞(CEF)单层的制备 选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，无菌取出鸡胚，去除头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿内。用Hank’s液洗涤胚体，用灭菌的剪刀剪成米粒大小的组织块，再用Hank’s液洗涤2～3次，然后加0.25％胰酶溶液(每个鸡胚约加4.0ml)，置38℃水浴中消化20～30min，吸出胰酶溶液，用Hank’s液洗涤2～3次，再加入适量的营养液吹打，100目尼龙网滤过，制成每1.0ml中含有活细胞约100万～150万个的细胞悬液，分装于培养板中，进行培养。形成CEF单层后备用。
2.3.2细胞观察 取2个已长成良好鸡胚成纤维细胞单层的(培养24h左右)细胞培养瓶(面积不小于25cm2)，接种处理后样品0.2ml，培养5～7d，观察细胞。
2.3.3红细胞吸附试验 取上述培养的细胞，弃去培养液，用PBS洗涤细胞面3次，加入0.1％(v/v)鸡红细胞悬液覆盖细胞面，置2～8℃60min后，用PBS轻轻洗涤细胞1～2次，在显微镜下检查红细胞吸附情况。
2.3.4禽白血病病毒检验
2.3.4.1接种与培养 取1.0ml处理好的待检样品接种于2个25cm2左右CEF单层，置37℃吸附45～60min，弃去接种液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞作对照。
2.3.4.2细胞培养传代 待细胞培养5～7d后，按常规方法消化、收获细胞，其中1/2细胞，置-60℃以下作检验用(P1)，其余细胞分散到2个瓶中。培养5～7d后，按同样方法收获细胞，留样(P2)。如此继续传第3代，收获(P3)。所有对照组按相同方法处理。
2.3.4.3处理 将P1、P2和P3的细胞培养物(包括样品和所有对照组)冻融3次，5000g离心3min，待用。
2.3.4.4病毒对照 去掉细胞生长液，分别加入RAV1和RAV2 0.5ml，置37℃下吸附45～60min，直接加入培养液，同样品连传3代，传代时被病毒对照应在最后进行。
2.3.4.5 ELISA试验
(1)加样 每孔加100μl待检样品，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，用封口膜封板后，放置37℃作用1h。
(2)洗涤 弃去样品，每孔加300μl洗涤液，放置1min，弃去洗涤液，同法洗涤4～5次。
(3)加酶标抗体 每孔100μl，用封口膜封板后，放置37℃作用1h。
(4)洗涤 同(2)。
(5)加显色液 每孔加100μl显色液，室温避光作用10min。
(6)加终止液 每孔加100μl。
(7)读数 置酶联读数仪读取各孔OD650nm值。
(8)结果判断
1)当阴性对照OD650nm值小于0.2，阳性对照OD650nm值大于0.4时，ELISA试验结果成立。
2)当正常细胞OD650nm值小于0.3，病毒对照OD650nm值均高于0.5时，检验结果成立。
3)待检样品OD650nm值大于或等于0.3判为阳性，OD650nm值小于0.3判为阴性。
2.3.5禽网状内皮组织增生症病毒检验
2.3.5.1接种与培养 取1.0ml处理好的待检样品，接种于1个25cm2左右CEF单层，置37℃吸附60min，弃去接种液，用含3％新生牛血清的M-199培养液洗CEF单层2次，2.0ml/次，每瓶细胞加7.0～8.0ml含3％新生牛血清的M-199培养液，37℃培养7d。同时设立正常细胞作阴性对照。
2.3.5.2病毒对照 将鸡网状内皮组织增生症病毒(REV)稀释至10TCID50/ml，取1.0ml接种至CEF作为阳性对照。
2.3.5.3细胞培养的传代 细胞培养7d后，按常规方法消化、收获细胞，将其中1/10的细胞用2.0ml含3％牛血清的M-199细胞培养液悬浮，接种4孔48孔板，每孔接种0.5ml。剩余细胞置-15℃以下保存备用。接种细胞的48孔板置5％CO2，37℃培养5d，然后进行荧光染色。
2.3.5.4荧光染色
(1)固定 弃去48孔板的细胞培养液，每孔约加0.5ml PBS(pH值7.2，下同)轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入0.3ml冷甲醇，置室温固定10～15min，弃去甲醇，自然晾干2～5min。
(2)加鸡REV特异性抗体自然晾干后，用PBS洗细胞面1次，然后每孔加入0.1ml用PBS(pH值7.2～7.4)进行适当稀释的鸡REV特异性抗体，置37℃作用1h。
(3)洗涤弃去鸡REV特异性抗体，先用含0.05％吐温-20的PBS洗3次，每次每孔加入洗液0.5ml，轻微振荡洗涤1min。然后用PBS以同样的方法洗2次。
(4)荧光二抗染色尽量弃尽洗液，每孔加入0.1ml用PBS进行适当稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG，置37℃作用1h。
(5)洗涤 方法同(3)。
(6)观察 在倒置荧光显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察。被感染的CEF细胞呈现绿色荧光，有完整的细胞形态，周围未被感染的细胞不着色，视野发暗。
(7)结果判定
1)当阳性对照接种的4个孔中全部出现特异性绿色荧光，阴性对照接种孔均未出现特异性绿色荧光时，检验结果成立。
