CN117462572A - 一种广谱抗病毒组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种广谱抗病毒组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种广谱抗病毒组合物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种广谱抗病毒组合物，包括：β‑葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖。所述广谱抗病毒组合物可有效预防和/或治疗多种病毒对细胞造成的裂解或使细胞的形态和功能产生的变化，使细胞维持正常、良好的生长状态，减轻病毒对细胞产生的毒害作用，进而预防和/或治疗多种病毒对细胞感染产生的疾病。进一步地，本发明提供的广谱抗病毒组合物对正常细胞没有损伤作用。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物可作为一种安全且有效的广谱抗病毒组合物，用于预防和/或治疗病毒感染。

Description

一种广谱抗病毒组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种广谱抗病毒组合物及其制备方法和应用。
背景技术
目前已知的可感染人类的病毒种类繁多，加上不断出现的变异毒株和可跨物种传播并感染人类的未知病毒，数量更是无法估计。病毒感染可引起严重的疾病甚至死亡。对于绝大部分病毒，目前尚无有效抗病毒药物。一些广谱抗病毒药物，如利巴韦林和干扰素，只对少部分病毒有效。因此，急需一种真正意义上的广谱抗病毒药物，用于预防和治疗病毒感染，并有效应对新发、突发病毒性传染病。
研究发现，某些多糖对某些病毒具有抑制作用。例如：板蓝根多糖对流感病毒具有抑制作用。多糖的抗病毒作用机制分为直接灭杀病毒、抑制病毒生物合成和增殖、阻止病毒吸附与进入细胞、直接抑制病毒和对宿主进行免疫调节5种。多糖按来源可分为植物多糖、微生物多糖和动物多糖。由于不同来源的多糖的抗病毒作用方式不尽相同，因此，采用复合多糖的形式，将起到多种方式，共同作用的抗病毒功效。但是，多糖成分复杂，直接使用可能会带来副作用。从多糖中选取有效成分，提供一种健康无害的组合物作为广谱抗病毒组合物对于病毒的防治具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的提供一种广谱抗病毒组合物，能够高效抑制多种病毒引起的感染，同时对机体细胞可以达到健康、无害的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种广谱抗病毒组合物，包括：β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖。
优选的，所述广谱抗病毒组合物包括0.5～0.6mg/mL的β-葡聚糖、2～3mg/mL的壳聚糖、2～3mg/mL的壳寡糖和2～3mg/mL的甘露寡糖。
优选的，所述广谱抗病毒组合物包括0.5mg/mL的β-葡聚糖、2mg/mL的壳聚糖、2mg/mL的壳寡糖和2mg/mL的甘露寡糖。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗病毒组合物的制备方法，包括以下步骤：
将β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖溶解，得到广谱抗病毒组合物。
优选的，溶解使用的试剂包括水。
优选的，溶解后，还包括将溶解得到的混合液进行过滤；所述过滤包括无菌过滤。
优选的，所述无菌过滤采用0.22μm滤膜进行。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗病毒组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的广谱抗病毒组合物在制备抑制病毒增殖的药物中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗病毒组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的广谱抗病毒组合物在制备预防和/或治疗病毒感染所致疾病的药物中的应用。
优选的，所述病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、冠状病毒、新型肠道病毒和柯萨奇病毒中的一种或两种以上。
