CN114480438A - 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用 - Google Patents

一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114480438A
CN114480438A CN202111571070.9A CN202111571070A CN114480438A CN 114480438 A CN114480438 A CN 114480438A CN 202111571070 A CN202111571070 A CN 202111571070A CN 114480438 A CN114480438 A CN 114480438A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
fusion gene
iridovirus
fusion
mcp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111571070.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480438B (zh
Inventor
赖迎迢
黄志斌
巩华
陶家发
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Original Assignee
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pearl River Fisheries Research Institute CAFS filed Critical Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority to CN202111571070.9A priority Critical patent/CN114480438B/zh
Publication of CN114480438A publication Critical patent/CN114480438A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480438B publication Critical patent/CN114480438B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用，所述融合基因中含有大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因、连接序列和标签序列。基于其制备得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000 pNZ8148‑MCP，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211160。使用该重组乳酸乳球菌制备得到的口服疫苗在免疫之后，会使大口黑鲈的血清特异抗体水平显著提高，且口服疫苗免疫后，肾脏中的IgM含量也会显著提高，相对免疫保护率可以达到60.47％，且无需注射，口服即可，操作简单，普及型和适用性强。

Description

一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫 苗的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用.
背景技术
大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)为虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员，是一种胞质型双链大DNA病毒。LMBV在两栖类、禽类等天然宿主体内，甚至鱼饵中均可以存活，存在多种传播途径，目前没有有效的治疗药物，只能靠科学饲养和及时消毒来预防。这类蛙病毒病夏季高发，发病时水温为25～30℃，会害成鱼，鱼类感染致死率高。
大口黑鲈(Micropterus Salmoides)，又名加州鲈，是一种重要的淡水养殖鱼类品种，生长速度快且对环境适应强。大口黑鲈年产量高，据统计，年产量突破约60万吨，是中国当前年产量最大的特种淡水鱼类之一，经济效益显著。但随着养殖规模不断增加，大口黑鲈病害问题也日益严重，特别是病毒类疾病，导致大口黑鲈苗种和成鱼出现大规模爆发性死亡，造成巨大的经济损失。近年来，随着研究人员先后从大口黑鲈病鱼分离到大口黑鲈虹彩病毒，证明了LMBV是引起大口黑鲈死亡的主要病原之一。而该病毒病的防治方法只有通过疫苗等免疫制品来预防。疫苗具有无残留、不易引起耐药性、安全高效等优点，作为大口黑鲈虹彩病毒病防控的重要途径，是加州鲈病害防控的发展趋势。
因此，开发一种能够有效预防或治疗大口黑鲈虹彩病毒的产品对于大口黑鲈的养殖以及大口黑鲈虹彩病毒病的防控具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用。本发明以乳酸菌L.lactis NZ9000 作为表达宿主，pNZ8148作为表达载体，通过对大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP抗原基因进行密码子优化并连接usp45短肽序列，制备得到了使用效果优异的活载体疫苗L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-mcp。该疫苗投喂大口黑鲈，口服免疫效果优异，为大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗的研究提供了新的思路。
本发明的第一个方面，提供一种大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP抗原优化基因。
大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)是决定大口黑鲈虹彩病毒毒力的主要蛋白，也是开发各种大口黑鲈虹彩病毒疫苗的关键抗原蛋白。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述优化基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。
发明人对于大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原基因做了优化，提高大口黑鲈虹彩病毒 MCP抗原基因中对应氨基酸乳酸乳球菌中高频密码子，减少低频密码子。该优化在不改变大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因序列的基础上，经过密码子优化设计，可以大幅度提高重组大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因的表达量，优化的序列与原序列的序列对比如说明书附图图1 所示。
本发明的第二个方面，提供一种融合基因，该融合基因中含有本发明第一个方面所述的大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。
在本发明的一些优选实施方式中，所述连接序列包括Usp45短肽序列。
在本发明的一些优选实施方式中，所述标签序列包括His标签。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择不加入标签序列或使用其他标签或标志物，以实现验证表达的成功与否的使用效果。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述融合基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.2所示。
