CN114621970A - 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用 - Google Patents

一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用。所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明方案通过将经密码子优化后的融合基因经原核表达，制备得到Lactococcus lactis NZ9000pNZ8148‑MSRGP作为加州鲈口服疫苗，方法简单，可以短时间制备得到大量的疫苗，可以高效用于加州鲈弹状病毒的防治。

Description

一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫 苗的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹 状病毒口服疫苗的应用。
背景技术
弹状病毒(rhabdovirus)为一类有包膜的负链单链RNA病毒，形态类似棒状，可 感染包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类、昆虫以及各种植物等。大多数的弹状病毒 是动植物重要病原，具有较强的致病性。鱼类弹状病毒是可引起各种淡水和海水鱼类致 死性和流行性病害的一类弹状病毒，感染宿主广、毒株多且毒力强，对淡水和海水鱼危 害严重。
大口黑鲈(Micropterus Salmoides)，又名加州鲈，是重要的淡水养殖品种，有生长 速度快且对环境适应强等优点。近年来，随着养殖规模不断增加，加州鲈病害问题日益严重，特别是病毒类疾病，导致加州鲈苗种和成鱼的大规模爆发性死亡，造成巨大的经 济损失。近年来，相关研究人员先后从加州鲈等品种病鱼分离到弹状病毒，证明了弹状 病毒是引起加州鲈死亡的主要病原之一。该病毒病的防治方法只有通过疫苗等免疫制品 来预防。疫苗具有无残留、不易引起耐药性、安全高效等优点，作为加州鲈弹状病毒病 防控的重要途径，是加州鲈病害防控的发展趋势。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种 融合基因。
本发明还提出一种上述融合基因编码的融合蛋白。
本发明还提出一种具有上述融合基因或上述的融合蛋白的表达载体、表达盒、转基 因细胞系或转基因重组菌。
本发明还提出上述融合基因的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述融合基因包含usp45和经密码子优化的msrgp基因的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述msrgp基因的核苷酸序列为经密码子优化的msrgp基因的核苷酸序列。通过将msrgp基因的核苷酸序列进行密码子优化使得msrgp 基因的表达成功率增加，与usp45基因进行融合，同时有效的提高了msrgp基因的表达 量。
在本发明的一些实施方式中，所述usp45基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，经密码子优化得到的msrgp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在本发明的一些实施方式中，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。
在本发明的一些实施方式中，所述连接序列如SEQ ID No.4所示，所述标签序列如SEQ ID No.5所示。
根据本发明的第二方面，提出了一种上述融合基因编码的融合蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
S1、将如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列连接到载体中，得到重组质粒；
S2、将重组质粒转入大肠杆菌，培养后提取重组质粒；
S3、将经步骤S2提取得到的重组质粒转化至乳酸菌，得到重组乳酸菌；
S4、诱导步骤S3得到的重组乳酸菌表达得到所述融合蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述载体选自pNZ8148质粒。
在本发明的一些实施方式中，所述大肠杆菌选自大肠杆菌DH5α或MC1061。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中，大肠杆菌的培养操作具体为将大肠杆菌菌体涂布于含氯霉素的培养基进行培养。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中，提取重组质粒的操作具体为从经培养后的含氯霉素的培养基中挑取阳性单菌落进行提取操作。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，转化为电转化。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，诱导表达采用的诱导剂为Nisin；优选地，所述Nisin的浓度为5～15μg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，诱导表达时间为2～8h；优选地， 所述诱导时间为4h。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，诱导表达温度为37℃。
根据本发明的第三方面提出了一种具有上述融合基因或上述的融合蛋白的重组表 达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。
在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体为将上述融合基因亚克隆至pNZ8148原核表达载体中，构建得到的。
在本发明的一些实施方式中，所述的转基因重组菌为转基因重组乳酸乳球菌；优选 地，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000-MSRGP，其保藏编号为CCTCCNO：M2021448；保藏信息如下：保藏号为CCTCC NO：M2021448的重组乳酸乳球菌 已于2021年4月25日在中国典型培养物保藏中心CCTCC(地址：武汉市武汉大学)注册 保藏。
在本发明的一些实施方式中，所述宿主菌为大肠杆菌MC1061和/或乳酸乳球菌。
