CN114452378B - Rdh10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用 - Google Patents

Rdh10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了RDH10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用。本发明实验结果表明随着糖尿病心肌损伤的发展，心肌RDH10基因表达的水平呈现出先升后降的趋势，且注射RDH10过表达腺相关病毒可使糖尿病患者心肌RDH10的表达恢复至健康水平，该水平的恢复可有效保护糖尿病患者的心脏功能和心肌结构，延缓和/或抑制糖尿病患者的心脏功能障碍和心肌结构重塑，进而有效预防/治疗糖尿病心肌损伤。

Description

RDH10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的 药物中的应用
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域。更具体地，涉及RDH10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用。
背景技术
1972年，Rubler等首次提出了二型糖尿病心肌损伤的概念，是指一种独立于高血压和冠状动脉疾病的原发型心肌损伤。二型糖尿病患者即使在无心肌缺血及高血压时，心脏也会发生以心肌细胞肥大、间质纤维化等为特征的明显病理改变，即二型糖尿病心肌损伤，该损伤会使患者出现左心室舒张和/或收缩功能障碍，最终导致心力衰竭、心源性休克，甚至猝死，成为了糖尿病患者死亡的主要原因。
视黄醇脱氢酶10(RDH10)是短链脱氢酶/还原酶家族的成员，最初来自于克隆人、小鼠和牛视网膜色素的上皮细胞，且随着对RDH10研究的深入，发现不同物种的RDH10基因亚型之间的氨基酸序列的同源性非常高，尤其是鼠和人在氨基酸水平上的RDH10之间具有99％的同一性。RDH10基因的含量对细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期有着显著的影响，特别的是，RDH10基因的含量还会对一些肿瘤疾病产生影响，如其敲除有利于治疗脑胶质瘤疾病等，但目前尚未有RDH10基因对糖尿病心肌损伤作用的相关研究。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供RDH10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用，为糖尿病心肌损伤的预防和/或治疗提供一种新选择。
本发明的首要目的是提供RDH10和/或其前药在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供RDH10激活剂在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用。
本发明的又一目的是提供一种治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明实验结果表明随着糖尿病心肌损伤的发展，心肌RDH10基因表达的水平呈现出先升后降的趋势，且注射RDH10过表达腺相关病毒可使糖尿病患者心肌RDH10的表达恢复至健康水平，该水平的恢复可有效保护糖尿病患者的心脏功能和心肌结构，延缓和/或抑制糖尿病患者的心脏功能障碍和心肌结构重塑，进而有效预防/治疗糖尿病心肌损伤。因此，RDH10和/或其前药、RDH10激活剂在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用均应在本发明的保护范围之内。
本发明为验证糖尿病心肌损伤对心肌RDH10基因表达水平是否有影响，随机选取了4、12、24和32周龄的2型糖尿病模型db/db小鼠及其同窝对照db/m小鼠，分别禁食12小时(不禁水)后检测其体重和血糖、心脏功能和RDH10的表达情况，发现糖尿病心肌损伤的发生发展与心肌RDH10基因表达水平有着密不可分的联系，心肌RDH10基因表达水平随着糖尿病心肌损伤的发展，表现为先升后降，且向患有2型糖尿病的小鼠注射重组RDH10过表达9型腺相关病毒，发现小鼠心肌RDH10基因表达水平恢复至健康水平。