本发明中的融合基因是基于密码子优化的虹彩病毒主要衣壳蛋白，加上usp45短肽序列 (标签序列仅用于验证表达的成功与否)得到的，以此得到的融合蛋白可作为大口黑鲈口服疫苗使用，通过添加口服佐剂，通过饲料投喂大口黑鲈，经感染评价、免疫保护效果评价、检测血液中抗体滴度的变化情况和荧光定量测定IgM抗体的变化情况等方法，充分验证了该口服疫苗的有效性和优异性。
本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述的融合基因所编码的融合蛋白。
本发明的第四个方面，提供含有本发明第一个方面所述优化基因、本发明第二个方面所述的融合基因或本发明第三个方面所述的融合蛋白的产品。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括重组表达载体、表达盒或转基因细胞系。
在本发明的一些优选实施方式中，所述载体为pNZ8148。
pNZ8148载体是乳酸菌表达载体，其具有最有效的食品诱导表达系统，即乳链菌肽诱导的基因表达系统(Nisin-Controlld Expression System，NICE)。NICE系统有高效表达细菌、病毒抗原和一些毒性蛋白的能力，同时更具有安全性高、价格成本低、通用性等的优点。而且， NICE系统表达诱导物Nisin，是一种生物安全肽,对人体无毒副作用，其进入消化道后被对应的蛋白酶作用从而失活，所以不会影响肠道的菌群平衡，是可作为天然安全的保鲜剂应用在食品工业中。以上优势使得乳酸菌能够作为食用性疫苗的传递载体。
而且，表达诱导物Nisin对革兰氏阳性菌有一定抑制作用，高浓度使用可能会伤害宿主菌而导致蛋白表达量下降，通常使用亚致死剂量诱导NlCE系统中目标蛋白的表达。在本发明中，使用的Nisin浓度是10ng/mL，诱导时间为4h，通过western-blot结果分析，具有较好的表达效果。
本发明的第五个方面，提供一种转基因重组菌，该转基因重组菌含有下述(1)～(3)中的至少一种：
(1)本发明第一个方面所述优化基因；
(2)本发明第二个方面所述的融合基因；
(3)本发明第三个方面所述的融合蛋白。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述转基因重组菌为转基因重组乳酸乳球菌。
乳酸菌是人、动物和鱼的肠道微生物组成成分，为普遍公认的安全菌株，应用于食品工业中，作为表达系统的宿主菌相比其他微生物有天然优势。
在本发明的一些优选实施方式中，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactisNZ9000 pNZ8148-MCP，于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址位于：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M20211160。
本发明以人和动物无致病性且被公认为安全的食品级微生物——乳酸乳球菌作为宿主菌，基于该重组乳酸乳球菌制备得到的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗，对于大口黑鲈的消费者(如人类)来说是安全的。而且，基于该重组乳酸乳球菌制备的口服疫苗制备过程简单，仅需经过简单的菌培养和菌体分离、重悬操作即可得到有效的口服疫苗，通过添加口服佐剂并通过饲料投喂免疫大口黑鲈，非常适合于大口黑鲈鱼苗和成鱼的养殖实践应用，能够极大地减少疫苗免疫的工作量，提高养殖户使用疫苗的便利程度。
本发明的第六个方面，提供下述(1)～(5)任一项在制备预防鱼类虹彩病毒产品中的应用；
(1)本发明第一个方面所述优化基因；
(2)本发明第二个方面所述的融合基因；
(3)本发明第三个方面所述的融合蛋白
(4)本发明第四个方面所述的产品；
(5)本发明第五个方面所述的转基因重组菌。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括疫苗。
本发明的第七个方面，提供一种口服疫苗，该口服疫苗含有下述(1)～(5)中的一种或多种：
(1)本发明第一个方面所述优化基因；
(2)本发明第二个方面所述的融合基因；
(3)本发明第三个方面所述的融合蛋白
(4)本发明第四个方面所述的产品；
(5)本发明第五个方面所述的转基因重组菌。
常见鱼类的免疫方法有浸泡、注射和口服等多种方法，其中注射免疫的方式的效果最佳，相对保护率能达到70％以上，但操作不方便，且存在应激等原因造成无法普遍应用各种养殖鱼类。相较于注射免疫的免疫方式，口服疫苗免疫使用更为方便，具有不受养殖时间、地点和鱼体的大小的限制，对鱼体无损伤、避免产生应激等优点，而且特别适合大口黑鲈这种苗种阶段无法注射疫苗的鱼种使用。
在本发明中，通过试验验证发现，本发明实施例中的大口黑鲈虹彩病毒乳酸菌载体口服疫苗在免疫之后，会使大口黑鲈的血清特异抗体水平逐渐升高。且口服疫苗免疫后，肾脏中的IgM含量也会逐步提高。根据免疫过后各组大口黑鲈的存活情况计算相对免疫保护率，发现本发明中的虹彩病毒乳酸菌载体口服疫苗的相对免疫保护率为60.47％，无抗原表达的空载体疫苗的相对免疫保护率为11.63％，单纯佐剂组的相对免疫保护率为6.98％，本发明中的虹彩病毒乳酸菌载体口服疫苗的相对免疫保护率显著高于其他各组，与血清抗体水平结果一致。
根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述疫苗还包括佐剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述佐剂为Essai GR 01PR。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的免疫佐剂用于制备适合使用的疫苗。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供了一种大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因，该优化在不改变大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因序列的基础上，经过密码子优化设计，可以大幅度提高重组大口黑鲈虹彩病毒MCP基因的表达量。
2.本发明提供了一种融合基因，基于该融合基因得到的融合蛋白可作为大口黑鲈口服疫苗使用，通过添加口服佐剂，通过饲料投喂大口黑鲈，经感染评价、免疫保护效果评价、检测血液中抗体滴度的变化情况和荧光定量测定IgM抗体的变化情况等方法，充分验证了该口服疫苗的有效性和优异性。
3.本发明实施例中的大口黑鲈虹彩病毒乳酸菌载体制备得到的口服疫苗在免疫之后，会使大口黑鲈的血清特异抗体水平显著提高，且口服疫苗免疫后，肾脏中的IgM含量也会显著提高，相对免疫保护率可以达到60.47％，且无需注射，口服即可，操作简单，普及型和适用性强。
附图说明
图1为本发明实施例中的大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原优化序列与原序列的序列对比结果图。
图2为本发明实施例中进行双酶酶切前后的pNZ8148质粒电泳图。
图3为本发明实施例中不同质粒的PCR鉴定结果(电泳图)，其中，M为DNA maker，泳道1为空白对照，2为pNZ8148空质粒，3～7均为pNZ8148-usp45-mcp。
