CN103402539A - 一种用于产生对抗病原体的持久免疫和保护的合成免疫原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由通式1表示的合成免疫原，用于产生对抗多种细胞内病原体的长效的保护性免疫，这些免疫原是肺结核、利什曼病、AIDS、锥虫病，疟疾以及敏感症、癌症，以及用于制备该免疫原的方法。发育免疫原能够在人体和家畜的HLA限制中规避HLA。本发明还涉及一种疫苗，包括所述免疫原，用于产生对抗多种疾病的长效保护性免疫。所述的疫苗是靶向对抗细胞内病原体，更特别是病原体M.tuberculosis。在本发明中，混杂M.tuberculosis的多肽是连接到TLR配体；Pam2Cys是靶向它们的，主要是树突状细胞，因此诱导持久的保护性免疫。
通式1，其中，X1=混杂的CD4T辅助细胞表位，选自SEQ ID No.1至98或者零；X2=混杂的CD8T细胞毒表位，选自SEQ ID No.99至103或者零；当X1=零时，X2=SEQ ID No.99至103，且当X2=零时，X1=SEQ ID No.1至98；Y=赖氨酸；以及S=丝氨酸。
Description
本发明的领域
本发明涉及一种产生对抗病原体的长期持久的免疫和保护的合成的免疫原，以及其制备方法。本发明所开发的免疫原能够规避人体中HLA限制。本发明进一步涉及一种疫苗，其包含所述的产生对抗不同疾病的病原体的长期持久的免疫和保护的合成的免疫原。所述疫苗是针对细胞内的病原体，更特别是在本例中涉及的病原体是结核分枝杆菌（M.tuberculosis）。本发明的主题所述的病原体结核分枝杆菌是结核病的病原体。该疫苗也可用于对抗细胞内的病原体，这些病原体导致以下疾病：布氏杆菌病、利什曼病、李氏杆菌病、麻风病、疟疾、伤寒、锥虫病、链球菌的疾病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS），该疫苗也可用于如癌症、过敏、自身免疫性疾病等。在本发明中，混杂的结核分枝杆菌的表位是共轭于Toll样受体（TLR）的配位体，以便将这些配位体靶向到抗原呈递细胞（APCs），特别是树突状细胞（DCs），并因此诱导持久的保护性免疫。
本发明的背景与现有技术描述
根据世界卫生组织（WHO）的报告（2000年），在1992年通过了关于100万新生儿和儿童接种卡介苗的世卫组织儿童基金会方案。虽然大多数全球人口接种卡介苗，但是每年仍约有300万人死于结核病。此外，大约有三分之一的世界人口仍然潜伏感染结核分枝杆菌。因此，作为唯一可用的疫苗，卡介苗是不可预测的和充满变数的。科学界已经对卡介苗接种的功效提出了质疑，因而急需针对结核分枝杆菌疫苗制定有效的手段。
不幸的是，艾滋病的额外问题以及多药耐药（MDR）结核分枝杆菌菌株的出现已加剧了结核病的全球性问题。此外，还出现了一个新的问题，即BCG在艾滋病毒感染者中的安全性问题。在接种BCG疫苗孩子的少数病例中已经报道了散发的BCG-杆菌，后来发现是HIV阳性（Von Reyn,et.al.Lancet1987:ii:669-672;Braun,et.al.,Pedietr.Infect.Dis.J.1992:11:220-227;Weltman,et.al.,AIDS7:1993:149)。WHO目前建议在显示明显的免疫缺陷迹象的儿童中停止使用BCG(世界卫生组织，Tuberculosis fact sheet number104，2002年8月）。
BCG已经在全球范围被广泛应用，尽管其强有力的应用，结核病仍然成为不仅在发展中国家而且在已开发的传播最快的疾病。人们日益关注它作为疫苗在对照试验中的可疑疗效（Bloom,B.R.et.al.,Annu.Rev.Immunol.10:1992:453）。此外，在印度Chenglepet完成的广泛的临床试验显示，在卡介苗接种和未接种的个体中显示出类似的保护程度，这表明它诱导零保护（Narayanan Indian J MedRes.2006,123(2):119-124）。因此，卡介苗接种显然不能阻止疾病传播。
卡介苗失灵的另一个原因是分枝杆菌在细胞内的位置。电子显微镜的研究结果表明，在体外感染巨噬细胞后，BCG基本上保持在吞噬溶酶体内，而致命的结核分枝杆菌（菌株H37Rv）能从吞噬溶酶体中逃脱，并进入细胞质（McDonough,et.al.,Infect.Immun.61:1993:2763）。这可能是与这样相关，即在抗原呈递细胞的内涵体隔室内的抗原是被呈递为结合对于CD4+T辅助细胞的MHC II类决定簇，而细胞质抗原是被呈递为结合对于CD8+细胞毒性T细胞（CTL）的主要组织相容性复合体（MHC）I类决定簇。这解释了为什么结核分枝杆菌是比BCG更依赖于它在MHC I类限制性CTL上的排除，这表明，BCG在诱导MHC I类限制性CTL方面并不是非常有效的（Stover,et.al.,Nature351:1991:456）。在Rich,1951,Kaufman et al2008一文中评论称，从感染结核分枝杆菌中的恢复比BCG提供了对抗未来肺结核的更强的保护。因此，有效对抗结核分枝杆菌感染将需要包括特定的裂解巨噬细胞的CD8+CTL或者实质细胞的参与，否则不能限制它们的感染，而且需要特定的CD4+T细胞，它们能产生IL-2、IFN-γ、TNF-α和其他参与巨噬细胞活化的淋巴因子。
最近的一系列研究表明，结核分枝杆菌或环境分枝杆菌活性地抑制由MHC-I和MHC-II途径的细菌抗原加工与呈递，因而显现出保护性适应性免疫（Wolf等人，2007年）。而且，结核分枝杆菌还会在体内削弱树突状细胞的抗原加工（Wolf等人，2007年）。因此，BCG在例如印度等疾病流行地区的失败可被认为是由于在环境中存在广泛的结核分枝杆菌负荷。因此，抗原加工途径可能会受到严重影响。为了克服这些问题，在TB流行地区的一个合适的方法可能是开发出一种能规避抗原加工的疫苗。因此，多肽可能是合适的替代品，因为它们不需要广泛的抗原处理。
多肽可能被潜在地应用为疫苗。它们规避抗原处理，因为它们可以直接结合到MHC I类和II类分子；因此，可被呈递给CD4和CD8T细胞。因此，环境分枝杆菌负荷不会影响它们的功效。不幸的是，有两个问题一直困扰着传统的多肽疫苗。首先，肽的免疫原性较弱。它们必须给药强大的佐剂来诱发免疫反应。可用于人类的佐剂的数量不仅是极其有限，而且也很昂贵。因此，对于大规模疫苗接种，这种策略在经济上是不可行的，特别是在发展中国家中，结核病发病率是最大的。其次，来自分枝杆菌抗原结合的大多数抗原肽是被限制为只有一个或两个人类白细胞抗原（HLA）等位基因。HLA是在整个人类基因组中最具多态性的基因系统。因此，很难应用多肽来消除在基因多样化（这是彻底多态性的）的人口中的免疫反应。这些原因都深深影响肽疫苗学的进展。但是，如果这些问题都能被规避，肽疫苗将比任何其他潜在的候选物更为有效；尤其是在由于环境药剂导致的抗原处理停滞的情况下。此外，混杂肽可以解决HLA限制的问题，混杂肽可以结合到许多HLA等位基因。因此，从结核分枝杆菌的抗原（特别是分泌抗原）中识别混杂肽，对于开发疫苗将会是非常重要的。混杂的T细胞表位是那些结合到超过一个HLA等位基因的多肽，因此可引起T细胞应答，从而克服MHC限制。它们可以通过传统的生物化学方法来识别：在体外HLA结合测试、诸如T细胞增殖的免疫分析，以及激活或反应器响应，例如分泌细胞因子（Agrewala和Wilkinson，1997年，1998年，1999年）。它们也可采用T细胞表位预测程序基于生物信息学分析而被选择。