本发明提供了一种广谱抗病毒组合物，包括：β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖。本发明提供的广谱抗病毒组合物使新型冠状病毒BA.5.2、新型肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引起的变圆的细胞减少，使甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒Victoria系和冠状病毒OC43引起的裂解的细胞减少，使人呼吸道合胞病毒A型和人偏肺病毒A2型引起的细胞融合减少，使表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)的人腺病毒7型引起的表达EGFP的细胞减少，使人腺病毒40型引起的肿胀变圆的细胞减少。综上，本发明提供的广谱抗病毒组合物对有包膜和无包膜病毒，RNA和DNA病毒均具有抑制作用。本发明所述广谱抗病毒组合物能够有效预防多种病毒对细胞造成的裂解或使细胞的形态和功能产生的变化，使细胞能够维持正常、良好的生长状态，减轻病毒对细胞产生的毒害作用，进而预防和/或治疗病毒对细胞感染产生的疾病。进一步地，本发明提供的广谱抗病毒组合物对正常细胞没有损伤作用。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物可作为一种安全且有效的广谱抗病毒组合物，用于预防和/或治疗病毒感染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为应用例1中MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞形态观察结果和活性检测结果图；
图2为实施例1中的广谱抗病毒组合物对新型冠状病毒BA.5.2作用效果示意图；
图3为实施例1中的广谱抗病毒组合物对甲型流感病毒H3N2作用效果示意图；
图4为实施例1中的广谱抗病毒组合物对乙型流感病毒Victoria系作用效果示意图；
图5为实施例1中的广谱抗病毒组合物对人呼吸道合胞病毒A型作用效果示意图；
图6为实施例1中的广谱抗病毒组合物对人偏肺病毒A2型作用效果示意图；
图7为实施例1中的广谱抗病毒组合物对表达EGFP的人腺病毒7型作用效果示意图；
图8为实施例1中的广谱抗病毒组合物对冠状病毒OC43作用效果示意图；
图9为实施例1中的广谱抗病毒组合物对人腺病毒40型作用效果示意图；
图10为实施例1中的广谱抗病毒组合物对新型肠道病毒71型作用效果示意图；
图11为实施例1中的广谱抗病毒组合物对柯萨奇病毒16型作用效果示意图；
图12为对比例1低浓度抗病毒组合物对表达EGFP的人腺病毒7型作用效果示意图；
图13为对比例4中MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞形态观察结果和活性检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种广谱抗病毒组合物，包括：β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖。
如无特殊说明，本发明对各组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知市售产品即可。
本发明提供的广谱抗病毒组合物包括β-葡聚糖。在本发明中，所述广谱抗病毒组合物中β-葡聚糖的质量浓度优选为0.5～0.6mg/mL，更优选为0.5mg/mL。
本发明提供的广谱抗病毒组合物包括壳聚糖。在本发明中，所述广谱抗病毒组合物中壳聚糖的质量浓度优选为2～3mg/mL，更优选为2mg/mL。
本发明提供的广谱抗病毒组合物包括壳寡糖。在本发明中，所述广谱抗病毒组合物中壳寡糖的质量浓度优选为2～3mg/mL，更优选为2mg/mL。
本发明提供的广谱抗病毒组合物包括甘露寡糖。在本发明中，所述广谱抗病毒组合物中甘露寡糖的质量浓度优选为2～3mg/mL，更优选为2mg/mL。
本发明提供的广谱抗病毒组合物通过各组分的相互作用，能够使新型冠状病毒BA.5.2、新型肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引起的变圆的细胞减少，使甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒Victoria系和冠状病毒OC43引起的裂解的细胞减少，使人呼吸道合胞病毒A型和人偏肺病毒A2型引起的细胞融合减少，使表达增强型绿色荧光蛋白的人腺病毒7型引起的表达EGFP的细胞减少，使人腺病毒40型引起的肿胀变圆的细胞减少。本发明所述广谱抗病毒组合物能够有效预防上述多种病毒对细胞造成的裂解或使细胞的形态和功能产生的变化，使细胞能够维持正常、良好的生长状态，从而减轻病毒对细胞产生的毒害作用，达到预防和/或治疗多种病毒对细胞感染产生的疾病的效果。本发明提供的所述广谱抗病毒组合物对正常细胞没有损伤作用，可作为一种安全且有效的广谱抗病毒组合物，用于预防和/或治疗病毒感染。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗病毒组合物的制备方法，包括以下步骤：
将β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖溶解，得到广谱抗病毒组合物。