2)待检样品接种的4个孔中，只要有1孔出现特异性绿色荧光，即判定该样品中REV阳性。
3结果
3.1鸡胚检查法
对本发明实施例2制备的鸡法氏囊素与现有鸡法氏囊素采用鸡胚检查法检查，经尿囊腔内接种和绒毛尿囊膜接种两种途径接种后，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素与现有鸡法氏囊素接种的鸡胚均未出现死亡，胎儿发育均正常(如图1)，绒毛尿囊膜均无病变(如图2)。取两种途径接种的鸡胚液做血凝试验，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素的血凝试验结果为阴性，现有鸡法氏囊素的血凝试验结果为阳性(如表3)。结果表明，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素无外源病毒污染，而现有鸡法氏囊素存在外源病毒污染。
表3鸡胚检查结果
Figure BDA0003667284730000141
Figure BDA0003667284730000151
注：“-”表示无鸡胚死亡、绒毛尿囊膜无病变或HA试验为阴性，“+”表示有鸡胚死亡、绒毛尿囊膜有病变或HA试验为阳性。
3.2细胞检查
3.2.1细胞观察及红细胞吸附试验结果
结果显示(如表4)，细胞观察结果中，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素和现有鸡法氏囊素检查结果均未出现细胞病变。红细胞吸附试验中，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素检查结果未出现红细胞吸附现象，现有鸡法氏囊素检查结果出现红细胞吸附现象。结果表明，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素无外源病毒污染，而现有鸡法氏囊素存在外源病毒污染。
表4细胞观察及红细胞吸附试验检查结果
Figure BDA0003667284730000161
注：“-”表示未出现细胞病变或未出现红细胞吸附现象，“+”表示出现细胞病变或出现红细胞吸附现象。
3.2.2禽白血病病毒检验结果
禽白血病病毒ELISA检查结果显示(如表3)，阴性对照OD650nm均值均小于0.2，阳性对照OD650nm均值均大于0.4，试验结果成立；正常细胞对照OD650nm均值均小于0.3，病毒RAV1和RAV2对照OD650nm均值均大于0.5，检验结果成立；接种本发明实施例2制备的鸡法氏囊素和现有鸡法氏囊素待检样品的OD650nm均值均小于0.3，均判为阴性。结果表明，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素和现有鸡法氏囊素均无禽白血病病毒污染。
表5禽白血病病毒检验结果
Figure BDA0003667284730000162
3.2.3禽网状内皮组织增生症病毒检验结果
禽网状内皮组织增生症病毒荧光抗体法结果显示(表6)，阴性对照孔均未出现特异性黄绿色荧光，阳性对照孔均出现典型的特异性黄绿色荧光，试验成立；接种本发明实施例2制备的鸡法氏囊素待检细胞孔均未出现特异性黄绿色荧光，判为阴性；接种现有鸡法氏囊素待检细胞孔均出现特异性黄绿色荧光，判为阳性(图3)。结果表明，本发明实施例2制备的鸡法氏囊素无禽网状内皮组织增生症病毒污染，而现有鸡法氏囊素存在禽网状内皮组织增生症病毒污染。
表6禽网状内皮组织增生症病毒检验结果
Figure BDA0003667284730000171
对比例3
本发明实施例3制备的鸡法氏囊素与现有鸡法氏囊素进行提高La Sota株鸡新城疫弱毒疫苗免疫保护率的对比实验。
本试验中所用到的现有鸡法氏囊素制备方法如下：
取鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗，将法氏囊与注射用水混合，用捣碎机捣碎，再经胶体磨匀浆，得到匀浆液。反复冻融后离心，得到一次上清液和沉淀。将沉淀和pH值为2.5-3.5的注射用水，经胶体磨匀浆得到匀浆液，反复冻融后离心，得到二次上清液。将一次上清液和二次上清液混合均匀，加入终浓度为0.01-0.02％的β-丙内酯，于2-8℃条件下搅拌16-32h进行灭活后，于35-39℃条件水解2-3h，经0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤后收集微滤透过液，经1-5kD滤膜进行切向流超滤后收集超滤透过液，调节渗透压至等渗溶液后，经0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，即为现有法氏囊素。
1材料与方法
1.1疫苗与病毒株
鸡新城疫病毒(Newcastle disease,virus,NDV)La Sota株弱毒疫苗病毒含量为107.17EID50/羽份，NDV F48E9株病毒含量为105.0ELD50/mL。
1.2主要仪器
动物饲养隔离器。
1.3实验动物
SPF鸡攻毒前在正压动物饲养隔离器中饲养，30日龄免疫接种，44日龄转至负压动物饲养隔离器中攻毒饲养。
1.4鸡法氏囊素对La Sota株弱毒疫苗攻毒保护率的影响研究
