CN112022867A - 老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用。本发明首次将老鹳草素应用于治疗由新型冠状病毒引起的感染中，研究发现，老鹳草素能够有效抑制新型冠状病毒在细胞内的增殖，因此能够用于治疗由新型冠状病毒感染引起的肺炎疾病。如此既扩展了老鹳草素的应用范围，又为新型冠状病毒的防治提供了新思路。研究发现，12.5‑100μg/mL的老鹳草素能够有效抑制SARS‑CoV‑2在细胞内增殖。其中，与未经任何药物处理的病毒感染细胞(病毒对照组)相比，100μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS‑CoV‑2病毒载量平均降低8.66×102倍。

Description

老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用
技术领域
本发明属于新型冠状病毒治疗技术领域，特别涉及老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用。
背景技术
2019年不明原因的感染性肺炎疾病的被感染人群会出现不同程度的症状，轻者只是发烧或轻微咳嗽，重者会发展成肺炎，更为严重者会导致死亡。经检测，该不明原因的感染性肺炎是由新型冠状病毒感染引起的，2020年2月，国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)正式将该新型冠状病毒命名为 SARS-CoV-2。
2019-2020年间，SARS-CoV-2爆发了全球大流行。自该新型冠状病毒被发现以来，全球各科研单位、组织均积极迅速地展开了深入研究，以期盼能找到或开发能够对新型冠状病毒SARS-CoV-2感染具有疗效的药物。
对待这种传染性极强的病毒，为了能够快速控制疫情，疗效药的一个重要研究方向是老药新用，即对那些已经被验证能够应用于人体的药物进行应用拓展，查看该药物是否具有新的治疗用途。这些“老药”由于已经经过或正在进行临床验证，如果发现有新的疗效，即可快速了加以应用。
老鹳草素(Geraniin，C14H28O27)是老鹳草、叶下珠、睡莲花等药用植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒及抗辐射等多种生物活性。研究发现，老鹳草素能够有效抑制横纹肌肉瘤细胞内人类肠道病毒(Ev71)的复制，能够显著抑制乙肝表面抗原和乙肝病毒e抗原的分泌，能够显著抑制单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的感染；此外，老鹳草素还是有效的抗人类免疫缺陷病毒的活性物质。
但目前还没有任何将老鹳草素用于治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2的相关报道。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种老鹳草素的新用途，即老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，既扩展了老鹳草素的应用范围，又为新型冠状病毒的防治提供了新思路。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用。
本发明首次将老鹳草素应用于治疗由新型冠状病毒引起的感染中，研究发现，老鹳草素能够有效抑制新型冠状病毒在细胞内的增殖，因此能够用于治疗由新型冠状病毒感染引起的肺炎疾病。如此既扩展了老鹳草素的应用范围，又为新型冠状病毒的防治提供了新思路。
在上述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的新型冠状病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。
在上述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度不超过100μg/mL。研究发现，老鹳草素对有机体细胞的最大无毒浓度是100μg/mL，因此在实际应用中，为了避免产生细胞毒性，老鹳草素在细胞水平上的应用浓度应当控制在100μg/mL以内。
作为优选，在上述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为12.5-100μg/mL。
研究发现，与未经任何药物处理的病毒感染细胞相比，12.5μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低2.86 倍；25μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低17.42倍；50μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低86.85倍；100μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低了8.66×102倍；表明25-100μg/mL的老鹳草素能够有效抑制SARS-CoV-2在细胞内增殖。
作为进一步优选，在上述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为25-100μg/mL。
作为更优选，在上述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为50-100μg/mL。
作为最优选，在上述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为100μg/mL。
本发明还提供了一种抗新型冠状病毒药，其有效成分包括老鹳草素。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明首次将老鹳草素应用于治疗由新型冠状病毒引起的感染中，研究发现，老鹳草素能够有效抑制新型冠状病毒在细胞内的增殖，因此能够用于治疗由新型冠状病毒感染引起的肺炎疾病。如此既扩展了老鹳草素的应用范围，又为新型冠状病毒的防治提供了新思路。
(2)与未经任何药物处理的病毒感染细胞相比，12.5μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低2.86倍； 25μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低17.42倍；50μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低86.85倍；100μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低了8.66×102倍；表明 12.5-100μg/mL的老鹳草素均能够有效抑制SARS-CoV-2在细胞内增殖。
具体实施方式
下面列举具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