对于有效引发适应性免疫系统的先决条件是APC的成熟，它的功能是吞噬病原体、处理和呈递给T细胞。抗原呈递细胞具有模式识别受体（PRRs），该受体能识别病原体的所谓病原相关分子模式（PAMPs）的保守结构域。由PAMPs触发的PRRs作用为一种“危险的信号”（Medzhitov与Janeway，1997年），这导致APCs的成熟，最终导致产生对抗该病原体的适应性免疫应答。Toll样受体是这样的一种关键的PRRs，它们连接免疫的先天臂和适应性臂。佐剂通过结合到TLRs而产生作用，因此传递必须用于激活APCs的信号。最近，它已被证明：如果TLR触发部分和抗原是物理关联时，在免疫反应中会有强劲增长（Blander与Medzhitov，2006年）。
当APCs是与TLRs结合时，共刺激分子、增强的抗原呈递，以及细胞因子和趋化因子的生产都是上调的。在本质上，TLRs是一族跨膜受体，APCs通过TLRs识别保守的PAMPs，它们从自身区别传染因子。在过去的几年中，通过TLRs识别的巨大分子已经被确定。用于TLRs的激动剂包括：三酰脂质化多肽炎症介质（TLR1）、脂磷壁酸（TLR2）、双链RNA（TLR3）、脂多糖（TLR4）、鞭毛蛋白（TLR5）、二酰基脂质化多肽（TLR6）、imidazoquinolines（TLR7，TLR8），以及CpG寡核苷酸（TLR9）（Akira，2003年）。Toll样受体构成的先天免疫系统的重要组成部分，但它们在适应性免疫系统中也是同等重要的。没有这个危险的信号的抗原递呈将导致无反应性或耐受性。
因此，迄今文献报道的分析揭示，游离肽可能不会引起一个最佳的免疫应答。由于TLR触发对于APCs的激活是非常重要的，物理耦合（共价键或包封的形式）将使多肽或表位混杂，以触发有效的免疫反应，这可能是一个额外的命题。大多数TLR配体是脂质基团，但TLR3、TLR7和TLR9都是由核酸来触发的。TLRs的触发，特别是TLR2、TLR4和TLR9的触发导致Th1反应。因此，特别提出，这些对于TLR2或TLR4或TLR9的多肽-TLR配体在对抗结核分枝杆菌的保护方面是非常有效的。
尽管有几个潜在的优点，所有基于合成的多肽表位的疫苗都尚未被授权或可用于人类或动物用途。缺乏共给药的佐剂时，多肽的免疫原性是差的，极少量的佐剂系统适合于人类应用，这已经限制了可行的基于表位的疫苗的开发。
因此，可以总结出：非生物疫苗不能施加对抗结核病的保护，由于该应用缺乏足够的佐剂。目前能用于人类疫苗的佐剂（基于铝盐）都仅在疫苗中起作用，它们需要体液免疫反应，因为它们对于Th2细胞极偏离免疫应答，这仅能有助于保护对抗细胞外感染。已经限制使用，由于这些可用的佐剂具有非常高的价格，它们的使用受到限制。因此，克服这个困境的有效方法是将脂质基团整合进入混杂多肽或子单位疫苗，它们将具有自身辅助性能。
发明目的
因此，在本发明的主要目的是开发一种免疫原，它克服了上文所详述的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种免疫原，它是可用于产生持久长效的对抗细胞内病原体的保护性免疫，该病原体会引起以下疾病：结核病、布鲁氏杆菌病、利什曼病、李斯特菌病、麻风病、疟疾、伤寒、锥虫病、链球菌疾病、艾滋病，以及诸如癌症、过敏和自身免疫等疾病。
本发明的又一个目的是提供一种免疫原，它能够规避人体的HLA限制性。
本发明还有一个目的是提供一种免疫原，它包括混杂的多肽/来自M.tuberculosis蛋白质组的表位，该免疫原耦合到TLR配体。
本发明仍有另一个目的是提供一种免疫原，它包括脂质化的混杂的多肽/来自M.tuberculosis的表位，该免疫原能增强持久的CD4+和CD8+T细胞记忆，并赋予对抗肺结核的保护性免疫。
本发明的另一个目的是提供一种免疫原，它包括脂质化的混杂的多肽/来自M.tuberculosis的表位，它能主要地诱导细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和白介素12（IL-12）的分泌。
本发明的另一个目的是提供一种免疫原，它包括脂质化的混杂的多肽/来自M.tuberculosis的表位，它能减少来从人体的肺内和肺外区域的细菌负担。
在本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，它包括上述的免疫原。
本发明的再一个目的是提供一种疫苗，它基于表面涂覆或包封有混杂的多肽/来自M.tuberculosis的表位的纳米颗粒。
发明内容
本发明涉及一种方法，用于诱导对抗细胞内病原体（特别是M.tuberculosis）的有效免疫应答。这是通过开发一种合成免疫原而获得的，该免疫原包括混杂的多肽/来自M.tuberculosis的表位，它结合到TLR配体。所述的免疫原可以是游离的形式，或者是包封在纳米微粒和/或脂质体内，以致它能有效地诱导强大的和持久的保护性免疫反应。本发明还涉及一种药物组合物，它是疫苗的形式，基于表面涂覆或包封有混杂的多肽/来自M.tuberculosis的表位的纳米颗粒，用于赋予对抗M.tuberculosis的持久长效的免疫性。所开发的免疫原也可被共价连接到/包埋在甘露糖化脂质体或者标记有抗-DEC-205抗体的脂质体，用于唤起所需的免疫反应。
所开发的合成免疫原包括混杂的多肽/来自M.tuberculosis蛋白质组的表位，该表位的序列表示为SEQ ID Nos.1至103（表1）。混杂的多肽是基于以下方法而被识别：结合到HLA I类（HLA-A、B、C）和HLA-II类分子（HLA-DR、DQ、DP）、T细胞的增殖、细胞因子（IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ）的分泌，以及电脑模拟（in silico）方法。
混杂的多肽结合所识别的MHC I和MHC II是共价结合到TLR配体，该TLR配体选自：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13（例如，二酰基脂质化多肽，三酰基脂质化多肽，脂阿拉伯甘露聚糖，脂磷壁酸，双链RNA，脂多糖，鞭毛蛋白，二酰基脂质化多肽，imidazoquinolines和CpG寡核苷酸，等），它们是通过丝氨酸和/或赖氨酸接头而适合于这种耦合。此外，所述多肽可以被包封在合成纳米微粒或脂质体中，以使它们有效地通过APCs（特别是树突状细胞）呈递CD4和CD8T细胞的（图1）。
因此，本发明提供了一种合成免疫原，有用于产生持久长效的对抗M.tuberculosis的免疫性，其中，所述免疫原是由通式1来表示：
通式1
其中，X1=混杂的CD4T辅助细胞表位，其序列是选自SEQ ID No.1至98，或者X1=零；
X2=混杂的CD8T细胞毒表位，其序列是选自SEQ ID No.99至103，或者X2=零；
当X1=零时，X2=SEQ ID No.99至103，且当X2=零时，X1=SEQ IDNo.1至98；
Y=赖氨酸；以及
S=丝氨酸。
在一个实施例中，本发明提供了一种合成疫苗，其包含混杂的多肽（能结合到几种MHC I类和MHC II类分子），这些多肽选自M.tuberculosis，结合到TLR2配体Pam2Cys和靶向到树突状细胞，用于诱导CD4和CD8T细胞的免疫反应。
在另一个实施例中，本发明提供了一种合成疫苗，它包括混杂的M.tuberculosis的多肽，结合到TLR2配体Pam3Cys。