本发明第四方面提出一种上述融合基因应用，所述应用为在制备预防鱼类弹状病毒 制剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为上述基因在制备口服疫苗中的应用。
一种口服疫苗，所述口服疫苗为上述融合基因、融合蛋白或含有上述融合基因、融合蛋白的表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。
在本发明的一些实施方式中，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂为Essai GR 01 PR佐 剂；通过佐剂的添加，使得口服疫苗抗原通过油性佐剂包裹而固定在饲料上，对鱼进行口服免疫；且这个油性佐剂能包裹住抗原，在池塘投喂的真实免疫过程中，不因为碰到 水就使得抗原马上溶解于水，而且包裹住抗原，可以在鱼的胃肠道中耐胃酸等恶劣环境， 不轻易被胃酸、各种酶等直接给消化破坏掉，保护口服疫苗到达肠道，起免疫的作用。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白与佐剂的质量比为(1～4)：(6～8)。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白与佐剂混合使用。
在本发明的一些实施方式中，所述疫苗还包括饲料，所述饲料与融合蛋白和佐剂的 混合物的质量比为(1～3)：(3～10)。
根据本发明实施方式的加州鲈弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗，至少具有如下有益效 果：
(1)与未经优化的基因相比，密码子优化的MSRGP基因序列中乳酸乳球菌偏好 的密码子出现频率增加，但是其编码的MSRGP蛋白氨基酸序列不变，从而使其更适于 在乳酸乳球菌中的蛋白表达，更有利于更利于提高目的蛋白表达量；由于目前对基因序 列的密码子优化尚没有统一的标准或原则，因此不同的研究人员完全会设计出不同的核 苷酸序列用于目标蛋白质的表达，相应地表达效率也可能存在明显差异，根据本申请优 化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了MSRGP基因蛋白表达水平；将该优化 后的基因用于构建核酸疫苗，更有效地刺激了加州鲈免疫系统，产生了中和抗体，体现 了良好的免疫原性；同时，在密码子优化的基础上，将该序列与usp45基因进行融合， 更有效地促进蛋白的分泌和提高目的蛋白诱导抗体产生的能力，可以短时间制备得到大 量的疫苗，可以高效用于加州鲈弹状病毒的防治。
(2)与其它加州鲈弹状病毒疫苗，具有以下明显的优势：第一，本发明中乳酸菌 是食品级的安全微生物，不存在其它弱毒疫苗、减毒活疫苗等隐藏的毒力返强的危险， 也不存在其它类似芽孢杆菌表达系统中，芽孢杆菌对鱼体和人体的潜在危害；第二，本 发明中外源蛋白在乳酸菌中表达后无需分离纯化，能降低疫苗生产的成本，比大肠杆菌 等表达后需要纯化的疫苗成本低；第三，采用乳酸菌增强疫苗的免疫效果；第四，本发 明中加州鲈口服疫苗非常适合于加州鲈鱼苗的养殖实践应用，因为鱼苗尺寸太小，无法 进行疫苗注射免疫；第五，与加州鲈注射免疫相比，本发明中加州鲈口服疫苗能够极大 地减少疫苗免疫的工作量和劳动力成本，提高养殖户使用疫苗的便利程度，而且也能减 少鱼体应激和注射部位的不良反应；第六，与加州鲈浸泡免疫相比，浸泡免疫这种方式 需要加强免疫，但是在养殖过程中很难把全部鱼从池塘中捞起来再次浸泡免疫(捞网会 增加鱼的应激导致死亡)，而本发明中口服疫苗可以每天和佐剂、饲料一起搅拌后投喂 加州鲈鱼，不需要全部鱼捞网，且多次投喂增强免疫，与浸泡免疫相比，具有较好的免 疫效果和操作实用性；第七，为避免为胃的酸性环境等破坏，减少肠道中疫苗剂量和免 疫原性，本发明方案首次采用了与Essai GR 01 PR佐剂进行乳化从而包裹保护住口服疫 苗的方法，且Essai GR 01 PR佐剂对本发明方案制备得到的疫苗具有协同增效作用，可 以提高疫苗的免疫能力。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的优化的序列与原序列的序列对比结果图；
图2为本发明实施例1中的pNZ8148质粒双酶切的结果图，其中M为marker；
图3为本发明实施例1中的重组质粒pNZ8148-msrgp和pNZ8148 PCR扩增鉴定图，其中，M为marker，1为重组质粒pNZ8148-msrgp，2、3为pNZ8148-usp45-msrgp的阳 性对照；4为空白对照；5、6为质粒pNZ8148；7为质粒pNZ8148的阳性对照；8为空 白对照；
图4为本发明实施例1中的重组质粒pNZ8148-msrgp和pNZ8148的HindIII酶切鉴定结果图；其中，M.为DNA maker；1为pNZ8148-msrgp质粒经HindIII酶切结果图； 2、3为pNZ8148-usp45-msrgp质粒经HindIII酶切结果图，4为pNZ8148质粒经HindIII 酶切结果图；
图5为本发明方案实施例1中的诱导表达蛋白MSRGP Western blot的检测分析结果 图，其中，A图为pNZ8148空载、NZ8148-usp45-msrgp和pNZ8148-msrgp的Western blot的检测分析结果图，M.为protein maker；1为诱导的L.lactis NZ9000pNZ8148-usp45-msrgp 的检测结果；2为诱导的L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp的检测结果；B图为未经优化 的NZ8148-usp45-msrgp和未经优化的pNZ8148-msrgp的Western blot的检测分析结果图， 3为诱导未经密码子优化的L.lactis NZ9000pNZ8148-usp45-msrgp的检测结果；4为诱导 的未经密码子优化的L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp的检测结果图；
图6为本发明方案测试例中的加州鲈血清ELISA抗体检测结果图；
图7为本发明方案测试例中的加州鲈肾脏IgM基因表达量的检测结果图；
图8为本发明方案测试例中的口服疫苗免疫保护结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充 分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动 的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法 如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到的试剂和材料。