图4为本发明实施例中不同质粒经酶切后电泳图，其中，M为DNA maker，泳道1为pNZ8148空质粒，2为pNZ8148-usp45-mcp。
图5为不同质粒的诱导表达蛋白MCP Western blot的检测分析，A为使用优化序列的含有和不含有Usp45短肽的pNZ8148质粒载体的对比(M为Marker)，B为未使用优化序列的含有和不含有Usp45短肽的pNZ8148质粒，pNZ8148空质粒作为对照(M为Marker)。
图6为不同免疫组的大口黑鲈血清ELISA抗体检测结果。
图7为不同免疫组的大口黑鲈肾脏实时PCR对IgM基因的分析结果。
图8为不同免疫组的大口黑鲈相对免疫保护率对比图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
试剂与材料
下述实施例中所使用的大口黑鲈均为来自广东省水产良种场的健康大口黑鲈(体长 8.5±0.7cm，体重15.3±2.5g)。
大口黑鲈虹彩病毒、pNZ8148质粒、HRP标记的羊抗鼠抗体、鼠抗草鱼IgM抗体均为中国水产科学研究院珠江水产研究所水产病害与免疫实验室保存。
乳酸乳球菌NZ9000(L.lactisNZ9000)、感受态大肠杆菌MC1061购自REBIO。
TaKaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit、TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit、TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit、In-Fusion试剂盒、Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB
Figure RE-GDA0003562504620000061
Premix ExTaqTMII(TliRNaseH Plus)、 PCR相关实验耗材购自takara。
MagPure Universal RNA KF Kit购自Magen。
Anti-6×His
Figure RE-GDA0003562504620000062
抗体(HRP)(ab1187)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体、TMB显色液等Western blot相关耗材购自广州勤卓生物科技有限公司。
BHI培养基、M17培养基、Nisin、氯霉素购买于广州市康龙生物科技有限公司。
Essai GR 01PR购买自SEPPIC公司。
大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因的优化
对大口黑鲈虹彩病毒G蛋白基因进行优化，提高大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因中对应氨基酸乳酸乳球菌中高频密码子，减少低频密码子。该优化在不改变大口黑鲈虹彩病毒 MCP抗原基因序列的基础上，经过密码子优化设计，可以大幅度提高重组大口黑鲈虹彩病毒 MCP基因的表达量，优化序列与原序列的序列对比结果图如图1所示。
将经密码子优化得到的大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原融合基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原融合基因核苷酸序列如S EQ ID NO.1所示，具体如下：5’-TCATCAGTAACAGGTTCAGGAATTACCTCTGGATTTAT TGATCTCGCGACCTATGATAGTTTAGATAAAGCCCTTTATGGTGGAAAAGATGCGACTAC TTATTTTGTTAAAGAACATTATCCAGTAGGTTGGTTTACAAAGTTACCAACTGCAGCAAC AAAAACTTCCGGAACACCGGCGTTCGGTCAACATTTTTCTGTGGGCGTTCCAAGGTCGG GGGATTATGTTTTAAATAGTTGGCTTGTTTTAAAGACTCCTCAAATTAAACTTCTTGCTGC TAATCAATTCAATAATGATGGGACAATTCGTTGGACTAAGAACTTAATGCACAATGTTGT TGAACACGCAGCACTGTCATTCAACGAAATTCAGGCTCAACAATTTAATACTGCTTTTTT GGATGCTTGGAATGAATATACAATGCCAGAAGCAAAACGAATCGGTTACTACAATATGAT TGGCAACACAAGTGACCTTGTGAATCCCGCTCCAGCAACCGGACAAGCTGGAGCTCGT GTTTTGCCAGCTAAAAACTTAGTTCTACCTTTACCTTTTTTCTTTGGTAGAGACTCTGGGC TTGCGCTACCGACCGTCACGCTCCCTTATAATGAAATCCGGATAACAATCAGCTTACGCT CAATTCAAGATTTGTTGATTCTTCAACACAAAACAACAGGTGAAGTGAAACCAATTGTT GCCACGGATTTAGAAGGAGGACTTCCGGATACAGTAGAGGCTCATGTTTATATGACAGTT GGATTGGTCACCGCAGCTGAACGTCAAGCAATGTCTAGTTCAGTTCGTGATATGGTAGTT GAACAAATGCAAATGGCACCTGTTCATATGGTTAACCCCAAAAATGCCACTGTTTTTCAT GCTGACTTAAGATTTAGTCATGCAGTCAAAGCATTGATGTTTATGGTTCAAAATGTAACT CATAAATCTGTTGGTTCAAATTATACTTGTGTCACGCCAGTTGTGGGGGCAGGAAATACT GTCCTTGAACCTGCTTTAGCTGTTGATCCAGTAAAATCAGCATCACTAGTATATGAAAATA CAACTCGACTTCCTGATATGAGCGTAGAATACTACTCTCTCGTCCAGCCTTGGTATTATGC CCCTGCAATTCCAATTAGTACAGGTCATCATTTATATTCTTATGCACTATCATTGAATGACC CACATCCATCTGGAAGCACGAATTTTGGACGTTTGACAAATGCTTCCATTAATGTGAGTCTTTCTGCTGAGGCGGGAACTGCCGCTGGTGGCGGAGGGGCTGATAATTCAGGTTATAAA AATCCACAAAAATATGCTCTCGTAGTCATGGCCATAAACCATAATATTATCAGAATTATGA ATGGTTCAATGGGTTTTCCTATTTTA-3’(SEQ ID NO.1)。