在另一个实施例中，本发明提供了一种合成疫苗，包含混杂的M.tuberculosis的多肽，结合到TLR2配体脂质化多肽MALP-2。
在另一个实施例中，本发明提供了一种合成疫苗，包含混杂的结核分枝杆菌的多肽，结合到TLR4配体脂多糖（LPS）。
在另一个实施例中，本发明提供了一种合成疫苗，包括混杂的结核分枝杆菌的多肽，结合到TLR9配体CpG寡核苷酸（CpG ODN）。
在另一个实施例中，本发明提供了一种疫苗，它基于表面涂覆或包封有混杂的M.tuberculosis的多肽的纳米颗粒。
在另一个实施例中，本发明提供了一种疫苗，它基于表面涂覆或包封有混杂的M.tuberculosis的多肽的脂质体。
在另一个实施例中，本发明提供了一种疫苗，通过混合M.tuberculosis的混杂的CD4和CD8表位多肽与TLR激动剂。
在另一个实施例中，本发明提供了一种通过混合M.tuberculosis的混杂的CD4和CD8表位多肽与纳米微粒来制备所述疫苗的方法。
在另一个实施例中，本发明提供了一种通过混合M.tuberculosis的混杂的CD4和CD8表位多肽与脂质体来制备所述疫苗的方法。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于制备疫苗的方法，其中，用于包封的主要原理是：假设对于TLR3、TLR7、TLR9的配体是核酸，当TLR配体是主要在细胞内时，共价偶联的情形不是很适合。然而，同样的策略可以应用于TLR2、TLR4和TLR5，因为虽然它们主要在表面上表达，它们也在内涵体的隔室内表达。
在另一个实施例中，本发明提供了一种由下式表示的免疫原：
其中，X1=混杂的CD4T辅助细胞表位，其序列是选自SEQ ID No.1至98；以及Y=赖氨酸；以及S=丝氨酸。
在另一个实施例中，本发明提供了一种由下式表示的免疫原：
其中，X2=混杂的CD8T细胞毒表位，其序列是选自SEQ ID No.99至103；以及Y=赖氨酸；以及S=丝氨酸。
在另一个实施例中，本发明提供了一种由下式表示的免疫原：
其中，Y=赖氨酸和S=丝氨酸。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中序列为SEQ ID No.1至103的混杂的表位是来自Mycobacterium tuberculosis。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中TLR配体是选自：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13配体。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中TLR配体是选自：二酰基脂质化多肽、三酰基脂质化多肽、脂阿拉伯甘露聚糖和脂多糖。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中TLR配体是S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸（Pam2Cys）。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的来自M.tuberculosis的表位是基于结合到HLA I类（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和HLAII类（HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ）分子而被识别的。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的来自M.tuberculosis的表位是基于T细胞增殖和IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-12的分泌而被识别的。
在另一个实施例中，本发明提供一种免疫原，其中混杂的来自M.tuberculosis的表位增强MHC/HLA的表达。
在另一个实施例中，本发明提供一种免疫原，其中混杂的来自M.tuberculosis的表位增强选自CD80、CD86和CD40的共刺激分子的表达。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的来自M.tuberculosis的表位通过上调CD69和CD44的表达而增强CD4+和CD8+T细胞的增殖。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的来自M.tuberculosis的表位调控细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-12的分泌。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位增强CD4+和CD8+T细胞记忆，包括中央和反应器T细胞记忆。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位调控CD44、CD62L和CD127在CD4+和CD8+T细胞记忆中的表达。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位是基于细胞因子IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ和IL-12的分泌而被识别的。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位促进肺内和肺外的对抗M.tuberculosis的免疫性。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位抑制M.tuberculosis在身体的肺内和肺外区域的生长。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位下调免疫抑制分子PD-1的表达。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位抑制调节T细胞的生成。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中混杂的表位能诱导IFN-γ的分泌和增殖，IFN-γ是通过从健康人和肺结核病人中获得的人淋巴细胞中获得的。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，其中采用TLR配体作为佐剂，因而不需要额外的佐剂。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，它是靶向到抗原呈递细胞，例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，它是被涂覆到或被包封入纳米微粒中。
在另一个实施例中，本发明提供了一种免疫原，它是共价连接到或被装入甘露糖基化脂质体或者标签为抗-DEC-205的脂质体。
在进一步的实施例中，本发明提供了一种药学上可注射的组合物，包括所述的免疫原，该免疫原可选地结合药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