选取80羽SPF鸡随机分为4组，每组各20羽，分别为：单独免疫组、联合免疫组与对照组(均点眼免疫10-4羽份La Sota株弱毒疫苗)、空白组(不免疫)，同时，联合免疫组肌肉注射本发明实施例3鸡法氏囊素0.2mL，对照组肌肉注射现有鸡法氏囊素0.2mL。免疫后14d，单独免疫组、联合免疫组与对照组均肌肉注射0.5mL NDV F48E9株强毒，设立空白组为非免疫非攻毒组，见表7。每日观察临床症状至攻毒后14d，剖检病死鸡和试验结束时存活鸡，SPF鸡发病即判为不保护，统计各剂量组SPF鸡的发病率和保护率。
表7实验设计
Figure BDA0003667284730000181
2结果
2.1临床症状
免疫后，各组鸡精神、采食、饮水、粪便均正常，鸡法氏囊素注射部位无肿胀、无坏死、无炎症等异常变化，未见局部和全身不良反应。攻毒后，单独免疫组和对照组均共有20羽鸡、联合免疫组共有4羽鸡，表现出采食量下降或废绝、精神沉郁、被毛粗乱、不愿走动、神经症状、头颈歪斜、点头呈啄米状、腿翅麻痹、动作失调、倒向一侧、鸡冠及肉髯渐变暗红色或暗紫色、昏睡、张口呼吸、流涎、粪便稀薄而后期排出蛋清样排泄物等临床症状。空白组无发病、无死亡(表8)。
2.2剖检变化
攻毒后，各组发病鸡均出现气管和腺胃乳头出血，腺胃粘膜水肿，肌胃角质层下有出血点，全身浆膜和粘膜出血，脑部点状出血且有炎症，心冠脂肪有针尖大小出血点，脾脏表面有白色坏死点，肾脏出血、肿大，嗉囊充满酸臭味的稀薄液体，十二指肠弥漫性出血，空肠与回肠有溃疡，盲肠扁桃体枣核样坏死，直肠出血、坏死，泄殖腔粘膜出血等剖检病变。
2.3攻毒保护率
攻毒后，单独免疫组、联合免疫组、对照组和空白组的发病率分别为20/20(100％)、4/20(20％)、20/20(100％)和0/20(0％)，单独免疫组、联合免疫组和对照组的保护率分别为0/20(0％)、16/20(80％)和0/20(0％)，见表2。
表8各组的保护效率
组别 发病率 保护率
单独免疫组 20/20(100％) 0/20(0％)
联合免疫组 4/20(20％) 16/20(80％)
对照组 20/20(100％) 0/20(0％)
空白组 0/20(0％)
实施例4
鸡法氏囊外源病毒检验法
1.待检样品处理随机抽取的鸡法氏囊样品量不低于全批鸡法氏囊总重量的0.5％，混合后匀浆，反复冻融后离心，取离心上清，过滤除菌，备用。
2禽白血病病毒及禽网状内皮组织增生症病毒检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果均应无禽白血病病毒及禽网状内皮组织增生症病毒污染。
3鸡传染性法氏囊病病毒检验
参考GB/T 17999.5-2008《SPF鸡琼脂扩散试验》进行检验，检验结果应无鸡传染性法氏囊病病毒污染，具体步骤如下：
3.1溶液配制
3.1.1 0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲溶液称取氯化钠8.0g，磷酸二氢钠0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g和氯化钾0.2g溶于800ml蒸馏水中，调pH至7.2，加蒸馏水定容至1000ml，灭菌，4℃保存备用。
3.1.2 0.01mol/L、pH7.2的8％氯化钠磷酸盐缓冲溶液向100ml 0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中加入8.0g氯化钠，除菌备用。
3.1.3鸡传染性法氏囊病阳性血清、鸡传染性法氏囊病琼扩抗原。
3.2检验步骤
3.2.1琼脂板制备 将1.0g优质琼脂粉加入100ml的0.01mol/L、pH7.2的8％氯化钠磷酸盐缓冲溶液中，水浴加热融化，稍凉(60℃～65℃)，倒入琼扩板内(厚度为3mm)，待琼脂凝固后，4℃保存备用。
3.2.2打孔 用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径3mm，孔距3mm，用针头挑出孔内琼脂，挑出时从孔一侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上挑出。
3.2.3封底 用酒精灯轻烤平皿底部至微融化，以防侧漏。
3.2.4加样 用移液枪吸取鸡传染性法氏囊病阳性血清，滴入中间孔，1、4孔加入鸡传染性法氏囊病琼扩抗原，其余孔加入待检样品，每孔均以不溢出为度。
3.2.5感作 将琼扩板加盖保湿，放于37℃温箱内作用24h～72h，观察沉淀线。
3.3结果判定
3.3.1将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，若鸡传染性法氏囊病阳性血清孔与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。否则，试验结果无效。
3.3.2待检样品孔与鸡传染性法氏囊病阳性血清孔之间出现清晰的沉淀线，判为阳性。否则，判为阴性。
实施例5
鸡法氏囊素外源病毒检验法
取同批鸡法氏囊素3瓶，混合后作为待检样品。鸡胚检查法，分别经尿囊腔和绒毛尿囊膜途径接种待检样品0.2ml；细胞检查法，每个细胞瓶接种待检样品0.2ml；禽白血病病毒检验，每个细胞瓶接种待检样品1.0ml；禽网状内皮组织增生症病毒检查，每个细胞瓶接种待检样品1.0ml。按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。

Claims (8)

1.一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1)选取健康鸡的法氏囊，去除鸡法氏囊表面的脂肪、肌肉、筋膜组织，用注射用水洗净后，经绞肉机绞碎，将注射用水与绞碎后的鸡法氏囊混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液；