本发明将β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖溶解。在本发明中，所述溶解使用的试剂优选为水，更优选为去离子水。本发明对所述溶解的方法没有特殊限定，采用本领域常规溶解方法使原料完全溶解均可。原料溶解后，本发明优选包括将溶解得到的混合液进行过滤；所述过滤包括无菌过滤；所述无菌过滤优选采用0.22μm滤膜进行。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗病毒组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的广谱抗病毒组合物在制备抑制病毒增殖的药物中的应用。本发明提供的广谱抗病毒组合物能有效抑制病毒对细胞的寄生效果，达到抑制病毒增殖的效果。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗病毒组合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的广谱抗病毒组合物在制备预防和/或治疗病毒感染所致疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述病毒优选包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、冠状病毒、新型肠道病毒和柯萨奇病毒中的一种或两种以上。
本发明提供的所述广谱抗病毒组合物对正常细胞没有损伤作用。本发明提供的广谱抗病毒组合物使新型冠状病毒BA.5.2、新型肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引起的变圆的细胞减少，使甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒Victoria系和冠状病毒OC43引起的裂解的细胞减少，使人呼吸道合胞病毒A型和人偏肺病毒A2型引起的细胞融合减少，使表达增强型绿色荧光蛋白的人腺病毒7型引起的表达EGFP的细胞减少，使人腺病毒40型引起的肿胀变圆的细胞减少。本发明所述广谱抗病毒组合物能够有效预防上述多种病毒对正常细胞造成的裂解或使正常细胞的形态和功能产生的变化，使正常细胞能够维持正常、良好的生长状态，从而有利于预防和/或治疗多种病毒对正常细胞产生的毒害作用，进而预防和/或治疗多种病毒对细胞感染产生的疾病。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下技术方案中的50×指的是在放大50倍的情况下，对细胞的观察结果。
实施例1
一种广谱抗病毒组合物，由下述浓度的组分组成：β-葡聚糖0.5mg/mL、壳聚糖2mg/mL、壳寡糖2mg/mL和甘露寡糖2mg/mL。
广谱抗病毒组合物的制备方法为：
以去离子水为溶剂，将β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖分别进行溶解，得到混合溶液，混合溶液中β-葡聚糖质量浓度为0.5mg/mL、壳聚糖质量浓度为2mg/mL、壳寡糖质量浓度为2mg/mL和甘露寡糖的质量浓度为2mg/mL。
将混合溶液经过0.22μm滤膜无菌过滤，得到广谱抗病毒组合物。所述广谱抗病毒组合物可在室温条件下进行保存。
实施例2
一种广谱抗病毒组合物，由下述浓度的组分组成：β-葡聚糖1mg/mL、壳聚糖4mg/mL、壳寡糖4mg/mL和甘露寡糖4mg/mL。
广谱抗病毒组合物的制备方法为：
以去离子水为溶剂，将β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖分别进行溶解，得到混合溶液，混合溶液中β-葡聚糖质量浓度为1mg/mL、壳聚糖质量浓度为4mg/mL、壳寡糖质量浓度为4mg/mL和甘露寡糖的质量浓度为4mg/mL。
将混合溶液经过0.22μm滤膜无菌过滤，得到广谱抗病毒组合物。所述广谱抗病毒组合物可在室温条件下进行保存。
实施例2广谱抗病毒组合物的设置是为了使作用于病毒的终浓度的广谱抗病毒组合物终浓度为β-葡聚糖0.5mg/mL、壳聚糖2mg/mL、壳寡糖2mg/mL和甘露寡糖2mg/mL。
应用例1
实施例2中的广谱抗病毒组合物对正常细胞作用的检测
1.使用含体积百分含量为10％胎牛血清(GIBCO公司)和体积百分含量为1％双抗(GIBCO公司)的DMEM培养基(GIBCO公司)将处于对数生长期的MRC-5细胞接种于96孔板中，在37℃、含5％CO2培养箱内培养，至细胞融合度达90％～95％，培养时间约为24h。
2.将实施例2中的广谱抗病毒组合物与含1％双抗的DMEM培养基按体积比1:1进行混合，得到组合物-培养基混合物。
3.弃去96孔板液体，每孔加入步骤2中的组合物-培养基混合物100μL，进行3组平行试验，作为试验组；同时设立空白对照，将去离子水与含1％双抗的DMEM培养基按体积比1:1混合后，将混合液于每孔中添加100μL。将试验组和空白对照组分别在37℃、含体积百分含量为5％CO2的培养箱内孵育1h。
4.孵育完成后，弃去液体，每孔加入100μL含1％双抗的DMEM培养基和10μL CCK-8溶液(碧云天公司)的混合液，共110μL，在37℃、含体积百分含量为5％CO2培养箱内培养。