在另一个实施例中，本发明提供了一种在对象中诱导对抗肺结核的免疫反应的方法，包括：将在治疗上有效量的所述的免疫原以及药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂给药给所述对象。
附图简要说明
图1是免疫原的作用机理。（A）当给药免疫原时，免疫原寻找DCs，因为DCs的TLR2配体与MHC分子的高表达特性。（B）由于对于MHC和TLR2的高亲和力，包含TLR2配体（Pam2cys）、CD8和CD4表位的结构结合到在DCs上的TLR2和MHC分。子（C）这样激活DCs并使它们上调共刺激与MHC分子。（D）当多肽结合MHC-I类和MHC-II类时，CD8和CD4T细胞识别各自的在激活的DCs上以MHC-I和MHC-II分子呈递的多肽。（F）这样导致CD4T-辅助细胞和CD8细胞毒T细胞的增殖，以及细胞因子的分泌，并导致促进免疫反应的增加。
图2显示脂化的混杂多肽[所开发的免疫原]在不同的实验室小鼠品系中许可的实验。遗传上不同的小鼠品系（BALB/c、C57BL/6、C3He）被用来测试已开发的免疫原引发T细胞增殖的能力。来自抗原暴露小鼠的脾细胞是与脂质化多肽（免疫原）和游离多肽共刺激的。T细胞增殖是在48小时体外挑战后通过掺入3H-胸苷来测定的。在附图中使用的缩写：p21：SEQ ID No.2的游离多肽；p91：SEQ ID No.1的游离多肽；L21：SEQ ID No.2的脂质化多肽；L91：SEQ ID No.1的脂质化多肽。
图3显示混杂的多肽/表位在从不同PPD+人类受试者获得的外周血单核细胞上的效果。人外周血单核细胞（PBMC）是从健康捐献者中分离得到的，它们在体外采用不同的免疫原性结构来刺激。T细胞增殖是在48小时后通过掺入3H-胸苷来测定的。
图4显示脂质化多肽[免疫原]增强DC的成熟。（A）以脂质化多肽[免疫原]和游离肽对BALB/c小鼠进行免疫接种。回收所有脾细胞，在体外以脂质化多肽和游离肽进行刺激。孵育48小时后，收获细胞并染色，显示DC（CD11c+/CD40+）增殖。CD11c+/CD40+增殖表明DC成熟。相比于非脂质化的结构，脂质化免疫原结构能够诱导DC成。熟（B）来自C57BL6小鼠的骨髓来源DC是采用标准规程来进行培养。在培养的第7天，用游离或脂质化的多肽处理细胞12小时。然后，收获细胞并染色，显示激活的标记。相比于p91处理的细胞，在L91处理的细胞中显示增强的CD80、CD86、CD40的表达。（C）在培养第7天，用游离或脂质化的多肽处理骨髓来源DC12小时。然后，收获细胞并染色，显示CD74（未成熟MHC）和IAb（成熟MHC）。与游离肽相比，当以L91处理时，在CD74的表达是下降的，而IAb的表达是增强的。
图5显示脂质化的多肽[开发的免疫原]诱导IFNγ在T细胞的生成。（A）将伽马射线辐照的结核分枝杆菌注射进入小鼠中，在体外以开发的免疫原挑战脾细胞。然后，通过ELISA法从培养上清液中估算IFN-γ水平。相比于游离肽，脂质化的多肽诱导显著更高的IFN-γ产生。这意味着这些细胞的Th1表型。（B）脂质化的多肽L91被注射入小鼠，在体外以所述构造的免疫原挑战48小时。然后，通过ELISA法从培养上清液中估算IFN-γ水平。相比于游离肽，脂质化的多肽诱导显著更高的IFN-γ产生。这意味着这些细胞的Th1表型。
图6显示来自以含有SEQ ID No.1的免疫原免疫的小鼠中的CD4T细胞在体外多肽再刺激中产生IFN-γ。以含有SEQ ID No.1的免疫原对小鼠进行免疫接种。将来自免疫小鼠的脾细胞与下列物质一起培养48小时：A）培养基；B）Pam2Cys；C）非脂质化多肽（SEQ ID No.1）；D）脂质化多肽（包含SEQ ID No.1）。对细胞再刺激6小时，染色，显示表面CD4和胞内IFN-γ。代表性的流式细胞仪的曲线描绘了CD4T细胞的IFN-γ产生，其数值表明它们的百分率。
图7显示所开发的免疫原给予比BCG更好的保护。该保护研究是在所述的小鼠模型中进行的。通过克隆形成单位（CFU）涂覆来清点肺内的结核分枝杆菌负荷。以平均值±SD（log10值）的条形图来描述结果。小鼠是以下述来进行免疫：A）PBS；B）BCG；C）包含SEQ ID No.1的免疫原；D）不相关的脂质化多肽，包含来自流感血凝素病毒的多肽。“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。
图8显示以开发的免疫原性脂质化多肽进行免疫导致在豚鼠中对抗M.tuberculosis的保护。该保护研究是在所述的豚鼠模型中进行的。通过克隆形成单位（CFU）涂覆来清点肺内的结核分枝杆菌负荷。以平均值±SD（log10值）的条形图来描述结果。豚鼠是以下述来进行免疫：A）PBS；B）BCG；C）包含SEQID No.1的免疫原；D）不相关的脂质化多肽，包含来自流感血凝素病毒的多肽。“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。
图9显示所开发的免疫原性脂质化多肽诱导人外周血单核细胞的增殖。人外周血单核细胞是从痰液阳性的结核患者获得的，并与以下共培养48小时：A）培养基单独培养；B）免疫原（含有SEQ ID NO.1）；C）游离肽（SEQ ID NO.1）；D）免疫原（含有SEQ ID NO.103）；E）非脂质化多肽（SEQ ID NO.103）；F）免疫原（含有序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.103）；G）非脂质化多肽（含有序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.103）。以3H-胸苷掺入法测定T细胞的增殖。
本发明详述
本文所用的缩写词：
TB：肺结核；
M.tuberculosis：结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）；
BCG：卡介苗；
TLR：Toll样受体；
HLA：人类白细胞抗原；
MHC：主要组织相容性复合体；
DC：树突状细胞；
APC：抗原呈递细胞；
L21：免疫原，其中，X1=SEQ ID.No.2，以及X2=0；
L91：免疫原，其中，X1=SEQ ID.No.1，以及X2=0；
p21：混杂的表位，由SEQ ID.No.2表示；
P91：混杂的表位，由SEQ ID.No.1表示；
PBMC：外周血单核细胞；
PBS：磷酸盐缓冲液；
PPD+：纯化的蛋白衍生物；
Pam2Cys：S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸；
BMDCs：骨髓来源DCs；
Ab：抗体；
p.i.：免疫后。
来自M.tuberculosis的术语“多肽”和“表位”可以在本发明中互换使用。
本发明利用了来自结核分枝杆菌的混杂的多肽以及TLR配体[TLRs]的生物学原理来设计一种合成的免疫原，其中，混杂的CD4和/或CD8多肽/表位是与TLR配体（TLR l至TLR13）通过赖氨酸和/或丝氨酸接头在物理上关联的。这些多肽/表位是通过共价偶联或包封入合成的纳米颗粒或脂质体而被制备成药学上可给药的形式，这些纳米颗粒或脂质体可最终由抗原递呈细胞来有效呈递；特别是从树突状细胞呈递到辅助性和细胞毒性T细胞。可选地，所述的免疫原也可通过结合它与药学上可接受的载体，稀释剂或添加剂而被制备为一种疫苗的形式。混杂的来自M.tuberculosis蛋白质组的多肽是采用电脑模拟（in silico）工具和/或实验方法来确定的，且已发现是103种序列，它们被列举在表1中，该表显示了序列号和在本发明中采用的CD4和CD8混杂表位的所有103种序列。然后，所确定的多肽被共价偶联到TLR配体，它们是被合适地偶联后再通过混合和/或包封入合成的纳米颗粒和脂质体中。