试剂与材料：
健康加州鲈(体长9±0.3cm，体重15±1.5g)，来自广东省水产良种场。
加州鲈弹状病毒、pNZ8148质粒、HRP标记的羊抗鼠抗体、鼠抗加州鲈IgM抗体 均为实验室保存。
L.lactis NZ9000，大肠杆菌MC1061感受态购买于REBIO公司。
TaKaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit，TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit，TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit，In-Fusion试剂盒， CapturemTM His-Tagged Purification Miniprep Kit，PCR相关实验耗材均购买于takara公 司。
Anti-6×His
Figure BDA0003401799140000061
抗体(HRP)(ab1187)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体、TMB 显色液等Western blot相关耗材购买于广州勤卓生物科技有限公司。
BHI培养基、M17培养基、Nisin、氯霉素购买于广州市康龙生物科技有限公司。
Essai GR 01 PR购买自SEPPIC公司。
加州鲈弹状病毒由珠江水产研究所水产病害与免疫实验室保存。
实施例1基于加州鲈弹状病毒G蛋白基因原核表达得到的加州鲈弹状病毒G蛋白的方 法
不同的物种有其偏好性的密码子，依据计算、分析获得的乳酸乳球菌高频密码子(使 用频率较高)及低频密码子(稀有密码子)对加州鲈弹状病毒G蛋白基因进行优化，提高加 州鲈弹状病毒G蛋白编码基因中对应氨基酸乳酸乳球菌中高频密码子，减少低频密码子。 本实施例选取了L.lactis MG1363来源的NZ9000作为表达菌，并研究了经密码子优化和 未经密码子优化的MSRGP基因所构建的乳酸乳球菌表达MSRGP蛋白的效率，比较发 现，在不改变加州鲈弹状病毒G蛋白序列的基础上，经过密码子优化设计，可以大幅度 提高重组加州鲈弹状病毒G蛋白的表达量，优化的序列与原序列的序列对比结果图如图 1所示，其中，第一个序列为原序列，第二个序列为优化的序列。
将经密码子优化得到的加州鲈弹状病毒G蛋白融合基因序列委托广州艾基生物技术有限公司合成，加州鲈弹状病毒G蛋白融合基因核苷酸序列如Seq ID No.1所示，具 体如下：
ATGAAAAAAAAGGTGCTGAAGGCTCATTTAGCTGTGGTTGTGATGCTTACGACGG CAGCCCCGATTTCCAATGTTAAGGCCGGTGGCGGTGGCAGCAAGTTGATCATTGCA CCTACACTTGTTAGTCAGGCCATAGGATACCCTTTGTTCGTACCAATTCGTCTTCAA GGATGGCATGACGTTAAGTTAGACACATTGAGATGTCCTAGTTACGCATCAGAATT GAATAAAGAAGCTGCCTGGCCTCAAATCGGATTACGTCACTTGGCAGCTAAAGATC ATTACGAAGTTAAGGGTACAATCTGTCACAAGACTACTTGGGTTAAGACTTGCGAT CTTAGATGGTATGGACCAAAGTACATTACTACAAAGATTTCTTACACTCCTATCACA GGTTTGGAATGTCAACAAGCAATAGTTAAGGCATCTAAAGATGAACTTGAAACAC CATACATGCCAGAAGACAATTGTGATTGGGCTACTATCTCTGACAATGAGAAGACA TTCATTACAGTTCAGAAGTCTAATATTTTTATGGACCCATACAATATGGTCTATGTAT CTACAGTCTTGAAAGGAGGAAAGTGTGCCAGTACTGTTTGTCCTTTAGAAATGCAT GGTGGTATCTGGATTCCAAGTGAAGCACCTCGTGAAAGTTGCCAGTTGGGTTCAA GTATCACTTCACACATCAATCCTAATAATGCCTCACGTTTGATATCAGAAGAGTCAT ATCTTGTTACTGAATACCACCGTCAATTGCCATTTCTTGGTGCATGTAGAATGTCTAT GTGTGGAGAAGTTGGTATGAGATTCAAGTCAGGTGAATGGTACAAGATTGAATCAT CAGACGGTAGAGTTCTTAGTTTCCTTTCTTCAGTTCCAATGTGCGATGGTGAACTTA CAGTTTCTATCCACGATGGTTCAGCAACTTATCATAAGTTAAGTCAGGAAATCTTGG ATCTTTCAGCTCAAATCGCCTGCATATCAGAACTTCGACGTGCACGAGAGAAGAAT GCTGTCTCAAATTACCTTCTTTCTTTCTTAACTCCAAATCATGGAGGATTTGGAACA GCATATCGTGTATTGAATGGTCAACTTCAGTCATCAAAGGCTACTTATGTTCGAGTC AAGTTGGGAGCACTTTCTACTGCTACAAATTGGGGACAACTTGACGATGGAAGTG CATACTCATCTGAAGATGTAACTGGAAAGATAGTTGATGGACCTTTGTTTAATGGAA ATCGAATGGACAATGGAACATTGAGAGTTGTTCAGAATGCAATTCTTGGTCAAACA TTAGAAGATGAAGACTTGTATGAACATTCAGCCAAAGAGATTCTTCATCCTCACTT AACAGTCTTAAGTTCTAATGAGTCTGATGTATTGTCAGCATTTCGACCAGTTGGAG CACAGGGAGACATCATTCATGCTGTTGGTGAATGGGTAGGTACTGGTGTAAGTGGA TTCATACATACTATTGTATACTTAGTTATCTTATGTGGTATCATCTTGTTGTTGTACCG TTGCCTTCCATATCTTCTTAAGAAACGTAAGAGTCAATCTACAAGTCAAACAACAC CTCAAATGATTCCATTACAACAATACCAGTTTGTACCTCATCATCACCATCACCATTAA(Seq ID No.1)。