2)匀浆液经细胞破碎后，进行离心获得离心上清液，采用0.1-0.45μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物；
3)将透过物用截留孔径分子量不同的滤膜逐级进行切向流过滤，收集透过物或截留物，获得所需的不同分子量范围的鸡法氏囊素粗制品；
4)将步骤3)中至少一种分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，即为鸡法氏囊素初制品；
5)对鸡法氏囊素初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后，调节PH至6.5-7.5，渗透压调节至280-320mosm/kg，采用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，即获得鸡法氏囊素。
2.根据权利要求1所述的一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：步骤3)具体如下：
3-1)小于5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用5kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于5kDa鸡法氏囊素粗制品；
3-2)1至5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3-1)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至5kDa鸡法氏囊素粗制品；
3-3)3至5kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3-1)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至5kDa鸡法氏囊素粗制品；
3-4)小于3kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3-1)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa鸡法氏囊素粗制品；
或者，将步骤2)中透过物采用8-50kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa鸡法氏囊素粗制品；
3-5)1至3kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3-4)中小于3kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至3kDa鸡法氏囊素粗制品；
或者，将步骤3-2)中1至5kDa鸡法氏囊素粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为1至3kDa鸡法氏囊素粗制品；
3-6)小于1kDa鸡法氏囊素粗制品的制备：将步骤3-1)中小于5kDa鸡法氏囊素粗制品或步骤3-4)中小于3kDa鸡法氏囊素粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa鸡法氏囊素粗制品；
或者，将步骤2)中透过物采用8-30kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa鸡法氏囊素粗制品。
3.根据权利要求2所述的一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：步骤4)中是将步骤3-1)至步骤3-6)中至少一种分子量范围的鸡法氏囊素粗制品混合，其中分子量小于1kDa的鸡法氏囊素体积比为20％-60％。
4.根据权利要求1所述的一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：步骤1)中，鸡法氏囊无禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒污染。
5.根据权利要求1所述的一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：步骤2)中，细胞破碎方法包括至少一种下述方法：反复冻融破碎、高压均质机破碎、超声波细胞破碎仪破碎。
6.根据权利要求1所述的一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：步骤5)中，去除/灭活病毒方法包括至少两种下述方法：①低pH孵放法：pH 2.0-4.0时4-25℃反应2h-1d；②膜过滤法：采用15-45nm除病毒过滤器过滤；③β-丙内酯灭活法：0.001％-0.025％浓度时4℃灭活6-24h后37℃水解2-8h；④甲醛灭活法：0.01％-0.05％浓度时37℃灭活6-12h。
7.根据权利要求1所述的一种鸡法氏囊素的制备方法，其特征在于：步骤5)获得的鸡法氏囊素无外源病毒污染。
8.根据权利要求3所述的制备方法得到的鸡法氏囊素在提高鸡疫苗的攻毒保护效果中的应用。
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