其中，在SEQ ID NO.1所示序列的5’端还连接有Usp45短肽序列，3’端连接有His标签。连接后的核苷酸序列为：5’-ATGAAAAAAAAGGTGCTGAAGGCTCATTTAGCTGTGGTTGT GATGCTTACGACGGCAGCCCCGATTTCCAATGTTAAGGCCGGTGGCGGTGGCAGCTCAT CAGTAACAGGTTCAGGAATTACCTCTGGATTTATTGATCTCGCGACCTATGATAGTTTAGA TAAAGCCCTTTATGGTGGAAAAGATGCGACTACTTATTTTGTTAAAGAACATTATCCAGT AGGTTGGTTTACAAAGTTACCAACTGCAGCAACAAAAACTTCCGGAACACCGGCGTTC GGTCAACATTTTTCTGTGGGCGTTCCAAGGTCGGGGGATTATGTTTTAAATAGTTGGCTT GTTTTAAAGACTCCTCAAATTAAACTTCTTGCTGCTAATCAATTCAATAATGATGGGACAA TTCGTTGGACTAAGAACTTAATGCACAATGTTGTTGAACACGCAGCACTGTCATTCAAC GAAATTCAGGCTCAACAATTTAATACTGCTTTTTTGGATGCTTGGAATGAATATACAATGC CAGAAGCAAAACGAATCGGTTACTACAATATGATTGGCAACACAAGTGACCTTGTGAAT CCCGCTCCAGCAACCGGACAAGCTGGAGCTCGTGTTTTGCCAGCTAAAAACTTAGTTCT ACCTTTACCTTTTTTCTTTGGTAGAGACTCTGGGCTTGCGCTACCGACCGTCACGCTCCC TTATAATGAAATCCGGATAACAATCAGCTTACGCTCAATTCAAGATTTGTTGATTCTTCAA CACAAAACAACAGGTGAAGTGAAACCAATTGTTGCCACGGATTTAGAAGGAGGACTTC CGGATACAGTAGAGGCTCATGTTTATATGACAGTTGGATTGGTCACCGCAGCTGAACGTC AAGCAATGTCTAGTTCAGTTCGTGATATGGTAGTTGAACAAATGCAAATGGCACCTGTTC ATATGGTTAACCCCAAAAATGCCACTGTTTTTCATGCTGACTTAAGATTTAGTCATGCAGT CAAAGCATTGATGTTTATGGTTCAAAATGTAACTCATAAATCTGTTGGTTCAAATTATACT TGTGTCACGCCAGTTGTGGGGGCAGGAAATACTGTCCTTGAACCTGCTTTAGCTGTTGA TCCAGTAAAATCAGCATCACTAGTATATGAAAATACAACTCGACTTCCTGATATGAGCGT AGAATACTACTCTCTCGTCCAGCCTTGGTATTATGCCCCTGCAATTCCAATTAGTACAGGT CATCATTTATATTCTTATGCACTATCATTGAATGACCCACATCCATCTGGAAGCACGAATTT TGGACGTTTGACAAATGCTTCCATTAATGTGAGTCTTTCTGCTGAGGCGGGAACTGCCG CTGGTGGCGGAGGGGCTGATAATTCAGGTTATAAAAATCCACAAAAATATGCTCTCGTAG TCATGGCCATAAACCATAATATTATCAGAATTATGAATGGTTCAATGGGTTTTCCTATTTTA CATCATCACCATCACCATTAA-3’(SEQ ID NO.2)。
大口黑鲈虹彩病毒重组表达载体的构建
pNZ8148质粒在含有30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中37℃，180r·min-1过夜扩大培养，然后采用质粒提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit)提取pNZ8148质粒，将质粒分别进行，NcoI和HindIII双酶切，双酶切体系如表1所示。反应条件：37℃， 4h。
表1质粒的双酶切体系
pNZ8148 3μL
Cut Smart 2μL
NcoI 0.5μL
HindIII 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 14μL
总计 20μL
将经双酶切后的质粒进行脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒(TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行回收目的条带，采用分光光度计测定回收后质粒浓度。电泳图如图2所示。从图中可以看出，pNZ8148质粒进行NcoI和HindIII双酶切后获得大小为3161bp的线性化质粒，表明上述实施例成功制备了双酶切后的质粒。
然后利用TaKaRa公司In-Fusion试剂盒，将SEQ ID NO.2所示序列连接双酶切处理的pNZ8148，使用50℃反应组装15min，热激法将得到的质粒转化MC1061感受态细胞。将转化完成的MC1061感受态细胞涂布在含30μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，获得MC1061 pNZ8148-usp45-mcp。利用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R对MC1061 pNZ8148-usp45-mcp进行PCR鉴定(以空质粒pNZ8148作为空白对照)，HindIII酶切阳性质粒，并送样至广州艾基生物技术有限公司进行测序验证。
pNZ8148-F和pNZ8148-R的核苷酸序列为：
pNZ8148-F：5’-TGTCGATAACGCGAGCATAATAAAC-3’(SEQ ID NO.3)；
pNZ8148-R：5’-CAGTAATTGCTTTATCAACTGCTGC-3’(SEQ ID NO.4)。
PCR鉴定结果如图3所示。
空质粒pNZ8148、上述实施例pNZ8148-usp45-mcp的PCR预期扩增目的片段分别为281、 1747bp，与PCR结果大小一致。
如图4所示，空质粒pNZ8148、上述实施例pNZ8148-usp45-mcp经HindIII酶切后，其对应的线性化片段大小分别为3165、4633bp，符合预期结果。
测序后，重组质粒测序结果与预测序列一致。
上述结果均能够说明成功构建了含有重组表达质粒pNZ8148-usp45-mcp的重组大肠杆菌。
重组乳酸乳球菌的构建
(1)乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞的制备：
将L.lactis NZ9000划线在含0.5％葡萄糖的M17琼脂培养基上，30℃静置培养过夜。挑取活化过的乳酸乳球菌单菌落于含0.5％葡萄糖的M17液体培养基，30℃静置培养6h。按 1:10比例(v/v)取上述培养物于含0.5％葡萄糖+1％甘氨酸的M17液体培养基，30℃静置培养过夜。按1:10(v/v)比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+0.5M蔗糖+2％甘氨酸的M17液体培养基，继续静置培养至OD 600＝0.5，4℃5000g离心15min弃上清。加入1体积份的预冷溶液(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬，4℃5000g离心15min弃上清。加入0.5体积份的预冷溶液(0.25体积份0.5M蔗糖+0.25体积10％的50mM Na-EDTA(pH 7.5))重悬，冰浴 15min，4℃5000g离心15min弃上清。加入0.01体积份预冷溶液(0.5M蔗糖+10％甘油) 重悬，分装-80℃保存备用。
(2)重组乳酸乳球菌的构建：
从上述实施例中得到的重组大肠杆菌(MC1061 pNZ8148-usp45-mcp)中提取质粒。具体操作为：取1000ng质粒pNZ8148-usp45-mcp与100μL上述实施例制得的乳酸乳球菌NZ9000 感受态细胞混匀，加入至预冷的2mm电击杯中，电击参数设置为2kV、200Ω、25μF。补充预冷的复苏液(M17+0.5％葡萄糖+0.5M蔗糖+20mm MgCl2+2mm CaCl2)至900uL，置于冰上静止5min。30℃静置培养4h。最终涂布在终浓度为10μg/mL氯霉素的M17琼脂平板上，30℃培养36h，对应获得L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-mcp。阳性克隆在含有终浓度为10μg/mL氯霉素的M17液体培养基上扩培后提取质粒，PCR扩增鉴定。