本发明还对糖尿病小鼠的心脏功能和心肌结构进行了检测，发现RDH10过表达病毒组在注射了重组RDH10过表达9型腺相关病毒后，左心室射血分数、左心室缩短分数、心肌细胞肥大、心肌细胞间质纤维化和心肌细胞凋亡均得到显著改善，糖尿病小鼠的心脏功能和心肌结构均得到有效保护，进而有效预防/治疗了糖尿病并发的心肌损伤，即糖尿病心肌损伤。
优选地，所述心肌损伤包括心脏功能障碍。
进一步优选地，所述心脏功能障碍包括左心室射血分数和/或缩短分数的降低。
优选地，所述心肌损伤包括心肌结构重塑。
进一步优选地，所述心肌结构重塑包括心肌细胞肥大、心肌细胞间质纤维化、心肌细胞凋亡中的一种或几种。
优选地，所述前药为在生物体内能转化成RDH10的药物。
此外，本发明还请求保护一种治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物，具体是以RDH10重组蛋白、RDH10有效肽段、RDH10激活剂、RDH10前药中的一种或几种作为活性成分的药物。该药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型，如注射剂、口服液、粉针剂、水针剂、汤剂、酒剂、缓控释制剂或肠溶剂等。
本发明具有以下有益效果：
本发明实验结果表明随着糖尿病心肌损伤的发展，心肌RDH10基因表达的水平呈现出先升后降的趋势，且注射RDH10过表达腺相关病毒可使糖尿病患者心肌RDH10的表达恢复至健康水平，该水平的恢复可有效保护糖尿病患者的心脏功能和心肌结构，延缓和/或抑制糖尿病患者的心脏功能障碍和心肌结构重塑，进而有效预防/治疗糖尿病心肌损伤。
本发明提供了RDH10的新应用，也为糖尿病心肌损伤的治疗提供了一种新型药物来源，为糖尿病心肌损伤的新药研发奠定了一定的基础。
附图说明
图1A是实施例1小鼠体重和血糖的检测结果，图1B是实施例1小鼠心脏功能的检测结果，图1C是实施例1小鼠心肌RDH10基因表达水平的检测结果。(数据以平均数±标准误形式呈现；***、**和*分别表示经统计分析，db/db组数值与db/m组数值相比P值小于0.001、0.01和0.05)
图2A是实施例2小鼠心肌RDH10基因表达水平的检测结果，图2B是实施例2小鼠心肌组织荧光水平的检测结果。
图3A是血糖稳定升高后第28周的小鼠心脏超声示意图，图3B是小鼠左心室射血分数统计图，图3C是小鼠左心室缩短分数统计图。(数据以平均数±标准误形式呈现；***、**和*分别表示经统计分析，空白组数值与野生对照组数值相比P值小于0.001、0.01和0.05；###、##和#分别表示经统计分析，GFP对照病毒组数值与野生对照组数值相比P值小于0.001、0.01和0.05；&表示经统计分析，RDH10过表达病毒组数值与野生对照组数值相比P值小于0.001)
图4A是心肌细胞肥大检测中中性树胶封片的观察结果，图4B是心肌细胞面积的分析结果。(数据以平均数±标准误形式呈现；***表示经统计分析，相应组数值与野生对照组数值相比P值小于0.001；##表示经统计分析，相应组数值与空白组数值相比P值小于0.01；&&&表示经统计分析，相应组数值与GFP对照病毒组数值相比P值小于0.001)
图5A是心肌间质纤维化检测中中性树胶封片的观察结果，图5B是心肌胶原面积比的分析结果。(数据以平均数±标准误形式呈现；***和**分别表示经统计分析，相应组数值与野生对照组数值相比P值小于0.001和0.01；##表示经统计分析，相应组数值与空白组数值相比P值小于0.01)
图6A是细胞凋亡程度检测中中性树胶封片的照片，图6B是心肌阳性细胞数的分析结果。(数据以平均数±标准误形式呈现；***和*分别表示经统计分析，相应组数值与野生对照组数值相比P值小于0.001和0.05；###表示经统计分析，相应组数值与空白组数值相比P值小于0.001；&表示经统计分析，相应组数值与GFP对照病毒组数值相比P值小于0.05)
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1糖尿病心肌损伤对心肌RDH10基因表达水平的影响