5.培养过程中，分别在1h、4h和24h观察细胞的形态，并分别测定1h、4h和24h细胞培养上清在450nm和630nm的吸光度，计算OD值(OD值＝OD450-OD630)，得出细胞活性；检测结果使用t检验进行统计学分析。
MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞形态观察结果和活性检测结果图如图1所示。其中图1中的A为MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞形态观察结果图(50×)；图1中的B为MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞活性检测结果图。其中MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞活性检测结果如表1所示。
表1MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞活性检测结果
由图1和表1可得，与空白对照相比，MRC-5细胞在实施例1所述广谱抗病毒组合物作用后的1h、4h和24h形态均正常，OD值差异没有统计学意义。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物对正常细胞没有损伤作用。
应用例2
病毒培养
本发明使用的病毒见表2，所有病毒均可引起严重疾病甚至死亡，具体为：可引起重症肺炎的呼吸道病毒，如：新型冠状病毒、流感病毒和人偏肺病毒等；和可引起严重腹泻的肠道病毒，如：人腺病毒40型、新型肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型。
表2病毒类型及其来源
*相关技术参见文章：Vaccine,2009,27:1145-1153.DOI:10.1016/j.vaccine.2008.12.039
1.病毒滴度测定
使用表2中各个病毒的培养细胞分别测定各个病毒的滴度，步骤如下：
(1)使用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，在37℃、含5％CO2培养箱内培养，至细胞融合度达90％～95％(约24h)；
(2)使用含1％双抗的DMEM培养基将待测病毒液作10倍系列稀释，稀释度从10-1到10-6，其中，用于流感病毒稀释的培养基中加入TPCK胰酶(默克公司)至终浓度为1μg/mL；
(3)步骤(1)培养结束后，弃去96孔板液体，每孔加入步骤(2)中稀释的病毒液100μL，每个稀释度做4个复孔，同时设立空白对照，空白对照为每孔加入含1％双抗的DMEM培养基，在37℃、含5％CO2的培养箱内吸附2h；
(4)弃去液体，每孔加入100μL含1％双抗的DMEM培养基，其中，用于流感病毒的培养基加入TPCK胰酶至终浓度为1μg/mL，在37℃、含5％CO2的培养箱内培养1～6天；
(5)观察致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，应用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose，TCID50)。
采用上述方法对表2中的病毒进行培养，测定病毒的半数组织培养感染剂量。其中，表2中相应病毒培养使用的细胞如表2所示。
2.广谱抗病毒组合物抗病毒活性检测
使用表2中各个病毒的培养细胞分别检测广谱抗病毒组合物对各个病毒的作用，步骤如下：
(1)使用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，至细胞融合度达90％～95％(约24h)；
(2)使用含1％双抗的DMEM培养基稀释的病毒液(200TCID50/0.1mL)与实施例2中的广谱抗病毒组合物按体积比1:1混合，得到组合物与病毒的混合液，其中，用于流感病毒的培养基加入TPCK胰酶至终浓度为2μg/mL，在37℃、含5％CO2的培养箱内孵育1h；
(3)弃去96孔板液体，每孔加入步骤(2)中的组合物与病毒的混合液100μL，每个稀释度做3个复孔，作为试验组，同时设立病毒对照和空白对照。其中病毒对照为稀释的病毒液与含1％双抗的DMEM培养基按体积比为1:1混合后，取混合液于每孔中添加100μL。空白对照为每孔中添加100μL含1％双抗的DMEM培养基。将试验组和对照组分别在37℃、含5％CO2的培养箱内吸附2h；
(4)弃去液体，每孔加入100μL含1％双抗的DMEM培养基，其中，用于流感病毒的培养基加入TPCK胰酶至终浓度为1μg/mL，在37℃、含5％CO2培养箱内培养1～6天；
(5)除表达EGFP的人腺病毒7型观察荧光并进行流式细胞检测外，其余病毒观察CPE。
流式细胞检测方法如下：弃去液体，每孔加入30μL胰蛋白酶(GIBCO公司)，待细胞变圆、脱落，每孔加入100μL细胞固定液，吹匀，上机检测；检测结果使用Wilcoxon秩和检验进行统计学分析。
广谱抗病毒组合物抗病毒检测结果如图2～图11所示(50×)。其中图2为实施例1中的广谱抗病毒组合物对新型冠状病毒BA.5.2作用效果示意图；图3为实施例1中的广谱抗病毒组合物对甲型流感病毒H3N2作用效果示意图；图4为实施例1中的广谱抗病毒组合物对乙型流感病毒Victoria系作用效果示意图；图5为实施例1中的广谱抗病毒组合物对人呼吸道合胞病毒A型作用效果示意图；图6为实施例1中的广谱抗病毒组合物对人偏肺病毒A2型作用效果示意图；图7为实施例1中的广谱抗病毒组合物对表达EGFP的人腺病毒7型作用效果示意图；图8为实施例1中的广谱抗病毒组合物对冠状病毒OC43作用效果示意图；图9为实施例1中的广谱抗病毒组合物对人腺病毒40型作用效果示意图；图10为实施例1中的广谱抗病毒组合物对新型肠道病毒71型作用效果示意图；图11为实施例1中的广谱抗病毒组合物对柯萨奇病毒16型作用效果示意图。
参见图2所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使新型冠状病毒BA.5.2引起的变圆的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了新型冠状病毒BA.5.2的感染。
参见图3所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使甲型流感病毒H3N2引起的裂解的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了甲型流感病毒H3N2的感染。
参见图4所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使乙型流感病毒Victoria系引起的裂解的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了乙型流感病毒Victoria系的感染。
参见图5所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使人呼吸道合胞病毒A型引起的细胞融合减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了人呼吸道合胞病毒A型的感染。
参见图6所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使人偏肺病毒A2型引起的细胞融合减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了人偏肺病毒A2型的感染。
参见图7所述，表达EGFP的人腺病毒7型进入细胞后，细胞会表达EGFP，发出绿色荧光。实施例1的广谱抗病毒组合物使表达EGFP的细胞减少(图7中的A)(50×)，比例从平均83.4％减至平均64.05％(图7中的B)，本发明广谱抗病毒组合物试验组和病毒对照组两者差异具有统计学意义(*p<0.05)。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了人腺病毒7型的感染。
参见图8所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使冠状病毒OC43引起的裂解的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了冠状病毒OC43的感染。
参见图9所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使人腺病毒40型引起的肿胀变圆的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒广谱抗病毒组合物抑制了人腺病毒40型的感染。
参见图10所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使新型肠道病毒71型引起的变圆的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了新型肠道病毒71型的感染。
参见图11所示，实施例1的广谱抗病毒组合物使柯萨奇病毒16型引起的变圆的细胞减少。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物抑制了柯萨奇病毒16型的感染。
对比例1
抗病毒组合物的组成为：β-葡聚糖0.4mg/mL、壳聚糖1.9mg/mL、壳寡糖1.9mg/mL和甘露寡糖1.9mg/mL。
对比例2
抗病毒组合物的组成为：β-葡聚糖0.8mg/mL、壳聚糖3.8mg/mL、壳寡糖3.8mg/mL和甘露寡糖3.8mg/mL。
抗病毒组合物抗病毒活性检测
具体检测方法同应用例2中的2广谱抗病毒组合物抗病毒活性检测，区别在于，步骤(2)使用含1％双抗的DMEM培养基稀释的病毒液(200TCID50/0.1mL)与对比例2中的抗病毒组合物按体积比1:1混合。
检测对比例1中的抗病毒组合物对表达EGFP的人腺病毒7型的作用效果。观察荧光并进行流式细胞检测，检测方法同上。
对比例1中低浓度抗病毒组合物对表达EGFP的人腺病毒7型的作用效果如图12所示。