质粒确认无误后，采用与上述实施例中大肠杆菌转化同样的方法转化乳酸乳球菌NZ9000 (L.lactis NZ9000)，即得重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-mcp。
本实施例中制备得到的L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-mcp(命名为Lactococcus lactis NZ9000 pNZ8148-MCP，于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址位于：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M20211160。下述实施例中均采用该重组菌作为试验对象。
重组乳酸乳球菌蛋白的表达和Western blot分析
将上述实施例中制得的L.lactisNZ9000pNZ8148-usp45-mcp接种至含有终浓度为10μg/mL氯霉素的M17液体培养基中30℃静置过夜培养。按1:10的比例(v/v)取过夜培养物于含有终浓度为10μg/mL氯霉素的M17液体培养基中培养至OD600＝0.5，加入终浓度为10ng/mL的Nisin，30℃诱导培养4h，4℃5000g离心15min弃上清，使用等体积的PBS洗菌体两次，用超声波破碎(200W，每次工作时间2s，每次间隔5s，共20min)，得到蛋白样品。
对获得的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白带从凝胶转移至醋酸纤维素膜上。一抗是Anti-6×His
Figure RE-GDA0003562504620000101
抗体(HRP)(稀释浓度为1:3000)，二抗是含带HRP标记的羊抗兔IgG(稀释浓度为1:5000)，将膜浸入新配制的显色溶液中，当条带或斑点出现后，终止反应，拍照保存。结果如图5所示。
从图5中可以看出，重组表达载体的目的蛋白MCP蛋白的分子量理论值为54.89kDa。 Western blot检测结果表明，在预期位置出现明显的免疫印迹，说明含有重组表达载体的重组乳酸乳球菌表达了大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP，而且添加了Usp45短肽并优化密码子的使得表达载体表达量显著增加，经过优化密码子的MCP蛋白表达量明显优于未经过优化密码子的蛋白表达量，且增加Usp45短肽的融合蛋白表达量，显著大于未加短肽的表达量。
口服疫苗的制备
将上述实施例中制得的L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-mcp菌体用PBS稀释成2×1010cfu/mL的菌液，与Essai GR 01PR佐剂3:7(v/v)混合乳化，乳化混合物与饲料以1:4的质量比(实际投入为25g乳化混合物与100g饲料混合)混合制备成饲料投喂型口服疫苗。
大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗的使用效果
将上述实施例中制备得到的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗进行实际使用测试，具体步骤如下：
随机挑选360尾健康大口黑鲈，随机分为4个不同免疫分类组，每组90尾，每组3个平行，每个平行30尾。暂养稳定后进行免疫实验。
4个不同免疫分类组情况为：
第一组：上述实施例中制备得到的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗(MCP+Essai GR01PR组)；
第二组：以L.lactis NZ9000 pNZ8148(空载体乳酸菌)采用与上述实施例同样方法制备的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗(pNZ8148+Essai GR 01PR组)；
第三组：不含任何载体，采用与上述实施例同样方法制备的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗 (Essai GR 01PR组)；
第四组：仅含有等量饲料(control组)。
连续饲喂免疫7天，免疫方式为隔周免疫。
免疫结束后从各组中随机选取大口黑鲈静脉采血，静置4℃过夜分离血清。采用ELISA 法测定血清IgM抗体水平，具体检测步骤为：1:100稀释采集的大口黑鲈血清，以虹彩病毒 MCP蛋白作为固定抗原，一抗为鼠抗草鱼IgM抗体(1:10000稀释)，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体(1:5000稀释)，使用酶标仪测定OD450的值。
实验结果如图6所示。
可以发现，使用上述实施例中的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗免疫之后的大口黑鲈血清特异抗体水平逐渐升高，与pNZ8148+Essai GR 01PR组和Essai GR 01PR组相比能显著提高血清特异性抗体水平，与control组抗体水平存在极显著性差异(P<0.01)。
进一步检测使用上述实施例中的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗免疫之后的大口黑鲈肾脏 IgM基因表达情况。
具体步骤为：免疫结束后，分别每隔两天(免疫之后的第3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d和19d)从各组中随机采集大口黑鲈肾脏，使用MagPure Universal RNA KF Kit提取RNA，Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录RNA，得到cDNA。以cDNA为模板，18S为内参基因，使用TB
Figure RE-GDA0003562504620000112
Premix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)进行实时PCR。
其中，所用引物及其信息如表2所示。
表2 IgM和18S检测引物
Figure RE-GDA0003562504620000111
Figure RE-GDA0003562504620000121
采用2-△△Ct方法，SPSS软件进行数据统计分析IgM基因与18S的相对表达量。
结果如图7所示。
可以发现，采用上述实施例中的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗免疫后，大口黑鲈肾脏中的 IgM含量逐步提高，30d后抗体水平达到最高，与另外三组比较，存在显著差异(P<0.05)。
为了进一步体现上述实施例中的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗的免疫保护效果，发明人在免疫结束后第21d对各组采用虹彩病毒进行人工感染实验，所用的虹彩病毒病毒浓度为3×107 TCID50。对各组实验鱼进行腹腔注射攻毒，每尾的注射量为100μL，试验水温为(28±2)℃，连续14d统计各组的大口黑鲈死亡情况。
按照以下公式计算各组相对免疫保护率(RPS)：
Figure RE-GDA0003562504620000122