在本专利申请中，被用作选择性的实施例的混杂的T细胞表位已经通过以下方式被确定：多肽结合试验（采用参考结合肽）和/或T细胞增殖，以及IFN-γ、IL-2、IL-4的分泌（Agrewala与Wilkinson，1997年，1998年，1999年；Weichold等人，2007年）。所列举的多肽序列是采用IEDB预测服务器来进行计算而被预测的，并且在IC50<500的结合切断的基础上而被选择，且多肽结合到至少三个HLA等位基因的能力的基础上而被选择。一些多肽也是基于体外结合实验和CD8T细胞溶解实验（Axelsson-Robertson等人，2009年；Masemola等人，2004年）而被选择的。混杂的来自M.tuberculosis的多肽/表位是以前述方法来进行测试的，并表示为SEQ ID Nos.1至103（表1）。
将TLR配体共价偶联到混杂多肽：SEQ ID Nos.1至103所表示的多肽/表位是采用标准的Fmoc技术来合成的。如果所述结构具有两个或更多的多肽，它们是以赖氨酸残基连接的，然后加入两个丝氨酸残基以增强免疫原性，并可使该多肽可被连接到TLR配体。这些多肽（连同丝氨酸接头）是采用已建立的方法（Jackson等人，2004年）而被连接到TLR配体。简言之，过量的合成的TLR配体、O_benzotriazole-N,N,N_,N_-tetramethyluronium-tetrafluoroborate以及1-羟基苯并三唑都是被溶解在二氯甲烷[DCM]中，再加入3倍过量的四甲基脲四氟硼酸盐。然后，将这个溶液加入到树脂结合的多肽（预先合成），以产生脂质化多肽，它是从树脂上裂解下来，并采用反相色谱法纯化。随后，将两个丝氨酸残基加入该多肽中，以增加免疫原的免疫原性。
将上述制备的免疫原结合到在APCs表面上表达的TLRs，并与MHC I类和II类分子结合。TLRs的触发导致APCs的成熟以及共刺激分子和细胞因子的上调。成熟的APC有效地将所述多肽呈递到CD4+和CD8+T细胞，并诱导对抗M.tuberculosis的强力的免疫反应。这个策略可被直接体内应用，或者可选地，DCs可以这个免疫原在体外被脉冲和触发，并可被用于转移到宿主，用于诱导保护性免疫。
多肽和TLR配体的包封：假设对于TLR3、TLR7、TLR9的配体是核酸，且当TLR配体是主要在细胞内时，共价偶联的情形不是很适合，应进行包封。然而，同样的策略可以应用于TLR2、TLR4和TLR5，因为它们也在内涵体的隔室内表达。混杂的来自M.tuberculosis的CD4和CD8表位是与例如核酸等TLR配体混合的，核酸不能被共价偶联到这些多肽，或者共价偶联的TLR2、TLR4配体——混杂的表位是以聚γ-谷氨酸、聚(d,l-乳酸-共-乙醇酸)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、2-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸氨基乙酯、methylmethacrlate等来包封入纳米微粒的形式，类似配合物，用于由树突状细胞的吸收。
此外，这个策略可以专门修改以靶向到树突状细胞。所有的APC都能大量地吸收抗原。在这些APC中，树突状细胞可以吸收直径达500-700纳米的大尺寸微粒。然而，为了对包封在纳米微粒中的抗原进行有效免疫，微粒的尺寸不应超过200nm。因此，200nm直径的颗粒可用于直接免疫，对于体外添加的包封材料，继而采用转移如生命系统，500nm包封的微粒是最理想的。混杂的来自M.tuberculosis的CD4和CD8T细胞表位是与例如核酸等TLR配体一起混合的，这些TLR配体可被共价连接到这些多肽，共价偶联的TLR-2、TLR-4配体——混杂的表位是被包封在例如配位体的纳米微粒的形式，用于由树突状细胞所吸收。
这些APC将大量地吸收已包封的结构，且一旦它到达细胞内隔室，TLR配体将激活APC，CD4T细胞表位将被负载到MHCⅡ类分子上，并呈递给CD4T细胞。CD8T细胞表位将被负载到MHC I类分子上，并将引起有效的CD8T细胞，最终将导致一个强大的CD4和CD8T细胞的免疫反应。
基于这些数据，脂质化的混杂多肽，在许多小鼠品系中触发T细胞反应（图2）。而且，它也能够规避在人体中的HLA限制（图3）。而且，它增强DC成熟，并最终导致Th1反应（图4、图5）。
采用这种策略，可以产生对抗许多病原微生物以及诸如癌症、过敏症等疾病的有效的免疫反应。
实施例
下面的实施例仅作为说明的方式给出，因此不应被解释为限制本发明的范围。
实验动物。6-8周龄的雌性BALB/c、C3He和C57BL/6小鼠。所有的实验都是在BALB/c小鼠上完成，除非另有提及。雌性Duncan-Hartley豚鼠（6-8周龄）是被用于保护研究。动物是被关在印度昌迪加尔微生物技术研究所和印度阿格拉的研究麻风病和其他分枝杆菌病（NJIL&OMD）的国家JALMA研究所的生物安全3级设施内。动物是自由采食颗粒饲料和水。
病人和健康志愿者。从痰液阳性的肺结核患者和PPD+健康志愿者的血液分离单核细胞。
免疫接种。小鼠是以所开发的免疫原性脂质化多肽（20nmol/个动物）来免疫接种。21天后，给药促进的剂量（10nmol）。在促进免疫45天时，处死这些动物。
对于长期的T细胞记忆和保护研究，脂质化多肽或对照的非脂质化多肽进行免疫（20nmol/只小鼠或者100nmol/只豚鼠），且21天后，促进器（10nmol/只小鼠或者50nmol/只豚鼠）已被孕育。为了比较，动物是用BCG（1×106CFU/只动物）。在以活的M.tuberculosis进行气雾剂挑战之前，这些动物静置75天。在挑战之后30天时，处死这些动物。
实施例1
脂质化多肽的合成：多肽和脂质化多肽的合成、纯化和特征是按照下面详述的方法进行的：
为了能使在CD4T细胞表位和CD8T细胞表位之间的脂质附着，将F-moc-赖氨酸(Mtt)-OH插入在这两个表位之间的某个点，该点在树脂结合的多肽的大致中心位置。在完成多肽合成之后，通过含1%TFA的DCM连续流冲洗30-45分钟，将Mtt基团洗去。然后，根据先前描述的方法（Zeng等人，1996年），将Pam2Cys连接到暴露的ε-氨基。在Pam2Cys与多肽部分之间存在丝氨酸的情形改善了免疫原性。因此，将两个丝氨酸残基插入在多肽与含肽免疫原的Pam2Cys的脂质部分之间。在脂质部分的共价连接之前，通过将两个丝氨酸残基按顺序加入所述多肽中，简单地完成这个过程。
采用这种方法，合成了包含单一的混杂CD4或CD8T细胞表位或同时含有CD4和CD8T细胞表位的结构。对于在小鼠、豚鼠和人淋巴细胞的免疫原性进行了实验验证。
结果发现，虽然使用自动合成器可以节省时间和相对毫无问题地完成简单序列的操作，但是手动合成多肽可允许在组装过程中有更多的灵活性和控制。对于合成困难的序列，这是特别重要的，因为它允许在任何点进行快速和方便的干预。在本实验室中日常使用的人工合成多肽的装置包括：连接到玻璃歧管的烧瓶，该歧管可支持多达四个烧结漏斗，从而允许同时合成多达四个多肽。烧瓶的侧臂是连接到一个真空泵，以允许从每个漏斗吸入溶剂。该歧管还包含阀，被配置为能使真空普遍适用到所有四个漏斗或只限制用于个别漏斗。