一、重组表达载体的构建：
采用质粒提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit)提取pNZ8148 质粒，将质粒分别进行，NcoI和HindIII双酶切，双酶切体系如表1所示；反应条件：37℃，4h。
表1质粒的双酶切体系
Figure BDA0003401799140000081
表2
Figure BDA0003401799140000091
将经双酶切后的质粒进行脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒(TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行回收目的条带，采用分光 光度计测定回收后质粒浓度。电泳图如图2所示，从图中可以看出，pNZ8148质粒 进行NcoI和HindIII双酶切后获得大小为3161bp的线性化质粒，表明本申请方案 成功制备了双酶切后的质粒。
利用TaKaRa公司In-Fusion试剂盒，将如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列连接至双酶切处理后的pNZ8148质粒后，50℃反应组装15min，得到pNZ8148-usp45-msrgp重组 质粒载体。
二、重组大肠杆菌的构建
将得到的重组质粒载体热激法转化MC1061感受态细胞。涂布在含30μg/mL氯 霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，获得MC1061 pNZ8148-usp45-msrgp。利 用引物pNZ8148-F(Seq ID No.6)和pNZ8148-R PCR(Seq ID No.7)鉴定，引物核 苷酸序列表如表2所示，HindIII酶切阳性质粒，并送样至广州艾基生物技术有限公 司进行测序验证。
阳性对照：将未连接msrgp片段的pNZ8148空载转入MC1061感受态细胞。
引物鉴定结果如图3-4所示，从图3中可以看出，利用引物pNZ8148-F和 pNZ8148-R鉴定重组质粒，pNZ8148、pNZ8148-msrgp、pNZ8148-usp45-msrgp PCR 预期扩增目的片段分别为281、1651、1747bp，与PCR结果大小一致，从图4中可 以看出，阳性克隆质粒pNZ8148、pNZ8148-msrgp、pNZ8148-usp45-msrgp经HindIII 酶切，其对应的线性化片段大小分别为3165、4675、4768bp，重组质粒测序结果与 预测序列一致，成功构建了乳酸菌表达质粒pNZ8148、pNZ8148-msrgp、 pNZ8148-usp45-msrgp。
三、重组乳酸乳球菌的构建
乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞的制备：将L.lactis NZ9000划线在含0.5％葡萄糖的M17琼脂培养基上，30℃静置培养过夜。挑取活化过的乳酸乳球菌单菌落于含0.5％ 葡萄糖的M17液体培养基，30℃静置培养6h。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄 糖+1％甘氨酸的M17液体培养基，30℃静置培养过夜。按1:10比例取上述培养物于含 0.5％葡萄糖+0.5M蔗糖+2％甘氨酸的M17液体培养基，继续静置培养至OD600＝0.5，4℃ 5000g离心15min弃上清。加入1体积预冷溶液(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬，4℃5000g 离心15min弃上清。加入0.5体积预冷溶液(0.25体积0.5M蔗糖+10％和0.25体积50 mM Na-EDTA(pH7.5))重悬，冰浴15min，4℃5000g离心15min弃上清。加入0.01 体积预冷溶液(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬，分装-80℃保存备用。
从MC1061pNZ8148-usp45-msrgp提取质粒pNZ8148-usp45-msrgp。取1000ng质粒与100μL乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞混匀，加入预冷的2mm电击杯中，电击参数 设置为2kV、200Ω、25uF，加入至900μL预冷的复苏液(M17+0.5％葡萄糖+0.5M蔗 糖+20mmMgCl2+2mmCaCl2)中于冰上静止5min，30℃静置培养4h。最终涂布在终浓 度为10μg/mL氯霉素的M17琼脂平板上，30℃培养36h，对应获得L.lactis NZ9000pNZ8148-usp45-msrgp。阳性克隆在终浓度为10μg/mL氯霉素的M17液体培养基 扩培后提取质粒，PCR扩增鉴定。
本发明方案制备得到的L.lactis NZ9000pNZ8148-usp45-msrgp，保藏编号为CCTCC NO：M2021448，保藏信息如下：保藏号为CCTCC NO：M2021448的重组乳酸乳球菌 已于2021年4月25日在中国典型培养物保藏中心CCTCC(地址：武汉市武汉大学)注册 保藏。后续试验例均采用本申请方案制备得到的重组菌。
四、加州鲈弹状病毒G蛋白诱导表达
将L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp于终浓度为10μg/mL氯霉素的M17液体培养基，30℃静置过夜培养，按1:10取过夜培养物于终浓度为10μg/mL氯霉素的M17 液体培养基培养至OD600＝0.5，加入总浓度为10ng/mL的Nisin 30℃诱导培养4h，4℃ 5000g离心15min弃上清，等体积的PBS洗菌体两次，收集菌体。
L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp重组菌的制备方法同L.lactis NZ9000pNZ8148-usp45-msrgp一致，区别仅在于，目的基因中不包括 “AAAAAAAAGGTGCTGAAGGCTCATTTAGCTGTGGTTGTGATGCTTACGACGGCA GCCCCGATTTCCAATGTTAAGGCCGGTGGCGGTGGCAGC”，将L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp重组菌进行诱导蛋白表达，诱导蛋白表达的方法同L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp一致。