其中，免疫组为MCP+Essai GR 01PR组、pNZ8148+Essai GR 01PR组或Essai GR01PR 组；
空白组为control组。
结果如图8所示。
可以发现，在免疫结束后第21d攻毒后，MCP+Essai GR 01PR组的相对免疫保护率为 60.47％，显著高于pNZ8148+Essai GR 01PR组(P<0.01)和Essai GR 01PR组(P<0.01)，说明上述实施例构建得到的大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗具有较好的口服免疫效果。
综上所述，本发明实施例中使用乳酸菌L.lactis NZ9000作为表达宿主，pNZ8148作为表达载体，通过对大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp抗原基因进行密码子优化并连接usp45 短肽序列，制备得到了使用效果优异的活载体疫苗L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45-mcp，通过佐剂与饲料，投喂大口黑鲈，实现口服免疫。其口服免疫效果优异，为大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗的研究提供了新的思路。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> MCP
<400> 1
tcatcagtaa caggttcagg aattacctct ggatttattg atctcgcgac ctatgatagt 60
ttagataaag ccctttatgg tggaaaagat gcgactactt attttgttaa agaacattat 120
ccagtaggtt ggtttacaaa gttaccaact gcagcaacaa aaacttccgg aacaccggcg 180
ttcggtcaac atttttctgt gggcgttcca aggtcggggg attatgtttt aaatagttgg 240
cttgttttaa agactcctca aattaaactt cttgctgcta atcaattcaa taatgatggg 300
acaattcgtt ggactaagaa cttaatgcac aatgttgttg aacacgcagc actgtcattc 360
aacgaaattc aggctcaaca atttaatact gcttttttgg atgcttggaa tgaatataca 420
atgccagaag caaaacgaat cggttactac aatatgattg gcaacacaag tgaccttgtg 480
aatcccgctc cagcaaccgg acaagctgga gctcgtgttt tgccagctaa aaacttagtt 540
ctacctttac cttttttctt tggtagagac tctgggcttg cgctaccgac cgtcacgctc 600
ccttataatg aaatccggat aacaatcagc ttacgctcaa ttcaagattt gttgattctt 660
caacacaaaa caacaggtga agtgaaacca attgttgcca cggatttaga aggaggactt 720
ccggatacag tagaggctca tgtttatatg acagttggat tggtcaccgc agctgaacgt 780
caagcaatgt ctagttcagt tcgtgatatg gtagttgaac aaatgcaaat ggcacctgtt 840
catatggtta accccaaaaa tgccactgtt tttcatgctg acttaagatt tagtcatgca 900
gtcaaagcat tgatgtttat ggttcaaaat gtaactcata aatctgttgg ttcaaattat 960
acttgtgtca cgccagttgt gggggcagga aatactgtcc ttgaacctgc tttagctgtt 1020
gatccagtaa aatcagcatc actagtatat gaaaatacaa ctcgacttcc tgatatgagc 1080
gtagaatact actctctcgt ccagccttgg tattatgccc ctgcaattcc aattagtaca 1140
ggtcatcatt tatattctta tgcactatca ttgaatgacc cacatccatc tggaagcacg 1200
aattttggac gtttgacaaa tgcttccatt aatgtgagtc tttctgctga ggcgggaact 1260
gccgctggtg gcggaggggc tgataattca ggttataaaa atccacaaaa atatgctctc 1320
gtagtcatgg ccataaacca taatattatc agaattatga atggttcaat gggttttcct 1380
atttta 1386
<210> 2
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaaaaaa aggtgctgaa ggctcattta gctgtggttg tgatgcttac gacggcagcc 60
ccgatttcca atgttaaggc cggtggcggt ggcagctcat cagtaacagg ttcaggaatt 120
acctctggat ttattgatct cgcgacctat gatagtttag ataaagccct ttatggtgga 180
aaagatgcga ctacttattt tgttaaagaa cattatccag taggttggtt tacaaagtta 240
ccaactgcag caacaaaaac ttccggaaca ccggcgttcg gtcaacattt ttctgtgggc 300
gttccaaggt cgggggatta tgttttaaat agttggcttg ttttaaagac tcctcaaatt 360
aaacttcttg ctgctaatca attcaataat gatgggacaa ttcgttggac taagaactta 420
atgcacaatg ttgttgaaca cgcagcactg tcattcaacg aaattcaggc tcaacaattt 480
aatactgctt ttttggatgc ttggaatgaa tatacaatgc cagaagcaaa acgaatcggt 540
tactacaata tgattggcaa cacaagtgac cttgtgaatc ccgctccagc aaccggacaa 600
gctggagctc gtgttttgcc agctaaaaac ttagttctac ctttaccttt tttctttggt 660
agagactctg ggcttgcgct accgaccgtc acgctccctt ataatgaaat ccggataaca 720
atcagcttac gctcaattca agatttgttg attcttcaac acaaaacaac aggtgaagtg 780
aaaccaattg ttgccacgga tttagaagga ggacttccgg atacagtaga ggctcatgtt 840