本实施例通过测定中药单体老鹳草素作用后感染细胞中SARS-CoV-2的病毒载量，并与未经药物处理的感染细胞中病毒载量进行比较，评价中药单体老鹳草素在Vero细胞中对SARS-CoV-2复制的抑制能力，从而在细胞水平上研究中药单体老鹳草素抗SARS-CoV-2的效果。
本实施例中所使用的老鹳草素(20mg/mL)购自成都德斯特公司；所使用的SARS-CoV-2毒株ZJ001，为浙江省疾病预防控制中心从2019年新冠肺炎患者标本中分离得到，病毒滴度为104/0.1mL；所使用的Vero细胞，购自ATCC 细胞库，代数低于150代。
试验步骤包括：
(1)药物前处理
采用DMSO将老鹳草素母液稀释至10mg/mL，然后，采用细胞维持液 (MEM，含2％FBS，1％P-S和1％L-g)将10mg/mL老鹳草素溶液稀释至1mg/mL，经0.22μm的滤器除菌过滤，分装保存于-20℃备用。
(2)药物的最大无毒浓度(CC0)测定
在96孔板上培养Vero细胞，待细胞长成单层后，弃细胞生长液；采用细胞维持液(MEM，含2％FBS，1％P-S和1％L-g)将1mg/mL老鹳草素溶液梯度稀释至浓度为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL，将稀释后的各老鹳草素溶液接种于Vero细胞中，接种量为100μL/孔，每个浓度设置三次重复；将细胞板置37℃培养48h后，观察细胞形态，获得老鹳草素对细胞的最大无毒浓度。
实验同时设置细胞对照和空白对照。
经检测，老鹳草素处理细胞48h后，通过观察细胞形态发现，100μg/mL、 50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的老鹳草素处理的Vero细胞均未出现细胞毒性，而200μg/mL老鹳草素处理后，Vero细胞出现毒性死亡。由此可以确定，老鹳草素对细胞的最大无毒浓度为100μg/mL。
(3)药物对SARS-CoV-2复制的抑制效果评价
将Vero细胞接种于24孔板中，待Vero细胞长成单层后，弃细胞生长液；采用细胞维持液将SARS-CoV-2毒株ZJ001稀释为100TICD50/0.1mL，向各细胞孔中加入100μL稀释后的病毒液(100TICD50/0.1mL)，37℃孵育1h；1h后弃病毒液，用PBS洗Vero细胞两次，1mL/孔，去除未进入细胞的游离病毒；然后，将不同浓度(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL)的老鹳草素溶液加入细胞孔中，1mL/孔，重复3孔，于37℃、5％CO2下培养48h。
实验同时设置病毒对照组和细胞对照组，其中，病毒对照组为感染病毒1h 后，向细胞孔加入1mL细胞维持液，37℃培养48h；细胞对照组为不感染病毒的细胞在37℃培养48h。
老鹳草素处理组、病毒对照组和细胞对照组培养48h后，于-80℃冻融两次，混匀后取200μL液体采用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit进行病毒RNA提取，参照试剂盒说明书操作。荧光定量RT-PCR采用Takara公司One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real-time)试剂盒进行，引物探针序列为国家 CDC提供，目标基因为N基因，由上海生工生物工程有限合成。同时，设置标准品(N蛋白编码基因的质粒)进行定量，获得各样本的病毒拷贝数。比较老鹳草素处理组和病毒对照组病毒载量的差异，分析老鹳草素在细胞内对 SARS-CoV-2复制的抑制效果。
测定结果如表1所示。
表1
Figure RE-GDA0002711278420000061
注：比值是指病毒拷贝数比值＝老鹳草素处理组病毒拷贝数/病毒对照组病毒拷贝数。
由表1可见，未经药物处理的感染细胞(病毒对照组)，病毒载量平均为3.17 ±0.76×109拷贝数/反应；而100μg/mL的老鹳草素处理感染细胞48小时后，病毒载量平均为3.66±0.51×106拷贝数/反应；50μg/mL的老鹳草素处理感染细胞 48小时后，病毒载量平均为3.65±0.42×107拷贝数/反应；25μg/mL的老鹳草素处理感染细胞48小时后，病毒载量平均为1.82±0.68×108拷贝数/反应；12.5 μg/mL的老鹳草素处理感染细胞48小时后，病毒载量平均为1.11±0.49×109拷贝数/反应。
由表1可见，12.5-100μg/mL的老鹳草素能够有效抑制SARS-CoV-2在细胞内增殖。其中，与未经任何药物处理的病毒感染细胞(病毒对照组)相比，12.5 μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低2.86倍；25μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内 SARS-CoV-2病毒载量平均降低17.42倍；50μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低86.85倍；100μg/mL的老鹳草素处理病毒感染细胞48小时后，细胞内SARS-CoV-2病毒载量平均降低 8.66×102倍。

Claims (8)

1.老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用。
2.如权利要求1所述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，其特征在于，所述的新型冠状病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。
3.如权利要求1所述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，其特征在于，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度不超过100μg/mL。
4.如权利要求1所述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，其特征在于，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为12.5-100μg/mL。
5.如权利要求4所述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，其特征在于，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为25-100μg/mL。
6.如权利要求5所述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，其特征在于，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为50-100μg/mL。
7.如权利要求6所述的老鹳草素在制备抗新型冠状病毒药中的应用，其特征在于，所述的老鹳草素在细胞水平上的应用浓度为100μg/mL。
8.一种抗新型冠状病毒药，其特征在于，有效成分包括老鹳草素。
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