可用于多肽合成的固相支持物有非常多的选择，预测多肽化学家也应该花一点时间熟悉这些选择的可行性。为了将T辅助细胞表位设计成结合MHC II类分子，以及将细胞毒性T细胞表位设计为适合于MHC I类分子的槽，然而，树脂（即Tentagel S PHB树脂，Rapp Polymere公司）将被用于组装在C-末端包含游离羧基、COOH基团的多肽。
对于合成含有SEQ ID No.1[SEFAYGSFVRTVSLPVGADE]-K-SEQ ID No.2[FVRSSNLKF]的免疫原，称取1克Tentagel S RAM树脂，加入烧结漏斗中，并使其在室温下在DMF中溶胀至少30分钟。
1．为了在树脂上暴露Fmoc-保护NH2基团，用哌啶或含2.5％DBU的DMF处理2×5分钟，然后用DMF洗涤四次。
2.称取0.92mmol的Fmoc-氨基酸（也就是，相对于固相支持物的替代水平的四倍过量的氨基酸），加入到清洁和干燥的塑料管（德国Sarstedt公司）；（具有10毫升体积容量的管是理想的。）相对于氨基酸的量，将等摩尔量的HOBT和HBTU加入到2毫升DMF和6倍过量的DIPEA中，超过固相支持物的替代水平。通过涡旋和超声处理使其充分溶解。
3.通过采用真空泵抽吸，将在玻璃烧结过滤漏斗中的溶胀树脂的DMF去除，再加入活化的氨基酸溶液。用刮勺搅拌，在室温下温育30-45分钟，偶尔搅拌。
4.在30-45分钟之后，吸取氨基酸溶液，随后用DMF洗涤树脂两次。
5.用巴斯德吸液管将一些树脂珠转移到Eppendorf管中，加入2滴DIPEA以及5滴TNBSA溶液。肉眼视察这些树脂珠，或在显微镜下观察。如果在1分钟后小珠变无色，再完成酰化和进行下一个步骤。如果发现这些珠有橙色，这表明存在游离氨基酸基团，未完成偶联。在该情况下，应重复步骤2-5，直到重现阴性的TNBSA测试结果。
6.通过进行步骤1除去耦合的氨基酸的N-Fmoc基团。通过进行TNBSA测试来确认Fmoc基团的去除，该测试的结果是出现阳性的橙色变化。
7.重复步骤2-6来组装下一个氨基酸，直到完成SEQ ID.No.103的合成。
8.为了能使脂质附着，采用(Fmoc)-K(Mtt)-OH重复步骤3-6，使在两个表位之间的脂质能连接。
9.以对应于SEQ ID.No.1的氨基酸重复步骤2-6。
10.采用(Boc)-Gly-OH重复步骤3-6，以暂时阻隔多肽的N-末端。Boc-保护基团是限制脂质附着的去除条件，直至已组装的产品从树脂上裂解下来，并伴随侧链保护基团的去除。
11.在这点上，以DMF、DCM和甲醇按顺序洗脱在树脂上的已完成的多肽，真空干燥，并存储在干燥的环境中，直到准备被裂解用作非脂质化多肽对照。
12.继续从步骤11开始，用1％TFA在DCM5中处理树脂×12分钟，以从位于两个表位之间的赖氨酸残基的侧链上除去Mtt基团。
13.重复步骤2-6以将两个丝氨酸连接到中间的赖氨酸残基的暴露的ε-氨基基团，并从第二个丝氨酸残基处去除Fmoc基团。该多肽现在准备进行脂质附着。
TLR配体Pam2Cys附着到多肽
S-(2,3-二羟基丙基)半胱氨酸的合成
1.将三乙胺（6g、8.2mL、58mmol）加入到1-半胱氨酸盐酸盐（3g、19mmol）和3-溴-丙-1,2-二醇（4.2g、2.36mL、27mmol）的水溶液。此均匀溶液在室温下保持3天。
2.将该溶液在4℃下真空干燥为白色残余物，用丙酮洗涤三次，干燥，得到S-(2,3-二羟基丙基)半胱氨酸，为白色无定形粉末（2.4g、12.3mmol、64.7%）。此产品无需进一步纯化即可用于下一步骤。
N-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-(2,3-二羟基丙基)半胱氨酸（Fmoc-Dhc-OH）的合成
1．将S-(2,3-二羟基丙基)半胱氨酸（2.45g、12.6mmol）溶解在20毫升9％碳酸钠中。
2.将fluorenylmethoxycarbonyl-N-羟基琥珀酰亚胺（3.45g、10.5mmol）加入乙腈（20mL）中，搅拌混合2小时。用水（240mL）稀释，用二乙醚（25mL×3）萃取。
3．用浓盐酸将水相酸化至pH2，然后用乙酸乙酯（70mL×3）萃取。
4．用水（50mL×2）和饱和氯化钠溶液（50mL×2）洗涤萃取液。用硫酸钠干燥并蒸发至干。在零下20℃从乙醚和乙酸乙酯中重结晶，得到无色粉末（2.8g、6.7mmol、63.8%）。
将Fmoc-Dhc-OH偶联到树脂结合的多肽
1.在DMF（3mL）中以HOBT（36mg、0.24mmol）与DICI（37_al、0.24mmol）0℃激活5分钟。
2.将这个混合物加入到包含树脂结合多肽（0.06mmol、0.25g氨基-肽树脂）的容器中。在摇动2小时后，通过过滤去除溶液，以DCM和DMF（3×30mL）清洗树脂。采用TNBSA试验来监控该反应是否完成。
Fmoc-Dhc-多肽的两个羟基基团的棕榈酰化
1.将棕榈酸（307mg、1.2mmol）、DICI（230_L、1.5mmol）和DMAP（14.6mg、0.12mmol）溶解在3mL的DCM中。
2.将树脂结合的Fmoc-Dhc-多肽（0.06mmol、0.25g）悬浮在上述溶液中，室温振荡保持16小时。通过过滤去除上清，以DCM和DMF彻底清洗，以去除尿素的任何残基。以2.5%DBU（2×5分钟）完成Fmoc基团的清除。
从固相支持物裂解脂质化多肽
这个程序是从固相支持物同时裂解脂质化多肽或多肽，并从那些氨基酸中去除侧链保护基团。
1.将真空干燥的树脂转移到清洁的干的McCartney玻璃瓶，加入3mL裂解试剂（88%TFA、5%苯酚、5%水和2%TIPS）。
2.以氮气轻柔冲洗，放置至少3小时，偶尔混合。
3.将混合物转移到5-mL注射器，塞上非吸收棉絮，用该棉塞来驱使含有多肽的上清液进入清洁的干的10-mL离心管。
4.在轻柔氮气流的条件下，蒸发该溶液至约500mL体积。
5.加入10mL冷的二乙醚到多肽溶液，强烈涡旋使多肽沉淀。
6.离心使多肽物质沉淀，用二乙醚洗涤，以冷的二乙醚重悬沉淀，然后以冷的二乙醚洗两次。
7.在最后的清洗之后，吸去残余的二乙醚，使小球在通风橱干燥约1小时。
8.将沉淀溶解在0.1%TFA水溶液，并冻干。
9.采用反相层析法测定产物的纯度，通过质谱法确定目标序列的精确度。
简言之，T细胞表位是结合到脂质部分Pam2Cys，对应于来自支原体的激活脂质化多肽2（MALP-2）的巨噬细胞的脂质部分。CD4T细胞混杂的多肽表示为SEQ ID No.1至98，它们是从M.tuberculosis的16kDa分泌蛋白中选择的，并连接到Pam2Cys，以制成免疫原L91。CD8T细胞混杂的多肽表示为SEQ ID No.99至103，它们是从M.tuberculosis的抗原85B中选择的。对照脂质化多肽是以来自流感血凝素病毒（HA）的表位来合成的，其包含序列KYVKQNTLKL。所有这些多肽是以两个丝氨酸残基在N-端修饰的，然后连接脂质部分Pam2Cys，以获得合成的脂质化多肽。
实施例2
在小鼠和豚鼠的保护研究
如上述方法进行动物免疫，静置75天。然后，通过气雾剂途径将这些动物暴露给M.tuberculosis菌株H37Rv，100CFU（小鼠）或30CFU（豚鼠），30天后处死。通过CFU计数来估算肺内的分枝杆菌负荷。为了组织病理学分析，福尔马林固定组织，苏木精和曙红染色。
结果
脂质化多肽的免疫导致强烈的Th1免疫反应