tatatgacag ttggattggt caccgcagct gaacgtcaag caatgtctag ttcagttcgt 900
gatatggtag ttgaacaaat gcaaatggca cctgttcata tggttaaccc caaaaatgcc 960
actgtttttc atgctgactt aagatttagt catgcagtca aagcattgat gtttatggtt 1020
caaaatgtaa ctcataaatc tgttggttca aattatactt gtgtcacgcc agttgtgggg 1080
gcaggaaata ctgtccttga acctgcttta gctgttgatc cagtaaaatc agcatcacta 1140
gtatatgaaa atacaactcg acttcctgat atgagcgtag aatactactc tctcgtccag 1200
ccttggtatt atgcccctgc aattccaatt agtacaggtc atcatttata ttcttatgca 1260
ctatcattga atgacccaca tccatctgga agcacgaatt ttggacgttt gacaaatgct 1320
tccattaatg tgagtctttc tgctgaggcg ggaactgccg ctggtggcgg aggggctgat 1380
aattcaggtt ataaaaatcc acaaaaatat gctctcgtag tcatggccat aaaccataat 1440
attatcagaa ttatgaatgg ttcaatgggt tttcctattt tacatcatca ccatcaccat 1500
taa 1503
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtcgataac gcgagcataa taaac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagtaattgc tttatcaact gctgc 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtggttctg ggactggaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggatttgac tgactcccgt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggacacggaa aggattgaca g 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gttcgttatc ggaattaacc agac 24

Claims (10)

1.一种大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因，其特征在于，所述优化基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因中含有权利要求1中所述的大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因。
3.根据权利要求2所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。
4.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于，所述连接序列包括Usp45短肽序列；所述标签序列包括His标签；所述融合基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。
5.权利要求4所述的融合基因所编码的融合蛋白。
6.含有如权利要求1所述优化基因、权利要求2-4任一项所述的融合基因或权利要求5所述的融合蛋白的产品；
所述产品优选包括重组表达载体、表达盒或转基因细胞系。
7.一种转基因重组菌，其特征在于，所述转基因重组菌含有权利要求1所述优化基因、权利要求2-4任一项所述的融合基因或权利要求5所述的融合蛋白中的至少一种；所述转基因重组菌优选为转基因重组乳酸乳球菌；所述重组乳酸乳球菌优选为LactococcuslactisNZ9000 pNZ8148-MCP，于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211160。
8.下述(1)～(5)任一项在制备预防鱼类虹彩病毒的产品中的应用；
(1)权利要求1所述优化基因；
(2)权利要求2-4任一项所述的融合基因；
(3)权利要求5所述的融合蛋白；
(4)权利要求6所述的产品；
(5)权利要求7所述的转基因重组菌；
所述产品包括疫苗。
9.一种口服疫苗，其特征在于，所述口服疫苗含有下述(1)～(5)中的一种或多种；
(1)权利要求1所述优化基因；
(2)权利要求2-4任一项所述的融合基因；
(3)权利要求5所述的融合蛋白；
(4)权利要求6所述的产品；
(5)权利要求7所述的转基因重组菌。
10.根据权利要求9所述的口服疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂优选为Essai GR 01PR。
CN202111571070.9A 2021-12-21 2021-12-21 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用 Active CN114480438B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111571070.9A CN114480438B (zh) 2021-12-21 2021-12-21 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111571070.9A CN114480438B (zh) 2021-12-21 2021-12-21 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480438A true CN114480438A (zh) 2022-05-13
CN114480438B CN114480438B (zh) 2022-09-06

Family

ID=81494694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111571070.9A Active CN114480438B (zh) 2021-12-21 2021-12-21 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480438B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116144525A (zh) * 2022-09-15 2023-05-23 华南农业大学 一株海水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株及其用途
CN116162637A (zh) * 2022-10-09 2023-05-26 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒和弹状病毒二联口服疫苗的应用
CN116334102A (zh) * 2022-07-29 2023-06-27 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用