未经密码子优化的L.lactis NZ9000pNZ8148--usp45-msrgp重组菌的制备方法同L. lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp一致，区别仅在于，目的基因中的msrgp为未经密码子优化的msrgp(QBF51718.1)，将未经密码子优化的L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp 重组菌进行诱导蛋白表达，诱导蛋白表达的方法同L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp一致。
未经密码子优化的L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp重组菌的制备方法同L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp一致，区别仅在于，msrgp为未经密码子优化的msrgp，将未经 密码子优化的L.lactis NZ9000pNZ8148-msrgp重组菌进行诱导蛋白表达，诱导蛋白表达 的方法同L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp一致。
通过Western blotting验证分析，蛋白样品经处理(将收集得到的菌体用超声波破碎 200W，每次工作时间2s，每次间隔5s，共20min)后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白带 从凝胶转移至醋酸纤维素膜上。一抗是Anti-6×His
Figure BDA0003401799140000121
抗体(HRP)(稀释浓度为1:3000)， 二抗是含带HRP标记的羊抗兔IgG(稀释浓度为1:5000)，将膜浸入新配制的显色溶液 中，当条带或斑点出现后，终止反应，拍照保存。结果如图5所示。
实验结果：从图5中可以看出，重组表达载体的目的蛋白G蛋白的分子量理论值为59.84kDa，与预期一致，Western blot检测结果表明，在预期位置出现明显的免疫印迹， 说明重组表达载体菌株成功表达了加州鲈弹状病毒G蛋白，添加usp45短肽并优化密码 子的使得表达载体表达量显著增加，经过优化密码子的蛋白表达量明显优于未经过优化 密码子的蛋白表达量，且增加短肽usp45的融合蛋白表达量，显著大于未加短肽的表达 量。
实施例2口服疫苗的制备
将实施例1中得到的L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp菌体用PBS稀释成 2×1010cfu/mL的菌液，与Essai GR 01 PR佐剂3:7混合乳化，乳化混合物与饲料1:4混 合制备成饲料投喂型口服疫苗。
试验例加州鲈弹状病毒乳酸菌载体疫苗与饲料口服免疫
加州鲈弹状病毒乳酸菌载体疫苗与饲料口服免疫及其检测步骤如下：
1、采用实施例2制备的口服疫苗进行口服免疫反应。
将准备的360尾加州鲈随机分为4个不同免疫分类组，每组30尾，每组3个平行， 共12个组，暂养稳定后进行免疫实验。4个不同免疫分类组情况为：PNZ8148-usp45-msrgp (口服疫苗PNZ8148-MSRGP)+Essai GR 01 PR(佐剂)+饲料(T1)、PNZ8148(空载 体乳酸菌)+Essai GR 01 PR(佐剂)+饲料(T2)、Essai GR 01 PR(佐剂)+饲料(T3)、 饲料(空白)，各组添加的每种物质的量均一致，连续免疫7天，免疫方式为隔周免疫， 免疫三周。
2、血清IgM抗体检测
免疫结束后分别隔两天随机选取加州鲈尾静脉采血，静置4℃过夜分离血清。采用ELISA测定血清IgM抗体水平：1:100稀释加州鲈血清，MSRGP蛋白作为固定抗原； 抗体是鼠抗加州鲈IgM抗体(1:10000稀释)、HRP标记的羊抗鼠抗体(1:5000稀释)， 使用酶标仪测定OD450的值。
实验结果如图6所示，从图中可以看出，免疫之后加州鲈的血清特异抗体水平随时间的增长逐渐升高，与对照组相比能显著提高血清特异性抗体水平，与空白载体组抗体 水平存在极显著性差异。
3、加州鲈肾脏IgM基因表达的检测
口服免疫结束后分别隔两天随机采集加州鲈肾脏检测IgM基因表达量，MagPureUniversal RNA KF Kit提取RNA，Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录。 以18S为内参基因(内参基因的荧光定量PCR的引物序列如Seq ID No.10和Seq IDNo.11 所示)，TB
Figure BDA0003401799140000131
Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)进行实时PCR。采用2-△△Ct方法， SPSS软件进行数据统计分析IgM基因与18S的相对表达量，引物见表2。
分别在免疫之后的3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d采集加州鲈肾脏做 IgM基因实时PCR(IgM基因的荧光定量PCR的引物序列如Seq ID No.8和Seq ID No.9 所示)。结果如图7所示，从图中可以看出，MSRGP抗原免疫后，肾脏中的IgM含量 逐步提高，与对照组比较差异显著(P<0.05)。
口服免疫结束后第18d采用弹状病毒对4个不同免疫分类组的加州鲈进行人工感染 实验，所用的浓度为6×104TCID50。对各组实验鱼进行腹腔注射攻毒，每尾的注射量为100μL，水温为(28±2)℃，连续14d统计各组鱼死亡情况。按照以下公式计算各组相对 免疫保护率：RPS(％)＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
实验结果如图8所示，从图中可以看出，弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗加佐剂的免疫组的相对免疫保护率为68.92％，显著高于空载体乳酸菌加佐剂组(P<0.01)，以及单 一佐剂组(P<0.01)，说明构建的弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗具有较好的口服免疫效 果。
本发明使用乳酸菌L.lactis NZ9000作为表达宿主，pNZ8148作为表达载体。乳酸菌现在已经广泛应用在食品、药物加工中，是安全级微生物。pNZ8148载体是乳酸菌表 达载体，具有最有效的食品诱导表达系统乳链菌肽诱导的基因表达系统(Nisin-ControlldExpression System，NICE)。NICE系统有高效表达细菌、病毒抗原和一些毒性蛋白的能 力，同时更具有安全性高、价格成本低、通用性等的优点。NICE系统表达诱导物Nisin， 是一种生物安全肽，对人体无毒副作用，因为进入消化道后被对应的蛋白酶作用从而失 活，所以不会影响肠道的菌群平衡，是可作为天然安全的保鲜剂应用在食品工业中，以 上使得乳酸菌能够作为食用性疫苗的传递载体。Nisin对革兰氏阳性菌有一定抑制作用， 高浓度使用可能会伤害宿主菌而导致蛋白表达量下降，通常使用亚致死剂量诱导NlCE 系统中目标蛋白的表达。在大多数的乳酸菌表达载体的研究中，常用的Nisin诱导表达 浓度为10ng/mL，诱导表达时间为4～5h，诱导表达条件与表达宿主菌株、表达载体和表 达的目的蛋白等有关，本发明使用的Nisin浓度是10ng/mL，诱导时间为4h，通过 western-blot结果分析，具有较好的表达效果。
常见鱼类的免疫方法有浸泡、注射和口服等多种方法，其中注射免疫的方式的效果 最佳，相对保护率能达到70％以上，但操作不方便，且应激等原因造成无法普遍应用各种养殖鱼类。本发明实施方式的加州鲈弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗的结果表明：口服 疫苗与佐剂和饲料同时免疫之后，加州鲈的血清特异抗体水平逐渐升高，与对照组相比 能显著提高血清特异性抗体水平，与空白组抗体水平存在极显著性差异(P<0.01)，此 外IgM基因实时PCR结果表明，口服疫苗免疫后，肾脏中的IgM含量逐步提高，与对 照组比较差异显著(P<0.05)。根据免疫过后各种加州鲈鱼的存活情况计算相对免疫保护 率，弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗加佐剂组的相对免疫保护率为68.92％，无抗原表达 的空载体加佐剂组的相对免疫保护率为9.46％，单纯佐剂组的相对免疫保护率为10.81％， 结果显示弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗的相对免疫保护率显著高于无抗原表达的空载 体组、单纯佐剂组的相对免疫保护率，这与血清抗体水平结果一致。
本发明通过加入usp45短肽和密码子优化提高加州鲈弹状病毒G蛋白的表达量，把加州鲈弹状病毒G蛋白(msrgp)抗原基因插入pNZ8148载体，加入his标签为了方便 蛋白检测分析，合成pNZ8148-usp45-msrgp-his载体，使用nisin在L.lactis NZ9000诱导 表达蛋白msrgp，制备活载体疫苗L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-msrgp，通过佐剂与饲 料，投喂加州鲈鱼，口服免疫检测免疫效果。从结果来看，弹状病毒乳酸菌载体口服疫 苗的免疫效果明显高于对照组，本研究为加州鲈弹状病毒口服疫苗的研究提供了新的思 路。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所 属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作 出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1638
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaaaa aggtgctgaa ggctcattta gctgtggttg tgatgcttac gacggcagcc 60
ccgatttcca atgttaaggc cggtggcggt ggcagcaagt tgatcattgc acctacactt 120
gttagtcagg ccataggata ccctttgttc gtaccaattc gtcttcaagg atggcatgac 180
gttaagttag acacattgag atgtcctagt tacgcatcag aattgaataa agaagctgcc 240
tggcctcaaa tcggattacg tcacttggca gctaaagatc attacgaagt taagggtaca 300
atctgtcaca agactacttg ggttaagact tgcgatctta gatggtatgg accaaagtac 360
attactacaa agatttctta cactcctatc acaggtttgg aatgtcaaca agcaatagtt 420
aaggcatcta aagatgaact tgaaacacca tacatgccag aagacaattg tgattgggct 480
actatctctg acaatgagaa gacattcatt acagttcaga agtctaatat ttttatggac 540
ccatacaata tggtctatgt atctacagtc ttgaaaggag gaaagtgtgc cagtactgtt 600
tgtcctttag aaatgcatgg tggtatctgg attccaagtg aagcacctcg tgaaagttgc 660
cagttgggtt caagtatcac ttcacacatc aatcctaata atgcctcacg tttgatatca 720
gaagagtcat atcttgttac tgaataccac cgtcaattgc catttcttgg tgcatgtaga 780
atgtctatgt gtggagaagt tggtatgaga ttcaagtcag gtgaatggta caagattgaa 840
tcatcagacg gtagagttct tagtttcctt tcttcagttc caatgtgcga tggtgaactt 900
acagtttcta tccacgatgg ttcagcaact tatcataagt taagtcagga aatcttggat 960
ctttcagctc aaatcgcctg catatcagaa cttcgacgtg cacgagagaa gaatgctgtc 1020
tcaaattacc ttctttcttt cttaactcca aatcatggag gatttggaac agcatatcgt 1080
gtattgaatg gtcaacttca gtcatcaaag gctacttatg ttcgagtcaa gttgggagca 1140
ctttctactg ctacaaattg gggacaactt gacgatggaa gtgcatactc atctgaagat 1200
gtaactggaa agatagttga tggacctttg tttaatggaa atcgaatgga caatggaaca 1260
ttgagagttg ttcagaatgc aattcttggt caaacattag aagatgaaga cttgtatgaa 1320
cattcagcca aagagattct tcatcctcac ttaacagtct taagttctaa tgagtctgat 1380
gtattgtcag catttcgacc agttggagca cagggagaca tcattcatgc tgttggtgaa 1440
tgggtaggta ctggtgtaag tggattcata catactattg tatacttagt tatcttatgt 1500
ggtatcatct tgttgttgta ccgttgcctt ccatatcttc ttaagaaacg taagagtcaa 1560
tctacaagtc aaacaacacc tcaaatgatt ccattacaac aataccagtt tgtacctcat 1620
catcaccatc accattaa 1638
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaagg tgctgaaggc tcatttagct gtggttgtga tgcttacgac ggcagccccg 60
atttccaatg ttaaggcc 78
<210> 3
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagttgatca ttgcacctac acttgttagt caggccatag gatacccttt gttcgtacca 60
attcgtcttc aaggatggca tgacgttaag ttagacacat tgagatgtcc tagttacgca 120
tcagaattga ataaagaagc tgcctggcct caaatcggat tacgtcactt ggcagctaaa 180
gatcattacg aagttaaggg tacaatctgt cacaagacta cttgggttaa gacttgcgat 240
cttagatggt atggaccaaa gtacattact acaaagattt cttacactcc tatcacaggt 300
ttggaatgtc aacaagcaat agttaaggca tctaaagatg aacttgaaac accatacatg 360
ccagaagaca attgtgattg ggctactatc tctgacaatg agaagacatt cattacagtt 420
cagaagtcta atatttttat ggacccatac aatatggtct atgtatctac agtcttgaaa 480
ggaggaaagt gtgccagtac tgtttgtcct ttagaaatgc atggtggtat ctggattcca 540
agtgaagcac ctcgtgaaag ttgccagttg ggttcaagta tcacttcaca catcaatcct 600
aataatgcct cacgtttgat atcagaagag tcatatcttg ttactgaata ccaccgtcaa 660
ttgccatttc ttggtgcatg tagaatgtct atgtgtggag aagttggtat gagattcaag 720
tcaggtgaat ggtacaagat tgaatcatca gacggtagag ttcttagttt cctttcttca 780
gttccaatgt gcgatggtga acttacagtt tctatccacg atggttcagc aacttatcat 840
aagttaagtc aggaaatctt ggatctttca gctcaaatcg cctgcatatc agaacttcga 900
cgtgcacgag agaagaatgc tgtctcaaat taccttcttt ctttcttaac tccaaatcat 960
ggaggatttg gaacagcata tcgtgtattg aatggtcaac ttcagtcatc aaaggctact 1020
tatgttcgag tcaagttggg agcactttct actgctacaa attggggaca acttgacgat 1080
ggaagtgcat actcatctga agatgtaact ggaaagatag ttgatggacc tttgtttaat 1140
ggaaatcgaa tggacaatgg aacattgaga gttgttcaga atgcaattct tggtcaaaca 1200
ttagaagatg aagacttgta tgaacattca gccaaagaga ttcttcatcc tcacttaaca 1260
gtcttaagtt ctaatgagtc tgatgtattg tcagcatttc gaccagttgg agcacaggga 1320
gacatcattc atgctgttgg tgaatgggta ggtactggtg taagtggatt catacatact 1380
attgtatact tagttatctt atgtggtatc atcttgttgt tgtaccgttg ccttccatat 1440
cttcttaaga aacgtaagag tcaatctaca agtcaaacaa cacctcaaat gattccatta 1500
caacaatacc agtttgtacc t 1521
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggcggtg gcagc 15
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcatcacc atcaccat 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtcgataac gcgagcataa taaac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagtaattgc tttatcaact gctgc 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtggttctg ggactggaga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggatttgac tgactcccgt 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggacacggaa aggattgaca g 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttcgttatc ggaattaacc agac 24

Claims (10)

1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述融合基因，其特征在于，所述融合基因包含usp45和msrgp基因。
3.根据权利要求2所述融合基因，其特征在于，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。
4.权利要求1所述的融合基因所编码的融合蛋白。
5.含有如权利要求1-3任一项所述的融合基因或权利要求4所述的融合蛋白的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，为将权利要求1所述的融合基因亚克隆至pNZ8148原核表达载体中，构建得到的。
7.根据权利要求5所述的转基因重组菌，其特征在于，该转基因重组菌为转基因重组乳酸乳球菌；优选地，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000-MSRGP，其保藏编号为CCTCC NO：M2021448。
8.含有如权利要求1-3任一项所述的融合基因、如权利要求4所述的融合蛋白或如权利要求5所述的表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌在制备预防鱼类弹状病毒制剂或疫苗中的应用。
9.一种口服疫苗，其特征在于，含有如权利要求1-3任一项所述的融合基因、如权利要求4所述的融合蛋白或如权利要求5所述的表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。
10.根据权利要求9所述的口服疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂为Essai GR 01PR佐剂。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116162637A (zh) * 2022-10-09 2023-05-26 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒和弹状病毒二联口服疫苗的应用
CN116334102A (zh) * 2022-07-29 2023-06-27 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107474142A (zh) * 2017-09-04 2017-12-15 中国动物疫病预防控制中心 促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用
CN110669710A (zh) * 2019-08-09 2020-01-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗
CN111850046A (zh) * 2020-07-06 2020-10-30 扬州大学 重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法
CN113215071A (zh) * 2021-05-26 2021-08-06 浙江理工大学 一种表达大口黑鲈弹状病毒g蛋白的重组乳酸乳球菌

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107474142A (zh) * 2017-09-04 2017-12-15 中国动物疫病预防控制中心 促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用
CN110669710A (zh) * 2019-08-09 2020-01-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗
CN111850046A (zh) * 2020-07-06 2020-10-30 扬州大学 重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法
CN113215071A (zh) * 2021-05-26 2021-08-06 浙江理工大学 一种表达大口黑鲈弹状病毒g蛋白的重组乳酸乳球菌

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张莉娟等: "弹状病毒基因组及功能基因研究进展", 《基因组学与应用生物学》 *
罗霞等: "鳜鱼传染性脾肾坏死病和弹状病毒病二联灭活疫苗毒种及种子批的研究", 《西北农林科技大学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116334102A (zh) * 2022-07-29 2023-06-27 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用
CN116334102B (zh) * 2022-07-29 2023-10-27 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用
CN116162637A (zh) * 2022-10-09 2023-05-26 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒和弹状病毒二联口服疫苗的应用

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