以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽免疫接种小鼠，静置45天，检查回忆应答。一旦以该多肽再刺激，可观察到在CD4T辅助细胞中主要产生IFN-γ（图6）。
脂质化多肽的免疫接种导致在小鼠中对抗M.tuberculosis的免疫保护
这里研究了所制备的含有SEQ ID No.1（SEFAYGSFVRTVSLPVGADE）的免疫原脂质化多肽是否可在肺结核实验中实施保护。小鼠被接种脂质化多肽或对照（BCG、游离多肽、来自流感血凝素的不相关的脂质化多肽，以及安慰剂）。然后，以M.tuberculosis气雾挑战小鼠，在75天后接种，再静置30天。可以观察到，相比于BCG（p<0.05）和其他对照，以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽来免疫的小鼠可显著限制分支杆菌的生长（图7）。
脂质化多肽的免疫接种导致在豚鼠中对抗M.tuberculosis的免疫保护
下一个进行的实验表明，以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽接种是否能在豚鼠的肺结核实验中实施保护。Duncan-Hartley豚鼠是以所制备的脂质化多肽或对照（BCG、游离多肽、来自流感血凝素的不相关的脂质化多肽，以及安慰剂）来接种。然后，以M.tuberculosis气雾挑战小鼠，在75天后接种，再静置30天。可以观察到，以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽来免疫的小鼠在肺内的细菌负荷比BCG和其他对照更低（图8）。
实施例3
气雾感染和肺内分枝杆菌负荷
M.tuberculosis菌株H37Rv的冻存物在37℃快速复苏，10000×g离心10分钟，用PBS-吐温-80洗涤2次。多肽/BCG/安慰剂免疫接种动物，该动物以标准化的低剂量气雾感染来进行挑战，采用一种吸入暴露系统（Glas-Col，Terre Haute，印度）以在肺内沉积约100活菌（小鼠）或者30活菌（豚鼠）（在暴露24小时之后通过CFU计数来检测）。感染30天后，收集肺组织并在7H9中均匀化，以吐温-80（0.05%）来悬浮。然后稀释个体肺组织匀浆，放置在Middlebrook7H11上，其包含噻吩羧酸肼（TCH，2μg/ml）和OADC。在37℃温育3-4周后计数CFU。
脂质化多肽的免疫接种导致在小鼠中对抗肺结核的免疫保护
这里研究了所制备的含有SEQ ID No.1（SEFAYGSFVRTVSLPVGADE）的免疫原脂质化多肽是否可在肺结核实验中实施保护。小鼠被接种脂质化多肽或对照（BCG、游离多肽、来自流感血凝素的不相关的脂质化多肽，以及安慰剂）。然后，以M.tuberculosis气雾挑战小鼠，在75天后接种，再静置30天。可以观察到，相比于BCG（p<0.05）和其他对照，以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽来免疫的小鼠可显著限制分支杆菌的生长（图7）。
脂质化多肽的免疫接种导致在豚鼠中对抗肺结核的免疫保护
下一个进行的实验表明，以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽接种是否能在豚鼠的肺结核实验中实施保护。Duncan-Hartley豚鼠是以所制备的脂质化多肽或对照（BCG、游离多肽、来自流感血凝素的不相关的脂质化多肽，以及安慰剂）来接种。然后，以M.tuberculosis气雾挑战小鼠，在75天后接种，再静置30天。可以观察到，以包含SEQ ID No.1的免疫原脂质化多肽来免疫的小鼠在肺内的细菌负荷比BCG和其他对照更低（图8）。
实施例4
从脾脏分离淋巴细胞
无菌条件摘除脾脏，制备单细胞悬浮液。由ACK溶解缓冲液（NH4Cl0.15M、KHCO310mM、EDTA88μM）溶解RBC，用PBS洗涤3次，在完全培养基（CM；RPMI-1640培养基，包含10%FBS）中重悬。在96孔U形底部板内培养脾细胞（2×105/孔）48-72小时。将不同浓度的多肽加入到培养物中。商业上可用的超纯Pam2Cys（Invivogen公司）的预期剂量（50或100ng/ml）被用作对照。通过T细胞增殖和IFN-γ分泌（图2和图5B）表明，来自脂质化多肽免疫小鼠的淋巴细胞可有效地响应多肽的回忆刺激。
实施例5
增殖检验
通过温育人PBMC与所述多肽72小时，或者温育鼠脾细胞与所述多肽48小时，进行T细胞增殖检验。然后，加入[3H]-胸苷（0.5μCi/孔）。16小时后，收集培养物，测定引入的放射性。如前所述地进行细胞增殖检验（Singh等，2011年）。简言之，从脾脏分离的淋巴细胞（2×105细胞/孔）和/或淋巴腺是以不同浓度的L91/F91在96孔U型底部板内以200μl完全培养基RPMI-1640培育三份。在48小时和72小时之后，以0.5μCi的[3H]-胸苷脉冲这些培养物。在16小时后采用Tomtec-Harvester-96仪器（Tomtec，Hamden，美国康涅狄格州）收集培养物。通过Wallac1450Microbeta Triluxβ-scintillation counter仪器（Perkin Elmer，Waltham，美国马萨诸塞州）。对于人淋巴增殖，从PPD+志愿者或唾液阳性肺结核病人中真空抽血（20ml）。按照厂商说明书，采用Histopaque-1077仪器通过密度梯度法分离外周血单核细胞（PBMC）。用含1%FBS的PBS洗涤纯化的PBMC4次。在U-底96孔板以CM培养基（不含2-巯基乙醇）培养细胞（2×105细胞/孔）与多肽三份。温育细胞72小时，随后以0.5μCi的[3H]-胸苷施加脉冲。在16小时后收集培养物，如上所述。
在图9中显示了脂质化多肽刺激肺结核病人的外周血单核细胞的影响。包含SEQ ID No.1（SEFAYGSFVRTVSLPVGADE）的免疫原脂质化多肽增强了人PBMC的增殖，与非脂质化多肽配对物相比。令人感兴趣的是，可观察到，以脂质化多肽免疫原获得了最好的反应，包括CD4辅助细胞表位（SEQ ID No.1）和CD8细胞毒细胞表位（SEQ ID No.103）。
实施例6
细胞内染色
淋巴细胞（2×106细胞/ml）是与多肽一起在96孔板分三份培育48小时。汇集细胞，并用清洗缓冲液（含1%FBS的PBS）洗涤两次。以PMA（50ng/ml）和离子霉素（1μg/ml）在37℃再刺激该细胞6小时，并在最后4小时在培养物中加入布雷菲德菌素A（10μg/ml）。在激活6小时后，用染色缓冲液（含1%BSA和0.01%NaN3的PBS）清洗细胞两次。用2.4G2阻断Fc受体，然后用抗鼠荧光标记的mAb对CD4进行染色。用染色缓冲液清洗细胞两次，在2%多聚甲醛中固定细胞。然后，用含0.01%皂甙和1%FCS的PBS（渗透缓冲液）对这些细胞进行渗透。然后用荧光标记的抗细胞因子Ab（或它的同型对照）在含有0.01%皂甙的染色缓冲液中温育。每个步骤的温育是在4℃温育30分钟或者另有说明。最后，在1%多聚甲醛中固定细胞，在FACS Aria II上获得结果，由FACS DIVA（BD Biosciences公司，美国加州圣何塞）分析数据。
统计学分析。通过不匹配的“t”检验和Student-Newman-Keuls多重比较检验，由GraphPad InStat3软件来分析数据。
本发明的优点
●所述表位都是精确定义的；能避免在抗原中的自发反应部分；