CN116731203A (zh) * 2023-05-09 2023-09-12 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合表达gcrv vp4和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690584A (zh) * 2020-06-16 2020-09-22 中国水产科学研究院珠江水产研究所 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690584A (zh) * 2020-06-16 2020-09-22 中国水产科学研究院珠江水产研究所 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUY HOA HOANG ET AL.: "Interleukin 34 serves as a novel molecular adjuvant against Nocardia Seriolae infection in largemouth bass(Micropterus Salmoides)", 《VACCINES(BASEL)》 *
马冬梅等: "大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立", 《中国水产科学》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116334102A (zh) * 2022-07-29 2023-06-27 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用
CN116334102B (zh) * 2022-07-29 2023-10-27 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用
CN116144525A (zh) * 2022-09-15 2023-05-23 华南农业大学 一株海水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株及其用途
CN116144525B (zh) * 2022-09-15 2024-03-29 华南农业大学 一株海水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株及其用途
CN116162637A (zh) * 2022-10-09 2023-05-26 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒和弹状病毒二联口服疫苗的应用
CN116731203A (zh) * 2023-05-09 2023-09-12 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合表达gcrv vp4和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用
CN116731203B (zh) * 2023-05-09 2023-12-19 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种融合表达gcrv vp4和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480438B (zh) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114480438B (zh) 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用
CN106282216B (zh) 一种重组长效鸡干扰素α的制备方法
CN107653260B (zh) 一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用
JP6113306B2 (ja) 抗マイコプラズマ属菌種サブユニットワクチン
CN114621970B (zh) 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用
Anuradha et al. Live recombinant Lactococcus lactis vaccine expressing aerolysin genes D1 and D4 for protection against Aeromonas hydrophila in tilapia (Oreochromis niloticus)
EP2560985B1 (en) Nucleic acid sequences of a fish virus and the use thereof
WO2021208913A1 (zh) 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用
CN115725002B (zh) 一种大肠杆菌特异性抗原融合蛋白及其重组乳酸乳球菌
CN111690584A (zh) 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗
CN114908029B (zh) 一种ii型草鱼呼肠孤病毒vp6重组乳酸菌的构建和应用
CN114015698B (zh) 一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用
CN109568572A (zh) 一种气单胞菌多价dna疫苗的制备方法及其应用
CN110669710B (zh) 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗
CN116162637A (zh) 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒和弹状病毒二联口服疫苗的应用
CN116003537B (zh) 一种弹状病毒重组g蛋白、包括其的重组细胞及其应用
CN116478953A (zh) 鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用
CN114058634B (zh) 一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗
CN112402598A (zh) 针对鸭疫里默氏杆菌感染引起的通用型亚单位疫苗
WO2013102492A1 (en) Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, dna fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application
WO2019084833A1 (zh) 防治家禽滑膜霉浆菌感染的组合物
CN105602981B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用
CN109735477B (zh) 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用
CN116334102B (zh) 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用
CN107245105B (zh) HN-VP233-221aa融合蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant