CN116731203A - 一种融合表达gcrv vp4和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用 - Google Patents

一种融合表达gcrv vp4和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种融合表达GCRV VP4和LTB的重组乳酸菌及其制备方法与应用。本发明提供了一种融合蛋白，包含GCRV VP4蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白；通过大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白可以进一步提升VP4蛋白被肠黏膜免疫组织抗原呈递细胞直接识别并呈递抗原，激活先天性免疫Toll样受体信号转导，提高免疫相关基因(IFNα、TLR3、TLR5、MyD88、NF‑κB、Mx、IRF3、IRF7、MHCII、IL‑1β和/或IL‑8基因)表达水平，增强鱼体抗病毒能力。

Description

一种融合表达GCRV VP4和LTB的重组乳酸菌及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种融合表达GCRV VP4和LTB的重组乳酸菌及其制备方法与应用。
背景技术
草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒引起的一种严重危害养殖草鱼的病毒性疾病，是我国二类动物疫病，在我国各草鱼主养地区均有发生。草鱼感染后主要症状是体内外各个器官和组织出现斑点状或块状充血。病鱼眼球突出，鳃丝苍白或充血。脑膜腔、肌肉、肠道、肠系膜、鳔壁、胆囊、肝、脾、肾等器官充血，死亡率高达90％以上。由于草鱼出血病致死率高、流行范围广，给我国草鱼养殖业带来了巨大的经济损失。流行病学调查结果表明目前基因II型草鱼呼肠孤病毒是目前引起草鱼出血病发生的主流行毒株。草鱼呼肠孤病毒隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，无囊膜构造，具两层衣壳结构，病毒对酸和氯仿不敏感，对热(56℃)稳定。该病毒基因组由11条不连续的双链RNA节段组成，编码12种蛋白。其中VP4蛋白由S6节段编码，为GCRV-II的外衣壳蛋白，参与病毒感染细胞过程，并与病毒穿过细胞膜有关，是介导病毒感染侵入的关键蛋白，并且在不同流行毒株之间具有高度的保守性。
目前草鱼出血病最有效的防控方法是疫苗接种。传统的草鱼出血病疫苗虽然能够很好的保护养殖草鱼免受感染，但是肌肉注射的免疫方式操作难度大，限制了草鱼出血病疫苗的推广应用。此外，随着流行毒株基因型的改变，传统疫苗的免疫屏障被不断突破，保护效力不断下降。目前开发的一些口服疫苗虽然操作简便，但是保护率相对较低。因此开发免疫操作简便、同时保护效果良好的草鱼出血病疫苗是目前该疫病防控的关键。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种融合蛋白。
本发明第二方面的目的，在于提供与本发明第一方面的融合蛋白相关的生物材料。
本发明第三方面的目的，在于提供一种重组乳酸菌。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的重组乳酸菌的制备方法。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的融合蛋白、第二方面的生物材料和/或第三方面的重组乳酸菌的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种融合蛋白，包含GCRV VP4蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白。
优选地，所述GCRV VP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
优选地，所述GCRV VP4蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白之间还包含连接肽。
优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第二个方面，提供与本发明第一个方面的融合蛋白相关的生物材料，所述材料包含c1)～c8)中任一种：
c1)编码本发明第一个方面的融合蛋白的核酸分子；
c2)包含c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)包含c1)所述核酸分子的载体；
c4)包含c2)所述表达盒的载体；
c5)包含c1)所述核酸分子的转基因细胞系；
c6)包含c2)所述表达盒的转基因细胞系；
c7)包含c3)所述载体的转基因细胞系；
c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述核酸分子中GCRV VP4的序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述核酸分子中LTB的序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述核酸分子中连接肽的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个方面，提供一种重组乳酸菌，所述重组乳酸菌包含g1)或g2)：
g1)本发明第一个方面中GCRV VP4蛋白的编码基因；
g2)本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因。
优选地，g1)中所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，g2)中所述编码基因中GCRV VP4的序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，g2)中所述编码基因中LTB的序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，g2)中所述编码基因中连接肽的序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述乳酸菌选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。
优选地，所述乳酸菌包含乳酸乳球菌；进一步包含乳酸乳球菌NZ9000。
优选地，所述重组乳酸菌的名称为L.lactis pNZ8148-VP4，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是CCTCC NO：M2023215，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-VP4(Lactococcus lactis pNZ8148-VP4)。
优选地，所述重组乳酸菌的名称为L.lactis pNZ8148-LTB-VP4，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年12月19日；保藏编号是CCTCC NO：M20221988，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-LTB-VP4(Lactococcus lactispNZ8148-LTB-VP4)。
本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面的重组乳酸菌的制备方法，将本发明第一个方面中GCRV VP4蛋白的编码基因或本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因导入乳酸菌中。
优选地，所述本发明第一个方面中GCRV VP4蛋白的编码基因或本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因通过重组载体导入乳酸菌。
优选地，所述重组载体为将所述本发明第一个方面中GCRV VP4蛋白的编码基因或本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。
优选地，所述表达载体可为现有技术中常见的表达载体，例如：pNZ8148、pNZ8048、pNZ9530、pNZ8149、pLEISS、pNZ2013、pNZ2103、pLEB590、pNZ8112、pIAβ5、pW425et、pW425t、pW425等。
优选地，所述表达载体为pNZ8148。
优选地，所述导入的方式为电转化。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面的融合蛋白、本发明第二个方面的生物材料和/或本发明第三个方面的重组乳酸菌在制备产品中的应用；所述产品具有h1)～h2)中至少一种功能：
h1)预防草鱼呼肠孤病毒感染；
h2)治疗和/或预防草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒为II型草鱼呼肠孤病毒。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病为草鱼出血病。
优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种。
优选地，所述药物通过口服途径施用。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物为疫苗，进一步为口服疫苗。
优选地，所述产品的施用对象为水产动物；进一步为淡水鱼；更进一步为鲤科淡水鱼。
本发明的第六个方面，提供一种产品，包含i1)～i3)中至少一种：
i1)本发明第一个方面的融合蛋白；
i2)本发明第二个方面的生物材料；
i3)本发明第三个方面的重组乳酸菌。
优选地，所述产品具有h1)～h2)中至少一种功能：
h1)预防草鱼呼肠孤病毒感染；
h2)治疗和/或预防草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒为II型草鱼呼肠孤病毒。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病为草鱼出血病。
优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种。
优选地，所述药物通过口服途径施用。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物为疫苗，进一步为口服疫苗。
优选地，所述产品的施用对象为水产动物；进一步为淡水鱼；更进一步为鲤科淡水鱼。
优选地，一种口服疫苗，包含佐剂和本发明第三个方面的重组乳酸菌。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种融合蛋白，包含GCRV VP4蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白；通过大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白可以进一步提升VP4蛋白被肠黏膜免疫组织抗原呈递细胞直接识别并呈递抗原，激活先天性免疫Toll样受体信号转导，提高免疫相关基因(IFNα、TLR3、TLR5、MyD88、NF-κB、Mx、IRF3、IRF7、MHCII、IL-1β和/或IL-8基因)表达水平，增强鱼体抗病毒能力。
本发明提供了一种重组乳酸菌，以乳酸菌作为活载体，表达GCRV VP4蛋白，既能发挥乳酸菌的益生功能，又能发挥GCRV VP4蛋白对草鱼呼肠孤病毒流行毒株的抵抗力；进一步地，本发明提供了一种重组乳酸菌，以乳酸菌作为活载体，共表达GCRV VP4蛋白和LTB，既能发挥乳酸菌的益生功能，又能增强鱼体针对草鱼呼肠孤病毒流行毒株的抵抗力，提高乳酸菌的草鱼出血病生态防病效果。
同时，乳酸菌具有调节免疫功能，抑制肠道致病菌生长，维持肠道微生态平衡，合成多种维生素、氨基酸和酶，促进消化吸收，提供饲料利用率等功能，并且，乳酸菌的稳定性好，耐消化道的酸性环境，可以长时间在鱼体肠道驻留。
本发明以乳酸菌为载体，递送草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白/包含草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白和LTB的融合蛋白，鱼体口服后，重组乳酸菌在鱼体肠道黏膜中固定和繁殖，展示表达的草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白/包含草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白和LTB的融合蛋白，持续诱导鱼体产生特异性的抗体，增加乳酸菌的草鱼出血病抗病能力。该重组乳酸菌具有疫苗的功能，与现有的技术比较，从鱼体分离的益生菌防控病毒性疾病，主要是调节机体的非特异性免疫系统产生干扰素(IFN)，发挥间接抑制病毒的作用，所以本发明改造后具有预防草鱼出血病的重组乳酸菌不同于现有的微生物生态防病技术。
附图说明
图1是重组质粒pNZ8148-VP4、pNZ8148-LTB-VP4的PCR鉴定和酶切鉴定结果图：其中，A是重组质粒pNZ8148-VP4的PCR鉴定和酶切鉴定结果图：M：DNA marker(DL5000)；泳道1：HindⅢ单酶切；泳道2：NcoⅠ、HindⅢ双酶切；泳道3：PCR鉴定；B是重组质粒pNZ8148-LTB-VP4的PCR鉴定和酶切鉴定结果图：M：DNA marker(DL5000)；泳道4：HindⅢ单酶切；泳道5：NcoⅠ、HindⅢ双酶切；泳道6：PCR鉴定。
图2是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactis pNZ8148-VP4在不同浓度诱导剂乳链球菌肽Nisin诱导下的表达产物的免疫印记(Western-blot)分析结果图：其中，A是L.lactis pNZ8148-VP4在不同浓度诱导剂乳链球菌肽Nisin诱导下的表达产物的免疫印记(Western-blot)分析结果图：M：蛋白Marker；泳道1：50ng/mL；泳道2：100ng/mLNisin；泳道3：300ng/mL；泳道4：500ng/mL；泳道5：700ng/mL；泳道6：1000ng/mL；泳道7：1500ng/mL；在Nisin浓度为500ng/mL诱导条件下，蛋白表达量最大；B是L.lactis pNZ8148-LTB-VP4在不同浓度诱导剂乳链球菌肽Nisin诱导下的表达产物的免疫印记(Western-blot)分析结果图：M：蛋白Marker；泳道1：0ng/mL；泳道2：10ng/mL Nisin；泳道3：50ng/mL；泳道4：200ng/mL；泳道5：500ng/mL；泳道6：1000ng/mL；泳道7：2000ng/mL；在Nisin浓度为500ng/mL诱导条件下，蛋白表达量最大。
图3是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4表达产物LTB-VP4的间接免疫荧光检测结果图：其中，A是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4表达产物LTB-VP4的间接免疫荧光检测的白光图；B是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4表达产物LTB-VP4的间接免疫荧光检测的荧光图。
图4是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactis pNZ8148-VP4表达产物的间接ELISA分析结果图。
图5是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactispNZ8148-VP4后肠中免疫相关基因(IL-1β、IFNα、IL-8、IRF3、IRF7)的相对表达量图：采用2-ΔΔCt法计算免疫相关基因的相对mRNA表达水平，与PBS对照组有显著差异的值用星号表示(单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图6是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactispNZ8148-VP4后肠中免疫相关基因(MHCII、Mx、MyD88、NF-κB、TLR3、TLR5)的相对表达量图：采用2-ΔΔCt法计算免疫相关基因的相对mRNA表达水平，与PBS对照组有显著差异的值用星号表示(单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图7是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactispNZ8148-VP4后经GCRV-HuNan1307攻毒连续14天监测实验鱼累积死亡率曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实验动物：稀有鮈鲫是由中国科学院水生生物所赠送，体长4±0.5cm。
菌、毒株：II型草鱼呼肠孤病毒由珠江水产研究所水产病害与免疫研究室分离保存，其分离方法为：实验室采用PSF细胞进行分离培养，具体方法：将病毒过滤除菌后接种在致密单层PSF细胞上，28℃吸附1小时，补加等量含有5％胎牛血清的M199培养基，28℃细胞培养箱中继续培养5～7天，通过反复冻融2次后收获病毒，具体方法可见《草鱼呼肠孤病毒分子流行病学、全基因组序列及流行株灭活疫苗研究》【D】曾伟伟，华南农业大学。
主要试剂：pNZ8148表达载体、乳酸乳球菌NZ9000购于广州勤卓生物科技有限公司，Trizol Reagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Takara Nco I、HindⅢ限制性内切酶、Takara Ex 基因组DNA提取试剂盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、CompetentCell Preparation Kit均购买于宝日医生物技术有限公司，SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR购买于艾科瑞生物科技有限公司，LB肉汤培养基购买于广东环凯微生物科技有限公司，GM17肉汤培养基购买于北京酷来搏科技有限公司，氯霉素购买于北京索莱宝科技有限公司，乳酸链球菌素Nisin购买于上海麦克林生化科技有限公司，Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-FITC抗体购买于安诺伦(北京)生物科技有限公司，Goat Anti-Mouse IgG,(H+L)抗体购买于赛默飞世尔科技公司，TMB显色液、反应终止液、SDS-PAGE和Western blot相关试剂均购买于苏州新赛美生物科技有限公司，Anti-6X His/>抗体购买于Abcam公司。
实施例1表达VP4、LTB-VP4的重组质粒的制备
重组表达载体pNZ8148-VP4、pNZ8148-LTB-VP4的合成和鉴定
根据乳酸菌表达的偏好性对插入序列进展密码子优化，优化是根据乳酸乳球菌在蛋白表达过程中对编码氨基酸密码子的偏好性，以及插入片段中整体GC含量，对部分碱基进行调整，密码子优化依据密码子的简并性原则，不改变氨基酸序列，更利于插入片段在乳酸乳球菌中表达，密码子优化采用人工合成的方式实现的。根据表达载体pNZ8148的基因序列，选择Nco I和HindⅢ两个酶切位点将GCRV VP4蛋白的编码基因、或GCRV VP4蛋白和LTB的编码基因(GCRV VP4蛋白和LTB之间通过Linker连接)插入，LTB编码的基因前加入保护碱基GT防止移码突变，VP4蛋白的编码基因后面加入His标签(由6个组氨酸残基组成)。该His标签的序列为：CATCATCATCATCACCAC(SEQ ID NO.1)；
GCRV VP4的核苷酸序列为：CGTACTCCACCAGTTGAACTTTCATACCAACCATCAGC TCTTTCAGCTAAAACTACTCCATGGCTTGTTCGTTACCCAGGTACTACTGCTATCGAAAAAACTTTCGATGTTGGTACTACTTCAAAAACTACTTACTACCTTTCAATGGGTAACTCAGGTGGTGGTGATCTTATGATCGATCTTAAACGTCTTCCAGCTTGTGGTCTTGAATACTCACTTCGTGGTATCCCAATCATCTACGATACTAACCTTACTGCTGCTAAACTTGCTAAAGTTACTCCAGCTCTTCTTATGCTTCAAACTGCTAAACCACTTTCAGCTGAAATCACTGCTGCTGATATCCAAGCTATCACTCCACTTGTTGTTGGTACTGATAAACTTAACACTCTTGTTACTACTGGTTTCGGTAACATCCGTAACATCACTGATTTCTCAATGTCAGCTATCTGGGAACCAGAAACTGTTTCAGCTGCTGGTAACTACTACCTTTGGCCAACTGTTATCGGTGATGCTTCAATGACTTCAGATTGGGGTACTATCTCAACTTCACTTGCTAACGGTCGTCTTCGTGTTGCTCCACTTGATCTTACTCACGCTCTTCACAAAGGTAACGTTGTTGAATCAATCGTT(SEQ ID NO.2)；
LTB的核苷酸序列为：AACAAAGTAAAATGTTATGTACTTTTCACAGCTCTTTTGAGT AGCCTTTATGCTCATGGAGCACCACAAACTATAACAGAGCTTTGTAGCGAATATCGTAATACTCAAATTTATACAATCAATGATAAAATCCTCAGTTATACTGAATCAATGGCTGGTAAAAGAGAAATGGTTATTATTACATTTAAATCTGGTGAAACTTTCCAAGTTGAAGTACCTGGGAGTCAACATATTGATTCACAAAAAAAGGCTATTGAACGTATGAAAGATACACTGAGAATCACTTATTTGACAGAAACAAAAATTGATAAGTTATGTGTTTGGAATAATAAAACACCCAACTCTATTGCTGCGATTTCTATGGAAAAT(SEQ ID NO.3)；
Linker基因序列为：GGTGGCGGTGGCTCA(SEQ ID NO.4)；
GCRV VP4的氨基酸序列为：RTPPVELSYQPSALSAKTTPWLVRYPGTTAIEKTFDVGT TSKTTYYLSMGNSGGGDLMIDLKRLPACGLEYSLRGIPIIYDTNLTAAKLAKVTPALLMLQT AKPLSAEITAADIQAITPLVVGTDKLNTLVTTGFGNIRNITDFSMSAIWEPETVSAAGNYYLW PTVIGDASMTSDWGTISTSLANGRLRVAPLDLTHALHKGNVVESIV(SEQ ID NO.5)；
LTB的氨基酸序列为：NKVKCYVLFTALLSSLYAHGAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKIL SYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCV WNNKTPNSIAAISMEN(SEQ ID NO.6)；
Linker氨基酸序列为：GGGGS(SEQ ID NO.7)。
重组表达载体pNZ8148-VP4、pNZ8148-LTB-VP4由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，并转化至E.coli MC1061甘油菌中保藏。将携带pNZ8148-VP4、pNZ8148-LTB-VP4的MC1061甘油菌划线含有氯霉素抗性LB平板，37℃过夜培养。挑单菌落，接种抗性LB液体培养基，37℃、200r/min震荡培养12h，提取质粒后进行酶切验证和PCR鉴定，并送至测序公司进行测序。PCR和酶切鉴定结果表明成功构建重组质粒pNZ8148-VP4、pNZ8148-LTB-VP4(图1)。
实施例2表达VP4、LTB-VP4的重组乳酸菌的制备
制备L.lactis NZ9000感受态细胞。将L.lactis NZ9000划线在0.5wt％葡萄糖的GM17固体培养基上，30℃静置培养过夜。挑取新鲜的乳酸乳球菌单菌落于5mL含0.5wt％葡萄糖GM17肉汤培养基，30℃静置培养6h，得到培养物。按1∶10(v/v)比例取上述培养物于50mL含0.5wt％葡萄糖+1wt％甘氨酸的GM17肉汤培养基，30℃静置培养过夜，得到培养物。按1∶10(v/v)比例取上述培养物于400mL含0.5wt％葡萄糖+0.5mol·L-1蔗糖+2wt％甘氨酸的GM17肉汤培养基，继续静置培养至光密度(OD600)＝0.5，分装置于50mL离心管中，4℃5000g离心15min弃上清。加入10mL预冷溶液(0.5mol·L-1蔗糖+10wt％甘油)重悬，4℃5 000g离心15min弃上清。加入5mL预冷溶液[2.5mL(0.5mol·L-1蔗糖+10wt％甘油)+2.5mL0.05mol·L-1Na-EDTA(pH7.5)]重悬，4℃5 000g离心15min弃上清。加入200uL预冷溶液(0.5mol·L-1蔗糖+10wt％甘油)重悬，分装，-80℃保存备用。
pNZ8148-VP4、pNZ8148-LTB-VP4重组质粒电转化L.lactis NZ9000感受态细胞。试验前将电转杯、恢复培养基(0.5M蔗糖+0.02M MgCL2+0.002M CaCl2的GM17肉汤培养基)预冷。将100μL的L.lactis NZ9000感受态细胞冰上融化，与10μL质粒混匀，冰中静置10min。将混合物转入预冷电转杯中，置于Eppendorf Eporator电转化仪电击(2500V，5ms)，迅速加入900μL预冷恢复培养基，均匀混合后置于冰上3min，30℃厌氧培养2h，3500r/min离心1min，弃掉900μL上清。将剩余菌液吹悬后涂布至抗性GM17固体平板，30℃厌氧静置过夜培养。挑取单菌落接种抗性GM17肉汤培养基中，30℃静置培养。将鉴定正确的表达VP4蛋白的重组乳酸菌命名为L.lactis pNZ8148-VP4，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是CCTCC NO：M2023215，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-VP4(Lactococcus lactis pNZ8148-VP4)；将鉴定正确的表达LTB-VP4融合蛋白的重组乳酸菌命名为L.lactis pNZ8148-LTB-VP4，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年12月19日；保藏编号是CCTCC NO：M20221988，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-LTB-VP4(Lactococcus lactis pNZ8148-LTB-VP4)。
重组乳酸菌的表达。将挑取L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactis pNZ8148-VP4菌落接种于10mL抗性GM17肉汤培养基，30℃厌氧静置培养过夜。取培养菌液按1：50(v/v)比例接种于300mL抗性GM17肉汤培养基中，30℃静置培养4h，L.lactis pNZ8148-LTB-VP4中分别加入终浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL诱导剂乳链球菌肽Nisin，L.lactis pNZ8148-VP4中分别加入终浓度为50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、700ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL诱导剂乳链球菌肽Nisin，30℃诱导4h。
表达产物的免疫印记(Western-blot)分析。将诱导后重组乳酸菌4℃，6000r/min离心5min，弃上清。用3mLPBS溶液悬浮，超声破碎(功率120w，工作2s，休息5s)，菌液破碎效果以澄清为宜。取20μL破碎菌液加入5μL5×SDS凝胶上样缓冲液，混匀后置于沸水中10min，在12％ SDS-PAGE上进行蛋白电泳(120V，60min)。电泳后将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜(400mA，20min)，于5％脱脂奶粉中封闭，37℃2h。加入PBST清洗3次，每次5min。以鼠抗His单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜。加入PBST清洗3次，每次5min。加入HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，室温孵育1h。加入PBST清洗3次，每次5min。按照高敏ECL化学发光试剂盒说明书进行显色，凝胶成像仪观察结果。重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4、L.lactispNZ8148-VP4经诱导后，在表达蛋白带的预期位置出现明显的反应，未加入诱导剂对照组没有(图2)。
融合蛋白LTB-VP4表达间接免疫荧光分析。将诱导后的L.lactis pNZ8148-LTB-VP4菌株取5ml离心，6000r/min，1min，弃掉培养基，PBS清洗3次。菌体沉淀加入200μL含有5％脱脂奶粉重新悬浮，37℃摇床120r/min，封闭2h，离心弃掉封闭液，PBS清洗3次；加入300μLVP4单克隆抗体(1：3000稀释)重新悬浮，37℃摇床120r/min，孵育1h，离心弃掉上清，PBS清洗3次；加入300μL FITC标记的羊抗鼠荧光抗体(1：500稀释)重新悬浮，37℃摇床120r/min，孵育1h，离心弃掉上清，PBS清洗3次；加入200μL PBS重悬中，取50μL菌液均匀涂于干净的载玻片，自然晾干，用预冷的丙酮固定，正置荧光显微镜下观察并拍照。重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP4经诱导后表达融合蛋白LTB-VP4(图3)。
VP4、LTB-VP4间接ELISA分析。将诱导后超声破壁的L.lactis pNZ8148-LTB-VP4(L.lactis pNZ8148-LTB-VP4(破碎))、L.lactis pNZ8148-VP4(L.lactis pNZ8148-VP4(破碎))以及完整菌体(L.lactis pNZ8148-LTB-VP4(全菌)、L.lactis pNZ8148-VP4(全菌))分别作为抗原包被96孔ELISA反应板(酶标板)，以pNZ8148/L.lactis为阴性对照，每组重复3次，每孔100μL，4℃包被过夜。PBST清洗3次，每次5min。每孔加入200μL含有5％脱脂奶粉37℃，封闭2h。PBST清洗3次，每次5min。每孔加入100μL VP4单克隆抗体(1：3000稀释)，4℃孵育过夜，PBST清洗3次，每次5min。每孔加入100μL HRP标记羊抗鼠IgG(1:5000稀释)，37℃，孵育1h，PBST清洗3次，每次5min。按照说明书，加入150μL NcmTMB One显色液，37℃避光显色20min，加50μL反应终止液(2M H2SO4)终止反应，酶标测定仪测定OD450nm值。所有数据表示为平均值±标准误差。数据经过Student's T检验分析，P<0.05被认为具有统计学意义。L.lactis pNZ8148-VP4(全菌/破碎)、L.lactis pNZ8148-LTB-VP4(全菌/破碎)的OD450nm值与阴性对照组相比均具有显著性差异(p＜0.05)。同时，经破碎的菌体包被与菌体直接包被结果没有显著性差异(p≥0.05)。表明两株重组菌体表面分别携带VP4、LTB-VP4融合蛋白(图4)。
实施例3稀有鮈鲫口服重组乳酸菌后免疫调节作用评价
稀有鮈鲫口服免疫。将400尾健康的稀有鮈鲫暂养实验动物房2周后，随机分为4组，每组100尾，分别为PBS空白对照组，pNZ8148/L.lactis空载对照组，L.lactis pNZ8148-VP4、L.lactis pNZ8148-LTB-VP4免疫组。免疫方式为灌胃口服免疫，第1次免疫后相隔2周加强免疫1次，每次连续灌胃3d，免疫剂量为10μL 2×109CFU/mL/鱼/d。
样品采集。免疫后的第7d、14d、21d和28d从各组中随机取取15尾稀有鮈鲫收集肠道后端组织进行免疫相关基因，提取各组织的总RNA后进行反转录，以β-actin作为内参基因，以获得的cDNA作为模板通过qRT-PCR测定各组织中IFNα、TLR3、TLR5、MyD88、NF-κB、Mx、IRF3、IRF7、MHCII、IL-1β和IL-8的相对表达量。各基因引物序列信息如表1所示，引物序列由测序公司合成。实验进行三次生物学重复。qRT-PCR反应体系如下：10μL 2×SYBR GreenTaq HS Premix，引物各0.4μL，0.4μL ROX，2μL cDNA模板以及加ddH2O补齐至20μL，95℃预变性5min后进入循环：95℃，15s变性；60℃，45s退火；共循环35次。测定结果使用2-ΔΔCt算法进行分析。所有数据为平均值±标准误差。数据经过Student's t检验分析，P<0.05被认为具有统计学意义。结果如图5、6所示：重组乳酸菌口服免疫，VP4蛋白可以被肠黏膜免疫组织抗原呈递细胞直接识别并呈递抗原，激活先天性免疫Toll样受体信号转导，提高IFNα、TLR3、TLR5、MyD88、NF-κB、Mx、IRF3、IRF7、MHCII、IL-1β和IL-8基因转录水平，增强鱼体抗病毒能力；并且LTB可以进一步提升VP4蛋白被肠黏膜免疫组织抗原呈递细胞直接识别并呈递抗原，激活先天性免疫Toll样受体信号转导，提高IFNα、TLR3、TLR5、MyD88、NF-κB、Mx、IRF3、IRF7、MHCII、IL-1β和IL-8基因转录水平，增强鱼体抗病毒能力。
表1荧光定量PCR中的引物序列
实施例4重组乳酸菌口服免疫保护评价
在实施例3的稀有鮈鲫免疫后第42天，每尾鱼腹腔注射25μL GCRV HuNan1307强毒株病毒液(LD50为10-3.04LD50/25μL)(每组大约重复70尾)，保持攻毒鱼在28℃～30℃水温环境中饲养。攻毒后连续14d内对所有实验鱼进行监测，记录发病率与死亡率，计算相对保护率(RPS，RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％)。结果表明，与PBS空白对照相比，L.lactis pNZ8148-VP4、L.lactis pNZ8148-LTB-VP4的相对保护率分别为24.6％、35.14％；口服免疫重组乳酸菌可提高实验鱼在GCRV感染中的存活率：口服免疫L.lactispNZ8148-VP4可以获得免疫保护，LTB可以介导提高口服疫苗的黏膜免疫保护效果(图7)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，包含GCRV VP4蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：
所述GCRV VP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
优选地，所述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；优选地，所述GCRV VP4蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白之间还包含连接肽。
3.与权利要求1或2所述的融合蛋白相关的生物材料，所述材料包含c1)～c8)中任一种：
c1)编码权利要求1或2所述的融合蛋白的核酸分子；
c2)包含c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)包含c1)所述核酸分子的载体；
c4)包含c2)所述表达盒的载体；
c5)包含c1)所述核酸分子的转基因细胞系；
c6)包含c2)所述表达盒的转基因细胞系；
c7)包含c3)所述载体的转基因细胞系；
c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系。
4.一种重组乳酸菌，所述重组乳酸菌包含g1)或g2)：
g1)权利要求1或2中所述GCRV VP4蛋白的编码基因；
g2)权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组乳酸菌，其特征在于：
所述乳酸菌选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种；
优选地，所述乳酸菌包含乳酸乳球菌；
优选地，所述重组乳酸菌的名称为L.lactis pNZ8148-VP4，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是CCTCC NO：M2023215，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-VP4(Lactococcus lactis pNZ8148-VP4)；优选地，所述重组乳酸菌的名称为L.lactis pNZ8148-LTB-VP4，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年12月19日；保藏编号是CCTCCNO：M20221988，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-LTB-VP4(Lactococcus lactispNZ8148-LTB-VP4)。
6.权利要求4或5所述的重组乳酸菌的制备方法，将权利要求1～2任一项中所述GCRVVP4蛋白的编码基因或权利要求1～2任一项所述的融合蛋白的编码基因导入乳酸菌中。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述权利要求1～2任一项中GCRV VP4蛋白的编码基因或权利要求1～2任一项所述的融合蛋白的编码基因通过重组载体导入乳酸菌；
优选地，所述重组载体为将所述权利要求1～2任一项中所述GCRV VP4蛋白的编码基因或权利要求1～2任一项所述的融合蛋白的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。
8.权利要求1～2任一项所述的融合蛋白、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4～5任一项所述的重组乳酸菌在制备产品中的应用；所述产品具有h1)～h2)中至少一种功能：h1)预防草鱼呼肠孤病毒感染；
h2)治疗和/或预防草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病；
优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种；
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物为疫苗。
9.一种产品，包含i1)～i3)中至少一种：
i1)权利要求1～2任一项所述的融合蛋白；
i2)权利要求3所述的生物材料；
i3)权利要求4～5任一项所述的重组乳酸菌。
10.一种口服疫苗，包含佐剂和权利要求4～5任一项所述的重组乳酸菌。
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周勇;曾令兵;范玉顶;罗晓松;徐进;肖艺;: "草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建", 中国水产科学, no. 01, pages 1 - 7 *

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