为验证糖尿病心肌损伤对心肌RDH10基因表达水平是否有影响，先随机选取4、12、24和32周龄的2型糖尿病模型db/db小鼠及其同窝对照db/m小鼠(购自江苏集萃药康)各三只，分别禁食12小时(不禁水)后检测其体重和血糖，再以小动物心动超声法检测其心脏功能，最后取其心肌组织并提取心肌总蛋白以检测RDH10的表达情况，具体如下：
(1)体重和血糖的检测：
4、24和32周龄的小鼠体重和血糖检测结果如图1A所示，可见4周龄的db/db小鼠血糖与db/m小鼠持平，但体重高于db/m小鼠；而24和32周龄的db/db小鼠血糖和体重均显著高于db/m小鼠，说明24和32周龄的db/db小鼠伴随着以血糖和体重显著升高为特征的糖尿病。
(2)心脏功能的检测：
采用Vevo 3100小动物心动超声仪检测4、24和32周龄的小鼠左心室收缩功能，首先采用异氟烷分别对小鼠进行吸入麻醉，在麻醉状态下用脱毛膏对小鼠胸部脱毛，仰卧位置于恒温加热板(37℃)上，持续性吸入异氟烷，并将小鼠四肢与心电图电极相连，用于检测心率并记录，30MHz探头于小鼠左胸骨部位探测。短轴，行M型超声测量左心室射血分数和左心室缩短分数，结果如图1B所示。
由图1B可知，24周龄的db/db小鼠左心室射血分数和左心室缩短分数均显著高于db/m小鼠，而32周龄的db/db小鼠左心室射血分数和左心室缩短分数却显著低于db/m小鼠，即db/db小鼠心脏功能呈现出从代偿性升高到失代偿下降的变化趋势，说明在24周龄时，db/db小鼠已伴随有糖尿病心肌损伤；而在32周龄时，db/db小鼠发生了以射血分数和缩短分数下降为特征的左心室收缩功能受损，出现了糖尿病心肌损伤所致的严重心脏结局，即心力衰竭。
(3)心肌RDH10基因表达水平的检测
a.心肌组织蛋白的提取：
检测完心脏功能后，将4、12、24和32周龄的小鼠分别处死，再分别取10mg小鼠心肌组织，加入300μL含PMSF的RIPA裂解液，冰上匀浆，所得匀浆液冰上静置30min后，在4℃下离心15min，转速为15000rpm，离心后将上清转移至新的ep管中，即得小鼠心肌组织蛋白液。
b.蛋白浓度的检测：
采用BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定，具体为：将蛋白标准液梯度稀释为1000ng/μL、500ng/μL、250ng/μL、125ng/μL、25ng/μL和0ng/μL，并分别取25μL至96孔板→2.5μL待测蛋白液和22.5μL超纯水加入96孔板孔中→以200：4的比例配制检测液→向已加有标准蛋白溶液和待测蛋白液的孔中加入200μL配制好的检测液→轻微振荡混匀后37℃孵育半小时→酶标仪检测562nm处的吸光度(OD)值→以标准蛋白液OD值为横坐标，浓度为纵坐标建立标准曲线(R2≥0.99)，并将待测蛋白液OD值代入，计算出相应的蛋白浓度。
c.免疫蛋白印迹：
得到小鼠心肌组织蛋白液及其浓度后，取35μg心肌组织蛋白液加入到超纯水和5×蛋白上样缓冲液中，煮沸后上样于SDS-PAGE凝胶，以60伏恒压电泳30min，再以120伏恒压电泳90min。电泳结束后以250毫安恒流电转90min，随后将转好的膜放入5％BSA中封闭，封闭结束后按以下顺序监测分析：裁膜→一抗4℃孵育16h→TBST漂洗→二抗25℃孵育60min→TBST漂洗→显影液显影→凝胶成像仪显影拍照(得到图1C的心肌RDH10表达变化情况)→Image J灰度扫描分析。
由图1C可知，12周龄db/db小鼠的心肌RDH10基因表达水平相对于db/m小鼠有升高的趋势，而24和32周龄db/db小鼠的心肌RDH10基因表达水平显著低于db/m小鼠，可见，db/db小鼠的心肌RDH10表达呈现出了先升后降的变化趋势。
综上可知，糖尿病心肌损伤的发生发展与心肌RDH10基因表达水平有着密不可分的联系，心肌RDH10基因表达水平随着糖尿病心肌损伤的发展，呈现出先升后降的趋势。
实施例2 RDH10对糖尿病心肌损伤小鼠心脏功能的保护
一、实验准备
(1)实验材料：
1)血糖稳定升高后第8周的2型糖尿病模型db/db小鼠30只，与之同窝的血糖稳定升高后第8周的db/m小鼠10只(购自江苏集萃药康)；
2)重组RDH10过表达9型腺相关病毒、重组GFP对照9型腺相关病毒(购自上海汉恒生物科技有限公司)；