参见图12所述，低浓度组合物使表达EGFP的细胞减少(图12中的A)(50×)，比例从平均83.06％减至平均73.05％(图12中的B)，低浓度组合物试验组和病毒对照组两者差异无统计学意义(p>0.05)。因此，低浓度组合物对人腺病毒7型的抑制作用不明显。组合物各成分浓度降低，会影响其抗病毒效果。
对比例3
抗病毒组合物的组成为：β-葡聚糖0.7mg/mL、壳聚糖3.1mg/mL、壳寡糖3.1mg/mL和甘露寡糖3.1mg/mL。
对比例4
抗病毒组合物的组成为：β-葡聚糖1.4mg/mL、壳聚糖6.2mg/mL、壳寡糖6.2mg/mL和甘露寡糖6.2mg/mL。
抗病毒组合物对正常细胞作用的检测
具体检测方法同应用例1中广谱抗病毒组合物对正常细胞作用的检测，区别在于，步骤2使用含1％双抗的DMEM培养基与对比例4中的抗病毒组合物按体积比1:1混合。
检测对比例3中的抗病毒组合物对正常细胞的作用。分别在1h、4h和24h、观察细胞的形态，并分别测定上清在450nm和630nm的吸光度，计算OD值(OD值＝OD450-OD630)，得出细胞活性；检测结果使用t检验进行统计学分析。
MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞形态观察结果和活性检测结果如图13所示，其中图13中的A为MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞形态观察结果图(50×)；图13中的B为MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞活性检测结果图。其中MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞活性检测结果如表3所示。
表3 MRC-5细胞培养1h、4h和24h的细胞活性检测结果
由图13和表3可得，与空白对照相比，MRC-5细胞在高浓度组合物作用后的1h、4h和24h形态均发生变化，包括出现变圆、皱缩，局部出现黑点，1h、4h和24h的OD值差异具有统计学意义(***p<0.001和****p<0.0001)。因此，高浓度组合物对正常细胞具有损伤作用。
综上所述，本发明以β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖作为组合，得到广谱抗病毒组合物。所述广谱抗病毒组合物对包括新型冠状病毒、流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人偏肺病毒、新型肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型等在内的有包膜和无包膜病毒，RNA和DNA病毒均具有抑制作用，且对正常细胞没有毒副作用。因此，本发明提供的广谱抗病毒组合物可作为一种安全且有效的广谱抗病毒组合物，用于预防和/或治疗病毒感染。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种广谱抗病毒组合物，其特征在于，包括：β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖。
2.根据权利要求1所述广谱抗病毒组合物，其特征在于，包括0.5～0.6mg/mL的β-葡聚糖、2～3mg/mL的壳聚糖、2～3mg/mL的壳寡糖和2～3mg/mL的甘露寡糖。
3.根据权利要求1所述广谱抗病毒组合物，其特征在于，包括0.5mg/mL的β-葡聚糖、2mg/mL的壳聚糖、2mg/mL的壳寡糖和2mg/mL的甘露寡糖。
4.权利要求1～3任一项所述广谱抗病毒组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将β-葡聚糖、壳聚糖、壳寡糖和甘露寡糖溶解，得到广谱抗病毒组合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，溶解使用的试剂包括水。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，溶解后，还包括将溶解得到的混合液进行过滤；所述过滤包括无菌过滤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述无菌过滤采用0.22μm滤膜进行。
8.一种权利要求1～3任一项所述广谱抗病毒组合物或权利要求4～7任一项所述制备方法制备得到的广谱抗病毒组合物在制备抑制病毒增殖的药物中的应用。
9.一种权利要求1～3任一项所述广谱抗病毒组合物或权利要求4～7任一项所述制备方法制备得到的广谱抗病毒组合物在制备预防和/或治疗病毒感染所致疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述应用，其特征在于，所述病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、冠状病毒、新型肠道病毒和柯萨奇病毒中的一种或两种以上。
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