●不需要价格高昂的方法；
●所开发的免疫原不需要任何佐剂；
●总体上是合成的；
●能激活CD4和CD8T细胞；
●对于Th1型的Skews免疫反应；
●能激活天然T细胞；
●能诱导长效记忆T细胞的产生；
●能减少来自身体的肺内和肺外区域的细菌负荷。
表1：序列编号和相应的序列
所用的混杂的表位（多肽）的列表
Claims (28)
1.一种用于产生长效免疫和保护对抗病原体的合成免疫原，其特征在于，所述免疫原是由通式1来表示：
通式1，
其中，X1=混杂的CD4T辅助细胞表位，其序列是选自SEQ ID No.1至98，或者X1=零；
X2=混杂的CD8T细胞毒表位，其序列是选自SEQ ID No.99至103，或者X2=零；
当X1=零时，X2=SEQ ID No.99至103，且当X2=零时，X1=SEQ IDNo.1至98；
Y=赖氨酸；以及
S=丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的免疫原，表示为下式：
其中，X1=混杂的CD4T辅助细胞表位，其序列是选自SEQ ID No.1至98；以及
Y=赖氨酸；以及
S=丝氨酸。
3.根据权利要求1所述的免疫原，表示为下式：
其中，X2=混杂的CD8T细胞毒表位，其序列是选自SEQ ID No.99至103；以及
Y=赖氨酸；以及
S=丝氨酸。
4.根据权利要求1所述的免疫原，表示为下式：
其中，Y=赖氨酸；以及
S=丝氨酸。
5.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述的序列为SEQ ID No.1至103的混杂的表位是来自Mycobacterium tuberculosis。
6.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于，TLR配体是选自：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13配体。
7.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于，所述TLR配体是选自：二酰基脂质化多肽、三酰基脂质化多肽、脂阿拉伯甘露聚糖和脂多糖。
8.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述TLR配体是S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸或Pam2Cys。
9.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的来自M.tuberculosis的表位是基于结合到HLA I类和HLA II类而被识别的，HLA I类是选自：HLA-A、HLA-B、HLA-C；HLA II类是选自：HLA-DR,HLA-DP,HLA-DQ分子。
10.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述来自M.tuberculosis的混杂的表位是基于T细胞增殖和IFN-γ与IL-4的分泌而被识别的。
11.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述免疫原增强MHC/HLA的表达。
12.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述免疫原增强选自CD80、CD86和CD40的共刺激分子的表达。
13.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：混杂的表位通过上调CD69和CD44的表达而增强CD4+和CD8+T细胞的增殖。
14.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述来自M.tuberculosis的混杂的表位调控细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-12的分泌。
15.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位增强CD4+和CD8+T细胞记忆，包括中央和反应器T细胞记忆。
16.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位调控CD44、CD62L和CD127在CD4+和CD8+T细胞记忆中的表达。
17.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述来自M.tuberculosis的混杂的表位是基于细胞因子IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ和IL-12的分泌而被识别的。
18.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位促进肺内和肺外的对抗M.tuberculosis的免疫性。
19.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位抑制M.tuberculosis在身体的肺内和肺外区域的生长。
20.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位下调免疫抑制分子PD-1的表达。
21.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位抑制调节T细胞的生成。
22.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述混杂的表位能诱导IFN-γ的分泌和增殖，IFN-γ是通过从健康人和肺结核病人中获得的人淋巴细胞中获得的。
23.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述免疫原采用TLR配体作为佐剂，因而不需要额外的佐剂。
24.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述免疫原是靶向到抗原呈递细胞，例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。
25.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述免疫原是被涂覆到或被包封入纳米微粒中。
26.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述免疫原是共价连接到或被装入甘露糖基化脂质体或者标签为抗-DEC-205的脂质体。
27.一种药学上可注射的组合物，包括在权利要求1所述的免疫原，该免疫原可选地结合药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
28.在对象中诱导对抗肺结核的免疫反应的方法，包括：将在治疗上有效量的权利要求1中所述的免疫原以及药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂给药给所述对象。
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