其中，血糖稳定升高后第8周即为16周龄小鼠。
(2)实验分组：
将30只2型糖尿病模型db/db小鼠随机分为三组：1)通过尾静脉注射重组RDH10过表达9型腺相关病毒(病毒注射量为0.8×1011病毒颗粒/小鼠个数)，作为RDH10过表达病毒组；2)通过尾静脉注射重组GFP对照9型腺相关病毒(病毒注射量为0.8×1011病毒颗粒/小鼠个数)，作为GFP对照病毒组；3)不作处理，作为空白组。
将10只db/m小鼠作为野生对照组。
二、实验方法
(1)心肌RDH10基因表达水平的检测：
在完成病毒注射后的第4周，每组随机抽取3只小鼠，处死并取其心肌组织，用荧光显微镜检测小鼠心肌组织中的荧光水平，并按照实施例1中(3)的检测方法来检测心肌RDH10基因表达水平。
心肌RDH10基因表达水平检测结果如图2A所示，病毒注射后第4周，与野生对照组相比，GFP对照病毒组和空白组的心肌RDH10基因表达水平显著降低，而RDH10过表达病毒组的心肌RDH10基因表达水平与野生对照组相当；荧光水平检测结果如图2B所示，RDH10过表达病毒组和GFP对照病毒组的db/db小鼠心肌均出现绿色影响。可见，糖尿病小鼠(GFP对照病毒组、空白组)的心肌RDH10基因表达水平会显著下调，而在注射过重组RDH10过表达9型腺相关病毒(RDH10过表达病毒组)后，小鼠的心肌RDH10基因表达水平可恢复至健康小鼠(野生对照组)的原有水平，说明通过向小鼠注射RDH10可有效恢复糖尿病小鼠的心肌RDH10基因表达水平。
(2)心脏功能的检测：
每组随机抽取5只小鼠，在血糖稳定升高后第0、4、16、28周，分别按照实施例1中(2)的检测方法对小鼠的心脏功能进行检测。
检测结果如图3所示，其中，图3A为血糖稳定升高后第28周的小鼠心脏超声示意图，图3B为小鼠左心室射血分数统计图，图3C为小鼠左心室缩短分数统计图。
结果显示，GFP对照病毒组和空白组在血糖稳定升高后第28周的左心室射血分数和左心室缩短分数显著低于野生对照组，而RDH10过表达病毒组与野生对照组接近，说明心肌RDH10基因表达水平的恢复可有效保护糖尿病小鼠的心脏功能，延缓和/或抑制糖尿病小鼠的心脏功能障碍，进而有效预防/治疗糖尿病心肌损伤。
实施例3 RDH10对糖尿病心肌损伤小鼠心肌结构的保护
(1)制备心脏石蜡切片：
待实施例2剩余小鼠达到实验终点(血糖稳定升高28周)后，提前12小时禁食不禁水。禁食结束后，戊巴比妥麻醉，以眼科剪开胸，剪开右心耳，并用注射器从小鼠左心室灌注无菌PBS至血液流尽。最后，剪下心脏，用PBS漂洗至无血渍，4％多聚甲醛固定16h。次日，PBS洗3次，每次30分钟；25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、90％乙醇、无水乙醇(Ⅰ)、无水乙醇(Ⅱ)梯度脱水，各30分钟；二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各15分钟；石蜡(Ⅰ)、石蜡(Ⅱ)各60分钟；脱水后，心脏平放于石蜡中包埋；徕卡石蜡切片机切片，片厚5μm。
(2)心肌细胞肥大的检测：
每组随机选取3-4个心脏石蜡切片进行心肌细胞肥大的检测实验，心脏石蜡切片HE染色，主要步骤为：60℃烘烤30分钟→二甲苯(Ⅰ)10分钟→二甲苯(Ⅱ)10分钟→无水乙醇(Ⅰ)3分钟→无水乙醇(Ⅱ)3分钟→95％乙醇(Ⅰ)1分钟→70％乙醇1分钟→蒸馏水2分钟→苏木素液5-10分钟→流水洗去苏木素1-3秒钟→1％盐酸酒精1-2秒钟→流水冲洗20分钟→蒸馏水过洗1-2秒钟→0.5％伊红2分钟→蒸馏水稍洗1-2秒钟→95％乙醇(Ⅱ)2-3秒钟→无水乙醇(Ⅲ)3-5秒钟→无水乙醇(Ⅳ)5-10秒钟→二甲苯(Ⅰ)2分钟→二甲苯(Ⅱ)2分钟→中性树胶封片观察(图4A)→Image J软件分析细胞面积(图4B)。
由图4A和4B可知，GFP对照病毒组和空白组的心肌细胞面积显著高于野生对照组，而RDH10过表达病毒组的心肌细胞面积与野生对照组相当，说明RDH10过表达9型腺相关病毒的注射能显著改善db/db小鼠的心肌细胞肥大。
(3)心肌间质纤维化的检测：
每组选取3个心脏石蜡切片进行心肌细胞间质纤维化的检测实验，心脏石蜡切片Masson染色，主要步骤为：60℃烘烤30分钟→二甲苯(Ⅰ)10分钟→二甲苯(Ⅱ)10分钟→无水乙醇(Ⅰ)3分钟→无水乙醇(Ⅱ)3分钟→95％乙醇(Ⅰ)1分钟→70％乙醇1分钟→蒸馏水2分钟→Weigert氏铁苏木素染5分钟→流水洗去苏木素1-3秒钟→1％盐酸酒精1-2秒钟→流水冲洗20分钟→蒸馏水过洗1-2秒钟→丽春红酸性品红液染5-10分钟→蒸馏水快速漂洗2-5s→磷钼酸水溶液处理3-5分钟→苯胺蓝液复染2分钟→1％冰醋酸处理1分钟→95％乙醇(Ⅱ)2-3秒钟→无水乙醇(Ⅲ)3-5秒钟→无水乙醇(Ⅳ)5-10秒钟→二甲苯(Ⅰ)2分钟→二甲苯(Ⅱ)2分钟→中性树胶封片观察(图5A)→Image J软件分析心肌胶原面积比(图5B)。
由图5A和5B可知，GFP对照病毒组和空白组的心肌胶原面积比显著高于野生对照组，而RDH10过表达病毒组的心肌胶原面积比与野生对照组相当，说明RDH10过表达9型腺相关病毒的注射能显著改善db/db小鼠的心肌细胞间质纤维化。
(4)心肌中的细胞凋亡程度检测：
每组选取3个心脏石蜡切片采用Tunel染色(DAB显色法)对小鼠心脏石蜡切片中的凋亡细胞进行标记，具体实验步骤如下：60℃烘烤30分钟→二甲苯(Ⅰ)10分钟→二甲苯(Ⅱ)10分钟→无水乙醇(Ⅰ)3分钟→无水乙醇(Ⅱ)3分钟→95％乙醇(Ⅰ)1分钟→70％乙醇1分钟→蒸馏水2分钟→不含DNase的蛋白酶K室温20分钟→PBS洗3次→3％H2O2(PBS)室温20分钟→PBS洗3次→生物素标记液37℃避光孵育60分钟→PBS洗1次→标记反应终止液室温10分钟→PBS洗3次→Streptavidin-HRP工作液室温30分钟→PBS洗3次→DAB显色液室温30分钟→PBS洗3次→苏木素室温30秒钟→流水冲洗→依次浸入80％、95％、100％乙醇，各2分钟→二甲苯两次→中性树胶封片→光学显微镜拍照保存(图6A)→标记阳性细胞数目统计分析(图6B)。
由图6A和6B可知，GFP对照病毒组和空白组的心肌阳性细胞数显著高于野生对照组，而RDH10过表达病毒组的心肌阳性细胞数与野生对照组相当，说明RDH10过表达9型腺相关病毒的注射能显著改善db/db小鼠的心肌细胞凋亡。
因此，RDH10过表达9型腺相关病毒的注射能显著改善db/db小鼠的心肌细胞肥大、心肌细胞间质纤维化和心肌细胞凋亡，说明心肌RDH10基因表达水平的恢复可有效保护糖尿病小鼠的心肌结构，延缓和/或抑制糖尿病小鼠心肌结构的重塑，进而有效预防/治疗糖尿病心肌损伤。
综上，本发明实验结果发现随着糖尿病心肌损伤的发展，心肌RDH10基因表达的水平呈现出先升后降的趋势，且注射RDH10过表达腺相关病毒可使糖尿病患者心肌RDH10的表达恢复至健康水平，该水平的恢复可有效保护糖尿病患者的心脏功能和心肌结构，延缓和/或抑制糖尿病患者的心脏功能障碍和心肌结构重塑，进而有效预防/治疗糖尿病心肌损伤。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. RDH10过表达9型腺相关病毒在制备治疗和/或预防糖尿病心肌损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述心肌损伤包括心脏功能障碍。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述心脏功能障碍包括左心室射血分数和/或缩短分数的降低。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述心肌损伤包括心肌结构重塑。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述心肌结构重塑包括心肌细胞肥大、心肌细胞间质纤维化、心肌细胞凋亡中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物以RDH10过表达9型腺相关病毒为活性成分。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、口服液、粉针剂、水针剂、汤剂、酒剂、缓控释制剂或肠溶剂。
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